CN110974944A - 间充质干细胞复合活性因子冻干粉及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种间充质干细胞复合活性因子冻干粉及其制备方法和应用。本发明的复合活性因子冻干粉在制备过程中对细胞培养容器使用特定的预包被液处理，并采用第一培养基和第二培养基在特定的培养条件下培养间充质干细胞，使得间充质干细胞饥饿培养和诱导过程中仍然能维持细胞的正常状态，并分泌更多的活性因子。本发明制备得到的复合活性因子冻干粉能促进细胞的分裂与增殖，修复受损或先天角质层薄的皮肤，还可以达到紧致肌肤，减少皱纹；并激活皮肤的免疫调节功能，促进皮肤的新陈代谢，发挥抗衰老的作用。

Description

间充质干细胞复合活性因子冻干粉及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及间充质干细胞复合活性因子冻干粉及其制备方法和应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一类来源于出生前胚胎发育阶段的中胚叶和外胚层，存在于多种组织器官，如骨髓、脂肪组织、肌肉组织、肺、肝脏、胰腺和滑膜等。MSCs具有多向分化能力和旁分泌作用，其在不同的诱导因子作用下可以向脂肪细胞、软骨细胞、城固细胞等分化；还能够分泌多种细胞因子，包括趋化因子、粘黏附分子等，近年来，研究表明干细胞分泌的各种生物活性因子，可以作为一种新型的无细胞生物调控模式促进或完成细胞间的信号传导，从而响应机体生理或病理状态的变化，以此对机体内环境的稳定发挥重要的调控作用。
目前，间充质干细胞复合活性因子是将间充质干细胞在特定培养基和诱导条件下培养，取上清液纯化浓缩得到。然而大多数培养基均含有市售的胎牛血清或者是人体不适用的化学组分，例如胎牛血清可能会携带未知病原体或者朊病毒蛋白等异种蛋白，一旦进入人体很可能会导致感染、过敏等不良事件，风险性高，且这些成分在提取、纯化、浓缩过程中并不能完全去除，因此在临床应用上具有非常大的限制性。除此之外，间充质干细胞复合活性因子含量低也是培养过程中存在的重要问题。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了一种间充质干细胞复合活性因子冻干粉的制备方法，该方法使得间充质干细胞在饥饿培养和诱导过程中仍然能维持细胞的正常状态，可以促进间充质干细胞分泌更多的活性因子。
本发明还提供一种上述制备方法制备得到的复合活性因子冻干粉，该冻干粉富含活性因子、氨基酸和维生素等物质，能够激活皮肤的免疫调节功能，促进皮肤的新陈代谢，共同发挥抗衰老的作用。
本申请还提供了上述制备方法或上述冻干粉的应用方法，以及包含所述冻干粉的产品，例如药物、化妆品、护肤品。
具体而言，本发明所采取的技术方案是：
本发明的一方面，提供一种复合活性因子冻干粉的制备方法，包括如下步骤：
1)从样品中收集间充质干细胞，得到单细胞悬液；
2)使用第一培养基，对所述间充质干细胞进行培养，收集培养上清液，经过滤浓缩，得到间充质干细胞活性因子提取液；
3)将所述间充质干细胞活性因子提取液冻干，得到所述复合活性因子冻干粉；
其中，所述第一培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂包括50～500ng/ml的肝素、1～50ng/ml的白血病抑制因子、10～100μg/ml的谷胱甘肽、1～50ng/ml的碱性成纤维生长因子、1～50ng/ml的表皮生长因子、1～50ng/ml的胰岛素样生长因子、1～50ng/ml的转化生长因子β1、1～50μg/ml的重组人转铁蛋白和10～100μg/ml的L-抗坏血酸。
根据本发明的一些实施方式，所述基础培养基选自MEM-α培养基、DMEM培养基、BME培养基或DMEM/F-12培养基；优选为MEM-α培养基。
MEM-α培养基含有多种人体非必需氨基酸、葡萄糖、无机盐和L-谷氨酰胺等，可以为间充质干细胞的新陈代谢提供营养物质和能量。肝素、白血病抑制因子、bFGF、EGF、IGF、TGF-β1，可以维持间充质干细胞正常生长及其干性特征，并且能刺激间充质干细胞快速增殖。重组人转铁蛋白可以为间充质干细胞的新陈代谢提供所需的铁元素，促进间充质干细胞的新陈代谢，而谷胱甘肽和L-抗坏血酸可以起到抗氧化作用，还能延缓细胞衰老、增强细胞免疫力。本发明的培养基能显著提高间充质干细胞的贴壁性能和增殖速率，同时保持间充质干细胞的干性特征，培养基成本低，成分明确，安全性高。
根据本发明的一些实施方式，步骤2)中，对培养所述间充质干细胞的培养容器进行预包被液处理，所述预包被液为0.5～50μg/ml的纤连蛋白和/或0.001～0.01g/ml的聚乙烯醇；优选地，所述预包被液为等体积混合的0.5～50μg/ml的纤连蛋白和0.001～0.01g/ml的聚乙烯醇。
纤连蛋白作为细胞培养的基质，可提高多种细胞的贴壁率、汇合率，缩短细胞汇合时间，使细胞形态结构良好，代谢率增强，DNA、RNA及蛋白质合成速度显著提高；而聚乙烯醇(PVA)能有效提高预包被液的黏附性能，与纤连蛋白协同作用，能显著提高脂肪干细胞的贴壁性能和增殖率。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤2)进一步包括：在使用所述第一培养基培养培养所述间充质干细胞之后，更换为第二培养基再培养，收集培养上清液，经过滤浓缩，得到间充质干细胞活性因子提取液；
其中，所述第二培养基由以下步骤制备得到：
在使用所述第一培养基培养所述间充质干细胞之后，更换为基础培养基再培养，收集细胞培养上清液，得到前体诱导液；将所述前体诱导液与所述基础培养基混合，得到所述第二培养基。
根据本发明的一些实施方式，所述再培养的条件均为在5℃～35℃、5％～15％O2条件下，培养24～72h；优选为在10℃、5％O2条件下，培养24～72h。
本发明的第二培养基通过将前提诱导液与基础培养基混合得到，这种方式可以使得培养基中有多种活性因子，与特定的再培养条件结合，使得在间充质干细胞饥饿培养和诱导过程中仍然能维持细胞的正常状态，而且，还能提高间充质干细胞的分泌能力，增加冻干粉中活性因子的含量。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤2)为，将所述间充质干细胞的单细胞悬液转移到经过预包被液处理后的培养容器中并加入第一培养基进行传代培养，取P5～P10代脂肪干细胞，当细胞培养至融合度为70％～90％时，弃去原培养基，加入适量无菌PBS缓冲液洗涤3～5次，更换为第二培养基，并在10℃、5％O2、95％氮气条件下，饥饿诱导48小时，收集细胞原液，经过滤浓缩，得到间充质干细胞活性因子提取液。
根据本发明的一些实施方式，所述第二培养基由以下步骤制备得到：取间充质干细胞的单细胞悬液转移到经过预包被液处理后的培养容器中并加入第一培养基进行传代培养，取P2～P15代脂肪干细胞，当细胞培养至融合度为70％～90％时，弃去原培养基，加入适量无菌PBS缓冲液洗涤3～5次，更换为基础培养基，并在5℃～35℃、5％～15％O2条件下，饥饿诱导24～72小时，收集细胞培养上清液，得到前体诱导液；将所述前体诱导液与所述基础培养基混合，得到所述第二培养基。
根据本发明的一些实施方式，所述前体诱导液和所述基础培养基的体积比为1～5：5。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤3)中，将所述间充质干细胞活性因子提取液与冻干赋形剂混合后冻干。
根据本发明的一些实施方式，所述冻干赋形剂为甘露醇。
根据本发明的一些实施方式，所述冻干赋形剂的质量百分含量为1％～20％。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤3)中，冻干条件为温度～50℃～30℃，真空度为1～10Pa，时间为20～45h。
为了最大程度地保存复合活性因子的生物活性和稳定性，本发明根据复合活性因子的主成分及其生物特性，调整冻干赋形剂的种类和用量，通过冷冻干燥工艺将其制备成冻干粉。
根据本发明的一些实施方式，所述间充质干细胞选自脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、肌肉间充质干细胞或脐带间充质干细胞。优选地，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。
人源性脂肪间充质干细胞(Human adipose-derived stem cells，HADSCs)是从人体脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，具有来源充足、获取简便、产量高、增殖快等特点，适宜大规模培养，能够通过旁分泌途径分泌各种生长因子和细胞因子，促进血管形成，发挥免疫调节作用，还能招募其他细胞参与重建，在细胞工程、组织工程和再生医学领域得到了广泛地应用。
本发明另一方面还提供了一种如上所述的复合活性因子冻干粉的制备方法制备得到的复合活性因子冻干粉。
根据本发明的一些实施方式，所述复合活性因子冻干粉至少含有5～50ng/ml的表皮生长因子(EGF)、5～50ng/ml的转化生长因子β1(TGF-β1)、5～50ng/ml的血小板衍生生长因子(PDGF)、5～50ng/ml的血管内皮生长因子(VEGF)、10～100ng/ml的碱性成纤维生长因子(bFGF)、5～50ng/ml的酸性成纤维生长因子(aFGF)、5～50ng/ml的胰岛素样生长因子(IGF)、5～50ng/ml的肝细胞生长因子(HGF)、5～50ng/ml的基质细胞衍生因子1(SDF-1)、5～50ng/ml的内皮细胞生长因子(ECGF)、5～50ng/ml的胎盘生长因子(PGF)，以及20～200μg/ml的L-抗坏血酸、10～100μg/ml的Ⅰ型胶原蛋白和10～100μg/ml的Ⅲ型胶原蛋白。
根据本发明的一些实施方式，所述复合活性因子冻干粉至少含有15～30ng/ml的表皮生长因子(EGF)、10～25ng/ml的转化生长因子β1(TGF-β1)、10～25ng/ml的血小板衍生生长因子(PDGF)、10～40ng/ml的血管内皮生长因子(VEGF)、20～70ng/ml的碱性成纤维生长因子(bFGF)、5～20ng/ml的酸性成纤维生长因子(aFGF)、10～40ng/ml的胰岛素样生长因子(IGF)、5～30ng/ml的肝细胞生长因子(HGF)、5～30ng/ml的基质细胞衍生因子1(SDF-1)、5～30ng/ml的内皮细胞生长因子(ECGF)、5～30ng/ml的胎盘生长因子(PGF)，以及80～160μg/ml的L-抗坏血酸、30～80μg/ml的Ⅰ型胶原蛋白和30～80μg/ml的Ⅲ型胶原蛋白。
根据本发明的一些实施方式，所述复合活性因子冻干粉至少含有20ng/ml的表皮生长因子(EGF)、15ng/ml的转化生长因子β1(TGF-β1)、15ng/ml的血小板衍生生长因子(PDGF)、20ng/ml的血管内皮生长因子(VEGF)、40ng/ml的碱性成纤维生长因子(bFGF)、5ng/ml的酸性成纤维生长因子(aFGF)、20ng/ml的胰岛素样生长因子(IGF)、10ng/ml的肝细胞生长因子(HGF)、10ng/ml的基质细胞衍生因子1(SDF-1)、10ng/ml的内皮细胞生长因子(ECGF)、15ng/ml的胎盘生长因子(PGF)，以及100μg/ml的L-抗坏血酸、60μg/ml的Ⅰ型胶原蛋白和50μg/ml的Ⅲ型胶原蛋白。
本发明的复合活性因子冻干粉包括间充质干细胞分泌的多种活性因子、氨基酸和维生素，活性因子能直达肌肤基底层，并形成皮肤生长因子和细胞因子的调节网络，多水平、多层次、多靶点来激活细胞活力，促进细胞的分裂与增殖，修复受损或先天角质层薄的皮肤，还可以改善皮肤组织胶原纤维的分布，刺激肌肤合成和分泌更多的胶原蛋白，恢复肌肤弹性，从而达到紧致肌肤，减少皱纹的作用。氨基酸和维生素能够激活皮肤的免疫调节功能，促进皮肤的新陈代谢，发挥抗衰老的作用。
本发明的另一个方面，还涉及上述复合活性因子冻干粉的制备方法或上述复合活性因子冻干粉在制备细胞修复药物、抗皱产品、抗衰老产品中的应用。
本发明的另一方面还提供一种皮肤用组合物，包括如上所述复合活性因子冻干粉。
本发明的有益效果是：
本发明间充质干细胞复合活性因子及其冻干粉的主要成分是细胞旁分泌的复合活性因子，能够促进细胞的分裂与增殖，修复受损或先天角质层薄的皮肤，恢复肌肤弹性，从而达到紧致肌肤，减少皱纹的作用；还能激活皮肤的免疫调节功能，促进皮肤的新陈代谢，发挥抗衰老的作用。
本发明中使用的基础培养基不含酚红、核苷酸、脱氧核苷酸等，含有L-谷氨酰胺和多种非必需氨基酸、葡萄糖、无机盐等，
本发明中间充质干细胞在培养、传代扩增以及饥饿阶段均未引入异源血清成分和对人体有高风险性和危害的成分；另外，将合适的细胞代数，在预包被液前处理和优化后的培养基的培养下能够在短期内扩增出更多的干细胞，在特定的诱导条件和培养基作用下，间充质干细胞在饥饿培养和诱导过程中仍然能维持细胞的正常状态，并且能够使饥饿阶段的间充质干细胞分泌出更多的生物活性因子。采用本发明的技术方案能够最大程度地获得间充质干细胞复合活性因子，且采用特定培养基培养得到的细胞状态良好、分泌能力强等，适合于产业化大规模生产。
附图说明
图1为原代脂肪干细胞的细胞形态和表型鉴定图；
图2为不同培养基对人源性脂肪干细胞增殖的影响图；
图3为预包被处理对于人源性脂肪干细胞贴壁性能的影响图；
图4为不同饥饿诱导条件下人源性脂肪干细胞分泌能力的检测结果图；
图5为人源性脂肪干细胞活性因子的成分分析图；
图6为人源性脂肪干细胞复合活性因子对人真皮成纤维细胞增殖的影响图；
图7为志愿者的使用人源性脂肪干细胞复合活性因子冻干粉前后的面部图。
具体实施方式
以下结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例中，纤调蛋白和聚乙烯醇均溶解在PBS缓冲液中使用；
实施例2中，市售脂肪干细胞无血清完全培养基购自赛莱拉干细胞科技股份有限公司，产品编号为S-10-012；
MEM-α培养基购自上海源培生物科技股份有限公司，货号为L562KJ。
实施例1：脂肪干细胞的提取与表型鉴定
取健康志愿者抽脂后多余的脂肪，加入过量的无菌含双抗的PBS缓冲液，浸泡10～15min，然后2000rpm，离心10min，去除血水和PBS缓冲液，重复一次。将得到的新鲜脂肪组织转移到50ml离心管中，加入等体积的0.075％胶原酶和0.25％胰酶(1：1)，37℃下水浴消化40～50min，待看不见明显的组织块，消化液呈乳糜状后，1000rpm离心5min，并利用200目细胞筛进行过滤，将滤液转移到培养瓶中，加入第一培养基，转移到5％CO2、95％空气，37℃的细胞孵育箱中进行孵育，次日观察细胞生长状态，进行半换液或全换液，当细胞融合度达到80％以上时，使用0.25％胰酶～EDTA消化细胞，分离得到原代脂肪干细胞。
其中，第一培养基的制备为：以MEM-α培养基为基础培养基，添加100ng/ml的肝素、10ng/ml的白血病抑制因子、40μg/ml的谷胱甘肽、10ng/ml的bFGF、5ng/ml的EGF、5ng/ml的IGF、5ng/ml的TGF-β1、5μg/ml的重组人转铁蛋白、40μg/ml的L-抗坏血酸，充分混合均匀，过0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
如图1A所示，为提取得到的原代脂肪干细胞在第一培养基中培养3～5天后的细胞形态，可以看出，细胞为纺锤形，排列相对紧密有序，形态饱满，生长状态良好。说明本发明提供的培养基在脂肪干细胞的培养过程中，能够为细胞提供必要的营养成分，保证细胞的生长和增殖。
取原代分离得到的脂肪干细胞，调整细胞数量为5*104个，转移到75cm2培养瓶中，加入适量的第一培养基进行培养与传代，取P3代脂肪干细胞，调整细胞数为1*106个，分别加入单克隆抗体CD44、CD29、CD105，4℃避光反应25min，PBS缓冲液洗涤3次，于4℃下以1500r/min转速离心10min，弃上清液后加入400μl预冷后的PBS缓冲液吹打均匀，流式细胞仪进行检测。
如图1B～D所示，为脂肪干细胞的表型鉴定图；其中，图1B、图1C、图1D分别对应脂肪干细胞CD44、CD29和CD105的表达情况，可以看出提取得到的脂肪干细胞符合ISCT中针对间充质干细胞的鉴定标准，是人源性脂肪干细胞，不会影响脂肪干细胞的干性特征。
实施例2：培养基对人源性脂肪干细胞增殖的影响
取实施例1中的P3代脂肪干细胞，按7000个/孔的细胞密度接种于96孔细胞培养板中，培养24h，弃去原孔内培养基，后分别采用本发明的第一培养基和市售脂肪干细胞无血清完全培养基进行培养，24h后，利用CCK8检测人源性脂肪干细胞的增殖情况，实验重复检测3次。
如图2所示，为不同培养基对人源性脂肪干细胞增殖的影响，可以看出第一培养基能有效促进脂肪干细胞的生长与增殖，大大提高脂肪干细胞扩增的数量。说明本发明培养基对于脂肪干细胞的增殖效果远好于市售无血清培养基。
实施例3：预包被处理对于人源性脂肪干细胞贴壁性能的影响
取10ml的10μg/ml纤连蛋白和0.001g/ml聚乙烯醇(PVA)等体积混合的预包被液，轻轻地沿着培养瓶壁上加入到75cm2培养瓶中，用手指轻轻敲打培养瓶排除气泡，保证预包被液充分覆盖培养瓶底壁上，转移到4℃冰箱内，放置30min，备用。
取10ml的10μg/ml纤连蛋白预包被液，轻轻地沿着培养瓶壁上加入到75cm2培养瓶中，用手指轻轻敲打培养瓶排除气泡，保证预包被液充分覆盖培养瓶底壁上，转移到4℃冰箱内，放置30min，备用。
取10ml的0.001g/ml聚乙烯醇(PVA)预包被液，轻轻地沿着培养瓶壁上加入到75cm2培养瓶中，用手指轻轻敲打培养瓶排除气泡，保证预包被液充分覆盖培养瓶底壁上，转移到4℃冰箱内，放置30min，备用。
未预包被处理的75cm2培养瓶同样转移到4℃冰箱内，放置30min。
取生长状态良好的P3代人源性脂肪干细胞，按5*105个/瓶的细胞密度分别接种于上述4组75cm2培养瓶中，培养24小时，在显微镜下观察和记录细胞贴壁情况。
如图3所示，为预包被处理对于人源性脂肪干细胞贴壁性能的影响图，其中，A图为未预包被处理组、B图为10μg/ml纤连蛋白预包被液处理组、C图为0.1％PVA预包被液处理组、D图为等体积比例混合的(10μg/ml的纤连蛋白：0.001g/ml的PVA＝1:1)预包被液处理组，相同比例尺情况下，可以看出，采用预包被液处理后，贴壁的细胞数量明显多于未处理组(A)，而采用等体积比例混合的(10μg/ml的纤连蛋白：0.001g/ml的PVA＝1:1)预包被液处理后，贴壁的细胞数量是最多的(D)，表明10μg/ml的纤连蛋白和0.001g/ml的PVA等体积混合的预包被液，能够有效提高脂肪干细胞的贴壁性能，促进脂肪干细胞快速生长与增殖。
实施例4：不同饥饿诱导条件下人源性脂肪干细胞分泌能力的检测
取原代分离得到的人源性脂肪干细胞，调整细胞数量为5*104个，转移到预包被(10μg/ml的纤连蛋白和0.001g/ml的PVA等体积混合)好的75cm2培养瓶中，加入适量的第一培养基(MEM-α基础培养基+添加剂)进行培养与传代，取P5代脂肪干细胞，当细胞培养至融合度为70％～90％时，弃去原培养基，加入适量无菌PBS缓冲液洗涤3～5次，更换为第二培养基(MEM-α基础培养基+前体诱导液)，并在常规诱导条件(37℃、5％CO2、95％空气)和特定诱导条件(10℃、5％氧气、95％氮气)下，饥饿诱导48小时，收集细胞培养上清液，根据ELISA试剂盒(R&D)说明书对bFGF、EGF、IGF、TGF-β1等生长因子的含量进行检测。
其中，第一培养基的制备：同实施例1。
第二培养基的制备：取原代分离得到的人源性脂肪干细胞，转移到预包被(10μg/ml的纤连蛋白和0.001g/ml的PVA等体积混合)好的75cm2培养瓶中，加入适量的第一培养基进行培养与传代，取P5代脂肪干细胞，当细胞培养至融合度为70％～90％时，弃去原第一培养基，加入适量无菌PBS缓冲液洗涤3～5次，更换为MEM-α基础培养基，并在10℃、5％氧气、95％氮气条件下，饥饿诱导48小时后，收集细胞培养上清液即前体诱导液。将MEM-α基础培养基与前体诱导液按照体积比5:1充分混合均匀，过0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
如图4所示，不同饥饿诱导条件下人源性脂肪干细胞分泌能力的检测结果图，可以看出，本发明的特定诱导条件下，脂肪干细胞分泌的生长因子的含量均高于常规诱导条件，表明本发明特定诱导条件可以促进人源性脂肪干细胞分泌更多的生长因子。
实施例5：人源性脂肪干细胞活性因子的成分分析
取实施例4中特定诱导条件(10℃、5％氧气、95％氮气)下得到的细胞培养原液。利用Label Free蛋白组学方法对该细胞培养原液进行检测，并对检测结果导入蛋白质谱数据库中进行比对分析。
结果如图5所示，为人源性脂肪干细胞活性因子的成分分析图；由节选的部分蛋白质谱图和分析可见，人源性脂肪干细胞复合活性因子主要包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、酸性成纤维生长因子(aFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肝细胞生长因子(HGF)、基质细胞衍生因子1(SDF-1)、内皮细胞生长因子(ECGF)、胎盘生长因子(PGF)、L-抗坏血酸，以及胶原蛋白(Ⅰ型、Ⅲ型)和纤维粘连蛋白等150多种活性因子。
实施例6：人源性脂肪干细胞活性因子的制备
取实施例4中特定诱导条件(10℃、5％氧气、95％氮气)下得到的细胞培养原液。将该细胞培养原液，通过0.45μm滤膜进行初滤，去除破碎细胞和杂质，然后通过50KD超滤膜进行首次超滤浓缩，再通过10KD超滤膜进行二次超滤浓缩，最后通过3KD超滤膜超滤浓缩至占上清液的1/5～1/10，即得浓缩液，最后通过0.22μm滤膜进行过滤除菌，即得人源性脂肪干细胞复合活性因子原液。
实施例7：人源性脂肪干细胞复合活性因子对人真皮成纤维细胞增殖的影响
取对数生长期的人真皮成纤维细胞(HDF细胞)，按7000个/孔的细胞密度接种于96孔细胞培养板中，培养24小时后，更换为含0、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml和10mg/ml实施例6制备得到的人源性脂肪干细胞复合活性因子的MEM-α完全培养基，培养48h后，利用CCK8检测人真皮成纤维细胞的增殖情况。
如图6所示，为人源性脂肪干细胞复合活性因子对人真皮成纤维细胞增殖的影响，结果可以说明低于2mg/ml的人源性脂肪干细胞复合活性因子对人真皮成纤维细胞的生长与增殖并没有明显促进作用，但高于2mg/ml的人源性脂肪干细胞复合活性因子能够促进人真皮成纤维细胞的生长和增殖。
实施例8：人源性脂肪干细胞复合活性因子冻干粉的制备
取实施例6制备得到的人源性脂肪干细胞复合活性因子原液，MEM-α基础培养基调整人源性脂肪干细胞复合活性因子浓度为75mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌，加入占总质量5％的甘露醇，每瓶2ml进行分装并冻干，其中冻干条件为程序变温，温度～50℃～25℃，真空度为1～5Pa，时间为25～35小时，冻干后即得每瓶150mg的人源性脂肪干细胞复合活性因子冻干粉。
实施例9：人源性脂肪干细胞复合活性因子冻干粉的理化性质和微生物检测
随机抽取实施例8制备得到的人源性脂肪干细胞复合活性因子冻干粉5瓶，对其性状、溶解性、含水量、pH、蛋白浓度和微生物进行检测，检测结果见表1。
表1人源性脂肪干细胞复合活性因子冻干粉检测结果
Figure BDA0002350419960000101
实施例10：人源性脂肪干细胞复合活性因子冻干粉的临床应用案例
取实施例8制备得到的冻干粉用3～4ml生理盐水溶解，备用。
招募抗衰老项目的志愿者10名，年龄在40～55岁之间，其中男性3名，女性7名，身体健康状况良好，无重要器官病变。采用0.5mm长度的滚针，在志愿者的皱纹周围边滚动边滴加上述的冻干粉溶液，每次使用间隔为10～15天，每次1～2瓶，疗程为3～4次。使用前后对志愿者特定部位进行拍照，拍照时必须保证所有光线、环境、距离一致。
如图7所示，为随机一名志愿者的使用人源性脂肪干细胞复合活性因子冻干粉前后的面部图，可以看出，志愿者鱼尾纹得到了很好地改善。说明本发明的冻干粉对于抗衰老、抗皱有非常好的疗效。
本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

Claims (10)

1.一种复合活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)从样品中收集间充质干细胞，得到单细胞悬液；
2)使用第一培养基，对所述间充质干细胞进行培养，收集培养上清液，经过滤浓缩，得到间充质干细胞活性因子提取液；
3)将所述间充质干细胞活性因子提取液冻干，得到所述复合活性因子冻干粉；
其中，所述第一培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂包括50～500ng/ml的肝素、1～50ng/ml的白血病抑制因子、10～100μg/ml的谷胱甘肽、1～50ng/ml的碱性成纤维生长因子、1～50ng/ml的表皮生长因子、1～50ng/ml的胰岛素样生长因子、1～50ng/ml的转化生长因子β1、1～50μg/ml的重组人转铁蛋白和10～100μg/ml的L-抗坏血酸。
2.根据权利要求1所述的复合活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤2)中，对培养所述间充质干细胞的培养容器进行预包被液处理，所述预包被液为0.5～50μg/ml的纤连蛋白和/或0.001～0.01g/ml的聚乙烯醇；优选地，所述预包被液为等体积混合的0.5～50μg/ml的纤连蛋白和0.001～0.01g/ml的聚乙烯醇。
3.根据权利要求1所述的复合活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤2)进一步包括：在使用所述第一培养基培养培养所述间充质干细胞之后，更换为第二培养基再培养，收集培养上清液，经过滤浓缩，得到间充质干细胞活性因子提取液；
其中，所述第二培养基由以下步骤制备得到：
在使用所述第一培养基培养所述间充质干细胞之后，更换为所述基础培养基再培养，收集细胞培养上清液，得到前体诱导液；将所述前体诱导液与所述基础培养基混合，得到所述第二培养基。
4.根据权利要求3所述的复合活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于，所述再培养的条件均为在5℃～35℃、5％～15％O2条件下，培养24～72h；优选为在10℃、5％O2条件下，培养24～72h。
5.根据权利要求3所述的复合活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于，所述第二培养基中，所述前体诱导液与所述基础培养基的体积比为1～5:5。
6.根据权利要求1所述的复合活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，将所述间充质干细胞活性因子提取液与冻干赋形剂混合后冻干；优选地，所述冻干的条件为温度～50℃～30℃，真空度为1～10Pa，时间20～45h。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的复合活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞选自脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、肌肉间充质干细胞或脐带间充质干细胞中的至少一种；优选地，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。
8.一种根据权利要求1至6中任一项所述的复合活性因子冻干粉的制备方法制备得到的复合活性因子冻干粉。
9.根据权利要求8所述的复合活性因子冻干粉，其特征在于，所述复合活性因子冻干粉至少含有5～50ng/ml的表皮生长因子、5～50ng/ml的转化生长因子β1、5～50ng/ml的血小板衍生生长因子、5～50ng/ml的血管内皮生长因子、10～100ng/ml的碱性成纤维生长因子、5～50ng/ml的酸性成纤维生长因子、5～50ng/ml的胰岛素样生长因子、5～50ng/ml的肝细胞生长因子、5～50ng/ml的基质细胞衍生因子1、5～50ng/ml的内皮细胞生长因子、5～50ng/ml的胎盘生长因子、20～200μg/ml的维生素C、10～100μg/ml的Ⅰ型胶原蛋白和10～100μg/ml的Ⅲ型胶原蛋白。
10.权利要求1至7中任一项所述的复合活性因子冻干粉的制备方法或权利要求8或9所述的复合活性因子冻干粉在制备细胞修复药物、抗皱产品、抗衰老产品中的应用。
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