CN112852724A - 一种含干细胞活性因子的美容组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种诱导干细胞产生干细胞活性因子的培养基，以重量份计，每份DEME培养基中添加1.3～2份寡肽‑1、1～10份胶原蛋白、0.2～1.2份甲基丙烯酸化明胶，并利用从采集的脐带中分离得到的间充质干细胞在上述培养基中培养得到含修复皮肤的干细胞活性因子的美容组合物，该组合具有改善皮肤角质层保水性、促进成纤维细胞活化的胶原蛋白和弹性蛋白的分泌、促血管新生及胶原沉积，减少皮肤黑色素沉着的作用，能够解决皮肤炎症、修复、美白、充分补水等问题。相较同类产品具有组织相容性高、易吸收、对皮肤改善效果好等优势。

Description

一种含干细胞活性因子的美容组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体的，涉及一种含干细胞活性因子的美容组合物及其制备方法和应用。

背景技术

干细胞是一种具有自我更新和分化成功能的能力的细胞，干细胞的再生潜力，特别是它们的分泌蛋白质组在再生医学领域具有广泛性应用。分泌组是指细胞通过旁分泌和自分泌放到细胞外空间的复杂因子混合物，包括多种细胞因子、生长因子、外泌体囊泡等，统称分泌组。分泌组通过控制炎症以及诱导选择性蛋白激活和转录改变微环境，以及细胞间进行信息传递。大量研究证明干细胞培养上清中含有多种分泌因子，主要包括3大类：第一类细胞外基质成分，如各种胶原蛋白和弹性蛋白等；第二类，生长因子类，如转化生长因子、干细胞生长因子、血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子等；第三类，炎症因子及趋化因子类(干扰素γ、白细胞介素9及肿瘤坏死因子α等)，它们能够抑制炎症，加速皮肤细胞迁移和增殖，抑制纤维化和凋亡，控制伤口瘢痕形成，改善血管生成，参与组织修复再生，从而抑制皮肤老化、肌肤达到美白、辅助脂肪移植、促进毛发再生等诸多抗衰老方面均有显著的效果。

人的皮肤由表皮、真皮、皮下组织组成，包括胶原纤维、弹力纤维、基质、血管、神经、皮脂腺、汗腺、毛囊等复杂成分。随着年龄增长，中老年人会出现皱纹增多、皮肤松弛、弹性减弱、各种皮肤炎症等皮肤衰老的明显特征。随着社会物质文化水平的不断提高，人们对面貌的完美追求变得日益强烈，以改善皮肤为目的的美容产品需求增加。然而目前市场上大多数美容剂由于活性成分单一、组织相容性差、难吸收等问题导致效果不佳。常见的如玻尿酸类产品，无论通过交联或非交联的结构设计，难以达到效果和持续时间之间的平衡。再如肉毒素，本身具有毒性，注射有一定风险。还有较常见的胶原蛋白，属于第一代填充剂，一般以牛胶原、猪胶原形式存在，属于异体生物蛋白，存在致敏隐患。其他诸如植物提取物由于物种差异巨大，难以被人体皮肤吸收利用，效果一般。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，首先提供了一种诱导干细胞产生干细胞活性因子的培养基。

本发明的第二个目的是提供上述诱导干细胞产生干细胞活性因子的培养基的应用。

本发明的第三个目的是提供一种含干细胞活性因子的美容组合物。

本发明的第四个目的是提供上述含干细胞活性因子的美容组合物的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种诱导干细胞产生干细胞活性因子的培养基，以重量份计，每份DEME培养基中添加1.3～2份寡肽-1、1～10份胶原蛋白、0.2～1.2份甲基丙烯酸化明胶。

优选的，所述干细胞为间充质干细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、表皮干细胞、神经干细胞中的一种或几种，优选间充质干细胞。

更优选的，所述间充质干细胞的获取方法为：

S1、将采集到的脐带无菌条件下清洗去除杂质；

S2、将脐带剪碎成段，撕下动脉和静脉组织；

S3、加入胶原蛋白和透明质酸，然后进行消化；

S4、终止消化、离心、过滤后即得到间充质干细胞。

本发明还提供上述培养基在制备干细胞活性因子方面的应用。

优选的，将间充质干细胞培养至第3代，弃去上清，加入到所述培养基中，于5％CO₂浓度37℃下培养2～3天，收集培养后的上清过滤即得干细胞活性因子。

更优选的，上述应用中，所述过滤是将收集的上清使用0.22μm快速过滤器进行过滤。

本发明还提供一种含干细胞活性因子的美容组合物，是在每份所述的干细胞活性因子中添加0.2～0.8份透明质酸。

本发明还提供所述的美容组合物的制备方法，是将上述美容组合物分装后，于-20℃保存。

本发明还提供所述美容组合物在改善皮肤角质层保水性、促进活化成纤维细胞的胶原蛋白和弹性蛋白的分泌、促血管新生及胶原沉积，减少皮肤黑色素沉着方面的应用。

本发明还提供所述美容组合物在改善皮肤炎症、细化皱纹、改善皮肤肤质方面的应用。

本发明上述美容组合的使用方式：外敷、微针、滚针、水光针等任何一种方式将其导入表皮深层和真皮层。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种诱导干细胞产生干细胞活性因子的培养基，以重量份计，每份DEME培养基中添加1.3～2份寡肽-1、1～10份胶原蛋白、0.2～1.2份甲基丙烯酸化明胶，并利用从采集的脐带中分离得到的间充质干细胞在上述培养基中培养得到含修复皮肤的干细胞活性因子的美容组合物，该组合具有改善皮肤角质层保水性、促进成纤维细胞活化的胶原蛋白和弹性蛋白的分泌、促血管新生及胶原沉积，减少皮肤黑色素沉着的作用，能够解决皮肤炎症、修复、美白、充分补水等问题。相较同类产品具有组织相容性高、易吸收、对皮肤改善效果好等优势。

附图说明

图1为诱导培养基对间充质干细胞分泌干细胞活性因子的影响；

图2为诱导培养基对脂肪干细胞分泌干细胞活性因子的影响；

图3为诱导培养基对胚胎干细胞分泌干细胞活性因子的影响；

图4为诱导培养基对造血干细胞分泌干细胞活性因子的影响；

图5为诱导培养基对表皮干细胞分泌干细胞活性因子的影响；

图6为诱导培养基对神经干细胞分泌干细胞活性因子的影响；

图7为含干细胞活性因子的美容组合物对皮肤皱纹的使用效果；

图8为含干细胞活性因子的美容组合物对皮肤炎症、皮肤肤质的使用效果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1间充质细胞的制备

一、采集前的准备

(1)配制“脐带采集缓冲液”：标志A/B/C/D共4管50ml离心管，每管装有30ml的磷酸缓冲盐溶液(PBS)；缓冲液、冰袋和马克笔放置运输箱中，等待采集；

(2)核对产妇病理信息，将截取的脐带在A/B/C管中清洗，之后转至D管中，并标志好采集时间等基本信息。

二、间充质干细胞分离培养

(1)在无菌条件下，用含有青霉素的缓冲液浸泡新鲜脐带，充分洗涤3-5遍，直至无血液及其它杂质；

(2)将脐带剪成5cm的小段，沿脐带切断处肉眼观察到其中包含的两条动脉和一条静脉，将静脉和动脉撕下，然后把脐带放到加有缓冲液的干净培养皿上剪碎，保持剪碎的组织一直处于湿润的环境中；

(3)取20ml DMEM培养基，加入400mg胶原酶和6mg透明质酸酶混匀配制成消化液，再将组织放入消化液中，放到37℃60rpm摇床1h进行消化；

(4)将消化好的悬液混匀后，加入5倍缓冲液稀释，混匀后进行400g×5min离心；将上清液滤过70um的滤网并把上清放到新的离心管，加入10ml缓冲液上下混匀，400g×5min再次离心；

(5)将装有组织的离心管中加入5ml胰蛋白酶，封口并放到摇床30min；

(6)将离心后的上清去掉，并加入培养基重悬，吹匀后加入到培养瓶，并将培养瓶放到5％CO₂浓度37℃培养箱培养；

(7)组织消化结束后，加入培养基终止消化，上下混匀后进行400g×5min离心；

(8)离心结束后，弃上清至5-10ml，之后加入10ml培养基，上下混匀并自然沉降后，将上清通过70um的滤网并加入到含有培养基的培养瓶中，将其放到5％CO₂浓度37℃培养箱培养；

(9)当细胞培养处于第3天和第6天时，应及时换液；到第7-10天时，观察3-5个细胞集落到达80％以上，即可进行细胞的传代。

三、细胞传代

(1)将培养上清去掉；加入缓冲液润洗培养瓶，去上清并加入胰蛋白酶进行消化3-5min，消化结束后在显微镜下观察细胞，用手掌轻拍培养瓶确保细胞完全从细胞瓶底壁脱落；

(2)加入培养基中止消化并把细胞吹打下来，转移至新的离心管中，并加入缓冲液润洗培养瓶，将剩余的细胞收集之后进行400g×3min离心。

离心后弃上清，加入培养基重悬并吹匀细胞，取100μL细胞悬液于细胞计数和活率检测,按1:3的比例进行细胞培养。

实施例2促进干细胞分泌皮肤修复相关活性因子的诱导培养基的制备

在DMEM培养基中加入1.3-2份谷胱甘肽、0.3-0.5份维生素C、0.2-1.2份寡肽-1、1-10份胶原蛋白、0.2-1.2份修饰过的明胶(gel MA)配成诱导培养基。

实施例3含干细胞活性因子的美容组合物的制备

1、依次按照实施案例1的步骤将干细胞培养到第3代，弃去上清；加入10ml实施例2中的诱导培养基，于5％CO₂浓度37℃条件下培养2-3天，诱导干细胞产生抗衰老活性因子，收集培养后的上清。

2、将收集的上清进行离心，离心后使用0.22μm快速过滤器进行过滤；

3、向上清中加入0.2-0.8份透明质酸(HA)，充分混匀后进行分装；

4、封装好的制剂存放于-20℃冰箱保存待用，即含干细胞活性因子的美容组合物制剂。实施案例4干细胞活性因子的美容组合物的使用方法

1、使用该制剂前应卸去所有化妆品，消毒皮肤，外涂复方利多卡因乳膏20-30min；

2、之后清洁掉复方利多卡因乳膏后，进行面部消毒；

3、采用外敷将实施案例3中的含干细胞活性因子的美容组合物制剂敷在表皮层或采用微针、滚针或水光针中任何一种方式将制剂导入表皮深层和真皮层。

实施例5诱导培养基促进多种干细胞分泌干细胞活性因子

分别检测使用实施案例2中的诱导培养基培养的间充质干细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、表皮干细胞和神经干细胞3天后的上清液中的弹性蛋白、干细胞生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维生长因子和白细胞介素9等干细胞活性因子，与使用常规培养基(DMEM基础培养基+5ng/ml人表皮生长因子(hEGF)+5ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)+10ng/ml重组人血小板衍生生长因子(PDGF-BB)+10％胎牛血清(FBS))培养对应干细胞的上清相比，使用诱导培养基的培养上清中的干细胞活性因子相对含量均高于常规培养基的培养上清(如图1-图6所示)。

实施例6含干细胞活性因子的美容组合物促使皮肤皱纹细化

对志愿者眼部周围皮肤使用微针导入实施案例3中的干细胞活性因子的美容组合物制剂。除每次疗程结束后出现红斑和轻微水肿外，未见任何副作用。由于注射造成的创伤可在1～2天后完全缓解。在疗程结束后1个月，注射治疗前后的对比可发现，志愿者眼部周围皮肤皱纹减少，眼纹被细化，皮肤衰老程度缓解(图7)。

实施例7含干细胞活性因子的美容组合物可降低炎症、改善肤质

将含有实施案例3中的干细胞活性因子的美容组合物的制剂涂抹于有痤疮的志愿者脸部，每天一次，连续30天后观察发现，志愿者脸部皮肤炎症缓解、痤疮消失且皮肤富有光泽与弹性(图8)。

实施例8含干细胞活性因子的美容组合物产品效果优于同类产品

选取共20名的志愿者，随机分成两组。其中10例进行含有实施案例3中的干细胞活性因子的美容组合物制剂注射治疗，另10例进行市场同类产品注射，分别对比试验前后的使用效果。

在治疗前对两组志愿者面部进行临床检查和拍照，然后在治疗一个疗程后的1个月再对志愿者脸部进行临床检查和拍照。评估两组皮肤肤质和皱纹改善情况。评估统一采用五分制(无＝0％，轻度＝1～25％，中度＝26～50％，良好＝51～75％，非常好的＝76～100％)。同时，在每次随访过程中，记录任何出现的不良反应，包括红斑、色素改变、水肿、瘀斑或结痂等。记录所有志愿者的满意度。

在所有的评估结束后，使用含实施案例3中的干细胞活性因子的美容组合物的实验组满意度一般、好、非常好改善率分别为20％、70％和10％；对应市场同类产品的对照组一般、好、非常好的改善率分别为60％、10％和10％。使用含干细胞活性因子的美容组合物的实验组所有10例自愿者自诉眼角鱼尾纹有所改善，有5例(50％)前额皱纹有所改善，有1例(10％)皮肤肤色有所改善，7例(70％)的皮肤肤质有所改善。而对照组仅有4例(40％)有鱼尾纹改善，2例(20％)前额皱纹有所改善(表1)。结果说明含干细胞活性因子的美容组合物具有更好的组织修复再生功能，能够抑制皮肤老化。

表1

通过多方面的检测可得，此制剂可安全使用于美容外敷或注射使用：可重新激活脸部的细胞，改善皮肤角质层保水性、促进成纤维细胞活化的胶原蛋白和弹性蛋白的分泌、促血管新生及胶原沉积，减少皮肤黑色素沉着，从而可改善皮肤炎方面的症状，促使凹凸的皮肤逐渐变为光滑平整。

本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

Claims (9)

1.一种诱导干细胞产生干细胞活性因子的培养基，其特征在于，以重量份计，每份DEME培养基中添加1.3～2份寡肽-1、1～10份胶原蛋白、0.2～1.2份甲基丙烯酸化明胶。

2.根据权利要求1所述的诱导干细胞产生干细胞活性因子的培养基，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、表皮干细胞、神经干细胞中的一种或几种，优选间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的诱导干细胞产生干细胞活性因子的培养基，其特征在于，所述间充质干细胞的获取方法为：

S1、将采集到的脐带无菌条件下清洗去除杂质；

S2、将脐带剪碎成段，撕下动脉和静脉组织；

S3、加入胶原蛋白和透明质酸，然后进行消化；

S4、终止消化、离心、过滤后即得到间充质干细胞。

4.根据权利要求1至3任一项所述的培养基在制备干细胞活性因子方面的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将间充质干细胞培养至第3代，弃去上清，加入到所述诱导培养基中，于5％CO₂浓度37℃下培养2～3天，收集培养后的上清过滤即得干细胞活性因子。

6.一种含干细胞活性因子的美容组合物，其特征在于，是在每份权利要求5所述的干细胞活性因子中添加0.2～0.8份透明质酸。

7.权利要求6所述的美容组合物的制备方法，其特征在于，是将上述美容组合物分装后，于-20℃保存。

8.权利要求6所述美容组合物在改善皮肤角质层保水性、促进活化成纤维细胞的胶原蛋白和弹性蛋白的分泌、促血管新生及胶原沉积，减少皮肤黑色素沉着方面的应用。

9.权利要求6所述美容组合物在改善皮肤炎症、细化皱纹、改善皮肤肤质方面的应用。

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