CN110840818A - 一种美容抗衰制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种美容抗衰制剂及其制备方法。美容抗衰制剂包括自体富血小板血浆、透明质酸和自体成纤维细胞，本制剂具有长效修复皱纹的作用，且具有安全性高和修复效果好的特点。自体富血小板血浆从患者的静脉血中分离获得，自体成纤维细胞从患者真皮层中分离获得，具有免疫原性低的特点。本制剂对皮肤修复、除皱、美容抗衰等具有较好的效果，可以应用于对皮肤损伤修复的实践操作中，具有广阔的应用前景。

Description

一种美容抗衰制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种美容抗衰制剂及其制备方法。

背景技术

皮肤包含表皮层、真皮层及附属器等多种结构，随着年龄的增大和外界因素的影响，皮肤的含水量下降，胶原蛋白流失以及皮肤基底出现组织段裂，都会导致皱纹的产生。皱纹的出现会影响外表和心情，市面上针对缓解皱纹的产品应运而生。

中国专利CN108066820A(一种自体真皮成纤维细胞注射液)公开了一种自体真皮成纤维细胞注射液以及制备方法，可用于治疗真皮薄弱型皱纹。该注射液包括自体真皮成纤维活细胞和注射液基质，所述注射液基质包括氯化钠、氯化钾等电解质。但是现有技术中的注射液存在以下问题：悬浮在电解质中的成纤维细胞活性差，被注射进入皮下之后不能很快适应体内环境，导致大量细胞死亡并产生炎症反应；成纤维细胞注射进入皮下后，增殖的方向、状态不能很好地控制，导致其对细纹的填充作用不均匀；注射液需要用电解质来维持渗透压，将大量电解质注入皮下会对正常组织产生负担，容易造成感染和水肿等情况。

发明内容

本发明的目的在于提供一种美容抗衰制剂，本制剂具有长效修复皱纹的作用，且具有安全性高和修复效果好的特点。

为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：

一种美容抗衰制剂，包括自体富血小板血浆、透明质酸和自体成纤维细胞。

采用上述技术方案，技术原理如下：分别采集患者自身的真皮成纤维细胞和富血小板血浆，将自体富血小板血浆、透明质酸和自体成纤维细胞制备成为注射剂，对皮肤皱纹进行注射治疗或对皮肤损伤部位进行皮下注射。在自体富血小板血浆的刺激作用下，注射剂中的自体成纤维细胞分泌大量细胞因子，使患者体内的成纤维细胞重新获得营养物质，增殖活性得到加强，细胞功能和性状得以激活,从而实现美容、缓解皱纹和修复皮肤损伤的功效。透明质酸本身就具有皮下填充的作用，在本制剂当中，透明质酸注射进入皮下之后，可形成半流体状，对来自注射剂的自体成纤维细胞具有很好的支撑和提供生长微环境的作用，并可将自体成纤维细胞聚集在待修复的部位，增加了自体成纤维细胞的细胞因子的分泌量，并且定点分泌到待修复区域，进一步刺激患者体内的成纤维细胞生长，减少了细纹或皮肤损伤部位填充不均匀的可能性。自体富血小板血浆和透明质酸组成的液态载体能够较好的维持自体成纤维细胞的渗透压平衡，不用在制剂中加入其它调节电解质的物质，使得本制剂更为安全，减少了感染的概率。

自体成纤维细胞是指从接收祛皱等治疗的个体(患者)上采集到的成纤维细胞，成纤维细胞在本方案中特指真皮源的成纤维细胞。自体富血小板血浆是指从接收祛皱和皮肤修复等治疗的个体(患者)上采集到的富血小板血浆。富血小板血浆(Platelet-richplasma,PRP)是全血经离心后得到的血小板浓缩物，其中含有大量生长因子及蛋白质。

有益效果：

(1)本技术方案使用自体富血小板血浆和透明质酸组成的液态载体代替现有技术中的电解质溶液，能够为自体成纤维细胞提供更多的营养，并且能够维持细胞渗透压的平衡。

(2)自体富血小板血浆可刺激注射剂中的自体成纤维细胞和存在于患者体内的成纤维细胞的增殖活性，避免了以下现象：自体成纤维细胞活性差，被注射进入皮下之后不能很快适应体内环境，导致大量细胞死亡并产生炎症反应。

(3)透明质酸除了具有填充作用之外，还能够促使自体成纤维细胞的增殖更加有序和均匀，加强了皱纹修复效果。透明质酸可以为自体成纤维细胞提供生长附着点，促进其分泌细胞因子，并限制自体成纤维细胞的无序迁移运动，在增加了自体成纤维细胞的细胞因子的分泌量的同时将自体成纤维细胞限定在待修复区域，使得皱纹的修复更加均匀和迅速。

进一步，自体富血小板血浆和透明质酸的体积比为(4-7):1，自体成纤维细胞的含量为3×10⁷-8×10⁷个/ml。

采用上述技术方案，上述比例和含量能够保证三种成分发挥协同作用，实现对皱纹的修复。自体成纤维细胞的含量过少会，会导致细胞释放的细胞因子过少，导致细胞增殖的基数过少，无法对原有细胞形成刺激，达不到激活自身成纤维细胞的效果，修复效果不明显且不能长时间维持；而细胞含量太高会对患者造成一定负担，可能会出现较为严重的炎症反应。采用上述比例的自体富血小板血浆和透明质酸，可充分促进自体成纤维细胞的活性和分泌功能。

进一步，一种美容抗衰制剂的制备方法包括自体成纤维细胞的制备，自体成纤维细胞的制备包括以下步骤：

步骤(1)：从皮肤组织中分离出真皮层；

步骤(2)：使用组织块贴壁法对真皮层进行原代培养，获得原代成纤维细胞；

步骤(3)：对原代成纤维细胞进行传代培养，获得的成纤维细胞。

采用上述技术方案，从皮肤组织的真皮层分离出原代成纤维细胞，再通过传代培养获得足够量的和稳定均一的自体成纤维细胞。

进一步，在步骤(1)中，从皮肤组织中分离出真皮层的方法为：将皮肤组织剪碎后用胰酶消化，然后用镊子去除表皮层，获得真皮层；或者用分散酶Ⅱ消化皮肤组织，然后用镊子去除表皮层，获得真皮层。

采用上述技术方案，可将表皮细胞除去，避免表皮细胞对分离真皮成纤维细胞的影响。

进一步，在步骤(2)中，使用组织块贴壁法对真皮层进行原代培养的方法为：使用含有细胞因子的培养基浸润真皮层，然后将真皮层以底层向下的状态铺设在培养瓶底部；将铺设有真皮层的培养瓶放入培养箱中进行贴壁固定处理，然后在培养瓶中加入含有细胞因子的培养基，使得含有细胞因子的培养基液面与真皮层上表面齐平，然后进行过夜培养；次日在培养瓶中补充含有细胞因子的培养基继续进行细胞培养，获得原代成纤维细胞。

采用上述技术方案，通过组织块贴壁法来获取自体成纤维细胞，相比于多步酶解法(通过酶解使得真皮层细胞分散成单个细胞，再进行传代培养)，获得的细胞活性更好，纯度高，细胞形态更好，修复细纹的作用更好。现有技术中，通常认为通过组织块贴壁法获得的成纤维细胞中会有表皮细胞的混杂，导致细胞不纯，对组织块贴壁法存在技术偏见。但是，发明人发现，多步酶解法获得的细胞活性较差，培养过程中在细胞太多，纯化复杂，成本较高，不适宜用于本制剂的制备。并且发明人通过在培养基中加入细胞因子，因子更适宜成纤维细胞扩增生长，实现了对自体成纤维细胞的纯化，使得成纤维细胞大量扩增，并进一步刺激了自体成纤维细胞的活性，抑制了其它细胞的生长。

进一步，在步骤(2)中，培养基中的细胞因子种类以及含量为：成纤维细胞生长因子80-120ng/ml、转化生长因子-β5-15ng/ml和胰岛素样生长因子-I 40-60ng/ml，所述培养基为间充质干细胞培养基。

采用上述技术方案，成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和胰岛素样生长因子-I(Insulin-Like Growth Factor-I，IGF-I)具有促进成纤维细胞增殖的作用。

进一步，在步骤(2)中，真皮层在培养瓶中间隔铺设，将铺设有真皮层的培养瓶放入培养箱中进行贴壁固定处理的时长为1-2h。

采用上述技术方案，真皮层之间留有间隔，便于组织细胞爬出。

进一步，当步骤(2)中的原代成纤维细胞的细胞融合度达到50-80％时，进行步骤(3)，对原代成纤维细胞进行传代培养。

采用上述技术方案，细胞融合度达到50-80％时，细胞活性较好且需要更多的营养和生长因子，需要进行传代处理，保持细胞的活性和增殖状态。

进一步，在步骤(1)之前还包括预处理：对原始皮肤组织进行消毒灭菌处理后，除去附着在原始皮肤组织上的脂肪组织，获得皮肤组织。

采用上述技术方案，避免自体成纤维细胞在采集过程中被污染。

进一步，一种分离胎盘源造血干细胞的方法还包括自体富血小板血浆的制备，自体富血小板血浆的制备包括以下步骤：取静脉血，450g离心10min，静脉血分层后取上层液体，获得血浆；在20-24℃的条件下，对血浆进行3000g离心15min，将上层液体吸出，取下层血浆沉淀，获得自体富血小板血浆。

采用上述技术方案，可从患者静脉血中分离获得含有大量营养物质和生长因子的自体富血小板血浆。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

实施例1：

(1)自体成纤维细胞的制备

预处理：将采集的皮肤组织加入盛装酒精的培养皿中浸泡1min，用加有质量分数为1％的双抗的生理盐水冲洗3-5次，并用止血钳和剪刀将脂肪组织去除，需尽量去除干净。双抗是指含有青霉素和链霉素的溶液，其中，青霉素100IU/ml，链霉素100IU/ml。

分离真皮层和表皮层：将皮肤组织剪碎为2×3mm²大小的条状，用质量分数为0.25％的姨酶37℃消化1h。消化完成后，去除表皮层，用生理盐水冲洗干净。

原代培养：将真皮层用含有细胞因子的培养基浸润后，真皮层的底层(真皮与脂肪接触的一面)铺在T25培养瓶底部，真皮层之间空出适当间隔便于组织细胞爬出。将铺好的培养瓶放入培养箱中贴壁培养1h，再在T25培养瓶里加入2ml含有细胞因子的培养基过夜培养(轻拿轻放，防止贴壁组织块被移动下来)。其中，培养基中的细胞因子及浓度分别为：100ng/ml FGF、10ng/ml TGF-β和50ng/ml IGF-I。培养箱的条件为37℃、5％二氧化碳浓度。其中，使用的培养基为间充质干细胞培养基(Solarbio，无血清培养基)。

补液：第二天补充含有细胞因子培养基至5ml，轻拿轻放，防止贴壁组织块被移动下来。

传代：待组织块细胞爬出铺满瓶底，细胞融合度达到50-80％即可进行传代，用胰酶消化后进行传代，传代后达到所需细胞量时即可收集细胞，为自体成纤维细胞。

(2)自体富血小板血浆的制备

将无菌采集的20ml静脉血从采血袋或注射器中移入到离心管中。全血450g离心10min。全血分层有明显界限的两层，取上层液体，为保证吸取到全部血小板，可尽量取到红细胞层以上的包括白细胞在内的上层少部分血浆。将获得的血浆离心3000g离心15min，离心温度22℃，使血小板下沉。轻轻吸出上层含血小板较少的血浆，余下5ml～10ml血浆沉淀，即为浓缩的富血小板血浆(PRP)，在富血小板血浆中约含有全血中90％以上的血小板，获得自体富血小板血浆。

(3)美白抗衰制剂的制备

取4ml的PRP与1ml注射用透明质酸(Restylane，Q-Med AB)将自体成纤维细胞吹匀，自体成纤维细胞的含量为8×10⁷个/ml，用无菌注射器抽取后封口即可使用。

实施例2：

(1)自体成纤维细胞的制备

预处理：将采集的皮肤组织加入盛装酒精的培养皿中浸泡1min，用加有质量分数为1％的双抗的生理盐水冲洗3-5次，并用止血钳和剪刀将脂肪组织去除，需尽量去除干净。双抗是指含有青霉素和链霉素的溶液，其中，青霉素100IU/ml，链霉素100IU/ml。

分离真皮层和表皮层：用4mg/ml的分散酶Ⅱ(Dispase II，中性蛋白酶)37℃消化2h，消化完成后，去除表皮层，用生理盐水冲洗干净。

原代培养：将真皮层用含有细胞因子的培养基浸润后，真皮层的底层(真皮与脂肪接触的一面)铺在T25培养瓶底部，真皮层之间空出适当间隔便于组织细胞爬出。将铺好的培养瓶放入培养箱中贴壁培养2h，再在T25培养瓶里加入2ml含有细胞因子的培养基过夜培养(轻拿轻放，防止贴壁组织块被移动下来)。其中，培养基中的细胞因子及浓度分别为：80ng/ml FGF、5ng/ml TGF-β和40ng/ml IGF-I。培养箱的条件为37℃、5％二氧化碳浓度。其中，使用的培养基为间充质干细胞培养基(Solarbio，无血清培养基)。

补液：第二天补充含有细胞因子培养基至5ml，轻拿轻放，防止贴壁组织块被移动下来。

传代：待组织块细胞爬出铺满瓶底，细胞融合度达到70％进行传代，用姨酶消化后进行传代，传代后达到所需细胞量时即可收集细胞，为自体成纤维细胞。

(2)自体富血小板血浆的制备

将无菌采集的20ml静脉血从采血袋或注射器中移入到离心管中。全血450g离心10min。全血分层为有明显界限的两层，取上层液体，为保证吸取到全部血小板，可尽量取到红细胞层以上的包括白细胞在内的上层少部分血浆。将获得的血浆离心3000g离心15min，离心温度20℃，使血小板下沉。轻轻吸出上层含血小板较少的血浆，余下5ml～10ml血浆沉淀，即为浓缩的富血小板血浆(PRP)，在富血小板血浆中约含有全血中90％以上的血小板，获得自体富血小板血浆。

(3)美白抗衰制剂的制备

取7ml的PRP与1ml注射用透明质酸将自体成纤维细胞吹匀，自体成纤维细胞的含量为6×10⁷个/ml，用无菌注射器抽取后封口即可使用。

实施例3：

本实施例基本同实施例1，不同点在于制剂的成分含量：取6ml的PRP与1ml注射用透明质酸将自体成纤维细胞吹匀，自体成纤维细胞的含量为3×10⁷个/ml，用无菌注射器抽取后封口即可使用。

另外，在原代培养步骤中，培养基中的细胞因子及浓度分别为：120ng/ml FGF、15ng/ml TGF-β和60ng/ml IGF-I。

对比例1

美容抗衰制剂中只有自体富血小板血浆和自体成纤维细胞两种成分，两种成分的制备方法同实施例1，美容抗衰制剂制备过程为使用自体富血小板血浆将自体成纤维细胞吹匀，自体成纤维细胞的含量为8×10⁷个/ml，即可获得。

对比例2

美容抗衰制剂中只有透明质酸和自体成纤维细胞两种成分，自体成纤维细胞的制备方法同实施例1。将自体成纤维细胞分散于透明质酸中，放置一段时间后，细胞大量死亡，制剂中可以看到大量的死细胞沉淀，因为没有PRP提供营养和微环境，细胞无法长时间在透明质酸中生存。在使用本制剂的时候，需要在将透明质酸和自体成纤维细胞混合后，立即进行注射，不能较长时间放置。

对比例3

美容抗衰制剂中只有自体富血小板血浆。

对比例4

美容抗衰制剂中只有透明质酸。

对比例5

美容抗衰制剂中只有自体成纤维细胞，使用复方电解质溶液吹散细胞，自体成纤维细胞的含量为6×10⁷个/ml。

对比例6

本对比例基本同实施例1，不同点在于，自体成纤维细胞的制备方法：用I型胶原酶消化真皮全层得到细胞，再用DMEM培养基培养细胞，通过换液去除非贴壁细胞，得到贴壁的真皮层细胞。对贴壁的真皮层细胞进行传代培养，获得自体成纤维细胞。

实验例1：

将实验小鼠皮下注射乌拉坦1000mg/kg麻醉后，用无菌手术器械去除小鼠腹部大约0.5×1cm²大小的表皮组织，将其真皮层裸露，将实施例1-3和对比例1-6的制剂注射在受伤部位及其周围(皮下注射，注射量为1ml)，观察小鼠皮肤的修复情况，观察指标为皮肤结痂时长和皮肤恢复时间，每天观察记录，实验结果如表1所示。每个实验组设置10只小鼠，小鼠的体重控制在30±2g，表1中结痂时间和皮肤恢复时间均为平均时间。对于0.5×1cm²的小创伤，一般是由真皮层细胞分裂、增生和分化后向上移行而实现创面愈合。表1中，皮肤结痂是指在皮肤损害部位的表面，浆液、脓液或血液干燥后而形成块状物，是皮肤损伤开始恢复的标志；皮肤恢复是指结痂掉落，皮肤损伤恢复；皮肤状态是指皮肤恢复后受损皮肤的恢复状态，观察皮肤表面是否平整，是否有疤痕、瘢痕产生。

表1：实验例1结果

分组	结痂时间(h)	皮肤恢复时间(h)	皮肤状态
				实施例1	2.6	72.8	皮肤平整，表皮颜色红润，无明显疤痕
实施例2	3.2	80.5	皮肤平整，表皮颜色红润，无明显疤痕
				实施例3	3.5	96.1	皮肤平整，表皮颜色红润，无明显疤痕
对比例1	3.0	75.8	皮肤不平整，表皮颜色泛白，有轻微疤痕
				对比例2	22.7	128.2	皮肤平整，表皮颜色红润，无明显疤痕
对比例3	4.2	120.7	皮肤平整，表皮颜色红润，有轻微明显疤痕
				对比例4	24.3	158.2	皮肤凸出，表皮颜色泛白，有明显疤痕
对比例5	22.6	140.9	皮肤凸出，表皮颜色泛白，有明显疤痕
				对比例6	3.1	108.4	皮肤不平整，表皮颜色红润，有轻微疤痕

由表1的数据可知，实施例1-3使用了本技术方案的制剂，因加入的PRP的量大于小鼠自身的血小板的量，凝血效果明显，结痂时间较快，并无明显差距，但是由于成纤维细胞和透明质酸的浓度不断减小，对皮肤恢复促进作用不足，导致后期皮肤恢复时间的逐渐增长。

对比例1制剂中缺少透明质酸，自体成纤维细胞在自体富血小板血浆的刺激作用下，分泌细胞因子刺激小鼠自身的真皮层细胞增殖和生长。透明质酸不具有促进皮肤结痂的作用，所以透明质酸的缺失对皮肤结痂没有显著的影响。但是相对于实施例1-3，透明质酸的缺失导致了皮肤恢复时间的延长，并且恢复后的皮肤的状态欠佳，有皮肤表面不平整的现象。这是因为透明质酸在皮下对自体成纤维细胞具有支撑和限位的作用，使得自体成纤维细胞较为均匀的聚集在待修复部位，自体成纤维细胞分泌的细胞因子均匀刺激小鼠自身的真皮层细胞的增殖和修复，并且获得支撑后的自体成纤维细胞的分泌功能得到了进一步强化。缺少透明质酸导致了上述效果的缺失。

对比例2制剂中缺少自体富血小板血浆，血小板的数量有小鼠自身提供，数量有限，凝血功能没有加入PRP的效果明显，但是有透明质酸和成纤维细胞的加入，后期皮肤恢复时间相比对比例4和5(只有单一的透明质酸或单一的成纤维细胞加入)的时间短很多。但是，相对于实施例1-3，本对比例的皮肤恢复时间和最后的皮肤恢复效果均较差，因为缺少PRP的作用，自体成纤维细胞的分泌效果不佳，不能促进小鼠自身的真皮层的成纤维细胞的增殖。所以透明质酸的使用以及透明质酸和自体成纤维细胞的联合使用，获得了预料不到的技术效果，通过增强自体成纤维细胞的分泌效果等，实现了减少皮肤恢复时间，皮肤恢复后表面更加平整光滑。

对比例3制剂中只有自体富血小板血浆，由于加入外部PRP，促进了凝血功能，结痂时间先比没有PRP的对照组要缩短很多，但是因为没有透明质酸和成纤维细胞后期作用，皮肤的恢复时间也相对较长。

对比例4制剂中只有透明质酸，透明质酸只具有支撑填充的作用，不具有受损皮肤修复的作用，依靠小鼠自身的血小板作用，小鼠受伤皮肤结痂时间较长，且后期皮肤恢复时间很长，皮肤出现感染出现轻微的炎症，恢复后皮肤颜色泛白，新长出的皮肤组织凸出，疤痕明显。

对比例5制剂中只有自体成纤维细胞，依靠小鼠自身的血小板作用，小鼠受伤皮肤结痂时间较长，自体成纤维细胞分泌细胞因子刺激小鼠真皮细胞生长，并且由于自体成纤维细胞生长增殖的影响，小鼠恢复后的皮肤表面存在不平整的现象，有些小鼠伤口处有疤痕残留。

对比例6的制剂中使用的自体成纤维细胞的制备方式和本方案不一致，导致细胞中的杂细胞比较多，纯化步骤较多，制剂虽然前期对小鼠受伤皮肤结痂效果明显，但是后期由于细胞的分化程度较高，分泌细胞因子较少，对后期的皮肤恢复作用较小，导致恢复时间也较长，皮肤的修复效果一般，出现皮肤不平整，轻微疤痕。

实验例2

将30名年龄在30-50岁之间的女性随机分为两组，实验组(15人)使用实施例1制备的美容抗衰制剂(注射量为1ml，患处皮下注射，浅皮层注射)，对照组(15人)注射常规的透明质酸(玻尿酸，Restylane，Q-Med AB)(注射量为1ml，患处皮下注射，浅皮层注射)，观察对眼角周围皱纹的修复效果，分别经过3天，7天，15天，1个月，2个月的回访，分别记录使用效果，结果如表2所示。

效果显著：眼周皱纹深度明显变浅或者消除，皱纹数量明显减少或者消失。

效果一般：眼周皱纹深度变浅，皱纹数量减少或者皱纹长度明显变短。

效果不显著：眼周皱纹深度无明显变化，皱纹数量无减少，皱纹长度轻微变短或无变化。

表2：实验例2结果

根据表2数据可知：对照组注射透明质酸后，1个月之前效果比较明显，但是一个月之后效果明显下降，两个月效果急剧下降只有20％的女性还有效果；实验组注射成纤维细胞联合PRP、透明质酸的美容抗衰制剂后，一个月前效果实验组和对照组无明显差距(P<0.5)，但是1～2个月之后实验组的效果几乎维持稳定，说明活性因子对面部细胞的修复效果显著，补充脸部细胞营养，维持和激活脸部成纤维细胞，是维持人脸部年轻化的重要因素。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种美容抗衰制剂，其特征在于，包括自体富血小板血浆、透明质酸和自体成纤维细胞。

2.根据权利要求1所述的一种美容抗衰制剂，其特征在于，自体富血小板血浆和透明质酸的体积比为(4-7):1，自体成纤维细胞的含量为3×10⁷-8×10⁷个/ml。

3.根据权利要求1或2所述的一种美容抗衰制剂的制备方法，其特征在于，包括自体成纤维细胞的制备，自体成纤维细胞的制备包括以下步骤：

步骤(1)：从皮肤组织中分离出真皮层；

步骤(2)：使用组织块贴壁法对真皮层进行原代培养，获得原代成纤维细胞；

步骤(3)：对原代成纤维细胞进行传代培养，获得的成纤维细胞。

4.根据权利要求3所述的一种美容抗衰制剂的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，从皮肤组织中分离出真皮层的方法为：将皮肤组织剪碎后用胰酶消化，然后用镊子去除表皮层，获得真皮层；或者用分散酶Ⅱ消化皮肤组织，然后用镊子去除表皮层，获得真皮层。

5.根据权利要求4所述的一种美容抗衰制剂的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，使用组织块贴壁法对真皮层进行原代培养的方法为：使用含有细胞因子的培养基浸润真皮层，然后将真皮层以底层向下的状态铺设在培养瓶底部；将铺设有真皮层的培养瓶放入培养箱中进行贴壁固定处理，然后在培养瓶中加入含有细胞因子的培养基，使得含有细胞因子的培养基液面与真皮层上表面齐平，然后进行过夜培养；次日在培养瓶中补充含有细胞因子的培养基继续进行细胞培养，获得原代成纤维细胞。

6.根据权利要求5所述的一种美容抗衰制剂的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，培养基中的细胞因子种类以及含量为：成纤维细胞生长因子80-120ng/ml、转化生长因子-β5-15ng/ml和胰岛素样生长因子-I 40-60ng/ml，所述培养基为间充质干细胞培养基。

7.根据权利要求6所述的一种美容抗衰制剂的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，真皮层在培养瓶中间隔铺设，将铺设有真皮层的培养瓶放入培养箱中进行贴壁固定处理的时长为1-2h。

8.根据权利要求3所述的一种美容抗衰制剂的制备方法，其特征在于，当步骤(2)中的原代成纤维细胞的细胞融合度达到50-80％时，进行步骤(3)，对原代成纤维细胞进行传代培养。

9.根据权利要求5所述的一种美容抗衰制剂的制备方法，其特征在于，在步骤(1)之前还包括预处理：对原始皮肤组织进行消毒灭菌处理后，除去附着在原始皮肤组织上的脂肪组织，获得皮肤组织。

10.根据权利要求3所述的一种美容抗衰制剂的制备方法，其特征在于，还包括自体富血小板血浆的制备，自体富血小板血浆的制备包括以下步骤：取静脉血，450g离心10min，静脉血分层后取上层液体，获得血浆；在20-24℃的条件下，对血浆进行3000g离心15min，将上层液体吸出，取下层血浆沉淀，获得自体富血小板血浆。