CN116407559A - 一种用于治疗卵巢早衰的制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于治疗卵巢早衰的制剂及其制备方法，该制剂包括以下质量份数的组分：富血小板血浆10‑25份、自体或异体胶原蛋白10‑25份、透明质酸1‑5份和钙离子激活剂1‑3份。本发明采用自体全血，通过离心分离纯化获得富血小板血浆，富血小板血浆被激活后，可以释放多种生长因子，将激活后富含多种生长因子的PRP靶向到人体卵巢中，诱导激活种子细胞，改善局部微环境，加速卵巢的自然愈合过程，促进卵巢的再生和修复，从而改善女性生育能力。
Description
技术领域
本发明属于卵巢修复技术领域，具体涉及一种用于治疗卵巢早衰的制剂及其制备方法。
背景技术
卵巢是女性重要的性腺器官，女性的生长、发育、生殖等均与卵巢功能和卵细胞的质量密切相关。卵巢早衰(POF)是指卵巢功能衰竭所导致的40岁之前即闭经的现象，特点是原发或继发闭经伴随血促性腺激素水平升高和雌激素水平降低，并伴有不同程度的一系列低雌激素症状如：潮热多汗、面部潮红、性欲低下等。随着社会发展，生活的压力和环境的污染，卵巢早衰的发病呈年轻化趋势，且发病率持续上升。卵巢早衰可能会导致女性闭经、不孕、肿瘤易发、骨质疏松、自主神经受到损伤、阴道分泌物减少、外阴萎缩、乳腺萎缩等，具体体现包括：
1.闭经：卵巢早衰可能会让雌性激素减少，导致体内黄体酮等元素变少，从而导致闭经。
2.不孕：卵巢早衰导致的闭经可能会使排卵受到一定的影响，导致不孕。
3.肿瘤易发：卵巢早衰可能会使女性提早进入更年期，更年期一般是肿瘤易发时期。
4.骨质疏松：卵巢早衰可能会让身材走样，随之而来的就是骨密度减少，骨骼变得脆弱。
5.自主神经受到损伤：如出现盗汗、潮热、性格不稳定等症状。
6.阴道分泌物减少：如出现阴道干涩、灼热疼痛、性欲减退等症状。
7.外阴萎缩：可能会导致皮肤表面出现裂口，造成排便困难、小便刺痛、性交困难等症状。
8.乳腺萎缩：可能会引起乳房出现下垂的现象。
卵巢早衰病因复杂，包括基于染色体或遗传的卵细胞减少，医源性药物引起的卵巢损伤，自身免疫引起功能失调等。鉴于卵巢早衰的发病因素多样化，尚无能够修复卵巢功能的明确有效方法。目前，卵巢早衰多采用激素治疗、免疫治疗、辅助生殖治疗和心理治疗等方法。但是，卵巢早衰病因复杂，常用的激素治疗甚至有致癌风险；免疫治疗副作用大，且效果不明显；辅助生殖治疗患者的接受度差；心理治疗疗效不确切，上述方法不能从根本上解决卵巢早衰造成的各种问题。
富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)是将全血通过离心获得的含高浓度血小板的血浆成分，富血小板血浆的血小板含量是正常人血浆血小板含量的3-4倍以上，并根据其中白细胞的含量分为富白细胞富血小板血浆和贫白细胞富血小板血浆。富血小板血浆富含多种生长因子，如血小板源性生长因子、转化生长因子-β3、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子等。这些生长因子具有促进伤口愈合、组织修复和再生的作用。富血小板血浆已经被广泛应用于骨缺损、软组织损伤修复、创面愈合、感染治疗、功能重建皮肤慢性溃疡等领域的研究和实验性治疗，已经成为再生医学研究领域的热点，目前未见富血小板血浆在治疗卵巢早衰方面的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于治疗卵巢早衰的制剂及其制备方法，用于解决现有技术中存在的上述问题。
为了实现上述目的，一方面，本发明采用以下技术方案：一种用于治疗卵巢早衰的制剂，包括以下质量份数的组分：富血小板血浆10～25份、自体或异体胶原蛋白10～25份、透明质酸1～5份和钙离子激活剂1～3份。
自体胶原蛋白具有极佳的生物相容性，应用于人体可被降解吸收，无任何排斥反应，无过敏反应，应用更加安全有效。由于异体胶原蛋白存在不确定风险，因此自体胶原蛋白的安全性高于异体胶原蛋白，但是其生产成本会更高。
作为上述技术方案的一种可选实施方式，所述制剂包括以下质量份数的组分：富血小板血浆15～20份、自体或异体胶原蛋白15～20份、透明质酸1～3份和钙离子激活剂1～3份。
作为上述技术方案的一种可选实施方式，所述制剂包括以下质量份数的组分：富血小板血浆15份、自体或异体胶原蛋白15份、透明质酸2份和钙离子激活剂1份。
作为上述技术方案的一种可选实施方式，所述钙离子激活剂为氯化钙。
另一方面，本发明采用以下技术方案：一种用于治疗卵巢早衰的制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤A，富血小板血浆的制备：采集人体静脉血，通过两次离心，弃掉上层血浆及下层红细胞，得到富血小板血浆；
步骤B，自体或异体胶原蛋白的制备；
步骤C，混合：将富血小板血浆、自体或异体胶原蛋白和钙离子激活剂混合均匀后，在富血小板血浆成胶之前注入多孔结构的透明质酸溶液中，获得具有缓释功能的凝胶制剂。
作为上述技术方案的一种可选实施方式，步骤A中，两次离心包括：将静脉血转移至离心管中，在2500rpm/min离心10min；弃掉下层红细胞，将剩余液体置于离心管中再次离心，3200rpm/min离心8min，弃掉上层血浆及下层红细胞，取中间层液体即得富血小板血浆。
作为上述技术方案的一种可选实施方式，步骤B中，自体胶原蛋白的制备包括：收集成纤维细胞，向成纤维细胞中加入细胞裂解液，充分裂解后离心分离得到第一上清液和沉淀物，利用蛋白酶对沉淀物进行酶解，酶解完成后离心分离得到第二上清液；将第一上清液、第二上清液加入NaCl溶液中混合均匀，然后离心分离得到自体胶原蛋白的原液。
作为上述技术方案的一种可选实施方式，所述透明质酸的制备包括：取适量透明质酸钠溶解于碱性水溶液中，然后加入交联剂，控制反应温度为40℃～50℃，反应时间为18h～22h，反应结束后，经过透析和冷冻干燥后得到交联的透明质酸。
作为上述技术方案的一种可选实施方式，所述冷冻干燥的时间为8～36h，冷冻干燥的温度为-80℃～-50℃。
作为上述技术方案的一种可选实施方式，所述交联剂为聚氨基酸类化学交联剂。
作为上述技术方案的一种可选实施方式，所述聚氨基酸类化学交联剂为聚谷氨酸。
本发明的有益效果为：
本发明采用自体全血，通过离心分离纯化获得富血小板血浆(含高浓度的血小板、白细胞和纤维蛋白)，富血小板血浆被激活后，可以释放多种生长因子(PDGF、TGF、IGF、VEGF、EGF等30余种)，将激活后富含多种生长因子的PRP靶向到人体卵巢中，诱导激活种子细胞，改善局部微环境，加速卵巢的自然愈合过程，促进卵巢的再生和修复，从而改善女性生育能力。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1
本实施例提供了一种用于治疗卵巢早衰的制剂，包括以下质量份数的组分：富血小板血浆10份、自体胶原蛋白10份、透明质酸1份和钙离子激活剂1份，所述钙离子激活剂为氯化钙。
富血小板血浆(PRP)中含有丰富的复合生长因子，而且各种生长因子的浓度和配比符合生理需求，能显著促进MSCs的增殖、分化和局部新生血管的形成。不过，富含血小板血浆激活后，超过90％预先合成的生长因子会在l小时内释放完毕，而生长因子半衰期短，体内容易被降解，无法在局部持续发挥促进血管生成的作用。皮肤修复过程的不同阶段需要不同种类的生长因子参与，而细胞在生长的不同阶段对各种生长因子种类和浓度的需求是不同的，因此单独应用富含血小板血浆或者干细胞均无法满足皮肤修复的全部条件，而目前对组织工程中生长因子的释放大多局限于单一种类和单一浓度，其结果往往差强人意，难以满足面部美容的需求。
自体胶原蛋白用于激活富血小板血浆，自体胶原蛋白富含von Willebrand因子，这种因子是调节胶原蛋白和血小板链接的重要物质，与凝血酶激活相比具有稳定缓慢释放生长因子的特点。PRP凝胶存在PRP释放速度快，导致凝胶较快的失效，从而影响修复效果，而且PRP在凝胶中分布不均匀导致同一批次的凝胶，修复效果不稳定，因此，本发明采用了透明质酸作为PRP的框架结构，可缓慢释放生长因子，提高修复效果。
该制剂的制备方法包括以下步骤：
步骤A，富血小板血浆的制备：采集人体静脉血，通过两次离心，弃掉上层血浆及下层红细胞，得到富血小板血浆；其中，两次离心包括：将静脉血转移至离心管中，在2500rpm/min离心10min；弃掉下层红细胞，将剩余液体置于离心管中再次离心，3200rpm/min离心8min，弃掉上层血浆及下层红细胞，取中间层液体即得富血小板血浆。
步骤B，自体胶原蛋白的制备，其具体包括：收集成纤维细胞，向成纤维细胞中加入细胞裂解液，充分裂解后离心分离得到第一上清液和沉淀物，利用蛋白酶对沉淀物进行酶解，酶解完成后离心分离得到第二上清液；将第一上清液、第二上清液加入NaCl溶液中混合均匀，然后离心分离得到自体胶原蛋白的原液。
步骤C，混合：将富血小板血浆、自体胶原蛋白和钙离子激活剂混合均匀后，在富血小板血浆成胶之前注入多孔结构的透明质酸溶液中，获得具有缓释功能的凝胶制剂。
其中，所述透明质酸的制备包括：取适量透明质酸钠溶解于碱性水溶液中，然后加入交联剂，控制反应温度为50℃，反应时间为22h，反应结束后，经过透析和冷冻干燥后得到交联的透明质酸。其中，所述冷冻干燥的时间为36h，冷冻干燥的温度为-80℃。所述交联剂为聚氨基酸类化学交联剂，优选地，所述聚氨基酸类化学交联剂为聚谷氨酸。
本发明采用自体全血，通过离心分离纯化获得富血小板血浆(含高浓度的血小板、白细胞和纤维蛋白)，富血小板血浆被激活后，可以释放多种生长因子(PDGF、TGF、IGF、VEGF、EGF等30余种)，将激活后富含多种生长因子的PRP靶向到人体卵巢中，诱导激活种子细胞，改善局部微环境，加速卵巢的自然愈合过程，促进卵巢的再生和修复，从而改善女性生育能力。
实施例2
本实施例提供了一种用于治疗卵巢早衰的制剂，包括以下质量份数的组分：富血小板血浆25份、自体胶原蛋白25份、透明质酸5份和钙离子激活剂3份，所述钙离子激活剂为氯化钙。
该制剂的制备方法包括以下步骤：
步骤A，富血小板血浆的制备：采集人体静脉血，通过两次离心，弃掉上层血浆及下层红细胞，得到富血小板血浆；其中，两次离心包括：将静脉血转移至离心管中，在2500rpm/min离心10min；弃掉下层红细胞，将剩余液体置于离心管中再次离心，3200rpm/min离心8min，弃掉上层血浆及下层红细胞，取中间层液体即得富血小板血浆。
步骤B，自体胶原蛋白的制备，其具体包括：收集成纤维细胞，向成纤维细胞中加入细胞裂解液，充分裂解后离心分离得到第一上清液和沉淀物，利用蛋白酶对沉淀物进行酶解，酶解完成后离心分离得到第二上清液；将第一上清液、第二上清液加入NaCl溶液中混合均匀，然后离心分离得到自体胶原蛋白的原液。
步骤C，混合：将富血小板血浆、自体胶原蛋白和钙离子激活剂混合均匀后，在富血小板血浆成胶之前注入多孔结构的透明质酸溶液中，获得具有缓释功能的凝胶制剂。
其中，所述透明质酸的制备包括：取适量透明质酸钠溶解于碱性水溶液中，然后加入交联剂，控制反应温度为40℃，反应时间为18h，反应结束后，经过透析和冷冻干燥后得到交联的透明质酸。其中，所述冷冻干燥的时间为8，冷冻干燥的温度为-50℃。所述交联剂为聚氨基酸类化学交联剂，优选地，所述聚氨基酸类化学交联剂为聚谷氨酸。
实施例3
本实施例提供了一种用于治疗卵巢早衰的制剂，包括以下质量份数的组分：富血小板血浆20份、自体胶原蛋白20份、透明质酸3份和钙离子激活剂3份，所述钙离子激活剂为氯化钙。
该制剂的制备方法包括以下步骤：
步骤A，富血小板血浆的制备：采集人体静脉血，通过两次离心，弃掉上层血浆及下层红细胞，得到富血小板血浆；其中，两次离心包括：将静脉血转移至离心管中，在2500rpm/min离心10min；弃掉下层红细胞，将剩余液体置于离心管中再次离心，3200rpm/min离心8min，弃掉上层血浆及下层红细胞，取中间层液体即得富血小板血浆。
步骤B，自体胶原蛋白的制备，其具体包括：收集成纤维细胞，向成纤维细胞中加入细胞裂解液，充分裂解后离心分离得到第一上清液和沉淀物，利用蛋白酶对沉淀物进行酶解，酶解完成后离心分离得到第二上清液；将第一上清液、第二上清液加入NaCl溶液中混合均匀，然后离心分离得到自体胶原蛋白的原液。
步骤C，混合：将富血小板血浆、自体胶原蛋白和钙离子激活剂混合均匀后，在富血小板血浆成胶之前注入多孔结构的透明质酸溶液中，获得具有缓释功能的凝胶制剂。
其中，所述透明质酸的制备包括：取适量透明质酸钠溶解于碱性水溶液中，然后加入交联剂，控制反应温度为45℃，反应时间为20h，反应结束后，经过透析和冷冻干燥后得到交联的透明质酸。其中，所述冷冻干燥的时间为24h，冷冻干燥的温度为-60℃。所述交联剂为聚氨基酸类化学交联剂，优选地，所述聚氨基酸类化学交联剂为聚谷氨酸。
实施例4
本实施例提供了一种用于治疗卵巢早衰的制剂，包括以下质量份数的组分：富血小板血浆15份、自体胶原蛋白15份、透明质酸2份和钙离子激活剂1份，所述钙离子激活剂为氯化钙。
该制剂的制备方法包括以下步骤：
步骤A，富血小板血浆的制备：采集人体静脉血，通过两次离心，弃掉上层血浆及下层红细胞，得到富血小板血浆；其中，两次离心包括：将静脉血转移至离心管中，在2500rpm/min离心10min；弃掉下层红细胞，将剩余液体置于离心管中再次离心，3200rpm/min离心8min，弃掉上层血浆及下层红细胞，取中间层液体即得富血小板血浆。
步骤B，自体胶原蛋白的制备，其具体包括：收集成纤维细胞，向成纤维细胞中加入细胞裂解液，充分裂解后离心分离得到第一上清液和沉淀物，利用蛋白酶对沉淀物进行酶解，酶解完成后离心分离得到第二上清液；将第一上清液、第二上清液加入NaCl溶液中混合均匀，然后离心分离得到自体胶原蛋白的原液。
步骤C，混合：将富血小板血浆、自体胶原蛋白和钙离子激活剂混合均匀后，在富血小板血浆成胶之前注入多孔结构的透明质酸溶液中，获得具有缓释功能的凝胶制剂。
其中，所述透明质酸的制备包括：取适量透明质酸钠溶解于碱性水溶液中，然后加入交联剂，控制反应温度为50℃，反应时间为22h，反应结束后，经过透析和冷冻干燥后得到交联的透明质酸。其中，所述冷冻干燥的时间为24h，冷冻干燥的温度为-80℃。所述交联剂为聚氨基酸类化学交联剂，优选地，所述聚氨基酸类化学交联剂为聚谷氨酸。
对比例1
一种用于治疗卵巢早衰的制剂，包括以下质量份数的组分：富血小板血浆15份、透明质酸3份和钙离子激活剂3份。
对比例2
一种用于治疗卵巢早衰的制剂，包括以下质量份数的组分：富血小板血浆15份、自体胶原蛋白15份和钙离子激活剂3份。
对比例3
一种用于治疗卵巢早衰的制剂，包括以下质量份数的组分：富血小板血浆15份、自体胶原蛋白15份和透明质酸3份。
对比例4
一种用于治疗卵巢早衰的制剂，包括以下质量份数的组分：富血小板血浆15份和钙离子激活剂3份。
为了进一步证明本发明的效果，提供了以下实验内容：
1、选用2～3月龄、体重200±20g、具有正常动情周期的雌性SD大鼠，适应性饲养1周后，随机分为10组，其中一组为正常对照组，一组为模型对照组，其余八组为模型实验组，分别对应实施例1-4、对比例1-4的制剂。
2.构建大鼠卵巢早衰模型：除正常对照组外，对模型对照组和模型实验组一次性腹腔注射环磷酰胺溶液(120mg/kg)和白消安溶液(12mg/kg)各0.1mL，每日用棉签轻取阴道分泌物涂片，再巴氏染色，观察阴道脱落细胞变化，当连续10d观测到持续动情间期，视为卵巢早衰建模成功，造模成功后，用微量注射器分别对模型实验组的大鼠注射实施例1-4、对比例1-4的制剂，正常对照组和模型对照组注射等量生理盐水，注射剂量为20μL/g大鼠体重，每日1次，连续14d。
3.末次给药24h后，腹主动脉取血，3000rpm离心10分钟，分离血清，测定血清中促卵泡生成激素(FSH)、促黄体生成激素(LH)和雌二醇(E2)水平；处死大鼠后，解剖，取卵巢，称重，将卵巢置于10％甲醛中固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，常规HE染色，然后置于光学显微镜下观察。
实验结果如下：
表1本发明制剂对大鼠血清性激素的影响
| 组别 | FSH(mIU/mL) | LH(mIU/mL) | E2(pg/mL) |
| 正常对照组 | 8.56±0.22** | 2.20±0.04* | 140.15±0.92** |
| 模型对照组 | 22.85±0.25 | 3.45±0.15 | 90.25±0.55 |
| 实施例1 | 14.68±0.13** | 2.56±0.02* | 109.55±0.36** |
| 实施例2 | 11.62±0.27** | 2.34±0.24* | 126.45±0.14** |
| 实施例3 | 12.65±0.26** | 2.42±0.17* | 115.65±0.73** |
| 实施例4 | 9.78±0.24** | 2.21±0.05* | 135.15±0.92** |
| 对比例1 | 16.73±0.18** | 2.79±0.63* | 101.27±0.63** |
| 对比例2 | 18.76±0.54** | 2.91±0.07* | 96.16±0.84** |
| 对比例3 | 16.71±0.76** | 2.58±0.74* | 105.46±0.35** |
| 对比例4 | 20.82±0.29** | 3.23±0.25* | 91.59±0.38** |
注：与模型对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01，下表同。
表2本发明制剂对大鼠卵泡发育的影响
由此可知，实施例1-实施例4中血清FSH、LH水平较模型对照组显著降低，E2水平较模型对照组明显增加，并且实施例1-实施例4中FSH、LH水平低于对比例1-对比例4中FSH、LH水平，实施例1-实施例4中E2水平高于对比例1-对比例4中E2水平，此外，实施例4中血清FSH、LH和E2水平接近正常对照组，说明本发明的制剂可显著降低血清中FSH水平、LH水平，并显著升高E2水平，可调节紊乱的性激素，使其趋向于正常水平。
实施例1-实施例4中动物各级卵泡数量较模型对照组有不同程度增多，卵泡生长活跃，成熟卵泡增多，卵泡发育良好，实施例4最为明显，且接近正常对照组，说明本发明的制剂对卵巢早衰大鼠卵泡发育和卵巢修复具有促进功能，使卵巢的内分泌功能得到了恢复，从而有效治疗卵巢早衰。
本申请的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本申请范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
在本申请中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上”和“下”。另外，在本申请说明书的描述中，术语“包括”“包含”等是指“包括但不限于”。在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。在本文中，“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。在本文中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“至少一种”、“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种用于治疗卵巢早衰的制剂，其特征在于，包括以下质量份数的组分：富血小板血浆10～25份、自体或异体胶原蛋白10～25份、透明质酸1～5份和钙离子激活剂1～3份。
2.根据权利要求1所述的用于治疗卵巢早衰的制剂，其特征在于，所述制剂包括以下质量份数的组分：富血小板血浆15～20份、自体或异体胶原蛋白15～20份、透明质酸1～3份和钙离子激活剂1～3份。
3.根据权利要求2所述的用于治疗卵巢早衰的制剂，其特征在于，所述制剂包括以下质量份数的组分：富血小板血浆15份、自体或异体胶原蛋白15份、透明质酸2份和钙离子激活剂1份。
4.根据权利要求1所述的用于治疗卵巢早衰的制剂，其特征在于，所述钙离子激活剂为氯化钙。
5.一种用于治疗卵巢早衰的制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A，富血小板血浆的制备：采集人体静脉血，通过两次离心，弃掉上层血浆及下层红细胞，得到富血小板血浆；
步骤B，自体或异体胶原蛋白的制备；
步骤C，混合：将富血小板血浆、自体或异体胶原蛋白和钙离子激活剂混合均匀后，在富血小板血浆成胶之前注入多孔结构的透明质酸溶液中，获得具有缓释功能的凝胶制剂。
6.根据权利要求5所述的用于治疗卵巢早衰的制剂的制备方法，其特征在于，步骤A中，两次离心包括：将静脉血转移至离心管中，在2500rpm/min离心10min；弃掉下层红细胞，将剩余液体置于离心管中再次离心，3200rpm/min离心8min，弃掉上层血浆及下层红细胞，取中间层液体即得富血小板血浆。
7.根据权利要求6所述的用于治疗卵巢早衰的制剂的制备方法，其特征在于，步骤B中，自体胶原蛋白的制备包括：收集成纤维细胞，向成纤维细胞中加入细胞裂解液，充分裂解后离心分离得到第一上清液和沉淀物，利用蛋白酶对沉淀物进行酶解，酶解完成后离心分离得到第二上清液；将第一上清液、第二上清液加入NaCl溶液中混合均匀，然后离心分离得到自体胶原蛋白的原液。
8.根据权利要求7所述的用于治疗卵巢早衰的制剂的制备方法，其特征在于，所述透明质酸的制备包括：取适量透明质酸钠溶解于碱性水溶液中，然后加入交联剂，控制反应温度为40℃～50℃，反应时间为18h～22h，反应结束后，经过透析和冷冻干燥后得到交联的透明质酸。
9.根据权利要求8所述的用于治疗卵巢早衰的制剂的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的时间为8～36h，冷冻干燥的温度为-80℃～-50℃。
10.根据权利要求8所述的用于治疗卵巢早衰的制剂的制备方法，其特征在于，所述交联剂为聚氨基酸类化学交联剂；所述聚氨基酸类化学交联剂为聚谷氨酸。
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