DE112017005025T5

DE112017005025T5 - Zusammensetzungen, enthaltend einstellbare Konzentrationen von Wachstumsfaktoren aus Blutsserum und Gerinnsel-Hypoxie-konditioniertem Medium und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE112017005025T5
Application number: DE112017005025.1T
Authority: DE
Inventors: Sarah Isenburg; Constance Neuhann-Lorenz
Original assignee: Cultema GmbH
Current assignee: Cultema GmbH
Priority date: 2016-10-04
Filing date: 2017-10-04
Publication date: 2020-05-28
Also published as: US20190290690A1; EP3305306A1; WO2018065092A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Idee, eine Wunde extrakorporal zu simulieren, um wundheilende/regenerative Wachstumsfaktor-Mischungen zu erhalten. Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Trennen der Wachstumsfaktoren bereit, die aus Zellen nach der der Koagulation (koagulationsinduzierte Signalphase) freigesetzt werden, von den Wachstumsfaktoren, die von Zellen unter Hypoxie (hypoxieinduzierte Signalphase) sekretiert werden, gefolgt von Mischen der beiden Phasen bei definierten Verhältnissen, um eine neue Zusammensetzung zu erhalten. Peripheres Blut wird gewonnen und gerinnenlassen oder zentrifugiert, um eine Gerinnung zu induzieren. Das Serum wird vollständig oder teilweise entfernt und durch frisches Medium mit einem Volumen ersetzt, das dem Volumen des entfernten Serums entspricht oder darunter liegt. Das Gerinnsel wird in frischem Medium bei einer Temperatur von 10 bis 40 °C unter Hypoxie (1 bis 10 % O) für 1 bis 7 Tage inkubiert. Das Gerinnsel-konditionierte Medium wird dann gesammelt und mit dem Serum in einem definierten Verhältnis gemischt, um die Zusammensetzung zu erhalten. Zusammensetzungen, die einstellbare Konzentrationen von Wachstumsfaktoren umfassen, die aus Blutserum (koagulationsinduzierte Phase) und Gerinnsel-konditioniertem Medium (hypoxieinduzierte Phase) stammen, können geeigneten Trägern zugesetzt werden und können topisch appliziert oder einem Subjekt injiziert werden, um die Wundheilung, Hautregeneration oder Verjüngung zu unterstützen.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die aus Blut und Blutserum hergestellt werden. Die Zusammensetzungen enthalten definierte und einstellbare Konzentrationen an Wachstumsfaktoren. Die Erfindung betrifft auch therapeutische und kosmetische Verfahren, worin diese Zusammensetzungen verwendet werden. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren und Kits zur Herstellung dieser Zusammensetzungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine Blutgerinnung ist unmittelbar nach einer Verletzung erforderlich, um übermäßige Blutungen zu vermeiden. In diesem Stadium wäre der Beginn der Bildung neuer Blutgefäße (Angiogenese) logisch kontraproduktiv, da neugebildete Gefäße fragil und instabil sind. Hämostase und Angiogenese sind daher zwei streng kontrollierte Prozesse, was sicherstellt, dass die Angiogenese erst ausgelöst wird, wenn die Hämostase abgeschlossen ist. Dies ist offensichtlich während der Wundheilung, wo die Angiogenese erst drei Tage nach der Verletzung beginnt. Diese zeitliche Regulierung der hämostatischen und angiogenetischen Phasen wird durch die räumlich-zeitlich kontrollierte Freisetzung von Proteinwachstumsfaktoren durch Zellen in die Mikroumgebung der Wunde erreicht.
Nach der Aktivierung der Koagulation schließt das Fibringerinnsel Blutplättchen an der Verletzungsstelle ein und bildet einen hämostatischen Pfropfen, der allmählich durch kapillarreiches Granulationsgewebe und schließlich Kollagen ersetzt wird, was zur Wiederherstellung der ursprünglichen extrazellulären Matrix führt (Reinke JM, Sorg H. Wound repair and regeneration. Eur Surg Res 2012; 49(1):35-43). Die Gerinnselhypoxie potenziert die Blutplättchen-abgeleitete pro-angiogene Signalübertragung, die durch Gerinnung erzeugt wird. Die Blutplättchenaktivierung und -freisetzung von Faktoren, die in ihren Granulaten gespeichert sind, wurde als Strategie zur Erzielung angiogener Zusammensetzungen auf der Basis von Blutplättchenkonzentraten wie blutplättchenreichem Plasma (PRP) und PRP-Gel/blutplättchenreicher Fibrinmatrix (PRFM) verwendet. Zusätzlich zu pro-angiogenen Mediatoren sind jedoch bestimmte Faktoren, die durch Blutplättchen freigesetzt werden (z.B. PF-4, TSP-1), stark anti-angiogen. Solche Faktoren spielen sicherlich eine wichtige Rolle bei der oben genannten natürlichen Regulation der hämostatischen und angiogenen Phasen während der Wundheilung. Wenn sie im Überschuss vorhanden sind (d.h. bei supraphysiologischen Konzentrationen, wie sie in Thrombozytenkonzentraten gefunden werden), können diese Faktoren jedoch die angiogenetische Wirksamkeit von blutplättchenreichen Produkten negativ beeinflussen, indem sie mit pro-angiogenen Faktoren konkurrieren oder die Wirkung aufheben. Dies könnte den eingeschränkten Erfolg von PRP-Produkten als chronische Wundtherapien erklären.
Hypoxie ist der primäre angiogenetische Reiz in physiologischen und pathologischen Prozessen. Die Ansammlung von Zellen im reifenden Wundbett oder in einem wachsenden Thrombus verschlimmert die bereits beeinträchtigte O₂-Versorgung, indem die lokale aerobe Bedarf erhöht wird. Die zellvermittelte hypoxische Konditionierung der hämostastischen Mikroumgebung führt zu einer hochregulierten Expression einer Reihe angiogenetischer Wachstumsfaktoren wie VEGF, ANG, IL8, MMP-9, die von Zellen sekretiert werden. Dieser Effekt könnte durch die gleichzeitige Hypoxie-induzierte Herunterregulierung bei der Expression von anti-angiogenen Faktoren wie Thrombospondin 1 (TSP1) weiter verstärkt werden.
Eine hypoxische Vorkonditionierung von Zellen in vitro wurde als vielversprechende Strategie zur Erzeugung komplexer, jedoch physiologischer angiogener Faktor-Proteinmischungen vorgeschlagen, die in ischämische Gewebe (z.B. Wunden, Geschwüre, Verbrennungen) eingebracht werden können, um die Wiederdurchblutung, Reparatur und Regeneration zu unterstützen. Unter den verschiedenen Zelltypen, die für eine hypoxische Stressstimulation geeignet sind, stellen periphere Blutzellen (PBCs) einen idealen autologen Zelltyp dar, da ihre leichte Ernte und ausreichende Verfügbarkeit bedeutet, dass der Bedarf für längere Zellpopulationsexpansionszyklen umgangen wird, die beispielsweise erforderlich sind, wenn durch eine Biopsie entnommene Hautfibroblasten verwendet werden. PBCs können daher direkt kultiviert werden, nachdem sie vom Patienten erhalten wurden. Frühere Studien haben gezeigt, dass periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) auf Stress (z.B. Hypoxie/Ischämie, Entzündung) reagieren, indem sie einen breiten Bereich angiogenetischer Wachstumsfaktoren wie VEGF, bFGF, IL-8, MMP-9 hochregulieren und die Fähigkeit haben, in vitro und in vivo eine Angiogenese zu induzieren. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass die Präkonditionierung von PBMCs gegenüber Hypoxie ihr Überleben und die angiogenetische Potenz bei der Implantation in ischämische Hinterbeine von Mäusen erhöht. Auch verleiht eine intravenöse Verabreichung eines Kulturüberstands von bestrahlten apoptotischen PBMCs Kardiomyozyten Cytoprotektion und inhibiert die Geweberemodellierung bei akutem Myokardinfarkt (AMI) von Ratten und Schweinen, während PBMC-Überstand enthaltende Emulsionen den Wundverschluss verstärken. In verschiedenen Patientenstudien wurde gezeigt, dass die Transplantation autologer peripherer mononukleärer Zellen aus periperem Blut oder Knochenmark die Beinperfusion bei kritischer Extremitätenischämie erhöht, die Herzfunktion nach AMI verbessert und die Heilung refraktärer Hautgeschwüre beschleunigt. Diese Ergebnisse liefern einen starken Hinweis dafür, dass peripheres Blut eine geeignete Quelle für angiogenetische Faktoren produzierende Zellen ist.
Konditionierte Kulturmedien, die Proteinwachstumsfaktoren enthalten, die von Zellen sekretiert werden, die unter Normoxie oder Hypoxie kultiviert werden, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und wurden als geeignete Zusammensetzungen zum Induzieren von Gewebereparatur und -regeneration vorgeschlagen. Hypoxie-konditioniertes Plasma, d.h. Plasma, das nach extrakorporaler Konditionierung von antikoaguliertem Blut unter physiologischer Temperatur (37 °C) und physiologischer Hypoxie (1 bis 10 % O₂) gewonnen wird, stellt eine besondere Form von konditioniertem Kulturmedium dar, indem seine Zusammensetzung (Konzentrationen und Verhältnisse von Faktoren) stöchiometrisch (d.h. genau) durch den Typ und die Anzahl/Zahl der peripheren Blutzellen des Patienten definiert wird, im Gegensatz zu konditionierten Medien, die typischerweise durch rekonstituierte Kulturverfahren ex vivo/in vitro erhalten werden. Dies bietet einen wichtigen Vorteil bei der Betrachtung der interindividuellen Variation hinsichtlich der Genexpression und der durch Wachstumsfaktoren induzierten zellulären Reaktionen und bildet die Grundlage für die Verwendung als autologe Therapie.
TECHNISCHE PROBLEME, DIE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG ZUGRUNDELIEGEN
Wie bereits erwähnt, unterscheidet sich der Beginn der Hypoxie-induzierten Angiogenese während der Wundheilung zeitlich von der frühen Entzündungsphase, in der die Blutplättchen hauptsächlich an der Hämostase beteiligt sind (die Angiogenese wird typischerweise 3 bis 4 Tage nach der Verwundung induziert) (Reinke & Sorg, 2012, supra). Während Thrombozyten eher eine regulatorische Rolle als eine direkt stimulierende Rolle bei der Gefäßneubildung spielen können, ist ihr Beitrag zur Initiierung, zur Fortführung und zum Abschluss des Wundheilungsprozesses selbstverständlich. Eine Schlüsselvoraussetzung dieser Erfindung ist, dass eine optimale Wundheilungszusammensetzung sowohl die durch Koagulation induzierte als auch die durch Hypoxie induzierte Wachstumsfaktor-Signalgebungsphasen umfassen sollte. Diese beiden Phasen treten in der Natur sequenziell auf, d.h. die koagulationsvermittelte Phase wird unmittelbar nach/kurz nach der Verletzung durch Freisetzung von Wachstumsfaktoren durch aktivierte Blutplättchen induziert, gefolgt von der Induktion der hypoxievermittelten Phase, die von der Wachstumsfaktorproduktion durch Blutzellen und anderen Zellen abhängt, die in der Wunde vorhanden sind oder in diese wandern. Zuvor beschriebene Verfahren zur Herstellung konditionierter Kulturmedien, einschließlich Zusammensetzungen, die konditionierte Blutprodukte umfassen, bieten jedoch keine Möglichkeit, diese beiden Phasen zu trennen, da alle Faktoren in dasselbe (Kultur-) Medium (z.B. konditioniertes Plasma oder konditioniertes Serum) freigesetzt werden. Man erhält daher eine kumulative Mischung, die alle erforderlichen Wachstumsfaktoren enthält, ihre Konzentrationen und Verhältnisse können jedoch weder kontrolliert/eingestellt werden noch korrelieren sie mit den Konzentrationen/Verhältnissen, bei denen diese Faktoren mit einer natürlichen Wunde fortschreitend angetroffen werden.
Diese Erfindung löst dieses Problem, indem ein Verfahren bereitgestellt wird, um zuerst die zwei Phasen zu trennen, um sie dann in definierten Verhältnissen mischen zu können, um maßgeschneiderte Zusammensetzungen zu erhalten, die schließlich die natürliche sequentielle Expression der zwei Wundheilungsphasen rekapitulieren können. Die Erfindung löst dieses Problem weiter, indem ein Kit-of-Parts bereitgestellt wird, das die zwei Phasen in getrennten Behältern umfasst, und ein Kit zum Herstellen und Trennen der zwei Phasen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit-of-Parts, umfassend:

(a) ein Hypoxie-konditioniertes Medium, das aus Blut stammt; und
(b) ein Serum

In einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Lösung von Wachstumsfaktoren, die eine Mischung umfasst aus:

(a) einem Hypoxie-konditionierten Medium, das aus Blut stammt; und
(b) einem Serum.

In einem dritten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Kit-of-Parts, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(i) Bereitstellen einer Blutprobe von einem Subjekt;
(ii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (i) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (i), wodurch eine Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst;
(iii) Entfernen von wenigstens einem Teil des Serums aus der in Schritt (ii) erhaltenen Zusammensetzung und Bestimmen des Volumens des entfernten Serums;
(iv) Hinzufügen eines Mediums zu dem Blutgerinnsel, wobei das Volumen des hinzugefügten Mediums gleich oder kleiner als das Volumen des in Schritt (iii) entfernten Serums ist,
(v) Inkubieren des Gerinnsels in dem Medium bei einer Temperatur zwischen 10 °C und 40 °C unter hypoxischen Bedingungen für 1 bis 7 Tage, wodurch ein Hypoxie-konditioniertes Medium erhalten wird;
(vi) Sammeln von wenigstens einem Teil des in Schritt (v) erhaltenen Hypoxie-konditionierten Mediums; und
(vii) Herstellen eines Kit-of-Parts, umfassend:
1. (a) das in Schritt (vi) gesammelte Hypoxie-konditionierte Medium und
2. (b) wenigstens ein Teil des in Schritt (iii) entfernten Serums.

In einem vierten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Lösung von Wachstumsfaktoren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(i) Bereitstellen einer Blutprobe von einem Subjekt;
(ii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (i) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (i), wodurch eine Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst;
(iii) Entfernen von wenigstens einem Teil des Serums aus der in Schritt (ii) erhaltenen Zusammensetzung und Bestimmen des Volumens des entfernten Serums;
(iv) Hinzufügen eines Mediums zu dem Blutgerinnsel, wobei das Volumen des hinzugefügten Mediums gleich oder kleiner als das Volumen des in Schritt (iii) entfernten Serums ist,
(v) Inkubieren des Gerinnsels in dem Medium bei einer Temperatur zwischen 10 °C und 40 °C unter hypoxischen Bedingungen für 1 bis 7 Tage, wodurch ein Hypoxie-konditioniertes Medium erhalten wird;
(vi) Sammeln von wenigstens einem Teil des in Schritt (v) erhaltenen Hypoxie-konditionierten Mediums;
(vii) Mischen des in Schritt (vi) gesammelten Hypoxie-konditionierten Mediums mit wenigstens einem Teil des in Schritt (iii) entfernten Serums, wodurch die Lösung von Wachstumsfaktoren erhalten wird.

In einem fünften Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Kit-of-Parts, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(i) Bereitstellen einer ersten Blutprobe von einem Subjekt;
(ii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (i) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (i), wodurch eine erste Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst;
(iii) Entfernen von wenigstens einem Teil des Serums aus der ersten in Schritt (ii) erhaltenen Zusammensetzung und Bestimmen des Volumens des entfernten Serums;
(iv) Hinzufügen eines Mediums zu dem Blutgerinnsel, wobei das Volumen des hinzugefügten Mediums gleich oder kleiner als das Volumen des in Schritt (iii) entfernten Serums ist,
(v) Inkubieren des Gerinnsels in dem Medium bei einer Temperatur zwischen 10 °C und 40 °C unter hypoxischen Bedingungen für 1 bis 7 Tage, wodurch ein Hypoxie-konditioniertes Medium erhalten wird;
(vi) Sammeln von wenigstens einem Teil des in Schritt (v) erhaltenen Hypoxie-konditionierten Mediums;
(vii) Bereitstellen einer zweiten Blutprobe von einem Subjekt;
(viii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (vii) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (vii), wodurch eine zweite Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst;
(ix) Gewinnen wenigstens eines Teils des Serums aus der in Schritt (viii) erhaltenen zweiten Zusammensetzung; und
(x) Herstellen eines Kit-of-Parts, umfassend:
1. (a) das in Schritt (vi) gesammelte Hypoxie-konditionierte Medium und
2. (b) das in Schritt (ix) gewonnene Serum.

In einem sechsten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Lösung von Wachstumsfaktoren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(i) Bereitstellen einer ersten Blutprobe von einem Subjekt;
(ii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (i) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (i), wodurch eine erste Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst;
(iii) Entfernen von wenigstens einem Teil des Serums aus der ersten in Schritt (ii) erhaltenen Zusammensetzung und Bestimmen des Volumens des entfernten Serums;
(iv) Hinzufügen eines Mediums zu dem Blutgerinnsel, wobei das Volumen des hinzugefügten Mediums gleich oder kleiner als das Volumen des in Schritt (iii) entfernten Serums ist,
(v) Inkubieren des Gerinnsels in dem Medium bei einer Temperatur zwischen 10 °C und 40 °C unter hypoxischen Bedingungen für 1 bis 7 Tage, wodurch ein Hypoxie-konditioniertes Medium erhalten wird;
(vi) Sammeln von wenigstens einem Teil des in Schritt (v) erhaltenen Hypoxie-konditionierten Mediums;
(vii) Bereitstellen einer zweiten Blutprobe von einem Subjekt;
(viii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (vii) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (vii), wodurch eine zweite Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst;
(ix) Gewinnen von wenigstens einem Teil des Serums aus der in Schritt (viii) erhaltenen zweiten Zusammensetzung, wodurch ein Serum erhalten wird; und
(x) Mischen des in Schritt (vi) gesammelten Hypoxie-konditionierten Mediums mit wenigstens einem Teil des in Schritt (ix) gewonnenen Serums, wodurch die Lösung von Wachstumsfaktoren erhalten wird.

In einem siebten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit-of-Parts, das durch das Verfahren des dritten oder fünften Aspekts hergestellt wird.
In einem achten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Lösung von Wachstumsfaktoren, die durch das Verfahren des vierten oder sechsten Aspekts hergestellt werden.
In einem neunten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend:

(a) die Lösung des zweiten oder des achten Aspekts; und
(b) einen Träger.

In einem zehnten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Lösung des zweiten Aspekts oder des achten Aspekts oder eine Zusammensetzung des neunten Aspekts zur Verwendung in der Medizin.
In einem elften Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Lösung des zweiten Aspekts oder des achten Aspekts oder eine Zusammensetzung des neunten Aspekts zur Verwendung bei der Verbesserung der Gewebeblutperfusion, zur Verwendung bei der Stimulation der Angiogenese, zur Verwendung bei der Behandlung von Haut, die debridiert wurde, zur Verwendung bei der Behandlung von übermäßiger Narbenbildung, zur Verwendung bei der Behandlung von Transplantaten, zur Verwendung bei der Behandlung von Klappen, zur Verwendung bei der Behandlung von Wunden und/oder zur Verwendung bei der Behandlung von Gewebeschäden.
In einem zwölften Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine kosmetische, nichttherapeutische Verwendung der Lösung des zweiten Aspekts oder des achten Aspekts oder der Zusammensetzung des neunten Aspekts.
In einem dreizehnten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zur Herstellung von aus Blut gewonnenem Serum und/oder Hypoxie-konditioniertem Medium, wobei der Kit umfasst:

(a) eine erste Spritze,
(b) eine zweite Spritze,
(c) gegebenenfalls eine dritte Spritze,
(d) gegebenenfalls eine vierte Spritze,
(e) ein Dreiwegeventil,
(f) ein Filter,
(g) eine Kappe,
(h) gegebenenfalls einen Behälter, der steriles Medium enthält,
(i) gegebenenfalls eines Katheters oder einer Schmetterlingskanüle,
(j) gegebenenfalls ein Heftpflaster,
(k) gegebenenfalls ein Gestell, in das die erste Spritze aufgerichtet platziert und gehalten werden kann, und
(l) gegebenenfalls einen Spatel.

In einem vierzehnten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Verwendung des Kits des dreizehnten Aspekts in einem Verfahren nach einem der dritten, vierten, fünften oder sechsten Aspekte.
Diese Zusammenfassung der Erfindung beschreibt nicht notwendigerweise alle Merkmale der vorliegenden Erfindung. Andere Ausführungsformen werden aus einem Studium der folgenden ausführlichen Beschreibung ersichtlich.
Figurenliste

1: Serumseparation. Nachdem sich in der ersten Spritze (auf der linken Seite der Fotografie gezeigt) ein Gerinnsel gebildet hat, wird das Serum in die zweite Spritze (in der Fotografie oben gezeigt) abgezogen.
2: Zugabe von Luft und Medium. Ein Filter wurde mit dem Dreiwegeventil verbunden.

Luft wurde durch den Filter in die erste Spritze gesaugt. Dann wurde der Filter mit einer Kappe abgedeckt. Eine dritte mit sterilem Medium gefüllte Spritze wurde mit dem Dreiwegeventil verbunden. Dies ist die auf dem Foto gezeigte Situation. Als Nächstes wird das Dreiwegeventil so gedreht, dass die Verbindung zum Filter blockiert wird und die erste Spritze und die dritte Spritze verbunden werden. Das Medium wird von der dritten Spritze in die erste Spritze gedrückt.
3: Sammlung neuer Mischung (konditioniertes Medium und Serum). Der Filter wurde entfernt und eine vierte leere Spritze wurde am Dreiwegeventil befestigt. Die zweite Spritze, die das Serum enthielt, wurde wieder mit dem Dreiwegeventil verbunden. Konditioniertes Medium aus der ersten Spritze wurde in die vierte Spritze gedrückt. Das Dreiventil wurde so gedreht, dass die erste Spritze blockiert ist und die zweite Spritze und die vierte Spritze miteinander verbunden sind. Dies ist die auf dem Foto gezeigte Situation. Als nächstes wird Serum in die vierte Spritze gedrückt, wodurch eine Mischung aus konditioniertem Medium und Serum entsteht.
AUSFÜRHLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Bevor die vorliegende Erfindung nachstehend ausführlich beschrieben wird, versteht es sich, dass diese Erfindung nicht auf die hier beschriebenen speziellen Verfahren, Protokolle und Reagenzien beschränkt ist, da diese variieren können. Es versteht sich auch, dass die hierin verwendete Terminologie nur zum Zweck der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und nicht den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken soll, der nur durch die beigefügten Ansprüche begrenzt ist. Wenn nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleichen Bedeutungen, wie sie üblicherweise von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird.
Die hier verwendeten Begriffe sind bevorzugt wie in „A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)“, Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. und Kölbl, H. Hrsg. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Schweiz) beschrieben.
In der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen, die folgen, versteht sich, dass das Wort „umfassen“ und Variationen, wie „umfasst“ und „umfassend“, sofern der Kontext nichts anderes erfordert, einen angegebenen Bestandteil, ganze Zahl oder einen Schritt oder eine Gruppe von Bestandteilen, ganzen Zahlen oder Schritten einbezieht, jedoch einen anderen Bestandteil, ganze Zahl oder Schritt oder eine Gruppe von Bestandteilen, ganzen Zahlen oder Schritten nicht ausschließt.
Verschiedene Dokumente (zum Beispiel: Patente, Patentanmeldungen, wissenschaftliche Veröffentlichungen, Herstellerangaben, Anweisungen usw.) werden im gesamten Text dieser Beschreibung zitiert. Nichts hierin soll als ein Zugeständnis verstanden werden, dass die Erfindung nicht berechtigt ist, eine solche Offenbarung aufgrund einer früheren Erfindung vorwegzunehmen. Einige der hier zitierten Dokumente sind dadurch gekennzeichnet, dass sie „durch Bezugnahme eingeschlossen sind“. Im Falle eines Konflikts zwischen den Definitionen oder Lehren solcher einbezogenen Verweise und Definitionen oder Lehren, die in der vorliegenden Beschreibung zitiert werden, hat der Text der vorliegenden Beschreibung Vorrang.
Wie hierin verwendet, beziehen sich „hypoxische Zustände“ auf Sauerstoffkonzentrationen von 10 % oder weniger.
Wie hier verwendet, bezieht sich ein „Hypoxie-konditioniertes Medium“ auf eine Lösung, die durch Inkubieren eines Blutgerinnsels in einer Lösung unter hypoxischen Bedingungen für eine bestimmte Zeitdauer und durch anschließendes Entfernen des Blutgerinnsels aus der Lösung erhältlich ist. Typischerweise ist die Lösung ein Medium, das zur Kultivierung von Blutzellen geeignet ist. Typischerweise wird die Inkubation unter hypoxischen Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 10 °C und 40 °C für 1 bis 7 Tage durchgeführt. Unter diesen Bedingungen sekretieren die im Blutgerinnsel vorhandenen Zellen bestimmte Wachstumsfaktoren in die Lösung. Dementsprechend enthält das „Hypoxie-konditionierte Medium“ Wachstumsfaktoren, die von den im Blutgerinnsel vorhandenen Zellen produziert werden. Die Ausdrücke „Hypoxie-konditioniertes Medium“, „Gerinnsel-konditioniertes Medium“ und „Gerinnsel-Hypoxie-konditioniertes Medium“ werden hierin austauschbar verwendet.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Serum“ auf eine Blutfraktion, die frei von Blutzellen und Gerinnungsfaktoren ist. Typischerweise kann Serum durch Zentrifugieren einer koagulierten Blutprobe erhalten werden.
Ausführungsformen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird nun weiter beschrieben. In den folgenden Abschnitten werden verschiedene Aspekte der Erfindung ausführlicher definiert. Jeder nachstehend definierte Aspekt kann mit einem anderen Aspekt oder Aspekten kombiniert werden, sofern nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist. Insbesondere kann jedes Merkmal, das als bevorzugt oder vorteilhaft angegeben ist, mit einem beliebigen anderen Merkmal oder Merkmalen kombiniert werden, die als bevorzugt oder vorteilhaft angegeben sind.
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit-of-Parts, umfassend: (a) ein Hypoxie-konditioniertes Medium, das aus Blut stammt; und (b) ein Serum in getrennten Behältern.
In einem zweiten Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf eine Lösung von Wachstumsfaktoren gerichtet, umfassend eine Mischung aus (a) einem Hypoxie-konditionierten Medium, das aus Blut stammt; und (b) einem Serum.
In einigen Ausführungsformen des ersten Aspekts oder des zweiten Aspekts wird das Hypoxie-konditionierte Medium aus Vollblut gewonnen.
In einigen Ausführungsformen des ersten Aspekts oder des zweiten Aspekts weist das Hypoxie-konditionierte Medium eine geringere Konzentration an Plättchenfaktor 4 (PF4) als das Serum auf. In bevorzugten Ausführungsformen des ersten Aspekts oder des zweiten Aspekts enthält das Hypoxie-konditionierte Medium PF4 in einer Konzentration zwischen 0 ng/ml und 15.000 ng/ml, bevorzugt zwischen 5 ng/ml und 5.000 ng/ml.
In einigen Ausführungsformen des ersten Aspekts oder des zweiten Aspekts enthält das Hypoxie-konditionierte Medium wenigstens einen Angiogenese-bezogenen Wachstumsfaktor, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus VEGF, TSP1, IL8, Angiogenin (ANG), MMP-9, MMP-8, TIMP-1 und PDGF.
In einigen Ausführungsformen des ersten Aspekts oder des zweiten Aspekts weist das Hypoxie-konditionierte Medium eine höhere Konzentration an vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) auf als das Serum. In bevorzugten Ausführungsformen des ersten Aspekts oder des zweiten Aspekts ist die VEGF-Konzentration in dem Hypoxie-konditionierten Medium größer als 100 pg/ml; bevorzugt im Bereich von 100 pg/ml bis 500 ng/ml, mehr bevorzugt im Bereich von 500 pg/ml bis 50.000 pg/ml.
In einigen Ausführungsformen des ersten Aspekts oder des zweiten Aspekts stammen das Hypoxie-konditionierte Medium und/oder das Serum aus einer oder mehreren Blutproben, die von demselben Subjekt erhalten wurden.
In einigen anderen Ausführungsformen des ersten Aspekts oder des zweiten Aspekts stammt das Hypoxie-konditionierte Medium von einer oder mehreren Blutproben, die von einem ersten Subjekt erhalten wurden, und das Serum stammt von einer oder mehreren Blutproben, die von einem zweiten Subjekt erhalten wurden, wobei das erste Subjekte und das zweite Subjekte nicht dasselbe Subjekt sind.
In einigen Ausführungsformen des ersten Aspekts oder des zweiten Aspekts sind das Hypoxie-konditionierte Medium und/oder das Serum zellfrei.
In einigen Ausführungsformen des zweiten Aspekts ist die Lösung zellfrei.
In einem dritten Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen eines Kit-of-Parts gerichtet, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(i) Bereitstellen einer Blutprobe von einem Subjekt;
(ii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (i) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (i), wodurch eine Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst;
(iii) Entfernen von wenigstens einem Teil des Serums aus der in Schritt (ii) erhaltenen Zusammensetzung und Bestimmen des Volumens des entfernten Serums;
(iv) Hinzufügen eines Mediums zu dem Blutgerinnsel, wobei das Volumen des hinzugefügten Mediums gleich oder kleiner als das Volumen des in Schritt (iii) entfernten Serums ist,
(v) Inkubieren des Gerinnsels in dem Medium bei einer Temperatur zwischen 10 °C und 40 °C unter hypoxischen Bedingungen für 1 bis 7 Tage, wodurch ein Hypoxie-konditioniertes Medium erhalten wird;
(vi) Sammeln von wenigstens einem Teil des in Schritt (v) erhaltenen Hypoxie-konditionierten Mediums; und
(vii) Herstellen eines Kit-of-Parts, umfassend:
1. (a) das in Schritt (vi) gesammelte Hypoxie-konditionierte Medium und
2. (b) wenigstens einen Teil des in Schritt (iii) entfernten Serums.

In einem vierten Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer Lösung von Wachstumsfaktoren gerichtet, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

In einem fünften Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Kit-of-Parts, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

In einigen Ausführungsformen des dritten Aspekts, des vierten Aspekts, des fünften Aspekts oder des sechsten Aspekts wird die Gerinnung in Verfahrensschritt (ii) durch Zentrifugieren der in Schritt (i) bereitgestellten Blutprobe induziert.
In einigen Ausführungsformen des fünften Aspekts oder des sechsten Aspekts wird die Gerinnung in Verfahrensschritt (viii) durch Zentrifugieren der in Schritt (vii) bereitgestellten Blutprobe induziert.
In einigen Ausführungsformen des fünften Aspekts oder des sechsten Aspekts wurden die erste Blutprobe und die zweite Blutprobe von demselben Subjekt erhalten.
In einigen anderen Ausführungsformen des fünften Aspekts oder des sechsten Aspekts wurde die erste Blutprobe von einem ersten Subjekt erhalten und die zweite Blutprobe wurde von einem zweiten Subjekt erhalten, wobei das erste Subjekt und das zweite Subjekt nicht dasselbe Subjekt sind.
Während die Exposition von PBCs gegenüber Hypoxie eine wirksame Methode zur Herbeiführung der Hochregulierung angiogener Faktoren darstellt, besteht das allgemeine Problem darin, dass die Anwendung von Hypoxie-basierten Therapien im Allgemeinen beschränkt ist, nämlich durch die begrenzte Verfügbarkeit von O₂-kontrollierten Inkubatoren/Kammern in klinischen Umgebungen. Ein vielversprechender Ansatz zur Überwindung dieser Einschränkung besteht darin, es PBCs zu ermöglichen, ihre O₂-Mikroumgebung zu regulieren, anstatt sie einer künstlichen Umgebung auszusetzen, d.h. einer innerhalb eines Inkubators erzeugten Hypoxie. Es wurde gezeigt, dass eine zellvermittelte Hypoxie im Kern von 3D-Kollagenmatrixdepots erreicht werden kann, die in hoher Dichte mit dermalen Fibroblasten oder glatten Gefäßmuskelzellen besiedelt werden, indem die Gesamtzellzahl und die Zellverteilung im Depot eingestellt wird (Cheema, U., Brown, R. A., Alp, B., and MacRobert, A. J., Spatially defined oxygen gradients and vascular endothelial growth factor expression in an engineered 3D cell model, Cellular and Molecular Life Sciences 65 (2008) 177-186, hierin durch Bezugnahme in vollem Umfang aufgenommen). In dieser Arbeit wurde eine VEGF-Antwort durch Zellen ausgelöst, die niedrigen O₂-Konzentrationen (~ 3 % O₂) ausgesetzt waren, hauptsächlich innerhalb des Konstruktkerns. Es wurde auch gezeigt, dass die Transplantation von Nabelschnurblut-Mesenchym-Stammzellen als Spheroide in ischämischen Hintergliedmassen von Mäusen die therapeutische Wirksamkeit aufgrund eines erhöhten Zellüberlebens und einer Parakrineaktivität verbessert, Effekte, die durch die hypoxische Zellvorbehandlung in Sphäroidkulturen vermittelt werden (Bhang, S. H., Lee, S., Shin, J. Y., Lee, T. J., and Kim, B. S., Transplantation of cord blood mesenchymal stem cells as spheroids enhances vascularization, Tissue Eng Part A 18 (2012) 2138-2147, hierin durch Bezugnahme in vollem Umfang aufgenommen). In dieser Studie wurden diese Effekte durch die Kultivierung von Zellen als Monoschicht, bei denen die Zellen keiner Hypoxie ausgesetzt waren, aufgehoben. Diese Befunde zeigen daher, dass die zellvermittelte Hypoxie eine gute Alternative zu einer extern kontrollierten (d.h. Inkubator) Hypoxie ist. Die perizelluläre O₂-Spannung von PBC, die eine Funktion des zellulären O₂-Verbrauchs ist, wird voraussichtlich vom Niveau des aeroben Metabolismus sowie von der Anzahl/Lebensfähigkeit der Populationen abhängen. Beide Parameter stehen in direktem Zusammenhang mit der PBC-Impfdichte, die anfänglich durch das Verhältnis des Blutvolumens zur Querschnittsfläche des Blutbehälters bestimmt wird. Während niedrigere Verhältnisse (z.B. <0,25 ml/cm²) eine gleichmäßige Zellverteilung/-ausbreitung gewährleisten würden und daher für externe (dh inkubatorgesteuerte) Hypoxie besser geeignet wären, würde höhere Verhältnisse (z.B. 0,25 bis 50 ml/cm², bevorzugt 0,25 bis 5 ml/cm²) eine höhere Zelldichte erzeugen und somit die Induktion einer persistierenden zellvermittelten Hypoxie unterstützen.
Dementsprechend werden in einigen Ausführungsformen des dritten Aspekts, des vierten Aspekts, des fünften Aspekts oder des sechsten Aspekts die hypoxischen Bedingungen in dem Medium in Schritt (v) durch zellvermittelten Sauerstoffverbrauch innerhalb eines normoxischen Inkubators und/oder innerhalb eines sauerstoffregulierten Inkubator erreicht.
Es ist allgemein bekannt, dass die zelluläre Stoffwechselaktivität mit der Aktivität der Proteinsynthese korreliert. Die Expression des angiogenen Faktors durch kultivierte PBCs hängt auch von der Umgebungstemperatur ab, die den zellulären Stoffwechsel direkt steuert. Die Kultivierung von PBCs unter physiologischer Temperatur (37 °C) ist daher zu bevorzugen, da dies eine höhere Wachstumsfaktorproduktion fördert. Dementsprechend wird in einigen Ausführungsformen des dritten Aspekts, des vierten Aspekts, des fünften Aspekts oder des sechsten Aspekts die Inkubation in Schritt (v) bei einer Temperatur zwischen 20 °C und 40 °C, bevorzugt zwischen 25 °C und 40 °C, mehr bevorzugt zwischen 30 °C und 40 °C, noch mehr bevorzugt zwischen 35 °C und 40 °C und am meisten bevorzugt bei ungefähr 37 °C durchgeführt.
In einigen Ausführungsformen des dritten Aspekts, des vierten Aspekts, des fünften Aspekts oder des sechsten Aspekts wird die Inkubation in Schritt (v) bei einer Sauerstoffkonzentration zwischen 1 und 10 %, bevorzugt zwischen 1 % und 5 % durchgeführt.
In einigen Ausführungsformen des dritten Aspekts, des vierten Aspekts, des fünften Aspekts oder des sechsten Aspekts liegt das Volumen des in Schritt (iv) hinzugefügten Mediums zwischen 1/200 und 2/3 des Volumens des in Schritt entfernten Serums (iii), zum Beispiel 1/200, 1/100, 1/20, 1/10, 1/5, 1/2 oder 2/3.
In einigen Ausführungsformen des dritten Aspekts umfasst der vierte Aspekt, der fünfte Aspekt oder der sechste Aspekt, Schritt (vi) das wiederholte Sammeln von Hypoxiekonditioniertem Medium durch Ausführen der folgenden Schritte:

(1) Sammeln von wenigstens einem Teil des Hypoxie-konditionierten Mediums zu einem ersten Zeitpunkt;
(2) Zugabe von Medium zu dem Blutgerinnsel, wodurch das in Schritt (1) gesammelte Hypoxie-konditionierte Medium ersetzt wird,
(3) Fortsetzen der Inkubation,
(4) Sammeln von wenigstens einem Teil des Hypoxie-konditionierten Mediums zu einem zweiten Zeitpunkt und
(5) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (2) bis (4) zwischen 1-mal und 5-mal.

In bevorzugten Ausführungsformen des dritten Aspekts, des vierten Aspekts, des fünften Aspekts oder des sechsten Aspekts ist das Volumen des in Schritt (iv) hinzugefügten Mediums und/oder des in Schritt (2) hinzugefügten Mediums gleich oder geringer als das Volumen des in Schritt (iii) entfernten Serums.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen des dritten Aspekts, des vierten Aspekts, des fünften Aspekts oder des sechsten Aspekts ist das Gesamtvolumen des in Schritt (iv) zugesetzten Mediums und des in Schritt (2) hinzugefügten Mediums gleich oder geringer als das Volumen des in Schritt (iii) entfernten Serums.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen des dritten Aspekts, des vierten Aspekts, des fünften Aspekts oder des sechsten Aspekts wird die Lösung von Wachstumsfaktoren, die in Schritt (vii) des vierten Aspekts oder in Schritt (x) des sechsten Aspekts erhalten werden, durch Mischen eines gegebenen Volumens Hypoxie-konditioniertem Medium (V_hcm) mit einem Serumvolumen (V_s) erhalten, das die folgende Ungleichung erfüllt: $\frac{V_{h c m} * V_{s_{t o t a l}}}{V_{h c m_{t o t a l}}} - V_{h c m}$

wobei V_s das Volumen des Serums ist, das zum Mischen verwendet werden kann, wobei V_hcm das Volumen des Hypoxie-konditionierten Mediums ist, das zum Mischen verwendet wird,
wobei V_s
total das Gesamtvolumen des in Schritt (iii) entfernten Serums ist,
wobei V_hcm
total das Gesamtvolumen des in Schritt (iv) hinzugefügten Mediums ist, und
wobei zusätzlich folgende Bedingung gilt: V_hcm
total ≤ V_s
total.

In einigen Ausführungsformen des dritten Aspekts, des vierten Aspekts, des fünften Aspekts oder des sechsten Aspekts ist das Medium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus serumhaltigem Kulturmedium, serumfreiem Kulturmedium, einer Lösung, die mit Blut isotonisch ist, einem Kulturmedium mit Glucose, einem Kulturmedium ohne Glucose, einem Kulturmedium mit Albumin und einem Kulturmedium ohne Albumin.
In einem siebten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit-of-Parts, das durch das Verfahren des dritten oder fünften Aspekts hergestellt wird.
In einem achten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Lösung von Wachstumsfaktoren gerichtet, die durch das Verfahren des vierten oder sechsten Aspekts hergestellt werden.
In einem neunten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend (a) die Lösung des zweiten Aspekts oder die Lösung des achten Aspekts; und (b) einen Hilfsstoff.
In einigen Ausführungsformen des neunten Aspekts ist die Zusammensetzung eine pharmazeutische Zusammensetzung. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Hilfsstoff ein pharmazeutisch akzeptabler Hilfsstoff.
In einigen Ausführungsformen des neunten Aspekts ist die Zusammensetzung eine kosmetische Zusammensetzung. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Hilfsstoff ein kosmetisch akzeptabler Hilfsstoff.
In einigen Ausführungsformen des neunten Aspekts ist der Hilfsstoff Fibrinogen. In einigen Ausführungsformen ist das Fibrinogen exogenes Fibrinogen, d.h. Fibrinogen, das von einem anderen Subjekt als dem Subjekt erhalten wurde, auf das die Zusammensetzung angewendet oder verabreicht wird.
In einigen Ausführungsformen des neunten Aspekts umfasst die Zusammensetzung ferner: (c) einen Träger. Bevorzugt ist der Träger ein pharmazeutisch akzeptabler Träger oder ein kosmetisch akzeptabler Träger. In bevorzugten Ausführungsformen liegt der Träger in Form einer Creme, eines Erweichungsmittels, einer Salbe, eines Gels, eines Sol-Gels, eines Sprays, eines Pulvers, eines Netzes, eines Schwamms, eines Pflasters, eines Verbands, von Nanopartikeln, Mikropartikeln, Nanofasern oder Mikrofasern vor. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Träger eine oder mehrere Substanzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen (z.B. Kollagen, Elastin, Fibrin oder Fibronektin), Polysacchariden (z.B. Alginat, Chitin oder Cellulose), Glykosaminoglykan (z.B. Hyaluronsäure, Dermatansulfat, Keratinsulfat, Chondroitinsulfat, Heparansulfat oder Heparinsulfat) und synthetischen Polymeren (z.B. Polyglykolsäure, Polymilchsäure, Polycaprolacton oder Polylaktische Co-Glykolsäure).
Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, glauben die Erfinder, dass die Verwendung von Fibrinogen als Hilfsstoff oder die Verwendung bestimmter Träger die folgenden Vorteile bietet: räumliche Faktorgradienten fördern die chemotaktische Migration von Zellen, einschließlich Endothelzellen, hin zu einer Zielstelle, und sind wichtig für die Stimulation von gerichteter Angiogenese. Um solche Gradienten zu erreichen, könnten Wachstumsfaktoren auf geeignete Polymerträger geladen werden, die lokal auf eine Wunde aufgebracht werden können oder lokal intradermal/subkutan über Gel- oder Sol-Gel-Träger injiziert werden können. Durch die schrittweise Freisetzung aus dem Vehikels wird ein räumlicher Gradient etabliert. Zusätzlich zur Verwendung von exogenen Gelen und Sol-Gelen könnte eine lokalisierte Abgabe durch Zugabe von exogenem Fibrinogen (autologem oder allogenem/xenogenem Ursprung) zu einer Zusammensetzung und Kombinieren dieser Lösung mit Thrombin/Calcium erreicht werden, um die Bildung einer Fibringel-Matrix ähnlich derjenigen zu induzieren, die sich bei der Koagulation bildet. Die in vivo gebildete Fibrinmatrix maskiert dann die Faktoren an der Verabreichungsstelle durch spezifische Bindung (z.B. VEGF) und/oder passives Einfangen und stellt deren kontrollierte Freisetzung in einer Wunde sicher. Dies hilft auch, unerwünschte Nebenwirkungen wie Gefäßleckagen und ektopische Angiogenese zu vermeiden. Eine weitere Funktionalität solcher mit Faktor beladenen Matrizen besteht darin, dass sie als Gerüste für die Wanderung von Wirtszellen (z.B. Fibroblasten, Endothelzellen) an einer Defektstelle dienen können, wodurch die Gewebereparatur und -regeneration gefördert wird.
In einem zehnten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Lösung des zweiten Aspekts oder eine Lösung des achten Aspekts oder eine Zusammensetzung des neunten Aspekts zur Verwendung in der Medizin.
In einem elften Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Lösung des zweiten Aspekts oder eine Lösung des achten Aspekts oder eine Zusammensetzung des neunten Aspekts zur Verwendung bei der Verbesserung der Gewebeblutperfusion, zur Verwendung bei der Stimulation der Angiogenese, zur Verwendung bei der Behandlung von debridierter Haut (z.B. durch mechanisches, chemisches Debridement oder Laser-Debridement, Mikrodermabrasion oder Nadeln) zur Verwendung bei der Behandlung von übermäßiger Narbenbildung (einschließlich der Behandlung von Akne, Keloiden und hypertrophen Narben), zur Verwendung bei der Behandlung von Transplantaten (z.B. Hauttransplantaten oder Fetttransplantaten) zur Verwendung bei der Behandlung von Klappen (z.B. lokalen Klappen oder freien Klappen), zur Verwendung bei der Behandlung von Wunden (z.B. diabetischen Geschwüren, arteriellen Geschwüren, venösen Stauwunden, dekubitalen Geschwüren, strahleninduzierten Wunden, steroidinduzierten Wunden, ischämischen Wunden, ischämischem Gewebe nach Verwundung und nach Transplantation, Einschnitten, Schnittwunden, Abschürfungen oder Verbrennungen) und/oder zur Verwendung bei der Behandlung von Gewebeschäden (z.B. Gewebeschäden verursacht durch Störungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Diabetes; peripherer Arterienerkrankung; vaskulärer Verschlusskrankheit; Atherosklerose; myointimaler Hyperplasie; Thromboangiitis obliterans; thrombotischen Störungen; mesenterialer Ischämie; Gliedmaßen-Ischämie; peripherer Arterienstenose; Vaskulitis; Infarkten einschließlich Hirninfarkten und Herzinfarkten; traumatischen Verletzungen; Knochenbrüchen; Osteoporose; Arthritis (einschließlich Arthrose); Rheuma; Knorpelruptur oder -ablösung; gezerrten oder gerissenen Sehnen; Wirbelsäulenverletzungen; Muskeldystrophien; amyotropher Lateralsklerose; Krebs; AIDS; zentraler Nervenverletzung; peripherer Nervenverletzung; zentraler Nervendegeneration; und peripherer Nervendegeneration).
In einem alternativen Wortlaut ist der elfte Aspekt der vorliegenden Erfindung auf die Verwendung einer Lösung des zweiten Aspekts oder einer Lösung des achten Aspekts oder einer Zusammensetzung des neunten Aspekts bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verbesserung der Gewebeblutperfusion, zur Verwendung bei der Stimulation der Angiogenese, zur Verwendung bei der Behandlung von debridierter Haut (z.B. durch mechanisches, chemisches Debridement oder Laser-Debridement, Mikrodermabrasion oder Nadeln) zur Verwendung bei der Behandlung von übermäßiger Narbenbildung (einschließlich der Behandlung von Akne, Keloiden und hypertrophen Narben), zur Verwendung bei der Behandlung von Transplantaten (z.B. Hauttransplantaten oder Fetttransplantaten) zur Verwendung bei der Behandlung von Klappen (z.B. lokalen Klappen oder freien Klappen), zur Verwendung bei der Behandlung von Wunden (z.B. diabetischen Geschwüren, arteriellen Geschwüren, venösen Stauwunden, dekubitalen Geschwüren, strahleninduzierten Wunden, steroidinduzierten Wunden, ischämischen Wunden, ischämischem Gewebe nach Verwundung und nach Transplantation, Einschnitten, Schnittwunden, Abschürfungen oder Verbrennungen) und/oder zur Verwendung bei der Behandlung von Gewebeschäden (z.B. Gewebeschäden verursacht durch Störungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Diabetes; peripherer Arterienerkrankung; vaskulärer Verschlusskrankheit; Atherosklerose; myointimaler Hyperplasie; Thromboangiitis obliterans; thrombotischen Störungen; mesenterialer Ischämie; Gliedmaßen-Ischämie; peripherer Arterienstenose; Vaskulitis; Infarkten einschließlich Hirninfarkten und Herzinfarkten; traumatischen Verletzungen; Knochenbrüchen; Osteoporose; Arthritis (einschließlich Arthrose); Rheuma; Knorpelruptur oder -ablösung; gezerrten oder gerissenen Sehnen; Wirbelsäulenverletzungen; Muskeldystrophien; amyotropher Lateralsklerose; Krebs; AIDS; zentraler Nervenverletzung; peripherer Nervenverletzung; zentraler Nervendegeneration; und peripherer Nervendegeneration).
In einem weiteren alternativen Wortlaut betrifft der elfte Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der Gewebeblutperfusion, zur Verwendung bei der Stimulation der Angiogenese, zur Verwendung bei der Behandlung von debridierter Haut (z.B. durch mechanisches, chemisches Debridement oder Laser-Debridement, Mikrodermabrasion oder Nadeln) zur Verwendung bei der Behandlung von übermäßiger Narbenbildung (einschließlich der Behandlung von Akne, Keloiden und hypertrophen Narben), zur Verwendung bei der Behandlung von Transplantaten (z.B. Hauttransplantaten oder Fetttransplantaten) zur Verwendung bei der Behandlung von Klappen (z.B. lokalen Klappen oder freien Klappen), zur Verwendung bei der Behandlung von Wunden (z.B. diabetischen Geschwüren, arteriellen Geschwüren, venösen Stauwunden, dekubitalen Geschwüren, strahleninduzierten Wunden, steroidinduzierten Wunden, ischämischen Wunden, ischämischem Gewebe nach Verwundung und nach Transplantation, Einschnitten, Schnittwunden, Abschürfungen oder Verbrennungen) und/oder zur Verwendung bei der Behandlung von Gewebeschäden (z.B. Gewebeschäden verursacht durch Störungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Diabetes; peripherer Arterienerkrankung; vaskulärer Verschlusskrankheit; Atherosklerose; myointimaler Hyperplasie; Thromboangiitis obliterans; thrombotischen Störungen; mesenterialer Ischämie; Gliedmaßen-Ischämie; peripherer Arterienstenose; Vaskulitis; Infarkten einschließlich Hirninfarkten und Herzinfarkten; traumatischen Verletzungen; Knochenbrüchen; Osteoporose; Arthritis (einschließlich Arthrose); Rheuma; Knorpelruptur oder -ablösung; gezerrten oder gerissenen Sehnen; Wirbelsäulenverletzungen; Muskeldystrophien; amyotropher Lateralsklerose; Krebs; AIDS; zentraler Nervenverletzung; peripherer Nervenverletzung; zentraler Nervendegeneration; und peripherer Nervendegeneration), wobei das Verfahren den Schritt des Verabreichens einer therapeutischen Menge einer Lösung des zweiten Aspekts oder einer Lösung des achten Aspekts oder einer Zusammensetzung des neunten Aspekts an einen Patienten, der dies benötigt, umfasst.
In einigen Ausführungsformen des elften Aspekts dient die Lösung oder Zusammensetzung zur autologen Verabreichung.
In einigen Ausführungsformen des elften Aspekts ist die Lösung oder die Zusammensetzung zur allogenen Anwendung.
In einigen Ausführungsformen des elften Aspekts dient die Lösung oder Zusammensetzung zur epidermalen Verabreichung.
In einigen Ausführungsformen des elften Aspekts dient die Lösung oder Zusammensetzung zur intradermalen Verabreichung.
In einigen Ausführungsformen des elften Aspekts dient die Lösung oder Zusammensetzung zur subkutanen Verabreichung.
In einem zwölften Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine kosmetische, nichttherapeutische Verwendung der Lösung des zweiten Aspekts oder der Lösung des achten Aspekts oder der Zusammensetzung des neunten Aspekts.
In einigen Ausführungsformen des zwölften Aspekts dient die Verwendung zur Verbesserung des Erscheinungsbildes der Haut (z.B. durch chronologische Alterung oder durch Lichtschädigung veränderte Haut), zur Stimulierung von neuem Haarwachstum, zur Verstärkung von Weichgewebe, zur Verringerung von Falten, zur Hautverjüngung, zur Verbesserung des Erscheinungsbildes von Narben, zur Verringerung übermäßiger Hautpigmentierung und/oder zur Verbesserung der Pigmentierung in der Haut mit reduzierter Pigmentierung.
In einem alternativen Wortlaut bezieht sich der zwölfte Aspekt der vorliegenden Erfindung auf ein kosmetisches, nichttherapeutisches Verfahren zur Verbesserung des Erscheinungsbildes der Haut (z.B. durch chronologische Alterung oder Lichtschädigung veränderte Haut), zum Stimulieren von neuem Haarwachstum, zur Verstärkung von Weichgewebe, zur Verringerung von Falten, zur Hautverjüngung, zur Verbesserung des Erscheinungsbildes von Narben, zur Verringerung übermäßiger Hautpigmentierung und/oder zur Verbesserung der Pigmentierung in der Haut mit reduzierter Pigmentierung, wobei das Verfahren den Schritt der Verabreichung einer wirksamen Menge einer Lösung der zweite Aspekt oder eine Lösung des achten Aspekts oder eine Zusammensetzung des neunten Aspekts für ein Subjekt, das eine solche kosmetische Behandlung benötigt, umfasst.
In einem dreizehnten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zur Herstellung von aus Blut gewonnenem Serum und/oder Hypoxie-konditioniertem Medium, wobei das Kit umfasst:

(a) eine erste Spritze,
(b) eine zweite Spritze,
(c) gegebenenfalls eine dritte Spritze,
(d) gegebenenfalls eine vierte Spritze,
(e) ein Dreiwegeventil,
(f) ein Filter und
(g) eine Kappe.

In bevorzugten Ausführungsformen des dreizehnten Aspekts hat die erste Spritze ein Volumen von ungefähr 30 ml. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen des dreizehnten Aspekts ist die erste Spritze für eine Inkubation bei 37 °C für 1 bis 7 Tage zertifiziert. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen des dreizehnten Aspekts ist die erste Spritze am Ende mit der Öffnung mit dem Wort ‚UP‘ (oder ‚TOP‘ oder einem ähnlichen Ausdruck) und mit dem Wort ‚DOWN‘ (oder ‚BOTTOM‘ oder ein ähnlicher Ausdruck) am Ende mit dem Kolben beschriftet.
In bevorzugten Ausführungsformen des dreizehnten Aspekts hat die zweite Spritze ein Volumen von ungefähr 10 ml.
In bevorzugten Ausführungsformen des dreizehnten Aspekts hat die dritte Spritze ein Volumen von ungefähr 10 ml.
In bevorzugten Ausführungsformen des dreizehnten Aspekts hat die vierte Spritze ein Volumen von ungefähr 10 ml.
In bevorzugten Ausführungsformen des dreizehnten Aspekts sind die erste, die zweite und (falls vorhanden) die dritte und vierte Spritze lösbar mit dem Dreiwegeventil verbindbar, z.B. durch Luer-Lock-Verbindungen.
In bevorzugten Ausführungsformen des dreizehnten Aspekts umfasst das Kit wenigstens einen Filter (z.B. 1 Filter, 2 Filter, 3 Filter, 4 Filter, 5 Filter, 6 Filter, 7 Filter, 8 Filter, 9 Filter oder 10 Filter). In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Kit wenigstens zwei Filter. In mehr bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Kit wenigstens drei Filter. In noch mehr bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Kit wenigstens vier Filter. In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Kit wenigstens fünf Filter. In bevorzugten Ausführungsformen des dreizehnten Aspekts ist der Filter ein 0,2 µm-Filter oder die Filter sind 0,2 µm-Filter. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen des dreizehnten Aspekts ist der Filter/die Filter entfernbar mit dem Dreiwegeventil und/oder mit einer der vier Spritzen verbunden, z.B. durch Luer-Lock-Verbindungen. In bevorzugten Ausführungsformen des dreizehnten Aspekts ist die Kappe lösbar mit dem Dreiwegeventil und/oder mit einer der vier Spritzen und/oder mit einem der Filter verbunden, z.B. durch Luer-Lock-Verbindungen.
In einigen Ausführungsformen des dreizehnten Aspekts umfasst das Kit ferner einen Behälter, der steriles Medium enthält. In bevorzugten Ausführungsformen ist das sterile Medium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus serumhaltigem Kulturmedium, serumfreiem Kulturmedium, einer Lösung, die mit Blut isotonisch ist, einem Kulturmedium mit Glucose, einem Kulturmedium ohne Glucose, einem Kulturmedium mit Albumin und ein Kulturmedium ohne Albumin.
In einigen Ausführungsformen des dreizehnten Aspekts umfasst das Kit ferner einen Katheter (z.B. Vasuflo-Int) oder eine Schmetterlingskanüle.
In einigen Ausführungsformen des dreizehnten Aspekts umfasst das Kit ferner ein Heftpflaster (d.h. einen Haftverband im amerikanischen Englisch), z.B. Band-Aid™ oder Elastoplast™.
In einigen Ausführungsformen des dreizehnten Aspekts umfasst das Kit ferner ein Gestell, in das die erste Spritze platziert und in aufrechter Position gehalten werden kann.
In einigen Ausführungsformen des dreizehnten Aspekts umfasst das Kit ferner einen Spatel. Der Spatel kann zum Mischen von Serum oder hypoxiekonditioniertem Medium verwendet werden, das unter Verwendung des Kits mit Hautpflegeprodukten hergestellt wird.
In einem vierzehnten Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf eine Verwendung des dreizehnten Aspekts in einem Verfahren nach einem der dritten, vierten, fünften oder sechsten Aspekte gerichtet.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Die erfindungsgemäße Lösung kann durch ein Verfahren hergestellt werden, das die folgenden Schritte umfasst: Gewinnen einer Blutprobe, bevorzugt aus einer peripheren Vene, und Gerinnenlassen des Blutes oder Zentrifugieren des Blutes, um die Gerinnung zu induzieren, und Entfernen des Serums ganz oder teilweise, bevorzugt ohne Stören des Gerinnsels, dann Ersetzen des Serums durch frisches Medium und Inkubieren des Gerinnsels in frischem Medium bei einer Temperatur von 10 bis 40 °C (bevorzugt bei 37 °C) unter Hypoxie (1 bis 10 % O₂, bevorzugt 1 bis 5 % O₂) für 1 bis 7 Tage (bevorzugt 1 bis 4 Tage) und Sammeln des konditionierten Mediums und Mischen mit dem Serum in einem definierten Verhältnis, um eine erfindungsgemäße Lösung zu erhalten.
Das für die Gerinnselinkubation verwendete frische Medium kann ein geeignetes Zellkulturmedium sein, wie serumhaltiges oder serumfreies Kulturmedium, eine Lösung, die mit Blut isotonisch ist, ein Kulturmedium mit oder ohne Glucose, ein Kulturmedium mit oder ohne Albumin. Das Serum, Gerinnsel-konditionierte Medium und/oder die gemischte Lösung können filtriert werden, um Zellen oder Zellmaterial zu entfernen. Während der Inkubationszeit (d.h. 1 bis 7 Tage) kann das Serum eingefroren (-10 °C bis -80 °C) und gelagert und anschließend zum Mischen aufgetaut werden. Die gemischte Zusammensetzung kann auch bis zu 12 Monate eingefroren werden (-10 °C bis -80 °C), während ihre Bioaktivität (zumindest teilweise) erhalten bleibt. Die gemischte Zusammensetzung kann auch lyophilisiert oder getrocknet werden und in einem Puffer rekonstituiert werden.
Dieses Verfahren ermöglicht eine genaue Kontrolle der Konzentration von Proteinwachstumsfaktoren in Gerinnsel-konditioniertem Medium durch Steuern des Volumens an frischem Medium, das nach der Serum entfernung zugegeben wird.
Bevorzugt wird das Serum durch ein frisches Medium mit einem Volumen ersetzt, das gleich oder kleiner als das Volumen des erhaltenen/entfernten Serums ist, um die Konzentration der von geronnenen Blutzellen in das konditionierte Medium sekretierten Faktoren über die Konzentration zu erhöhen, die erreicht werden würde, wenn die Faktoren während der Konditionierung direkt in das ursprüngliche Serumvolumen sekretiert wurden. Auf diese Weise können die Faktoren um das 1,5fache, 2fache, 5fache, 10fache, 20fache, 100fache, 200fache oder mehr konzentriert werden. Beispielsweise konnte VEGF mit einer durchschnittlichen Serumkonzentration von 60 bis 700 pg/ml auf 500 ng/ml konzentriert werden. Dieser starke Anstieg der Faktorkonzentration ist signifikant höher als der Anstieg, der durch Konditionierung der Blutzellen unter Hypoxie erzielt werden kann. Die Konzentration der im Serum freigesetzten Faktoren kann indirekt durch Mischen mit Gerinnsel-konditioniertem Medium eingestellt werden. Das Serum enthält eine signifikant höhere Konzentration an Blutplättchen-abgeleiteten Faktoren, wie z.B. den anti-angiogenen Faktor PF4, der normalerweise im Serum bei ca. 3000 bis 15000 ng/ml vorliegt, als in Gerinnsel-konditioniertem Medium. Das bevorzugte Mischvolumenverhältnis des Gerinnsel-konditionierten Mediums zu Serum ist derart, dass die Konzentration der Faktoren in dem Gerinnsel-konditionierten Medium als Ergebnis des Vermischens niemals unter das reduziert wird, was der Fall gewesen wäre, wenn die von einem Gerinnsel abgeleiteten Faktoren direkt in das ursprüngliche Serumvolumen während der Konditionierung sekretiert worden wären. Daher ist die Priorität die Aufrechterhaltung einer hohen Konzentration der Hypoxie-induzierten pro-angiogenen Faktoren wie VEGF (hergestellt in konditioniertem Medium), während gleichzeitig auch von Blutplättchen abgeleitete Faktoren (in Serum freigesetzt) in natürlich vorkommenden Konzentrationen abgegeben werden.
Gerinnsel-konditioniertes Medium kann zu definierten Zeitpunkten ab dem Beginn der Inkubation gesammelt werden, z.B. nach 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Tagen und durch neues frisches Medium ersetzt, wodurch die Inkubation fortgesetzt werden kann. Dadurch können verschiedene Zusammensetzungen erhalten werden, die unterschiedliche Faktorkonzentrationen und -verhältnisse umfassen, da bekannt ist, dass die Hypoxieinduzierte Faktorexpression durch Zellen im Laufe der Zeit variiert. Diese Zusammensetzungen rekapitulieren dann die natürliche sequentielle Expression der Wundheilungsphasen.
Es versteht sich, dass die durch Koagulation induzierten und durch Hypoxie induzierten Signalphasen, die innerhalb einer Wunde erzeugt werden, für das Individuum einzigartig/spezifisch sind. Um diese Spezifität bei der Herstellung von Zusammensetzungen aufrechtzuerhalten, werden das zur Konditionierung verwendete Blutserum und Gerinnsel bevorzugt von demselben Subjekt abgeleitet. Nichtsdestotrotz kann die gemischte (zellfreie) Zusammensetzung auf dasselbe Subjekt, von dem das Blut erhalten wurde (autologe Zusammensetzung), oder auf ein anderes Subjekt (allogene Zusammensetzung) angewandt werden.
Die Zusammensetzung, die die zwei Phasen umfasst, kann verabreicht werden, um Gewebeschäden zu verhindern oder zu behandeln, indem sie topisch auf eine Wunde aufgebracht oder intradermal/subkutan injiziert wird. Die Zusammensetzung kann mit Transplantaten wie Haut- und Fetttransplantaten kombiniert werden, um ihre Aufnahme zu verbessern, indem die Blutversorgung des Transplantats erhöht wird. Die Zusammensetzung kann auch in kosmetischen Anwendungen verwendet werden, um das Aussehen der Haut zu verbessern, das durch chronologische Alterung oder durch Lichtschädigung verändert wurde, und auch neues Haarwachstum zu stimulieren.
Bei Verwendung des hier beschriebenen Kits zur Herstellung von aus Blut gewonnenem Serum und/oder Hypoxie-konditioniertem Medium kann die Erfindung durch Ausführen der folgenden Verfahren ausgeführt werden:
Verfahren zur Blutentnahme und Gerinnenlassen der Blutprobe

1. Sterilisieren der Haut und Einsetzen eines intravenösen Katheters (z.B. Vasuflo®Int) oder einer Schmetterlingskanüle in die periphere Vene.
2. Verbinden der erste Spritze* (z.B. Omnifix®, 30 ml) mit einem Dreiwegeventil (z.B. Discofix®) und Verbinden des Dreiwegeventils mit einem ersten Sterilfilter (z.B. 0,2 µm Sterifix®) in einem sterilen Bereich (* Spritze, die für eine Inkubation unter 37 °C für 1 bis 7 Tage zertifiziert ist (Spritze kann mit Up und Down gekennzeichnet sein).
3. Verbinden der ersten Spritze (mit aufgesetztem Dreiwegeventil und aufgesetztem Filter) mit dem Katheter oder der Kanüle und Blutentnahme (ca. 10 bis 20 ml).
4. Entfernen von Katheter oder Kanüle und Aufbringen von Pflaster auf der Haut.
5. Trennen der ersten Spritze vom Katheter oder der Kanüle und Ablegen des Katheters oder der Kanüle in einen Behälter für scharfe Gegenstände. Das Dreiwegeventil und der erste Filter bleiben mit der ersten Spritze verbunden.
6. Während die erste Spritze mit Blut aufrecht gehalten wird (Öffnung nach oben), Einziehen von Luft (ca. 1 bis 10 ml) durch den ersten Filter in die erste Spritze.
7. Trennen des ersten Filters vom Dreiwegeventil und Entsorgen des ersten Filters.
8. Während die erste Spritze aufrecht gehalten, Aufbringen der Abdeckung (z.B. Combi Stopper) auf das Dreiwegeventil, und Platzieren der erste Spritze in einem Ständer oder Gestell in aufrechter Position.

Verfahren zum Erhalten von Serum und Mischen von Serum in ein Hautpflegeprodukt

1. Nach Inkubation von Blut bei 37 °C für 1 bis 7 Tage, Entfernen der ersten Spritze aus dem Inkubator, wobei diese stets aufrechterhalten wird.
2. Abnehmen der Kappe vom Dreiwegeventil ab und Verbinden des zweiten Sterilfilters (z.B. 0,2 µm Sterifix®) mit dem Dreiwegeventil.
3. Drücken des Kolbens der ersten 30-ml-Spritze nach oben (während die erste Spritze aufrecht gehalten wird), um die gesamte Luft durch den zweiten Filter zu entfernen.
4. Trennen des zweiten Filters und dessen Entsorgen.
5. Während die erste Spritze aufrecht gehalten wird, Befestigen der zweiten 10-ml-Luer-Lock-Spritze am 3-Wege-Ventil und Bewegen des Kolben der ersten 30-ml-Spritze, so dass das Serum in die zweite 10-ml-Spritze gelangt.
6. Sammeln des gesamten Serumvolumens, ohne das Gerinnsel in der ersten 30 ml-Spritze zu stören.
7. Trennen der zweiten 10 ml-Spritze von der ersten 30 ml-Spritze und sicheres Entsorgen der ersten 30 ml-Spritze.
8. Aufsetzen eines 0,2-µm-Filters (d.h. des dritten Filters) auf die zweite 10-ml-Spritze und das Filterserum, während es zu dem Hautpflegeprodukt hinzufügt wird. Wenn der Filter verstopft ist, wird dieser durch einen anderen verfügbaren Filter ersetzt (d.h. vierter Filter).
9. Mischen des Serums mit einem Spatel in das Hautpflegeprodukt.

Verfahren zum Erhalten von Serum und Hypoxie-konditioniertem Medium:

Schritt 1
1. 1. Nachdem Blut aus der peripheren Vene entnommen wurde, wird das Blut gerinnen lassen oder das Blut zentrifugiert, um die Blutgerinnung zu induzieren, während die erste Spritze* aufrecht gehalten wird**, wie oben im Abschnitt Verfahren zur Blutentnahme und Gerinnenlassen der Blutprobe beschrieben (*Spritze für 1 bis 7 Tage bei Inkubation unter 37 °C zertifiziert. ** Spritze mit Up- und Down-Markierungen gekennzeichnet: UP entspricht der Spritzenöffnung, DOWN entspricht dem Kolben. Die aufrechte Position wird während der Schritte 1 und 2 aufrechterhalten).
2. 2. Entfernen der Luft aus der ersten Spritze wie in den Absätzen 1 bis 4 des Abschnitts „Verfahren zum Erhalten von Serum und Mischen von Serum in ein Hautpflegeprodukt“ beschrieben.
3. 3. Verbinden einer zweiten Spritze mit dem Dreiwegeventil. Aufziehen des Serums in die zweite Spritze, ohne das Gerinnsel in der Blut enthaltenden Spritze zu stören (1). Trennen der zweiten Spritze vom Dreiwegeventil und Lagern der serumhaltigen zweite Spritze (bei niedriger Temperatur; z.B. eingefroren zwischen 80 °C und -10 °C).
4. 4. Aufsetzen eines neuen Filters (d.h. eines dritten Filters; z.B. 0,2 µm Sterifix®) auf das 3-Wege-Ventil der Blut enthaltenden ersten Spritze und Ziehen von Luft durch den dritten Filter in die erste Spritze. Entfernen des Filter vom 3-Wege-Ventil und Entsorgen des Filters. Aufsetzen einer Abdeckung (z.B. einer Kappe) auf das Dreiwegeventil.
5. 5. Verbinden einer dritte Spritze mit sterilem Medium mit dem 3-Wege-Ventil und Hinzufügen von Medium zu der Blut enthaltenden ersten Spritze (2). Entfernen der dritte Spritze von dem Dreiwegeventil.
6. 6. Platzieren der Blut enthaltenden ersten Spritze aufrecht in einer Halterung. Inkubieren der ersten Spritze 1 bis 7 Tage bei 37 °C.
Schritt 2
1. 1. Nach Inkubation von Blut bei 37 °C für 1 bis 7 Tage, Entfernen der ersten Spritze aus dem Inkubator, wobei diese stets aufrechterhalten wird. Abnehmen der Abdeckung vom Dreiwegeventil und Verbinden des vierten Sterilfilters (z.B. 0,2 µm Sterifix®) mit dem Dreiwegeventil. Drücken des Kolbens der Blut enthaltenden ersten Spritze nach oben, um die gesamte Luft durch den vierten Filter zu entfernen.
2. 2. Trennen des vierten Filters, dessen Entsorgen und Befestigen einer leeren vierten Spritze am 3-Wege-Ventil.
3. 3. Verbinden der serumhaltigen zweiten Spritze mit dem 3-Wege-Ventil.
4. 4. Sammeln eines definierten Volumens an konditioniertem Medium und Serum in die leere vierte Spritze, um eine neue Mischung zu erhalten (3).

Diese neue Mischung kann unter Verwendung eines neuen 0,2 µm-Filters (d.h. eines fünften Filters) gefiltert werden und kann unter Verwendung eines Spatels in ein Hautpflegeprodukt gemischt werden.
Herkömmlich wird Blut im klinischen Umfeld nicht inkubiert. Dies geschieht in erster Linie nur im Fall einer Blutkultur zum Nachweis des Bakterienwachstums (septischer Patient). Im Gegensatz zu diesem Verfahren ist es hier wichtig, dass während der Inkubationsphase keine Blutkontamination erfolgt, da aus Blut abgeleitete Wachstumsfaktoren therapeutisch eingesetzt werden. Luft muss in die Blut enthaltende Spritze eingeführt werden, da dies die Lebensfähigkeit der Blutzellen unter Bedingungen niedriger Sauerstoffspannung (hypoxisch) garantiert, d.h. die Vermeidung pathologischer Hypoxie/Anoxie (d.h. Sauerstoffspannung unter 1 %, die die Produktion von Blutzellen verringern würde). Um sicherzustellen, dass die in die Spritze eingeleitete Luft steril ist, muss Luft durch den Filter eingesaugt werden. Außerdem sollte der Filter vor der Inkubation entfernt werden, um das Wachstum von Krankheitserregern innerhalb des Filters und eine mögliche Rückaspiration in das Serum oder das konditionierte Medium zu vermeiden.
Ein anderes neuartiges Konzept ist die direktionale Verwendung der Spritze: üblicherweise ist die Position der Spritze nach der Blutentnahme nicht definiert. Bei der Einstellung der Erfindung muss die erste Blut enthaltende Spritze nach der Blutgerinnung, während der Inkubationsphase und danach immer aufrecht gehalten werden (Öffnung oben, Kolben unten). Der Grund dafür ist, sicherzustellen, dass weiße Blutkörperchen in und um das Gerinnsel in direktem Kontakt mit dem Medium bleiben, wodurch ausreichend Nährstoffe und Wachstumsfaktoren in das Medium anstatt in die rote Blutkörperchenschicht gelangen. Darüber hinaus wird verhindert, dass das Medium, das die Wachstumsfaktoren enthält, mit roten Blutkörperchen vermischt wird. Da die weißen Blutkörperchen und das Blutgerinnsel immer über der roten Blutkörperchenschicht enden, hat der Kolben der ersten Spritze am Boden die Möglichkeit, das Medium aus der ersten Spritze auszutreiben, indem der Kolben nach oben gedrückt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die folgenden 39 Gegenstände:

1. Kit-of-Parts, umfassend:
1. (a) ein Hypoxie-konditioniertes Medium, das aus Blut stammt; und
2. (b) ein Serum
in getrennten Behältern.
2. Lösung von Wachstumsfaktoren, umfassend eine Mischung aus
1. (a) einem Hypoxie-konditionierten Medium, das aus Blut stammt; und
2. (b) einem Serum.
3. Kit-of-Parts nach Gegenstand 1 oder Lösung nach Gegenstand 2, wobei das Hypoxie-konditionierte Medium eine geringere Konzentration an Thrombozytenfaktor 4 (PF4) als das Serum aufweist.
4. Kit-of-Parts nach Gegenstand 1 oder 3 oder Lösung nach Gegenstand 2 oder 3, wobei das Hypoxie-konditionierte Medium PF4 in einer Konzentration zwischen 0 ng/ml und 15.000 ng/ml, bevorzugt zwischen 5 ng/ml und 5.000 ng/ml enthält.
5. Kit-of-Parts nach einem der Gegenstände 1, 3 oder 4 oder Lösung nach einem der Gegenstände 2 bis 4, wobei das Hypoxie-konditionierte Medium wenigstens einen Angiogenese-verwandten Wachstumsfaktor enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus VEGF, TSP1, IL8, Angiogenin (ANG), MMP-9, MMP-8, TIMP-1 und PDGF.
6. Kit-of-Parts nach einem der Gegenstände 1 oder 3 bis 5 oder Lösung nach einem der Gegenstände 2 bis 5, wobei das Hypoxie-konditionierte Medium eine höhere Konzentration an vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) als das Serum aufweist
7. Kit-of-Parts nach einem der Gegenstände 1 oder 3 bis 6 oder Lösung nach einem der Gegenstände 2 bis 6, wobei die VEGF-Konzentration in dem Hypoxie-konditionierten Medium größer als 100 pg/ml ist.
8. Kit-of-Parts nach einem der Gegenstände 1 oder 3 bis 7 oder Lösung nach einem der Gegenstände 2 bis 7, wobei das Hypoxie-konditionierte Medium und/oder das Serum aus einer oder mehreren Blutproben stammen, die von demselben Subjekt erhalten wurden.
9. Kit-of-Parts nach einem der Gegenstände 1 oder 3 bis 7 oder Lösung nach einem der Gegenstände 2 bis 7, wobei das Hypoxie-konditionierte Medium aus einer oder mehreren Blutproben stammt, die von einem ersten Subjekt erhalten wurden, und das Serum aus einer oder mehreren Blutproben stammen, die von einem zweiten Subjekt erhalten wurden, wobei das erste Subjekt und das zweite Subjekt nicht dasselbe Subjekt sind.
10. Kit-of-Parts nach einem der Gegenstände 1 oder 3 bis 9 oder Lösung nach einem der Gegenstände 2 bis 9, wobei das Hypoxie-konditionierte Medium und/oder das Serum zellfrei sind.
11. Lösung nach einem der Gegenstände 2 bis 10, wobei die Lösung zellfrei ist.
12. Verfahren zur Herstellung eines Kit-of-Parts, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
1. (i) Bereitstellen einer Blutprobe von einem Subjekt;
2. (ii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (i) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (i), wodurch eine Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst;
3. (iii) Entfernen von wenigstens einem Teil des Serums aus der in Schritt (ii) erhaltenen Zusammensetzung und Bestimmen des Volumens des entfernten Serums;
4. (iv) Hinzufügen eines Mediums zu dem Blutgerinnsel, wobei das Volumen des hinzugefügten Mediums gleich oder kleiner als das Volumen des in Schritt (iii) entfernten Serums ist;
5. (v) Inkubieren des Gerinnsels in dem Medium bei einer Temperatur zwischen 10 °C und 40 °C unter hypoxischen Bedingungen für 1 bis 7 Tage, wodurch ein Hypoxie-konditioniertes Medium erhalten wird;
6. (vi) Sammeln von wenigstens einem Teil des in Schritt (v) erhaltenen Hypoxie-konditionierten Mediums; und
7. (vii) Herstellen eines Kit-of-Parts, umfassend:
  1. (a) das in Schritt (vi) gesammelte Hypoxie-konditionierte Medium und
  2. (b) wenigstens ein Teil des in Schritt (iii) entfernten Serums.
13. Verfahren zur Herstellung einer Lösung von Wachstumsfaktoren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
1. (i) Bereitstellen einer Blutprobe von einem Subjekt;
2. (ii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (i) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (i), wodurch eine Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst;
3. (iii) Entfernen von wenigstens einem Teil des Serums aus der in Schritt (ii) erhaltenen Zusammensetzung und Bestimmen des Volumens des entfernten Serums;
4. (iv) Hinzufügen eines Mediums zu dem Blutgerinnsel, wobei das Volumen des hinzugefügten Mediums gleich oder kleiner als das Volumen des in Schritt (iii) entfernten Serums ist;
5. (v) Inkubieren des Gerinnsels in dem Medium bei einer Temperatur zwischen 10 °C und 40 °C unter hypoxischen Bedingungen für 1 bis 7 Tage, wodurch ein Hypoxie-konditioniertes Medium erhalten wird;
6. (vi) Sammeln von wenigstens einem Teil des in Schritt (v) erhaltenen Hypoxie-konditionierten Mediums;
7. (vii) Mischen des in Schritt (vi) gesammelten Hypoxie-konditionierten Mediums mit wenigstens einem Teil des in Schritt (iii) entfernten Serums, wodurch die Lösung von Wachstumsfaktoren erhalten wird.
14. Verfahren zur Herstellung eines Kit-of-Parts, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
1. (i) Bereitstellen einer ersten Blutprobe von einem Subjekt;
2. (ii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (i) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (i), wodurch eine erste Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst;
3. (iii) Entfernen von wenigstens einem Teil des Serums aus der ersten in Schritt (ii) erhaltenen Zusammensetzung und Bestimmen des Volumens des entfernten Serums;
4. (iv) Hinzufügen eines Mediums zu dem Blutgerinnsel, wobei das Volumen des hinzugefügten Mediums gleich oder kleiner als das Volumen des in Schritt (iii) entfernten Serums ist;
5. (v) Inkubieren des Gerinnsels in dem Medium bei einer Temperatur zwischen 10 °C und 40 °C unter hypoxischen Bedingungen für 1 bis 7 Tage, wodurch ein Hypoxie-konditioniertes Medium erhalten wird;
6. (vi) Sammeln von wenigstens einem Teil des in Schritt (v) erhaltenen Hypoxie-konditionierten Mediums;
7. (vii) Bereitstellen einer zweiten Blutprobe von einem Subjekt;
8. (viii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (vii) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (vii), wodurch eine zweite Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst;
9. (ix) Gewinnen wenigstens eines Teils des Serums aus der in Schritt (viii) erhaltenen zweiten Zusammensetzung; und
10. (x) Herstellen eines Kit-of-Parts, umfassend:
  1. (a) das in Schritt (vi) gesammelte Hypoxie-konditionierte Medium und
  2. (b) das in Schritt (ix) gewonnene Serum.
15. Verfahren zur Herstellung einer Lösung von Wachstumsfaktoren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
1. (i) Bereitstellen einer ersten Blutprobe von einem Subjekt;
2. (ii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (i) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (i), wodurch eine erste Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst;
3. (iii) Entfernen von wenigstens einem Teil des Serums aus der ersten in Schritt (ii) erhaltenen Zusammensetzung und Bestimmen des Volumens des entfernten Serums;
4. (iv) Hinzufügen eines Mediums zu dem Blutgerinnsel, wobei das Volumen des hinzugefügten Mediums gleich oder kleiner als das Volumen des in Schritt (iii) entfernten Serums ist;
5. (v) Inkubieren des Gerinnsels in dem Medium bei einer Temperatur zwischen 10 °C und 40 °C unter hypoxischen Bedingungen für 1 bis 7 Tage, wodurch ein Hypoxie-konditioniertes Medium erhalten wird;
6. (vi) Sammeln von wenigstens einem Teil des in Schritt (v) erhaltenen Hypoxie-konditionierten Mediums;
7. (vii) Bereitstellen einer zweiten Blutprobe von einem Subjekt;
8. (viii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (vii) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (vii), wodurch eine zweite Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst;
9. (ix) Gewinnen von wenigstens einem Teil des Serums aus der in Schritt (viii) erhaltenen zweiten Zusammensetzung, wodurch ein Serum erhalten wird; und
10. (x) Mischen des in Schritt (vi) gesammelten Hypoxie-konditionierten Mediums mit wenigstens einem Teil des in Schritt (ix) gewonnenen Serums, wodurch die Lösung von Wachstumsfaktoren erhalten wird.
16. Verfahren nach Gegenstand 14 oder Gegenstand 15, wobei die erste Blutprobe und die zweite Blutprobe von demselben Subjekt erhalten wurden.
17. Verfahren nach einem der Gegenstände 12 bis 16, wobei die hypoxischen Bedingungen in dem Medium in Schritt (v) durch zellvermittelten Sauerstoffverbrauch in einem normoxischen Inkubator und/oder in einem mit Sauerstoff regulierten Inkubator erreicht werden.
18. Verfahren nach einem der Gegenstände 12 bis 17, wobei die Inkubation in Schritt (v) bei einer Sauerstoffkonzentration zwischen 1 und 10 % durchgeführt wird.
19. Verfahren nach einem der Gegenstände 12 bis 18, wobei das Volumen des in Schritt (iv) zugesetzten Mediums zwischen 1/200 und 2/3 des Volumens des in Schritt (iii) entfernten Serums liegt.
20. Verfahren nach einem der Gegenstände 12 bis 19, wobei Schritt (vi) das wiederholte Sammeln von Hypoxie-konditioniertem Medium durch Ausführen der folgenden Schritte umfasst:
1. (1) Sammeln von wenigstens einem Teil des Hypoxie-konditionierten Mediums zu einem ersten Zeitpunkt,
2. (2) Zugabe von Medium zu dem Blutgerinnsel, wodurch das in Schritt (1) gesammelte Hypoxie-konditionierte Medium ersetzt wird,
3. (3) Fortsetzen der Inkubation,
4. (4) Sammeln von wenigstens einem Teil des Hypoxie-konditionierten Mediums zu einem zweiten Zeitpunkt, und
5. (5) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (2) bis (4) zwischen 1-mal und 5-mal.
21. Verfahren nach Gegenstand 20, wobei das Volumen des in Schritt (iv) zugesetzten Mediums und/oder des in Schritt (2) zugesetzten Mediums gleich oder geringer als das Volumen des in Schritt (iii) entfernten Serums ist, bevorzugt das Gesamtvolumen des in Schritt (iv) zugesetzten Mediums und des in Schritt (2) zugesetzten Mediums gleich oder geringer als das Volumen des in Schritt (iii) entfernten Serums ist.
22. Verfahren nach einem der Gegenstände 12 bis 21, wobei die in Schritt (vii) von Gegenstand 13 oder in Schritt (x) von Gegenstand 15 erhaltene Lösung von Wachstumsfaktoren durch Mischen eines gegebenen Volumens von Hypoxiekonditioniertem Medium (V_hcm) mit einem Serumvolumen (V_s), das folgende Ungleichung erfüllt: $\frac{V_{h c m} * V_{s_{t o t a l}}}{V_{h c m_{t o t a l}}} - V_{h c m}$
wobei V_s das Volumen des Serums ist, das zum Mischen verwendet werden kann, wobei V_hcm das Volumen des Hypoxie-konditionierten Mediums ist, das zum Mischen verwendet wird, wobei V_s
total das Gesamtvolumen des in Schritt (iii) entfernten Serums ist, wobei V_hcm
total das Gesamtvolumen des in Schritt (iv) hinzugefügten Mediums ist, und wobei zusätzlich folgende Bedingung gilt: V_hcm
total ≤ V_s
total.
23. Verfahren nach einem der Gegenstände 12 bis 22, wobei das Medium ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus serumhaltigem Kulturmedium, serumfreiem Kulturmedium, einer Lösung, die mit Blut isotonisch ist, einem Kulturmedium mit Glucose, einem Kulturmedium ohne Glucose, einem Kulturmedium mit Albumin und einem Kulturmedium ohne Albumin.
24. Kit-of-Parts, hergestellt nach einem der Gegenstände 12, 14 oder 16 bis 20.
25. Lösung von Wachstumsfaktoren, hergestellt nach einem der Gegenstände 13, 15 oder 16 bis 20.
26. Zusammensetzung umfassend
1. (a) die Lösung eines der Gegenstände 2 bis 11 oder 25; und
2. (b) einen Hilfsstoff.
27. Zusammensetzung nach Gegenstand 26, wobei die Zusammensetzung eine pharmazeutische Zusammensetzung oder eine kosmetische Zusammensetzung ist.
28. Zusammensetzung nach Gegenstand 26 oder 27, wobei der Hilfsstoff Fibrinogen ist.
29. Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 26 bis 28, wobei die Zusammensetzung ferner umfasst:
- (c) einen Träger.
30. Zusammensetzung nach Gegenstand 29, wobei der Träger in Form einer Creme, eines Erweichungsmittels, einer Salbe, eines Gels, eines Sol-Gels, eines Sprays, eines Pulvers, eines Netzes, eines Schwamms, eines Pflasters, eines Verbands, von Nanopartikels, Mikropartikels, Nanofasern oder Mikrofasern ist.
31. Zusammensetzung nach Gegenstand 29 oder 30, wobei der Träger eine oder mehrere Substanzen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Polysacchariden, Glycosaminoglycan und synthetischen Polymeren.
32. Lösung nach einem der Gegenstände 2 bis 11 oder 25 oder Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 26 bis 31 zur Verwendung in der Medizin.
33. Lösung nach einem der Gegenstände 2 bis 11 oder 25 oder Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 26 bis 31 zur Verwendung bei der Verbesserung bei der Verbesserung der Gewebeblutperfusion, zur Verwendung bei der Stimulation der Angiogenese, zur Verwendung bei der Behandlung von Haut, die debridiert wurde, zur Verwendung bei der Behandlung von übermäßiger Vernarbung, zur Verwendung bei der Behandlung von Transplantaten, zur Verwendung bei der Behandlung von Klappen, zur Verwendung bei der Behandlung von Wunden und/oder zur Verwendung bei der Behandlung von Gewebeschäden.
34. Lösung zur Verwendung oder Zusammensetzung zur Verwendung nach Gegenstand 32 oder 33, wobei die Lösung oder Zusammensetzung zur autologen Verabreichung oder zur allogenen Anwendung ist.
35. Lösung zur Verwendung oder Zusammensetzung zur Verwendung nach einem der Gegenstände 32 bis 34, wobei die Lösung oder Zusammensetzung zur epidermalen Verabreichung, intradermalen Verabreichung oder zur subkutanen Verabreichung ist.
36. Kosmetische, nicht therapeutische Verwendung der Lösung nach einem der Gegenstände 2 bis 11 oder 25 oder der Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 26 bis 31.
37. Kosmetische, nicht-therapeutische Verwendung nach Gegenstand 36, wobei die Verwendung zur Verbesserung des Aussehens der Haut, zum Stimulieren von neuem Haarwachstum, zum Verstärken von Weichgewebe, zum Verringern von Falten, zur Hautverjüngung, zum Verbessern des Aussehens von Narben, zur Verringerung übermäßiger Hautpigmentierung und/oder zur Verbesserung der Pigmentierung in der Haut mit reduzierter Pigmentierung ist.
38. Kit zur Herstellung von aus Blut gewonnenem Serum und/oder Hypoxie-konditioniertem Medium, wobei das Kit umfasst:
1. (a) eine erste Spritze,
2. (b) eine zweite Spritze,
3. (c) gegebenenfalls eine dritte Spritze,
4. (d) gegebenenfalls eine vierte Spritze,
5. (e) ein Dreiwegeventil,
6. (f) ein Filter,
7. (g) eine Kappe,
8. (h) gegebenenfalls einen Behälter, der steriles Medium enthält,
9. (i) gegebenenfalls einen Katheter oder eine Schmetterlingskanüle,
10. (j) gegebenenfalls ein Heftpflaster,
11. (k) gegebenenfalls ein Gestell, in das die erste Spritze aufgerichtet platziert und gehalten werden kann, und
12. (l) gegebenenfalls einen Spatel.
39. Verwendung des Kit-of-Parts nach Gegenstand 38 in einem Verfahren nach einem der Gegenstände 12 bis 23.

Claims

Kit-of-Parts, umfassend: (a) ein Hypoxie-konditioniertes Medium, das aus Blut stammt; und (b) ein Serum in separaten Behältern.
Lösung von Wachstumsfaktoren, umfassend eine Mischung aus (a) ein Hypoxie-konditioniertes Medium, das aus Blut stammt; und (b) ein Serum.
Kit-of-Parts nach Anspruch 1 oder Lösung nach Anspruch 2, wobei - das Hypoxie-konditionierte Medium eine geringere Konzentration an Thrombozytenfaktor 4 (PF4) als das Serum hat, und/oder - das Hypoxie-konditionierte Medium PF4 in einer Konzentration zwischen 0 ng/ml und 15.000 ng/ml, bevorzugt zwischen 5 ng/ml und 5.000 ng/ml enthält, und/oder - das Hypoxie-konditionierte Medium wenigstens einen Angiogenese-verwandten Wachstumsfaktor enthält, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus VEGF, TSP1, IL8, Angiogenin (ANG), MMP-9, MMP-8, TIMP-1 und PDGF besteht, und/oder - das Hypoxie-konditionierte Medium eine höhere Konzentration an vaskulärem entodthelialem Wachstumsfaktor (VEGF) als das Serum hat, und/oder - die VEGF-Konzentration in dem Hypoxie-konditionierten Medium größer als 100 pg/ml ist, und/oder - das Hypoxie-konditionierte Medium und/oder das Serum aus einer oder mehreren Blutproben stammen, die von demselben Subjekt erhalten wurden, und/oder - das Hypoxie-konditionierte Medium aus einer oder mehreren Blutproben stammt, die von einem ersten Subjekt erhalten wurden, und das Serum aus einer oder mehreren Blutproben stammt, die von einem zweiten Subjekt erhalten wurden, wobei das erste Subjekt und das zweite Subjekt nicht das gleiche Subjekt sind, und/oder - das Hypoxie-konditionierte Medium und/oder das Serum zellfrei sind.
Verfahren zur Herstellung eines Kit-of-Parts, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Bereitstellen einer Blutprobe von einem Subjekt; (ii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (i) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (i), wodurch eine Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst; (iii) Entfernen von wenigstens einem Teil des Serums aus der in Schritt (ii) erhaltenen Zusammensetzung und Bestimmen des Volumens des entfernten Serums; (iv) Hinzufügen eines Mediums zu dem Blutgerinnsel, wobei das Volumen des hinzugefügten Mediums gleich oder kleiner als das Volumen des in Schritt (iii) entfernten Serums ist; (v) Inkubieren des Gerinnsels in dem Medium bei einer Temperatur zwischen 10 ° C und 40 ° C unter hypoxischen Bedingungen für 1 bis 7 Tage, wodurch ein Hypoxie-konditioniertes Medium erhalten wird; (vi) Sammeln von wenigstens einem Teil des in Schritt (v) erhaltenen Hypoxie-konditionierten Mediums; und (vii) Herstellen eines Teilekits, umfassend: (a) das in Schritt (vi) gesammelte Hypoxie-konditionierte Medium und (b) wenigstens ein Teil des in Schritt (iii) entfernten Serums.
Verfahren zur Herstellung einer Lösung von Wachstumsfaktoren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Bereitstellen einer Blutprobe von einem Subjekt; (ii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (i) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (i), wodurch eine Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst; (iii) Entfernen von wenigstens einem Teil des Serums aus der in Schritt (ii) erhaltenen Zusammensetzung und Bestimmen des Volumens des entfernten Serums; (iv) Hinzufügen eines Mediums zu dem Blutgerinnsel, wobei das Volumen des hinzugefügten Mediums gleich oder kleiner als das Volumen des in Schritt (iii) entfernten Serums ist; (v) Inkubieren des Gerinnsels in dem Medium bei einer Temperatur zwischen 10 ° C und 40 ° C unter hypoxischen Bedingungen für 1 bis 7 Tage, wodurch ein Hypoxie-konditioniertes Medium erhalten wird; (vi) Sammeln von wenigstens einem Teil des in Schritt (v) erhaltenen Hypoxie-konditionierten Mediums; (vii) Mischen des in Schritt (vi) gesammelten Hypoxie-konditionierten Mediums mit wenigstens einem Teil des in Schritt (iii) entfernten Serums, wodurch die Lösung von Wachstumsfaktoren erhalten wird.
Verfahren zur Herstellung eines Kit-of-Parts, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Bereitstellen einer ersten Blutprobe von einem Subjekt; (ii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (i) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (i), wodurch eine erste Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst; (iii) Entfernen von wenigstens einem Teil des Serums aus der ersten in Schritt (ii) erhaltenen Zusammensetzung und Bestimmen des Volumens des entfernten Serums; (iv) Hinzufügen eines Mediums zu dem Blutgerinnsel, wobei das Volumen des hinzugefügten Mediums gleich oder kleiner als das Volumen des in Schritt (iii) entfernten Serums ist; (v) Inkubieren des Gerinnsels in dem Medium bei einer Temperatur zwischen 10 ° C und 40 ° C unter hypoxischen Bedingungen für 1 bis 7 Tage, wodurch ein Hypoxie-konditioniertes Medium erhalten wird; (vi) Sammeln von wenigstens einem Teil des in Schritt (v) erhaltenen Hypoxie-konditionierten Mediums; (vii) Bereitstellen einer zweiten Blutprobe von einem Subjekt; (viii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (vii) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (vii), wodurch eine zweite Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst; (ix) Gewinnen wenigstens eines Teils des Serums aus der in Schritt (viii) erhaltenen zweiten Zusammensetzung; und (x) Herstellen eines Kit-of-Parts, umfassend: (a) das in Schritt (vi) gesammelte Hypoxie-konditionierte Medium und (b) das in Schritt (ix) gewonnene Serum.
Verfahren zur Herstellung einer Lösung von Wachstumsfaktoren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Bereitstellen einer ersten Blutprobe von einem Subjekt; (ii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (i) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (i), wodurch eine erste Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst; (iii) Entfernen von wenigstens einem Teil des Serums aus der ersten in Schritt (ii) erhaltenen Zusammensetzung und Bestimmen des Volumens des entfernten Serums; (iv) Hinzufügen eines Mediums zu dem Blutgerinnsel, wobei das Volumen des hinzugefügten Mediums gleich oder kleiner als das Volumen des in Schritt (iii) entfernten Serums ist; (v) Inkubieren des Gerinnsels in dem Medium bei einer Temperatur zwischen 10 ° C und 40 ° C unter hypoxischen Bedingungen für 1 bis 7 Tage, wodurch ein Hypoxie-konditioniertes Medium erhalten wird; (vi) Sammeln von wenigstens einem Teil des in Schritt (v) erhaltenen Hypoxie-konditionierten Mediums; (vii) Bereitstellen einer zweiten Blutprobe von einem Subjekt; (viii) Gerinnenlassen der Blutprobe von Schritt (vii) oder Induzieren einer Gerinnung in der Blutprobe von Schritt (vii), wodurch eine zweite Zusammensetzung erhalten wird, die ein Blutgerinnsel und Serum umfasst; (ix) Gewinnen von wenigstens einem Teil des Serums aus der in Schritt (viii) erhaltenen zweiten Zusammensetzung, wodurch ein Serum erhalten wird; und (x) Mischen des in Schritt (vi) gesammelten Hypoxie-konditionierten Mediums mit wenigstens einem Teil des in Schritt (ix) gewonnenen Serums, wodurch die Lösung von Wachstumsfaktoren erhalten wird.
Kit-of-Parts, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 6.
Lösung von Wachstumsfaktoren, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 7.
Zusammensetzung umfassend (a) die Lösung nach einem der Ansprüche 2 bis 3 oder 9; (b) einen Hilfsstoff, bevorzugt Fibrinogen; und (c) gegebenenfalls einen Träger.
Lösung nach einem der Ansprüche 2 bis 3 oder 9 oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 10 zur Verwendung in der Medizin; bevorzugt zur Verwendung bei der Verbesserung der Gewebeblutperfusion, zur Verwendung bei der Stimulation der Angiogenese, zur Verwendung bei der Behandlung von Haut, die debridiert wurde, zur Verwendung bei der Behandlung von übermäßiger Vernarbung, zur Verwendung bei der Behandlung von Transplantaten, zur Verwendung bei der Behandlung von Klappen, zur Verwendung bei der Behandlung von Wunden und/oder zur Verwendung bei der Behandlung von Gewebeschäden.
Kosmetische, nicht-therapeutische Verwendung der Lösung nach einem der Ansprüche 2 bis 3 oder 9 oder der Zusammensetzung nach Anspruch 10.
Kosmetische, nichttherapeutische Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Verwendung zur Verbesserung des Aussehens der Haut, zum Stimulieren von neuem Haarwachstum, zum Verstärken von Weichgewebe, zum Verringern von Falten, zur Hautverjüngung, zum Verbessern des Aussehens von Narben, zur Verringerung übermäßiger Hautpigmentierung und/oder zur Verbesserung der Pigmentierung in der Haut mit reduzierter Pigmentierung ist.
Kit zur Herstellung von aus Blut gewonnenem Serum und/oder Hypoxiekonditioniertem Medium, wobei das Kit umfasst: (a) eine erste Spritze, (b) eine zweite Spritze, (c) gegebenenfalls eine dritte Spritze, (d) gegebenenfalls eine vierte Spritze, (e) ein Dreiwegeventil, (f) ein Filter, (g) eine Kappe, (h) gegebenenfalls einen Behälter, der steriles Medium enthält, (i) gegebenenfalls eines Katheters oder einer Schmetterlingskanüle, (j) gegebenenfalls ein Heftpflaster, (k) gegebenenfalls ein Gestell, in das die erste Spritze aufgerichtet platziert und gehalten werden kann, und (1) gegebenenfalls einen Spatel.
Verwendung des Kits nach Anspruch 14 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7.