BR112020015616B1

BR112020015616B1 - Composição de biotinta para folha de regeneração de derme, método para fabricar folha de regeneração de derme customizada usando a mesma e folha de regeneração de derme customizada fabricada usando o método de fabricação

Info

Publication number: BR112020015616B1
Application number: BR112020015616-7A
Authority: BR
Inventors: Seok Hwan You
Original assignee: Rokit Healthcare Inc
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2023-11-21
Also published as: CO2020009504A2; BR112020015616A2; SG11202007127QA; RU2020124018A3; JP2021512680A; KR20200001580A; EP3747478A1; EP3747478B1; CL2020002005A1; JOP20200188A1; EP3747478A4; WO2019151611A1; KR20190098907A; PE20211587A1; JP7105898B2; CN111670056B; EP3747478C0; SA520412549B1; CN111670056A; RU2020124018A

Abstract

A presente invenção se refere auma composição de biotinta para uma folha de regeneração de derme e um método para fabricar uma folha de regeneração de derme customizada usando a mesma, sendo que a composição de biotinta compreende: um primeiro líquido que compreende uma fração vascularde estroma derivada de tecido adiposo, uma matriz extracelular e fibrinogênio; e um segundo líquido que compreende trombina.

Description

[Campo Técnico]

[0001] O presente relatório descritivo reivindica prioridade a e o benefício de Pedido de Patente Coreano n° 10-2018-0012220 depositado no Escritório de Propriedade Intelectual Coreano em 31 de janeiro de 2018, cujo conteúdo do mesmo é incorporado ao presente documento a título de referência.

[0002] A presente invenção se refere a uma composição de biotinta para uma folha de regeneração de derme, um método para fabricar uma folha de regeneração de derme customizada usando o mesmo, e uma folha de regeneração de derme customizada fabricada usando o dito método de fabricação.

[Antecedentes da Técnica]

[0003] O presente relatório descritivo reivindica prioridade a e o benefício de Pedido de Patente Coreano n° 10-2018-0012220 depositado no Escritório de Propriedade Intelectual Coreano em 31 de janeiro de 2018, cujo conteúdo do mesmo é incorporado ao presente documento a título de referência.

[0004] A presente invenção se refere a uma composição de biotinta para uma folha de regeneração de derme, um método para fabricar uma folha de regeneração de derme customizada usando o mesmo, e uma folha de regeneração de derme customizada fabricada usando o dito método de fabricação.

[0005] A pele é o maior órgão que cobre toda a superfície do corpo humano, e funciona para impedir a perda de fluidos corporais, impedir o influxo de materiais prejudiciais e microrganismos externos, e proteger nossos corpos de irritação física, radiação, raios ultravioletas e similares. A pele tem diversos órgãos acessório como folículos capilares, cabelo, glândulas sudoríparas e glândulas sebáceas e, desse modo, é um órgão complexo importante que realiza diversas funções além da função de filme protetor. A pele é aproximadamente dividida na epiderme, na derme e no tecido subcutâneo (hipoderme).

[0006] A derme é uma camada abaixo da epiderme, é uma camada que fornece um substrato que suporta diversas estruturas, como vasos sanguíneos e nervos, e consiste em colágeno, fibras elásticas e matrizes extracelulares. A derme consiste amplamente em uma camada papilar, na qual fibroblastos são abundantes na região superior e microvasos são distribuídos e um tecido conector reticular no qual fibras de colágeno são abundantes.

[0007] Uma parte do tecido de pele pode ser danificada por queimaduras, trauma, doenças de pele e, nesse caso, um método de autoenxerto para implantar o tecido de pele da pessoa com o propósito de curar tecido danificado ou para cirurgia reconstrutiva, um método de homoenxerto ou aloenxerto para implantar a pele de outra pessoa, e um método de heteroenxerto ou xenoenxerto para implantar a pele de um animal são usados. Dentre esses métodos, o autoenxerto é o mais ideal, mas tem desvantagens uma vez que, quando um sítio de tratamento é amplo, o sítio no qual o tecido pode ser preso é limitado, e o sítio de coleta permanece como um novo sítio de ferida. O homoenxerto ou aloenxerto serve para auxiliar na migração e cura de células ao redor de um ferimento.

[0008] A pele artificial é reconstruída de modo tridimensional pele usando pele células e componentes de pele, como colágeno e elastina, e é chamada um equivalente de pele ou pele reconstruída devido ao fato de que a pele artificial consiste em fibroblastos vivos e queratinócitos para exibir características morfológicas e fisiológicas similares àquelas de pele real. A pele artificial foi desenvolvida nos anos 1980 com o propósito de tratar pacientes que adquiriram implante de pele devido a queimaduras severas, mas sua própria pele não pode ser implantada devido ao fato de que a gravidade da queimadura é muito alta ou a área afetada é muito ampla, e através de pesquisa e aprimoramento contínuo, pele artificial é atualmente usada em diversos campos, como pesquisa de fisiologia de pele, avaliação de irritação de pele e avaliação de eficácia de pele. No entanto, pele artificial existente tem um problema de que ocorre um fenômeno em que a derme gradualmente se contrai durante a cultura de tecido no método de fabricação, e quando a derme se contrai bruscamente, a pele artificial é completamente deformada.

[0009] No caso de agentes terapêuticos celulares existentes, um método para implantar células alogênicas usando as células alogênicas ou um método de transplantar células autólogas tem sido usado. A implantação de células alogênicas tem um efeito parácrino, mas tem um problema em que o corpo percebe as células alogênicas como um corpo estranho e as células alogênicas eventualmente desaparecem. Além disso, quando células autólogas são implantadas por um método de injeção, é altamente provável que as células irão desaparecer quando não há ambiente (por exemplo, um arcabouço) para as células crescerem, e eventualmente, é difícil observar um efeito ocasionado por células injetadas.

[0010] Ademais, a implantação autóloga na qual uma parte de um tecido autólogo é isolada, cultivada e proliferada tem problemas, como a possibilidade de cicatrização de um sítio doador e a ausência de um sítio doador quando um sítio a ser implantado é amplo, e o aloenxerto e o xenoenxerto têm problemas como respostas de rejeição imune ou indução de inflamação. Portanto, há uma necessidade de desenvolver um método com capacidade de substituir ou regenerar pele danificada e minimizar os efeitos colaterais como descrito acima.

[Documentos de Técnica Anterior] [Documento de Patente]

[0011] Patente Coreana n°: 10-1710615

[Revelação] [Problema Técnico]

[0012] A presente invenção foi produzida em um esforço para fornecer uma composição de biotinta para uma folha de regeneração de derme com capacidade de minimizar uma resposta de rejeição de implantação e fabricar uma folha de regeneração de derme customizada de paciente, um método para fabricar uma folha de regeneração de derme customizada usando a mesma, e uma folha de regeneração de derme.

[Solução Técnica]

[0013] Uma modalidade exemplificativa da presente invenção fornece uma composição de biotinta para uma folha de regeneração de derme, sendo que a composição de biotinta compreende: um primeiro líquido que compreende uma fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo, uma matriz extracelular, e fibrinogênio; e um segundo líquido que compreende trombina.

[0014] Outra modalidade exemplificativa da presente invenção fornece um método para fabricar uma folha de regeneração de derme customizada, sendo que o método compreende: a) obter dados em 3D de um sítio de derme defeituoso usando um digitalizador 3D; b) formar uma primeira camada que corresponde a um formato dos dados em 3D obtidos usando um primeiro líquido que compreende uma fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo, uma matriz extracelular, e fibrinogênio; c) formar uma segunda camada aplicando-se um segundo líquido que compreende trombina na primeira camada; e d) formar uma folha de regeneração de derme ao permitir que a primeira camada e a segunda camada reajam uma com a outra.

[0015] Ainda outra modalidade exemplificativa da presente invenção fornece uma folha de regeneração de derme customizada fabricada usando o método de fabricação.

[Efeitos Vantajosos]

[0016] Uma composição de biotinta para uma folha de regeneração de derme de acordo com a presente invenção e um método para fabricar uma folha de regeneração de derme customizada usando a mesma têm uma vantagem de que uma folha de regeneração dérmica adequada para um tecido de pele danificado de um paciente pode ser fabricada. Especificamente, o método para fabricar uma folha de regeneração de derme customizada de acordo com a presente invenção pode fabricar uma folha de regeneração de derme que tem um formato que corresponde a uma área afetada por digitalização em 3D de um formato preciso da área afetada.

[0017] A folha de regeneração de derme de acordo com a presente invenção tem uma vantagem de que a implantação pode ser realizada sem uma resposta de rejeição imune, e também tem uma vantagem de que células saudáveis podem ser implantadas em uma área afetada devido ao fato de que a folha de regeneração de derme pode ser fabricada dentro de um curto período de tempo

[Descrição dos Desenhos]

[0018] A FIG. 1 ilustra um processo de, respectivamente, preparar um primeiro líquido e um segundo líquido a fim de fabricar uma folha de regeneração de derme customizada de acordo com a presente invenção.

[0019] A FIG. 2 mostra fotografias que confirmam a viabilidade celular da folha de regeneração de derme customizada de acordo com o Exemplo Experimental 1.

[0020] A FIG. 3 mostra uma fotografia na qual a pele é removida em um experimento com animal para o Exemplo Experimental 2.

[0021] A FIG. 4 mostra um controle preparado de acordo com o Exemplo Experimental 2 e uma folha de regeneração de derme customizada do Exemplo.

[0022] A FIG. 5 mostra o progresso das folhas de regeneração de derme customizadas implantadas de acordo com o Exemplo Experimental 2.

[0023] A FIG. 6 mostra os resultados de realizar coloração Tricrômio de Masson em um experimento com animal do Exemplo Experimental 2.

[0024] A FIG. 7 mostra a presença ou ausência de angiogênese em um sítio implantado como resultado do experimento com animal de acordo com o Exemplo Experimental 2 usando coloração CD31.

[Modos da Invenção]

[0025] Quando um membro está disposto “em” outro membro no presente relatório descritivo, isso inclui não apenas um caso no qual o um membro é colocado em contato com outro membro, mas também um caso em que ainda outro membro está presente entre os dois membros.

[0026] Quando uma parte “inclui” um elemento constituinte no presente relatório descritivo, a menos que especificamente descrito de outro modo, isso não significa que outro elemento constituinte é excluído, mas significa que outro elemento constituinte pode ser ainda incluído.

[0027] Doravante, a presente invenção será descrita em detalhes.

[0028] Uma modalidade exemplificativa da presente invenção fornece uma composição de biotinta para uma folha de regeneração de derme, sendo que a composição de biotinta compreende: um primeiro líquido que compreende uma fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo, uma matriz extracelular, e fibrinogênio; e um segundo líquido que compreende trombina.

[0029] A composição de biotinta para uma folha de regeneração de derme de acordo com a presente invenção é um tipo de dois líquidos, e o primeiro líquido e o segundo líquido podem ser aplicados de modo sequencial e, então, reagidos para formar uma folha de regeneração de derme. Especificamente, a trombina no segundo líquido pode ser reagida com o fibrinogênio no primeiro líquido para formar uma rede de fibrina, que pode servir para fixar de modo suficiente a fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo e a matriz extracelular.

[0030] A fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo inclui células-tronco derivadas de adiposo. De preferência, a fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode não incluir substancialmente células (por exemplo, adipócitos, eritrócitos, outras células de estroma e similares) além de células-tronco derivadas de tecido adiposo e materiais de matriz extracelular e, mais preferencialmente, pode não incluir outras células e materiais de matriz extracelular de modo algum.

[0031] A fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode ser extraída de um tecido adiposo de um animal alogênico ou um animal heterólogo. De preferência, a fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode ser extraída de um tecido adiposo autólogo. Mais especificamente, a fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode ser extraída usando um tecido adiposo de um paciente ou animal a ser tratado. A fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode ser obtida extraindo-se a fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo (SVF), uma matriz extracelular (ECM), e similares na forma de um micro ou nano conjunto de SVF/ECM de um tecido adiposo, e uma fração vascular de estroma pura derivada de tecido adiposo (SVF) e matriz extracelular (ECM) também podem ser separadas uma da outra e usada. Como exemplo, a fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode ser extraída de um tecido adiposo usando um kit Lipocell disponível junto à Tiss'you. No entanto, a presente invenção não é limitada ao mesmo, e a fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode ser obtida usando um método, um kit de extração, e similares conhecidos na técnica.

[0032] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, uma concentração da fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo no primeiro líquido pode ser 105 de células/ml a 107 de células/ml. Quando a concentração da fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo está dentro da faixa descrita acima, uma folha de regeneração de derme customizada a ser fabricada pode diferenciar de modo eficaz a fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo em células dérmicas em um sítio de implantação.

[0033] Quanto maior o teor da fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo for, mais o efeito é aprimorado, mas quando o teor do mesmo é extremamente alto, pode ser difícil que o efeito ocasionado pela matriz extracelular, fibrinogênio, e similares seja expresso. Portanto, o teor da fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode equilibrar o teor dos outros componentes constituídos no primeiro líquido.

[0034] A fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode ser usada com uma matriz extracelular derivada de tecido adiposo para promover diferenciação em células dérmicas. Especificamente, a matriz extracelular derivada de tecido adiposo tem fatores biotécnicos necessários para o crescimento e diferenciação de células essenciais para a cura de ferimento em uma área afetada, e pode fornecer um ambiente físico no qual a fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode se diferenciar em células dérmicas e, então, fixada.

[0035] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a matriz extracelular pode ser extraída de um tecido adiposo (ou células) de um animal alogênico ou heterólogo. Além disso, a matriz extracelular pode ser extraída de um tecido fibroso (ou células) de um animal alogênico ou heterólogo. Especificamente, a matriz extracelular pode ser extraída de um tecido adiposo autólogo (ou células) ou um tecido fibroso autólogo (ou células). Mais especificamente, a matriz extracelular pode ser extraída usando adipócitos de um paciente ou animal a ser tratado.

[0036] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a matriz extracelular pode ser descelularizada.

[0037] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a matriz extracelular pode ser partículas que têm um diâmetro de 5 μm a 100 μm. Especificamente, a matriz extracelular pode ser descelularizada e pulverizada por um método físico e preparada em uma forma de particulado. Além disso, a matriz extracelular pode ser obtida usando métodos conhecidos na técnica.

[0038] Uma matriz de fibrina através de uma reação de fibrinogênio do primeiro líquido e trombina do segundo líquido pode servir para fixar a fração vascular de sangue de estroma derivada de tecido adiposo e a matriz extracelular.

[0039] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, um teor da matriz extracelular no primeiro líquido pode ser 20 % em peso a 60 % em peso. Especificamente, o teor da matriz extracelular no primeiro líquido pode ser 20 % em peso a 50 % em peso. Quando o teor da matriz extracelular está dentro da faixa acima, a viabilidade de diferenciação celular em células dérmicas pode ser aprimorada para alcançar de modo eficaz a regeneração de um sítio de derme defeituoso. Quando o teor da matriz extracelular é muito alto, o teor de fibrinogênio e trombina para fabricar uma folha de regeneração de derme são relativamente reduzidas, de modo que possa haver um problema em que é difícil de manter a forma de uma folha de regeneração de derme preparada. Além disso, quando o teor da matriz extracelular é muito baixo, o teor de fibrinogênio e trombina para fabricar uma folha de regeneração de derme são extremamente aumentados, e como resultado, a folha de regeneração de derme fabricada se torna extremamente dura, de modo que possa haver um problema em que é difícil esperar um efeito ocasionado pela matriz extracelular. Portanto, é preferencial aprimorar a viabilidade de diferenciação celular em células dérmicas ajustando-se o teor da matriz extracelular à faixa acima e, além disso, para facilitar a manutenção do formato da folha de regeneração de derme.

[0040] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, uma concentração de fibrinogênio no primeiro líquido pode ser 4 mg/ml a 50 mg/ml. Ademais, a concentração de fibrinogênio no primeiro líquido pode ser 5 mg/ml a 40 mg/ml, ou 7 mg/ml a 30 mg/ml.

[0041] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, uma concentração de trombina no segundo líquido pode ser 30 IU/ml a 250 IU/ml. Além disso, a concentração de trombina no segundo líquido pode ser 40 IU/ml a 250 IU/ml, 40 IU/ml a 100 IU/ml, ou 45 IU/ml a 80 IU/ml.

[0042] Quando a concentração de fibrinogênio e trombina estão dentro das faixas acima, a taxa de cura pode ser apropriadamente mantida e a distribuição da fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode ser mantida de modo uniforme. Assim, a distribuição de células pode ser uniformemente mantida em uma folha de regeneração de derme customizada a ser fabricada, e habilidade de diferenciação celular após a implantação da folha de regeneração de derme customizada pode ser efetivamente realizada. Ademais, quando as concentrações de fibrinogênio e fibrinogênio estão dentro das faixas acima, há vantagens em que a forma da folha de regeneração de derme fabricada pode ser mantida bem, e a folha pode ser adequadamente implantada em uma área afetada mantendo-se uma dureza apropriada.

[0043] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o primeiro líquido pode incluir ainda aprotinina. A aprotinina é um inibidor de enzimas proteolíticas secretadas do pâncreas, e é um polipeptídeo que consiste em um total de 58 aminoácidos. A aprotinina é, geralmente, extraída dos pulmões de gado, e é conhecida por realizar uma ação hemostática inibindo-se a degradação de fibrina no sangue.

[0044] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a aprotinina pode ser incluída em uma quantidade de 900 unidades de ativador de cininogênio (KIU) a 1.1000 KIU, especificamente 1.000 KIU, por ml do primeiro líquido.

[0045] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o segundo líquido pode ser trombina dispersa em uma solução de cloreto de cálcio. Especificamente, o segundo líquido pode incluir 40 IU a 250 IU de trombina e 5 mg a 6,5 mg de cloreto de cálcio por ml do segundo líquido.

[0046] Um solvente do primeiro líquido e do segundo líquido pode ser água, especificamente soro fisiológico. Além disso, o fibrinogênio no primeiro líquido e a trombina no segundo líquido podem ser obtidos por um kit de cola de fibrina comercialmente disponível.

[0047] Visto que a reação do primeiro líquido e do segundo líquido é completada dentro de 10 minutos, de preferência, dentro de 5 minutos, a composição de biotinta para uma folha de regeneração de derme tem uma vantagem de que uma folha de regeneração de derme pode ser imediatamente fabricada usando uma impressora 3D em um sítio de tratamento.

[0048] A presente invenção usa uma cola de fibrina, incluindo fibrinogênio e trombina como um adesivo, que pode manter viscosidade maior que aquela de um adesivo de ácido hialurônico ou adesivo de colágeno, de modo que a folha de regeneração de derme customizada tenha excelente força de ligação para uma área afetada e, além disso, pode manter resistência alta.

[0049] Outra modalidade exemplificativa da presente invenção fornece um método para fabricar uma folha de regeneração de derme customizada, sendo que o método compreende: a) obter dados em 3D de um sítio de derme defeituoso usando um digitalizador 3D; b) formar uma primeira camada que corresponde a um formato dos dados em 3D obtidos usando um primeiro líquido que compreende uma fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo, uma matriz extracelular, e fibrinogênio; c) formar uma segunda camada aplicando-se um segundo líquido que compreende trombina na primeira camada; e d) formar uma folha de regeneração de derme ao permitir que a primeira camada e a segunda camada reajam uma com a outra.

[0050] Além disso, de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o método compreende ainda: etapa a1) fabricar um molde que corresponde a um formato dos dados em 3D obtidos usando uma impressora 3D, na qual na etapa b), o primeiro líquido é aplicado no molde.

[0051] Na etapa a), equipamento de digitalizador 3D ou equipamento de impressão 3D conhecidos na técnica podem ser usados. Ademais, na etapa a1), equipamento de impressão 3D conhecido na técnica pode ser usado. O molde pode servir para ter capacidade de fixar uma forma tridimensional quando o primeiro líquido e o segundo líquido são aplicados. O molde pode ser removido após a folha de regeneração de derme customizada ser formada. O molde pode ser formado usando um polímero biocompatível, em geral, usado na técnica.

[0052] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, etapas b) e c) podem ser realizadas usando impressão de jato de tinta ou impressão 3D. Especificamente, nas etapas b) e c), um dispositivo de impressão que tem dois ou mais bocais conhecidos na técnica pode ser usado, e um formato tridimensional pode ser criado descarregando-se o primeiro líquido e o segundo líquido dos respectivos bocais. Além disso, quando a primeira camada é formada, uma distribuição de célula uniforme pode ser obtida usando uma impressora 3D ou uma impressora de jato de tinta, impedindo, dessa maneira, um fenômeno de agregação de célula, e similares na folha de regeneração de derme customizada.

[0053] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, etapas b) e c) podem ser repetidas alternadamente. Especificamente, quando é necessário formar uma folha de regeneração de derme de volume grande, etapas b) e c) são alternativamente realizada para laminar camadas como em “primeira camada/segunda camada/primeira camada/segunda camada e, então, as camadas podem ser coaguladas para formar um arcabouço para regeneração de cartilagem.

[0054] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a etapa d) pode ser completada dentro de 10 minutos, de preferência, dentro de 5 minutos. Especificamente, na etapa d), uma reação pode ser realizada por 3 minutos a 7 minutos e a primeira camada e a segunda camada podem ser reagidas para formar uma folha de regeneração de derme customizada.

[0055] No método para fabricar uma folha de regeneração de derme customizada de acordo com a presente invenção, a fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo e a matriz extracelular podem ser extraídas de um tecido adiposo de um paciente ou animal e preparado sem uma etapa de cultura separada. Após o primeiro líquido ser preparado usando a mesma, a folha de regeneração de derme customizada pode ser fabricada dentro de um curto período de tempo e implantada em uma área afetada, de modo que a atividade de células pode ser maximizada.

[0056] Além disso, visto que uma folha de regeneração de derme pode ser fabricada da mesma maneira que um formato da área afetada pelo método para fabricar uma folha de regeneração de derme customizada, um estado natural após restauração pode ser realizado minimizando-se uma lacuna entre o sítio de implantação e a folha de regeneração de derme.

[0057] Ainda outra modalidade exemplificativa da presente invenção fornece uma folha de regeneração de derme customizada fabricada usando o método de fabricação.

[0058] Como descrito acima, a folha de regeneração de derme customizada pode ser implantada após ser fabricada em um formato adequado para uma área afetada dentro de um curto período de tempo usando um tecido adiposo de um paciente ou um animal. Pode ser planejado restaurar pele danificada implantando-se a folha de regeneração de derme em uma área afetada e protegendo a área afetada com um curativo. Após a folha de regeneração de derme customizada ser implantada, uma fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo se diferencia em células dérmicas, as células dérmicas diferenciadas podem ser fixadas na matriz extracelular derivada de tecido adiposo e na matriz de fibrina para restaurar a pele danificada.

[0059] Doravante, a presente invenção será descrita em detalhes em referência aos Exemplos para descrever especificamente a presente invenção. No entanto, os Exemplos de acordo com a presente invenção podem ser modificados em diversas formas diferentes, e não deve ser interpretado que o escopo da presente invenção é limitado aos Exemplos a serem descritos abaixo. Os Exemplos do presente relatório descritivo são fornecidos para explicar mais completamente a presente invenção para aqueles com habilidade comum na técnica.

Fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo (SVF)

[0060] As células de fração vascular de estroma derivadas de tecido adiposo (SVF) foram obtidas através das seguintes etapas. 1. Aproximadamente 60 cc de tecido adiposo foram extraídos realizando-se lipossucção conduzida por um médico em uma sala de operação estéril, e 0, 075 % de colagenase foi adicionado na mesma quantidade ao tecido, e a mistura resultante foi reagida agitando-se incubação a 230 rpm em uma temperatura de 37 °C por 30 minutos. 2. Após a reação, como descrito acima, o produto de reação foi centrifugado em uma velocidade de 420 g (força centrífuga relativa (RCF)) a 25 °C por 10 minutos e, como resultado da centrifugação, o produto de reação foi dividido em três camadas de uma camada de pélete de SVF, uma camada de colágeno e uma camada de óleo. 3. Após a solução superior, exceto pela camada de pélete de SVF, ser removida e a camada de pélete de SVF ser novamente suspensa em solução salina tampona com fosfato (PBS), materiais fibrosos e as impurezas remanescentes da camada de SVF novamente suspensa foram removidas usando um filtro de náilon de 100 μm (filtro celular). 4. Após uma solução que inclui a SVF filtrada ser novamente suspensa e centrifugada três vezes, todos os materiais remanescentes foram removidos, exceto pelo pélete na camada de fundo e, então, como resultado de calcular células nucleadas com o uso de um contador de células, poderia ser confirmado que 0,26 x 106 a 2,2 x 106 de células de SVF foram obtidas.

Matriz extracelular (ECM)

[0061] Após um tecido adiposo ser extraído realizando-se lipoaspiração conduzida por um médico em uma sala de operação estéril, o tecido adiposo foi misturado com soro fisiológico. Ademais, após a ECM ser mecanicamente isolada do tecido adiposo usando um homogeneizador mediante as condições de 12.000 rpm a 20.000 rpm, a ECM isolada foi centrifugada. Após um processo de centrifugar o precipitado após centrifugação novamente foi repetido 3 a 5 vezes, a ECM foi finalmente obtida.

Exemplo Experimental 1 - Experimento in vitro paraconfirmar viabilidade celular em folha de regeneração de derme customizada

[0062] A FIG. 1 ilustra um processo de, respectivamente, preparar um primeiro líquido e um segundo líquido a fim de fabricar uma folha de regeneração de derme customizada de acordo com a presente invenção. Especificamente, após a SVF e ECM obtidas serem misturadas usando uma seringa de mistura, um primeiro líquido foi preparado misturando-se 1 ml de um líquido de aprotinina na qual 4,5 mg/ml de fibrinogênio foi misturado com a mistura de SVF/ECM usando uma seringa de mistura. Nesse caso, o teor da ECM no primeiro líquido foi ajustado para 10 % em peso a 20 % em peso como na FIG. 2.

[0063] Além disso, uma solução de cloreto de cálcio na qual trombina que tem o mesmo volume que o primeiro líquido preparado foi dispersado foi preparada. Nesse caso, a concentração de trombina no segundo líquido foi ajustada para 7,8 IU/ml a 250 IU/ml como na FIG. 2.

[0064] Após uma primeira camada ser formada aplicando-se a primeiro líquido preparado, uma folha de regeneração de derme customizada foi fabricada aplicando-se o segundo líquido preparado na primeira camada.

[0065] A FIG. 2 mostra fotografias que confirmam a viabilidade celular da folha de regeneração de derme customizada de acordo com o Exemplo Experimental 1. Especificamente, a FIG. 2 confirma a viabilidade celular usando um microscópio confocal (Leica, TCS SP5) após coloração de AM de calceína de fluorescência verde para confirmar que células vivas e coloração de homodímero-1 de etídio de fluorescência vermelha para confirmar se a membrana plasmática foi perdida foram realizadas na folha de regeneração de derme customizada. De acordo com a FIG. 2, quando o teor da ECM foi 20 % em peso, a interação entre SVF e ECM foi aprimorada, de modo que a proliferação de células seja ativada e, além disso, quando a concentração de trombina foi 50 IU/ml ou mais, pode ser confirmado que proliferação celular é adicionalmente ativada.

Exemplo Experimental 2 - Experimento em Animal (experimento in vivo) para confirmar eficácia de folha de regeneração de derme customizada

[0066] A fim de verificar a eficácia da folha de regeneração de derme de acordo com a presente invenção, um pedaço de pele de 2,5 cm x 2,5 cm de um porco de quatro meses de idade foi removida e, então, SVF e ECM foram obtidas a partir de um tecido adiposo do porco da mesma maneira, como descrito acima. A FIG. 3 mostra uma fotografia na qual a pele é removida em um experimento com animal para o Exemplo Experimental 2.

[0067] Além disso, após a SVF e ECM obtidas serem misturadas usando uma seringa de mistura, um primeiro líquido foi preparado misturando-se 1 ml de um líquido de aprotinina na qual 9 mg/ml de fibrinogênio foi misturado com a mistura de SVF/ECM usando uma seringa de mistura. Nesse caso, o teor da ECM no primeiro líquido foi 20 % em peso, e a concentração da SVF foi 6, 25 x 106 células/ml. Além disso, um segundo líquido que compreende trombina em uma concentração de 50 IU/ml foi preparado.

[0068] Ademais, após a região de pele removida ser digitalizada usando um digitalizador 3D, o primeiro líquido preparado e segundo líquido foram aplicados de modo sequencial usando uma impressora 3D Bio 3D (INVIVO, ROKIT) e, então, uma folha de regeneração de derme customizada foi fabricada endurecendo-se o primeiro líquido e o segundo líquido por 5 minutos. Após a folha de regeneração de derme fabricada, como descrito acima, ser implantada na região de pele removida e submetida a tratamento com curativo, o grau de restauração da pele foi observado por 14 dias.

[0069] Como controle, uma folha de regeneração de derme customizada foi fabricada da mesma maneira, como descrito acima, sem incluir a ECM no primeiro líquido e implantada na região de pele removida e submetida a tratamento com curativo e, então, o grau de restauração da pele foi observado por 14 dias.

[0070] A FIG. 4 mostra um controle preparado de acordo com o Exemplo Experimental 2 e uma folha de regeneração de derme customizada do Exemplo.

[0071] A FIG. 5 mostra o progresso das folhas de regeneração de derme customizadas implantadas de acordo com o Exemplo Experimental 2. Especificamente, a FIG. 5 mostra fotografias nas quais as folhas de regeneração de derme customizadas de acordo com um controle (apenas SVF) e um Exemplo (SVF+ECM) são implantadas, e mostra o progresso da data de implantação (0 dias) a 14 dias após implantação.

[0072] A FIG. 6 mostra os resultados de realizar coloração Tricrômio de Masson em um experimento com animal do Exemplo Experimental 2. Especificamente, na FIG. 6, cada uma dentre uma região de pele não danificada (normal), uma região com pele removida (apenas defeituosa) e uma região (SVF+ECM) na qual a folha de regeneração de derme customizada de acordo com o Exemplo é implantada em uma região com pele removida que foi manchada com Tricrômio de Masson e observada 14 dias após a pele ser removida. De acordo com a FIG. 6, pode ser confirmado que, quando a pele é removida, e, então, deixada em descanso por 14 dias (apenas defeituosa), um complexo de colágeno é formado em uma concentração muito baixa na derme. Em contraste, pode ser confirmado que, quando a folha de regeneração de derme customizada de acordo com o Exemplo é implantada (SVF+ECM), a derme é claramente manchada de azul e, desse modo, um complexo de colágeno é formado em alta densidade na derme, e pode ser confirmado que a derme é claramente manchada de vermelha e, desse modo, queratina, que é um componente constituinte da epiderme, citoplasma e similares são formados.

[0073] A FIG. 7 mostra a presença ou ausência de angiogênese em um sítio implantado como resultado do experimento com animal de acordo com o Exemplo Experimental 2 usando coloração CD31. Especificamente, na FIG. 7, é observado se os vasos sanguíneos são regenerados realizando-se coloração CD31 em cada uma dentre uma região de pele não danificada (normal), uma região com pele removida (apenas defeituosa) e uma região (SVF+ECM) na qual a folha de regeneração de derme customizada de acordo com o Exemplo é implantada em uma região com pele removida 14 dias após a pele ser removida. De acordo com a FIG. 7, pode ser confirmado que, quando a pele é removida, e, então, deixada em descanso por 14 dias (apenas defeituosa), regiões angiogênicas manchadas de marrom aparecem mito esporadicamente e estreitas. Em contraste, pode ser confirmado que quando a folha de regeneração de derme customizada de acordo com o Exemplo é implantada (SVF+ECM), há um grande número de regiões angiogênicas manchadas de marrom.

[0074] Com base em diversos resultados experimentais no Exemplo Experimental 2, pode ser observado que, quando a folha de regeneração de derme customizada de acordo com a presente invenção é implantada na pele, a regeneração da pele é promovida e, além disso, angiogênese na pele é também promovida, de modo que a região na qual a pele é removida possa ser restaurada similar à pele original.

Claims

1. Composição de biotinta para uma folha de regeneração de derme, sendo a composição de biotinta caracterizada por compreender: um primeiro líquido que compreende uma fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo, uma matriz extracelular derivada de tecido adiposo, e fibrinogênio; e um segundo líquido que compreende trombina, em que uma concentração da fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo no primeiro líquido é 105 de células/ml a 107 de células/ml; em que um teor da matriz extracelular derivada de tecido adiposo no primeiro líquido é 20 % em peso a 60 % em peso; em que uma concentração de fibrinogênio no primeiro líquido é 4 mg/ml a 50 mg/ml; e em que uma concentração de trombina no segundo líquido é 40 IU/ml a 250 IU/ml.

2. Composição de biotinta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a matriz extracelular derivada de tecido adiposo é partículas que têm um diâmetro de 5 μm a 100 μm.

3. Composição de biotinta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo e a matriz extracelular derivada de tecido adiposo são, cada um, extraídos de um tecido adiposo autólogo.

4. Composição de biotinta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro líquido compreende ainda aprotinina.

5. Método para fabricar uma folha de regeneração de derme customizada, sendo o método caracterizado por compreender: a) obter dados em 3D de um sítio de derme defeituoso usando um digitalizador 3D; a1) fabricar um molde que corresponde a um formato dos dados em 3D obtidos usando uma impressora 3D, b) formar uma primeira camada que corresponde a um formato dos dados em 3D obtidos usando um primeiro líquido que compreende uma fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo, uma matriz extracelular derivada de tecido adiposo e fibrinogênio, em que o primeiro líquido é aplicado no molde da etapa a1); c) formar uma segunda camada aplicando-se um segundo líquido que compreende trombina na primeira camada; e d) formar uma folha de regeneração de derme ao permitir que a primeira camada e a segunda camada reajam uma com a outra; em que uma concentração da fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo no primeiro líquido é 105 de células/ml a 107 de células/ml; em que um teor da matriz extracelular derivada de tecido adiposo no primeiro líquido é 20 % em peso a 60 % em peso; em que uma concentração de fibrinogênio no primeiro líquido é 4 mg/ml a 50 mg/ml; e em que uma concentração de trombina no segundo líquido é 40 IU/ml a 250 IU/ml.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que as etapas b) e c) são repetidas alternadamente.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a etapa d) é completada dentro de 10 minutos.

8. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que as etapas b) e c) são realizadas com o uso de impressão de jato de tinta ou impressão 3D.

9. Folha de regeneração de derme customizada caracterizada por ser fabricada usando o método conforme definido na reivindicação 5.