JP6023049B2 - 皮膚組織細胞の集合体の製造方法及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、皮膚組織細胞の集合体（ｄｅｒｍｉｓ ｔｉｓｓｕｅ ｃｅｌｌｓ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）及びその製造方法と、瘢痕修復技術での皮膚組織細胞の集合体の用途に関する。

顔面部の色々な凹んだ瘢痕と刃型瘢痕は、患者の容姿を大きく損ない、人体の顔つきの美しさに影響を及ぼし、患者の学業、事業、婚姻、交際と生活における障害となり、より酷いことは瘢痕が患者の心理に特別に大きな精神障害を引き起こす。多数の患者は瘢痕のために自己卑下して絶望し、ひいては性格の捻れと心理変態が発生する。瘢痕は、患者自身、家庭と社会に重い負担をもたらす。顔面部の瘢痕の弊害の重さは、ほかの部位の瘢痕より高い。

瘢痕の形成原因は、元来正常な全層皮膚が色々な傷を受け欠損されて完全に癒えることができず、替えって繊維組織が創面を補修したが故に各種類の瘢痕を形成することである。瘢痕は、世界的難治性疾病で、その治療において、今まで何れの国における技術方法でも顔面部の瘢痕の治療で正常又は正常に近い効果を得ることができていない。医学上の瘢痕の治療は、今まで伝統的な方法である、例えば「切開縫合術」と「皮膚移植術」を利用している。「切開縫合術」は、瘢痕を切り除いてから両側の傷縁を引き付けて縫合するが、皮膚の量が元々充分でないので、両側の傷縁を引き付けた後引き張り力が大きくなり、術後に切り目が容易に分裂し増殖されて、瘢痕除去の目的を達成することができない。「皮膚移植術」の欠点は、移植された皮膚と周辺の皮膚との色の差が大きく、周りに縫合跡が残り、皮膚を取った処にはより大きい瘢痕が残されている。

特許文献１には、「皮膚組織細胞の集合体」を製造して瘢痕を治療する方案が開示されている。「皮膚組織細胞の集合体」は、以下のステップを通じて製造する。すなわち、正常の皮膚に、表面色素を除去して創面を形成するステップと、特別に製造した器具で創面を０．３〜０．５ｍｍの深さで縦横に切りながら、器具上の皮膚組織くずを収集して、その皮膚組織くずをヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）を含有する塩水に浸し、皮膚組織くず中の血液凝固塊を洗浄するステップと、皮膚組織くずを繰り返して加工し、繰り返し洗い流して、脂肪塊を除くステップと、上記切り加工と洗浄を繰り返し実行してから皮膚組織細胞を集めて、粘着性のある「皮膚組織細胞の集合体」を得るステップとを含む。このような方法で製造した「皮膚組織細胞の集合体」を瘢痕治療に利用して、創面を完全に修復でき、最後に正常または正常に近い皮膚を形成する。この「皮膚組織細胞の集合体」の技術方法は、顔面部の複数の凹んだ瘢痕と多線状の瘢痕を修復でき、瘢痕の数量の制限を受けない。しかし、このような方法で製造した皮膚組織細胞の集合体を瘢痕修復に利用する際に、活着率が好ましくない欠点があり、一般的には、修復を数回繰り返して始めて完全に正常な皮膚に近くなる。

中国特許出願公開第１０１０２０８９９号明細書

上記課題を解決するための本発明の第１目的は、人体の顔面部の瘢痕修復技術に利用することができ、活着率が高く、癒えた部位の外観がよく、顔面部の小さな面積の凹んだ瘢痕、外傷後形成した瘢痕、外傷後のダスト染色及び術後の刀痕を良好に修復できる効果を有する皮膚組織細胞の集合体を提供することである。

本発明の第２目的は、上記皮膚組織細胞の集合体の製造方法を提供することである。

本発明の第３目的は、瘢痕修復に利用する薬物を製造するために、前記皮膚組織細胞の集合体の応用を提供することである。

本発明の第１目的を達成するための本発明が提供する皮膚組織細胞の集合体は、医療用の等張塩水、血液抗凝固剤、細胞栄養維持剤及び細胞成長促進剤の混合溶液に保存した生物活性を有する分離された分離体皮膚組織細胞を含む。

本発明における生物活性のある離体皮膚組織細胞は、特許文献１（中国特許出願公開第１０１０２０８９９号明細書）に記載された方法によって得られる。

本発明における医療用の等張塩水は、塩水と細胞内液の電解質と浸透圧が等張であり、細胞の脱水を起こさず、細胞の膨張と溶解を惹起することがなく、分離された分離体細胞組織の保存に利用する。一実施例として、医療用の等張塩水には市販の乳酸リンゲル液を利用できる。

本発明における血液抗凝固剤は、血液の凝固を防止できる医療用の製剤で、へパリン注射液及び／又は漢方薬の注射液を選択して使用でき、前記漢方薬注射液は、例えば香丹注射液、田七注射液、紅花注射液、当帰注射液などである。好ましい実施例として、前記血液抗凝固剤は、へパリン注射液と、一つ又は二つの漢方薬の滅菌注射液である。もう一つの好ましい実施例として、前記血液抗凝固剤は、香丹注射液と田七注射液である。前記薬物を添加すると、血液が凝固されることを防止でき、漢方医の観点から見ると、淤血を除去して血液を流通させ、細胞の活着、再生、増殖の機能を促進できる。好ましい一実施例として、混合溶液は、血液抗凝固剤と医療用の等張塩水の用量の体積比が（０．２〜１）：８であってもよい。当業者であれば、実際状況又は選択して使用する試薬の濃度などの要素に基づいて、適当な量の試薬を選定して使用できる。

本発明における細胞栄養維持剤は、分離された分離体組織細胞に栄養を提供して維持させる製剤で、例えば重量比濃度が２０〜５０％のブドウ糖注射液である。一実施例として、混合溶液におけるブドウ糖注射液と医療用の等張塩水との用量の体積比は（１〜２）：８でもよい。当業者であれば、実際状況又は選択して作用する試薬の濃度などの要素に基づいて、適当な試薬を選定して利用できる。

本発明における細胞成長促進剤は、細胞の活着と増殖を促進できる製剤である。前記細胞成長促進剤は、上皮成長因子を含むことが好ましい。一実施例として、細胞成長因子は、凍結乾燥粉剤としての組換え体ヒト上皮成長因子を用い、混合溶液における細胞成長因子の用量は、５００ｍＬの医療用の等張塩水の用量に２〜１０ｍｇの細胞成長因子を使用でき、当業者であれば、実際状況及び選択して使用する試薬の濃度などの要素に基づいて、適当な量の試薬を選定して使用できる。

本発明において、前記「皮膚組織細胞の集合体」に混合溶液を添加すると、希釈、抗凝固、洗い流し、保護、精製と細胞に栄養を提供する目的を実現できる。当業者であれば、実際の必要に基づいて、一定の比率と前後順序によって、各種の試薬を添加できる。しかし、添加する試薬の種類と用量は、分離された分離体皮膚組織細胞の生物活性に影響を及ぼさない程度でなければならない。

本発明における前記皮膚組織細胞の集合体において、混合溶液の液量は、皮膚組織細胞を浸漬できる量でもよい。混合溶液の液量が多いと、希薄な流体状になり、瘢痕を修復する際に、直接に利用できない。そのため、使用の際に、混合溶液の液量が多過ぎれば、大量の混合溶液を含有する皮膚組織細胞集合体について、皮膚組織細胞の生物活性に阻害を齎さない条件で濾過などの濃縮処理を実行し、混合液体を濾過し除去して「濾過残留物」、即ち、非流動状態の皮膚組織細胞を含有する皮膚組織細胞の集合体を得ることができる。前記皮膚組織細胞の集合体は一定の粘着性を有している。この粘着性のある皮膚組織細胞の集合体は、直接に瘢痕の創面に播種でき、皮膚組織細胞の集合体を播種してから１３〜１５日経過すると、集合体が活着されて瘢痕の凹んだ部分を充填することができる。そのため、前記皮膚組織細胞の集合体で、混合溶液の液量は、皮膚組織細胞と共に粘着性のコロイド状の皮膚組織細胞の集合体を形成できる量であり、このような皮膚組織細胞の集合体は、他の処理が必要なく直接に利用できる。使用する際に、当業者は、瘢痕面積の大きさ、瘢痕の数量及び深度などの実際の状況に基づいて、集合体の用量を把握でき、患者の体質状態を考慮して、平らに充填するか又は創面より少し高く充填するように柔軟に適用できる。

本発明の第１目的のために提供する皮膚組織細胞の集合体には、血液抗凝固剤、細胞栄養維持剤と細胞成長促進剤などの物質を含有しているので、細胞の活着と増殖に有利である。臨床観察によると、上記物質を添加した集合体は、上記物質を添加しなかった集合体に比べて、活着率、増殖率及び癒えた外観の美観度が大幅に向上した。

本発明の第２目的を達成するために、皮膚組織細胞の集合体の製造方法を提供する。この方法は、生物活性を有する分離された分離体の皮膚組織細胞を医療用の等張塩水に浸す第１ステップと、第１ステップで得た混合物に、順次、血液抗凝固剤、細胞栄養維持剤、及び細胞成長促進剤を添加し、一つの物質を添加する毎に分散操作をして添加した物質を混合物に均一に分散させ、添加が終了してから医療用の等張塩水、血液抗凝固剤、細胞栄養維持剤と細胞成長促進剤の混合溶液に保存した生物活性を有する分離された皮膚組織細胞の集合体を得る第２ステップを含む。

本発明の第２目的の皮膚組織細胞の集合体の製造方法は、さらに、第２ステップで得た混合物について、皮膚組織細胞の活性に阻害を引き起こさない条件で濃縮処理をして、非流動状態の生物活性を有する皮膚組織細胞の集合体を得る第３ステップを含んでもよい。

本発明の第２目的の製造方法では、第１ステップにおいて、分離された皮膚組織細胞の医療用の等張塩水への浸漬は、少なくとも３０分実行する。

本発明の第２目的の製造方法では、第２ステップにおいて、一つの物質を添加してから、少なくとも３０分経過した後に、他の一つの物質を添加する。

本発明の第２目的の製造方法では、第３ステップにおいて、前記濃縮処理は、例えば濾過でもよい。

本発明の第２目的の製造方法では、漸進的に色々な試薬を添加し、充分に分散させて、血液抗凝固剤、細胞栄養維持剤と細胞成長促進剤を活性のある分離された皮膚組織細胞に充分に浸透、混合させて、細胞の活着率を向上し、細胞の増殖を促進して、瘢痕修復の成功率と癒えた外観の美観度を高める目的を実現できる。

本発明の第３目的を達成するため、瘢痕修復に用いる薬物の製造において、本発明の第１目的の皮膚組織細胞の集合体の応用を提供する。

以下、実施例を示して本発明をさらに説明するが、これによって本発明を以下の実施例の範囲に限定するものではない。

〔実施例１〕
特許文献１（中国特許出願公開第１０１０２０８９９号明細書）に記載の方法によって、分離された生物活性を有する分離体皮膚組織細胞を得て、これを乳酸リンゲル液（Ｌａｃｔａｔｅｄ Ｒｉｎｇｅｒｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に半時間浸す。その後、香丹注射液、田七注射液、紅花注射液、当帰注射液、５０％のブドウ糖注射液と組換え体ヒト上皮成長因子を順次添加した。ここで上記各物質を順次添加する毎に均一にかき回し操作を行い、半時間経過してから他の一つの物質を添加する。全部の上記成分物質を添加して、皮膚組織細胞の集合体を得た。香丹注射液、田七注射液、紅花注射液、当帰注射液、５０％のブドウ糖注射液は、市販されている中国四川昇和製薬會社の製品である。組換え体ヒト上皮成長因子は、中国成都美兮生物技術有限會社の製品である。

得た皮膚組織細胞の集合体に対して、濾過濃縮を行い、直接瘢痕修復に使用できる粘着性のあるコロイド状の皮膚組織細胞の集合体を得た。

〔実施例２〕
実施例１の方法によって本発明の皮膚組織細胞の集合体を獲得し、獲得した皮膚組織細胞の集合体と、特許文献１（中国特許出願公開第１０１０２０８９９号明細書）に記載の方法で獲得した皮膚組織細胞の集合体とで、瘢痕患者に対して瘢痕修復を実行し、修復効果を比較して評価した。

瘢痕患者は、総計１０６例で、女性は８８例、年齢は１８〜４５歳、男性は１８例、年齢は２０〜４２歳で、手術治療部位は顔面部である。患者を一組５３人ずつランダムに２組に分けた。第１組については、実施例１の方法によって獲得した皮膚組織細胞の集合体を使用して瘢痕修復を実行し、第２組については、特許文献１（中国特許出願公開第１０１０２０８９９号明細書）に記載の方法によって獲得した皮膚組織細胞の集合体をそのまま使用して瘢痕修復を実行した。瘢痕修復を実行する際に、皮膚組織細胞の集合体を患者の瘢痕創面に播種してから１３〜１５日経過した後、包帯を除去して活着状態を観察し、手術後に患者の瘢痕修復状況を長期経過観察した。

実施例１によって獲得した本発明による皮膚組織細胞の集合体を第１組の患者の瘢痕創面に播種してから、１３〜１５日経過した後、包帯を除去すると、播種した皮膚組織細胞の集合体が全部活着されて、ピンク色の創面を形成し、元の瘢痕の凹み部位がなくなったことが確認できた。一年間復元して、播種部位は、瘢痕周囲の正常な皮膚に近い素地と外観を形成していた。一回の修復手術で瘢痕をなくさせて正常な皮膚になる確率は７０％で、二回の修復手術で基本的に正常に近くなる確率は１００％であり、無効のケースはなかった。

第２組の患者に対して、特許文献１に記載の方法で獲得した皮膚組織細胞の集合体を第２組の患者の瘢痕創面に播種してから、１３〜１５日経過した後、播種した皮膚組織細胞の集合体の一部が活着されたことを確認したが、一回の修復手術で瘢痕を完全に取り除くことはできず、複数回の修復手術が必要であった。三回の修復手術で正常に近くなる確率は大体６５％であった。

Claims (7)

1. 乳酸リンゲル液、香丹注射液、田七注射液、紅花注射液、当帰注射液、重量比濃度が２０〜５０％であるブドウ糖注射液及び上皮成長因子の混合溶液に保存した、離体の生物活性のある皮膚組織細胞を含むことを特徴とする皮膚組織細胞の集合体。
2. 前記混合溶液の量は、皮膚組織細胞が浸される程度の量であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚組織細胞の集合体。
3. 請求項２に記載の皮膚組織細胞の集合体について、皮膚組織細胞の生物活性に阻害を起こさない濃縮を実行して得た非流動状態の皮膚組織細胞を含有する皮膚組織細胞の集合体であることを特徴とする皮膚組織細胞の集合体。
4. 生物活性を有する離体の皮膚組織細胞を乳酸リンゲル液に浸す第１ステップと、離体の皮膚組織細胞を含有する乳酸リンゲル液に、順次、香丹注射液、田七注射液、紅花注射液、及び当帰注射液と、重量比濃度が２０〜５０％であるブドウ糖注射液と上皮成長因子とを添加し、一つの物質を添加した毎に分散操作をして、添加した物質を混合物の中に均一に分散させ、添加と分散操作を完了して、乳酸リンゲル液、香丹注射液、田七注射液、紅花注射液、当帰注射液、重量比濃度が２０〜５０％であるブドウ糖注射液と上皮成長因子の混合溶液の中に保存した離体の生物活性を有する皮膚組織細胞の集合体を得る第２ステップとを含むことを特徴とする請求項２に記載の皮膚組織細胞の集合体の製造方法。
5. 前記第１ステップで、離体の皮膚組織細胞を乳酸リンゲル液に少なくとも半時間浸し、前記第２ステップで、一つの物質を添加した毎に少なくとも半時間経過してから他の一つの物質を添加することを特徴とする請求項４に記載の皮膚組織細胞の集合体の製造方法。
6. 請求項４又は５に記載の第１ステップと、第２ステップとを含み、さらに前記第２ステップで獲得した混合物について、皮膚組織細胞の生物活性に阻害を齎さない濃縮を実行して、非流動状態の皮膚組織細胞の集合体を得る第３ステップを含むことを特徴とする請求項３に記載の皮膚組織細胞の集合体の製造方法。
7. 瘢痕修復薬物の製造における請求項１乃至３の何れか１項に記載の皮膚組織細胞の集合
   体の応用。