CN108030914A - 一种基底膜胶原材料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种基底膜胶原材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基底膜胶原材料及其制备方法与应用。本发明基底膜胶原材料的制备方法包括以下步骤：(1)取动物组织，进行清洗后灭菌；(2)清洗步骤(1)灭菌后的动物组织，再采用脱细胞液A对动物组织进行脱细胞处理；(3)清洗步骤(2)脱细胞处理后得到的动物组织，然后采用脱细胞液B对动物组织进行脱细胞处理；(4)将步骤(3)脱细胞处理所得动物组织置于PBS缓冲液或注射用水中，进行清洗处理；(5)将步骤(4)清洗处理后的动物组织冻干和定型，得到基底膜胶原材料。采用本发明方法制得的基底膜胶原材料具有良好的生物学功效，且其能修复创面，尤其可用于慢性难愈合创面修复。

Description

一种基底膜胶原材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种胶原材料及其制备方法与应用，具体涉及一种基底膜胶原材料及其制备方法与应用。
背景技术
基底膜是细胞外基质特化而形成的一种柔软、坚韧的网膜结构，一般厚 40-120nm，其位于上皮细胞和内皮细胞的基底部。基底膜将表皮基底细胞和位于其下层相连接的组织分隔开，向细胞提供结构支撑，并通过表皮-真皮间细胞因子调节，维持表皮-真皮间机能。基底膜同时还具有一定的渗透屏障作用。随着年龄增长及紫外线照射可引起皮肤基底膜的重叠与断裂，其与表皮、真皮之间的连接、信息传递受到阻碍，可引发多种肌肤烦恼，甚至皮肤病变。因此表皮-基底膜-真皮三者之间的顺畅循环沟通，是构成健康肌肤的重要因素，可以将其称之为“黄金循环”。基底膜作为真皮与表皮之间的重要连接结构，由外至内由胞膜层、透明层、致密层和致密下层组成，其主要成分是Ⅳ型胶原蛋白，Ⅶ型胶原蛋白，层粘连蛋白，弹性蛋白，巢蛋白以及部分细胞生长因子，比如血管内皮生长因子(VEGF，vascular endothelial growth factor)、成纤维细胞生长因子 (FGF，fibroblast growthfactor)、转化生长因子(TGF-β，transforming growth factor-β)，粘多糖等，主要以蛋白为主。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种生物学功效良好、可用于创面修复的基底膜胶原材料及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种基底膜胶原材料的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取动物组织，进行清洗后灭菌；
(2)清洗步骤(1)灭菌后的动物组织，再采用脱细胞液A对动物组织进行脱细胞处理；
(3)采用脱细胞液B对步骤(2)脱细胞处理后得到的动物组织进行脱细胞处理；
(4)将步骤(3)脱细胞处理所得动物组织置于PBS缓冲液或注射用水中，进行清洗处理；；
(5)将步骤(4)清洗处理后的动物组织冻干和定型，得到基底膜胶原材料。
采用本发明上述方法制得的基底膜胶原材料具有良好的生物学功效，且其能修复创面，尤其可用于慢性难愈合创面修复。
作为本发明所述基底膜胶原材料的制备方法的优选实施方式，
所述脱细胞液A中的溶质为碳酸钠、碳酸钾、EDTA三钠、EDTA四钠、磷酸钠、磷酸钾中的至少一种；
所述脱细胞液B由酸溶液和盐溶液组成，所述酸溶液中的酸为HCl、磷酸、硫酸、醋酸、乳酸、甘醇酸、草酸中的至少一种；所述盐溶液中的盐为氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾中的至少一种。
目前最常用的脱细胞方法是物理和化学处理相结合的方法，包括用搅拌或超声波，机械按摩或加压，冻结和解冻来破坏细胞膜，使细胞成分释放出来，这样更利于后续的化学洗涤剂的脱细胞清洗。物理方法本身一般不足以实现完全的脱细胞，化学方法更多的采用酶学处理方法，如某些胰蛋白酶，酶法在脱细胞的过程中，也可能会降解掉一些蛋白质，对本身的成分有一定的影响。这些方法会不同程度的影响改变组织器官基质生物化学组成成分，操作复杂，成本较高且脱细胞程度较低，易有细胞残留，本发明使用所述的脱细胞液进行脱细胞处理，操作简单，成本低，且得到的基底膜胶原材料中没有细胞和DNA残留，除去了主要免疫原性成分，生物相容性好，免疫原性低，能较好的调控细胞的黏附、迁移、增殖和分化。
作为本发明所述基底膜胶原材料的制备方法的更优选实施方式，所述脱细胞液A中的溶质由(a)碳酸钠和(b)EDTA三钠或EDTA四钠组成；所述脱细胞液B中，酸溶液中的酸为盐酸，盐溶液中的盐为氯化钠，或者所述脱细胞液B中，酸溶液中的酸为甘醇酸和HCl，盐溶液中的盐为硫酸钠与氯化钠。碳酸钠脱细胞效果好且成本低，盐酸脱细胞彻底，对细胞的杀伤力大；氯化钠为中性盐，对胶原等有效成分无损伤，成本低，易获得。
作为本发明所述基底膜胶原材料的制备方法的优选实施方式，所述脱细胞液A中，溶质的质量分数为2～10％；所述脱细胞液B中，酸的浓度为0.8～2mol/L，盐的浓度为0.8～4mol/L。
作为本发明所述基底膜胶原材料的制备方法的优选实施方式，所述脱细胞液A由下述质量百分比的组分组成：(a)碳酸钠5％和(b)EDTA三钠或EDTA 四钠0.01％-1％；所述脱细胞液B由下述浓度的组分组成：盐酸1mol/L和氯化钠1mol/L。采用所述浓度的脱细胞液A和脱细胞液B，能在尽量减少破坏有效成分的前提下，使脱细胞最干净和完全。
作为本发明所述基底膜胶原材料的制备方法的更优选实施方式，所述脱细胞液A中，组分(b)的质量百分比为0.1％
作为本发明所述基底膜胶原材料的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2) 中，脱细胞液A与动物组织的体积比为4～30:1，采用脱细胞液A浸泡动物组织 8～24小时；所述步骤(3)中，脱细胞液B与动物组织的体积比为4～30:1，采用脱细胞液B浸泡动物组织8～24小时。
作为本发明所述基底膜胶原材料的制备方法的更优选实施方式，所述步骤 (2)中，脱细胞液A与动物组织的体积比为5:1；所述步骤(3)中，脱细胞液 B与动物组织的体积比为5:1。
作为本发明所述基底膜胶原材料的制备方法的优选实施方式，所述脱细胞液A的pH值为7.2-7.4。
作为本发明所述基底膜胶原材料的制备方法的优选实施方式，所述动物组织为小肠、神经、膀胱、皮肤、心包或肾脏等；所述动物组织来源于猪、牛或羊等。本发明中，动物组织包括但不限于小肠、神经、膀胱、皮肤、心包或肾脏；动物组织的来源包括但不限于猪、牛或羊。
作为本发明所述基底膜胶原材料的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1) 中，采用消毒剂进行灭菌，所述消毒剂含有过氧乙酸、过氧化氢或乙醇溶液；所述消毒剂中，过氧乙酸的体积百分含量为0.05-1％，过氧化氢的体积百分含量为0.5-10％，乙醇的体积百分含量为5-30％；所述步骤(2)，采用清洗液进行清洗，所述清洗液为PBS溶液或注射用水，所述PBS溶液的pH值为7.0-7.4。
作为本发明所述基底膜胶原材料的制备方法的优选实施方式，所述消毒剂中，过氧乙酸的体积百分含量为0.1％，乙醇的体积百分含量为25％。
作为本发明所述基底膜胶原材料的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1) 中，消毒剂与动物组织的体积比为5-10：1，灭菌的时间为1-2h，灭菌的温度为 20-25℃；更优选地，消毒剂与动物组织的体积比为5：1，灭菌的时间为1h，灭菌的温度为20℃。
作为本发明所述基底膜胶原材料的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2) 中，清洗液与动物组织的体积比为20-40：1；更优选地，清洗液与动物组织的体积比为30：1。
另外，本发明还提供了一种采用上述方法制备得到的基底膜胶原材料。本发明制得的基底膜胶原材料具有良好的生物学功效，其与周围组织具有良好的生物相容性，能够补充基底膜营养，改善表皮细胞生长微环境，增强新陈代谢，活化具有免疫活性的郎格汉氏细胞，诱发免疫系统和修护功能，形成网状结构，锁住水分，被皮肤吸收，起到天然保湿因子的作用；其还能促进吸收，滋润及形成一层保护膜，使肌肤更加保湿柔滑，使皮肤中的胶原蛋白活性加强，保持角质层水分以及纤维结构的完整性。此外，本发明制得的基底膜胶原材料能修复创面，尤其可用于慢性难愈合创面修复。
最后，本发明还提供了上述基底膜胶原材料在制备治疗创面修复的药物、医疗器械或化妆品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了一种新的基底膜胶原材料的制备方法，采用本发明方法制得的基底膜胶原材料具有良好的生物学功效，且其能修复创面，尤其可用于慢性难愈合创面修复。
(2)本发明制备基底膜胶原材料时，采用了新的脱细胞液，这样操作简单，成本低，且得到的基底膜胶原材料中没有细胞和DNA残留，除去了主要免疫原性成分，生物相容性好，免疫原性低，能较好的调控细胞的黏附、迁移、增殖和分化。
附图说明
图1为本发明基底膜胶原材料的HE染色结果图；
图2为本发明基底膜胶原材料超微结构观察的SEM图；
图3为本发明人源皮肤上皮细胞接种至基底膜胶原材料2天后的DPI染色结果图；
图4为本发明人源皮肤上皮细胞接种至基底膜胶原材料2天后的倒置显微镜观察结果图；
图5为本发明人源皮肤上皮细胞接种至基底膜胶原材料3天后的DPI染色结果图；
图6为本发明人源皮肤上皮细胞接种至基底膜胶原材料3天后的倒置显微镜观察结果图；
图7为本发明基底膜胶原材料修复糖尿病鼠全层皮肤缺损的结果图；
图8为本发明基底膜胶原材料修复糖尿病鼠全层皮肤缺损的HE染色结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明基底膜胶原材料的制备方法的一种实施例，本实施例基底膜胶原材料的制备方法为：
(1)表面清洗：剪除猪小肠外壁脂肪，用自来水冲洗去除猪小肠内容物，分离出小肠黏膜下层，使用注射用水冲洗3遍，再用纯化水冲洗至表面无污渍，将冲洗后的小肠黏膜下层组织材料置于滤网滤水5分钟，滤干后，用量筒等量取体积的装置进行量取。
(2)灭菌：将猪小肠黏膜下层放入装有无菌注射用水配制的低浓度过氧乙酸-乙醇溶液消毒剂中，浸泡；所述消毒剂中，过氧乙酸的体积百分含量为0.1％，乙醇的体积百分含量为25％，消毒剂和猪小肠黏膜下层体积比10:1，灭菌时间为1h，灭菌温度范围为20℃。
(3)清洗过程：采用清洗液清洗步骤(2)得到的小肠黏膜下层，清洗液 pH值为7.3的PBS溶液，PBS溶液温度为20℃，PBS溶液与小肠黏膜下层组织材料体积比为30:1，清洗次数3-5次，每次20-30分钟；然后采用纯化水清洗，纯化水与小肠黏膜下层的体积比为20-40:1，至检测电导率为10μS/cm以下终止。
(4)采用脱细胞液A浸泡小肠黏膜下层12小时，脱细胞液A中的溶质为碳酸钠和EDTA-三钠，脱细胞液A中，碳酸钠的质量分数为5％，EDTA-三钠的质量分数为0.1％；脱细胞溶液A的pH值为7.3；脱细胞液A与小肠黏膜下层的体积比为5:1；清洗动物组织后，用脱细胞液B浸泡小肠黏膜下层12小时，所述脱细胞液B由盐酸溶液和盐溶液组成，所述脱细胞液B中，盐酸的浓度为 1.0mol/L，盐溶液中的盐为氯化钠，盐的浓度为1.0mol/L；脱细胞液B与动物组织的体积比为5:1，脱细胞溶液B的pH值为7.3。
(5)清洗过程：采用清洗液进行清洗，清洗液为pH7.3的PBS溶液，PBS 溶液温度为20℃，PBS溶液与小肠黏膜下层比例为为30:1，优选清洗2-5次，每次20-30分钟；然后采用20℃的降温的注射用水清洗，注射用水与小肠黏膜下层的体积比为20-40:1，检测清洗注射用水与未清洗注射用水电导率之差小于 1μS/cm终止。
(6)氯化钠处理：在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中进行，将氯化钠溶液注入清洗槽中，开启清洗器，清洗时间为20min，氯化钠溶液浓度为 0.015mol/L、pH值不超过7.8，然后以流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到1.5μS/cm以下时终止。该步骤中清洗槽震荡率为200rpm，超声波频率为 45KHZ。
(7)固定成型：在模具上进行，所述模具包括带针底板与压框，需要根据不同的规格尺寸选择不同的模具，将步骤(6)制备的小肠黏膜下层基质材料平铺于带针底板上，将所述压框放置于小肠黏膜下层基质材料上，压框的尺寸可为最终剪裁的尺寸或更宽，将所述带针底板和所述压框相对固定。
(8)将步骤(6)制备的小肠黏膜下层基质材料分装到西林瓶中，该步骤需要无菌转运与操作。
(9)真空冷冻干燥：在真空冷冻干燥机中进行，产品的冷冻干燥工艺需要根据不同的设备重新确认，将模具平铺于真空冷冻干燥机中，关闭冻干室的门，打开循环泵约1分钟，开启压缩机对冻干箱致冷，将步骤(7)的模具连同上面的小肠黏膜下层基质材料或者步骤(8)中分装好的西林瓶连同里面的小肠黏膜下层基质材料预冻至-50℃，保温1-2小时，然后开启真空泵，调节温度至-15℃，保温5-7小时，再调节温度至0℃，保温2小时，最后调节温度至25℃，保温4 小时，真空冷冻干燥完成，冷冻干燥装置的腔室内的压强为20-25Pa。
(10)包装：干燥材料取出后，在模具上用切割装置分别切割成 3*3cm,7*7cm,10*10cm，然后采用特卫强包装袋包装，封口机热封，贴标签，该过程需要无菌转运与操作，即得生物型创面基质材料，即为基底膜胶原材料。西林瓶取出后，盖好瓶盖，低温保存，即得基底膜胶原冻干粉。
(11)灭菌：采用钴60辐照灭菌，灭菌剂量为25kGy，灭菌6小时。
实施例2
本发明基底膜胶原材料的制备方法的一种实施例，本实施例基底膜胶原材料的制备方法为：
(1)表面清洗：从刚屠宰的牛身上采集新鲜心包膜，剪除黏附的脂肪组织，用自来水冲洗去除黏附物，分离出心包膜，使用注射用水冲洗3遍，再用纯化水冲洗至表面无污渍，将冲洗后的心包膜组织材料置于滤网滤水5分钟，滤干后，用量筒等量取体积的装置进行量取。
(2)灭菌：将心包膜放入装有无菌注射用水配制的低浓度过氧乙酸-乙醇溶液消毒剂中，浸泡；所述消毒剂中，过氧乙酸的体积百分含量为0.1％，乙醇的体积百分含量为25％，消毒剂和猪小肠黏膜下层体积比5:1，灭菌时间为1h，灭菌温度范围为20℃。
(3)清洗过程：采用清洗液清洗步骤(2)得到的心包膜组织材料，清洗液为pH值为7.2的PBS溶液，PBS溶液温度为20℃，PBS溶液与心包膜组织材料的体积比35:1，清洗次数3次，每次30分钟；然后采用纯化水清洗，纯化水与心包膜组织材料比例为30:1，至检测电导率为10μS/cm以下终止。
(4)采用脱细胞液A浸泡心包膜组织材料12小时，脱细胞液A中的溶质为碳酸钾和EDTA-四钠，脱细胞液A中，溶质的质量分数为10％；脱细胞溶液 A的pH值为7.2；脱细胞液A与小肠黏膜下层的体积比为35:1；然后用脱细胞液B浸泡心包膜组织材料12小时，所述脱细胞液B由甘醇酸溶液和盐溶液组成，所述脱细胞液B中，甘醇酸的浓度为1.0mol/L，盐溶液中的盐为硫酸钠和硫酸钾，盐的浓度为1.5mol/L；脱细胞液B与动物组织的体积比为35:1，脱细胞溶液B的pH值为7.3。
(5)清洗过程：采用清洗液进行清洗，清洗液为pH7.2的PBS溶液，PBS 溶液温度为20℃，PBS溶液与心包膜组织材料的比例为30:1，清洗3次，每次 25分钟；然后采用20℃的降温的注射用水清洗，注射用水与心包膜组织材料比例(体积比)为：30:1，检测清洗注射用水与未清洗注射用水电导率之差小于 1μS/cm终止。
(6)氯化钠处理：该步骤在清洗槽可震荡的恒温超声波清洗器中进行，将氯化钠溶液注入清洗槽中，开启清洗器，清洗时间为20min，氯化钠溶液浓度为 0.015mol/L、pH值不超过7.8，然后以流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到1.5μS/cm以下时终止。该步骤中清洗槽震荡率为200rpm，超声波频率为 45KHZ。
(7)冻干、裁剪、定型：上述清洗完成后，放入冷冻干燥机冻干后，根据临床不同的适应症需要，将脱细胞真皮基质分别裁剪定型成：片状型、网孔型、圆孔型、微粒型。
(8)包装和辐照消毒工艺：成型包装，经γ射线辐照灭菌即可。
实施例3
本发明基底膜胶原材料的制备方法的一种实施例，本实施例基底膜胶原材料的制备方法为：
(1)制备断层皮片：清洗羊的皮肤，用取皮机将羊皮肤制成厚度为 0.1-0.2mm的断层皮片，用打孔器将断层皮片制成不同形状的断层皮片；
(2)灭菌：将断层皮片放入装有无菌注射用水配制的低浓度过氧乙酸-乙醇溶液消毒剂中，浸泡；所述消毒剂中，过氧乙酸的体积百分含量为0.15％，乙醇的体积百分含量为5％，消毒剂和猪小肠黏膜下层体积比6:1，灭菌时间为1.5h，灭菌温度范围为22℃。
(3)清洗过程：采用清洗液清洗步骤(2)得到的断层皮片，清洗液为pH 值为7.3的PBS溶液，PBS溶液温度为20℃，PBS溶液与心包膜组织材料的体积比40:1，清洗次数3次，每次30分钟；然后采用纯化水清洗，纯化水与心包膜组织材料比例为40:1，至检测电导率为10μS/cm以下终止。
(4)采用脱细胞液A浸泡断层皮片10小时，脱细胞液A中的溶质为碳酸钠和EDTA-四钠，脱细胞液A中，溶质的质量分数为5％；脱细胞溶液A的pH 值为7.3；脱细胞液A与小肠黏膜下层的体积比为25:1；然后用脱细胞液B浸泡心包膜组织材10小时，所述脱细胞液B由酸溶液和盐溶液组成，所述脱细胞液 B中，酸溶液中的酸为盐酸和甘醇酸，酸的浓度为1.0mol/L,盐溶液中的盐为氯化钠和硫酸钠，盐的浓度为1.5mol/L；脱细胞液B与动物组织的体积比为25:1，脱细胞溶液B的pH值为7.3。
(5)清洗过程：采用清洗液进行清洗，清洗液为pH7.2的PBS溶液，PBS 溶液温度为20℃，PBS溶液与皮片组织材料的比例为25:1，清洗3次每次20 分钟；然后采用20℃的降温的注射用水清洗，注射用水与皮片组织材料比例 25:1，检测清洗注射用水与未清洗注射用水电导率之差小于1uS/cm终止。
(6)冻干、裁剪、定型：步骤(5)清洗完成后的断层皮片，放入冷冻干燥机冻干后，根据临床不同的适应症需要，将脱细胞真皮基质分别裁剪定型成：片状型、网孔型、圆孔型、微粒型。
(7)包装和辐照消毒工艺：成型包装，经γ射线辐照灭菌即可。
实施例4
本发明基底膜胶原材料的制备方法的一种实施例，本实施例基底膜胶原材料的制备方法为：
(1)表面清洗：取刚屠宰的牛的肾脏，剪除黏附的脂肪组织，用自来水冲洗去除黏附物，分离出牛肾脏，使用注射用水冲洗3遍，再用纯化水冲洗至表面无污渍，将冲洗后的牛肾脏组织材料置于滤网滤水5分钟，滤干后，用量筒等量取体积的装置进行量取。
(2)灭菌：将牛肾脏放入装有无菌注射用水配制的低浓度过氧乙酸-乙醇溶液消毒剂中，浸泡；所述消毒剂中，过氧乙酸的体积百分含量为1％，乙醇的体积百分含量为30％，消毒剂和猪小肠黏膜下层体积比8:1，灭菌时间为1.5h，灭菌温度范围为25℃。
(3)清洗过程：采用清洗液清洗步骤(2)得到的牛肾脏组织材料，清洗液为pH值为7.4的PBS溶液，PBS溶液温度为20℃，PBS溶液与牛肾脏组织材料的体积比20：1，清洗次数3次，每次30分钟；然后采用纯化水清洗，纯化水与牛肾脏组织材料比例为20:1，至检测电导率为10μS/cm以下终止。
(4)采用脱细胞液A浸泡牛肾脏组织材料24小时，脱细胞液A中的溶质为碳酸钾和磷酸钠，脱细胞液A中，溶质的质量分数为2％；脱细胞溶液A的 pH值为7.4；脱细胞液A与小肠黏膜下层的体积比为4:1；然后用脱细胞液B 浸泡牛肾脏组织材料24小时，所述脱细胞液B由盐酸溶液和盐溶液组成，所述脱细胞液B中，盐酸的浓度为0.8mol/L，盐溶液中的盐为氯化钾和硫酸钾，盐的浓度为4mol/L；脱细胞液B与动物组织的体积比为4:1，脱细胞溶液B的pH 值为7.4。
(5)清洗过程：采用清洗液进行清洗，清洗液为pH7.4的PBS溶液，PBS 溶液温度为20℃，PBS溶液与牛肾脏组织材料的比例为20:1，清洗3次，每次 25分钟；然后采用20℃的降温的注射用水清洗，注射用水与牛肾脏组织材料比例(体积比)为：20:1，检测清洗注射用水与未清洗注射用水电导率之差小于 1μS/cm终止。
(6)氯化钠处理：该步骤在清洗槽可震荡的恒温超声波清洗器中进行，将氯化钠溶液注入清洗槽中，开启清洗器，清洗时间为30min，氯化钠溶液浓度为 2mol/L、pH值不超过7.8，然后以流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到 1.5μS/cm以下时终止。该步骤中清洗槽震荡率为100rpm，超声波频率为80KHZ。
(7)冻干、裁剪、定型：上述清洗完成后，放入冷冻干燥机冻干后，根据临床不同的适应症需要，将脱细胞真皮基质分别裁剪定型成：片状型、网孔型、圆孔型、微粒型。
(8)包装和辐照消毒工艺：成型包装，经γ射线辐照灭菌即可。
实施例5
本发明基底膜胶原材料的制备方法的一种实施例，本实施例基底膜胶原材料的制备方法为：
(1)表面清洗：取刚屠宰的牛身上的膀胱，剪除黏附的脂肪组织，用自来水冲洗去除黏附物，分离出牛膀胱，使用注射用水冲洗3遍，再用纯化水冲洗至表面无污渍，将冲洗后的牛膀胱组织材料置于滤网滤水5分钟，滤干后，用量筒等量取体积的装置进行量取。
(2)灭菌：将牛膀胱放入装有无菌注射用水配制的低浓度过氧乙酸-乙醇溶液消毒剂中，浸泡；所述消毒剂中，过氧乙酸的体积百分含量为0.05％，乙醇的体积百分含量为30％，消毒剂和牛膀胱体积比10:1，灭菌时间为2h，灭菌温度范围为25℃。
(3)清洗过程：采用清洗液清洗步骤(2)得到的牛膀胱组织材料，清洗液为pH值为7.2的PBS溶液，PBS溶液温度为20℃，PBS溶液与牛膀胱组织材料的体积比40:1，清洗次数3次，每次30分钟；然后采用纯化水清洗，纯化水与牛膀胱组织材料比例为40:1，至检测电导率为10μS/cm以下终止。
(4)采用脱细胞液A浸泡牛膀胱组织材料8小时，脱细胞液A中的溶质为碳酸钾和磷酸钾，脱细胞液A中，溶质的质量分数为10％；脱细胞溶液A的 pH值为7.2；脱细胞液A与牛膀胱的体积比为30:1；然后用脱细胞液B浸泡牛膀胱组织材料8小时，所述脱细胞液B由乳酸溶液和盐溶液组成，所述脱细胞液B中，乳酸的浓度为2.0mol/L，盐溶液中的盐为硫酸钠和硫酸钾，盐的浓度为0.8mol/L；脱细胞液B与动物组织的体积比为30:1，脱细胞溶液B的pH值为7.2。
(5)清洗过程：采用清洗液进行清洗，清洗液为pH7.2的PBS溶液，PBS 溶液温度为20℃，PBS溶液与牛膀胱组织材料的比例为30:1，清洗3次，每次 25分钟；然后采用20℃的降温的注射用水清洗，注射用水与牛肾脏组织材料比例(体积比)为：30:1，检测清洗注射用水与未清洗注射用水电导率之差小于 1μS/cm终止。
(6)氯化钠处理：该步骤在清洗槽可震荡的恒温超声波清洗器中进行，将氯化钠溶液注入清洗槽中，开启清洗器，清洗时间为5min，氯化钠溶液浓度为2mol/L、pH值不超过7.8，然后以流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到 1.5μS/cm以下时终止。该步骤中清洗槽震荡率为300rpm，超声波频率为20KHZ。
(7)冻干、裁剪、定型：上述清洗完成后，放入冷冻干燥机冻干后，根据临床不同的适应症需要，将脱细胞真皮基质分别裁剪定型成：片状型、网孔型、圆孔型、微粒型。
(8)包装和辐照消毒工艺：成型包装，经γ射线辐照灭菌即可。
实施例6
本发明基底膜胶原材料的制备方法的一种实施例，本实施例基底膜胶原材料的制备方法与实施例1的不同之处仅在于：本实施例中，脱细胞液A中的溶质为碳酸钠和EDTA-四钠，脱细胞液A中，碳酸钠的质量分数为5％，EDTA- 四钠的质量分数为0.01％；脱细胞溶液A的pH值为7.3。
实施例7
本发明基底膜胶原材料的制备方法的一种实施例，本实施例基底膜胶原材料的制备方法与实施例1的不同之处仅在于：本实施例中，脱细胞液A中的溶质为碳酸钠和EDTA-三钠，脱细胞液A中，碳酸钠的质量分数为5％，EDTA- 三钠的质量分数为1％；脱细胞溶液A的pH值为7.3。
实施例8
本实施例对实施例1步骤(10)得到的生物型创面基质材料(即基底膜胶原材料)进行理化性质，生物学检测。
1、对制备的生物型创面基质材料进行物理化学性能检测，检测项目包括外观，规格尺寸。
(1)外观测定：外观白色或微黄，无杂质和异物，符合要求。
(2)规格尺寸测定：采用符合精度要求的通用量具进行检测，结果为 XSM-S3的长度为3.09-3.20cm，宽度为3.06-3.16cm；XSM-S7的长度为 7.20-7.25cm，宽度为6.95-7.20cm；XSM-S10的长度为10.20-10.25cm，宽度为 10.15-10.20cm。符合《生物型创面基质材料》产品技术要求。
2、对制备的生物型创面基质材料进行物理化学性能检测，检测项目包括pH 值，重金属(以铅计)含量，蛋白质含量，DNA残留量，内毒素残留量。
(1)pH值测定：按照GB/T 14233.1《医用输液、输血、注射器具检验方法第一部分：化学分析方法》中5.4.1中规定的方法试验，结果显示，浸提液与空白对照组的pH值差异为0.685，符合《生物型创面基质材料》产品技术要求规定的1.0。
(2)重金属(以铅计)含量测定：按照《中华人民共和国药典》2015版四部通则0800限量检查法中的0821重金属检查法第二法要求进行测定，结果显示，重金属含量不大于10ug/g，符合《生物型创面基质材料》产品技术要求。
(3)蛋白质含量测定：按照《中华人民共和国药典》2015版四部通则0731 蛋白质含量测定法第一法要求进行测定，结果显示，蛋白质含量为85.0％，符合《生物型创面基质材料》产品技术要求中规定的不应小于50％。
(4)DNA残留量测定：参照YY/T 0606.25-2014组织工程医疗产品第25 部分动物源性生物材料DNA残留量测定法:荧光染色法，依据样品本身特性设计方法进行测定，结果显示，DNA残留量为2.34ng/mg，符合《生物型创面基质材料》产品技术要求中规定的不应大于50ng/mg。
(5)内毒素残留量测定：按照6cm2样品加1mL浸提介质的比例，37±1℃， 72±2h制备试验液，浸提介质为生理盐水。按GB/T 14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分：生物学试验方法》规定的方法试验，检测3 批样品。结果显示，内毒素含量小于5EU/g。
3、对制备的生物型创面基质材料进行物理化学性能检测，检测项目包括无菌试验测定，全身急性毒性测定，细胞毒性测定，致敏试验测定，遗传毒性测定，植入试验测定，皮内刺激测定。
(1)无菌试验测定：按照《中华人民共和国药典》2O15年版四部通则1100 生物检查法中的1101无菌检查法规定进行，结果显示无菌，符合《生物型创面基质材料》产品技术要求中规定的无菌要求。
(2)全身急性毒性测定：按照GB/T 16886.12－2005医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品的要求制备样品，浸提介质为生理盐水和棉籽油，样品的吸水容量为2ml/0.1g(即0.1g样品吸水量是2ml)，浸提比例3ml/0.1g (即0.1g样品用3ml浸提介质)，在37±1℃条件下浸提72±2小时制得浸提液。按照GB/T16886.11-2011医疗器械生物学评价第11部分：全身毒性试验中的规定方法进行，结果显示，产品无急性全身毒性反应。
(3)细胞毒性测定：按照GB/T 16886.12－2005医疗器械生物学评价第 12部分：样品制备与参照样品的要求制备样品，浸提介质为含血清培养基，样品的吸水容量为2ml/0.1g(即0.1g样品吸水量是2ml)，浸提比例3ml/0.1g(即 0.1g样品用3ml浸提介质)，在37±1℃条件下浸提72±2小时制得浸提液。按照 GB/T16886.5-2003医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验中的规定方法进行，结果显示，细胞毒性反应小于1级。
(4)致敏试验测定：按照GB/T 16886.12－2005医疗器械生物学评价第 12部分：样品制备与参照样品的要求制备样品，浸提介质为生理盐水，样品的吸水容量为2ml/0.1g(即0.1g样品吸水量是2ml)，浸提比例3ml/0.1g(即0.1g 样品用3ml浸提介质)，在37±1℃条件下浸提72±2小时制得浸提液。按照 GB/T16886.10-2005医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验中的规定方法进行，结果显示，无迟发型超敏反应。
(5)遗传毒性测定：按照GB/T 16886.12－2005医疗器械生物学评价第 12部分：样品制备与参照样品的要求制备样品，浸提介质为生理盐水，样品的吸水容量为2ml/0.1g(即0.1g样品吸水量是2ml)，浸提比例3ml/0.1g(即0.1g 样品用3ml浸提介质)，在37±1℃条件下浸提72±2小时制得浸提液。按 GB/T16886.3-2008医疗器械生物学评价第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验的规定方法进行，结果显示，产品的遗传毒性试验为阴性。
(6)植入试验测定：按照GB/T 16886.6-1997医疗器械生物学评价第6 部分：植入后局部反应试验的规定方法进行，结果显示，皮下植入1周：样品周围可见嗜中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润，无囊腔形成；皮下植入4 周，样品周围可见少量巨噬细胞和淋巴细胞，胶原纤维和纤维母细胞增生，有纤维囊腔形成；皮下植入12周：样品周围可见少量淋巴细胞、胶原纤维、纤维囊腔较致密规整。
(7)皮内刺激测定：按照GB/T 16886.12－2005医疗器械生物学评价第 12部分：样品制备与参照样品的要求制备样品，浸提介质为生理盐水和棉籽油，样品的吸水容量为2ml/0.1g(即0.1g样品吸水量是2ml)，浸提比例3ml/0.1g(即0.1g样品用3ml浸提介质)，在37±1℃条件下浸提72±2小时制得浸提液按照 GB/T16886.10-2005医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验中的规定方法进行，结果显示，试验样品与溶剂对照平均记分之差小于1.0。
4、组织学检测
(1)光学显微镜观察：方法：石蜡包埋后的材料进行苏木精-伊红染色，光学显微镜观察。结果显示，无细胞和细胞碎片残留，胶原显微连续无断裂，如图1所示。
(2)超微结构观察，结果显示，材料呈多孔结构，显微无断裂，孔径均匀，孔径尺寸为100-800μm，平均孔径大小为200μm。孔隙率大于85％，如图2所示。
5、生长因子检测
按照6cm2样品加1mL浸提介质的比例，37±1℃，72±2h制备试验液，浸提介质为生理盐水。采用ELISA法检测浸提液中碱性生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF-β)和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量，结果显示，bFGF含量为5.90±4.01pg/mg，VEGF含量为70.14±23.37ng/mg，TGF-β含量为11.93±4.31pg/mg，TNF-α含量为9.11±5.62pg/mg。
实施例9慢性难愈合创面修复
1、人源皮肤上皮细胞与生物型创面基质材料接触培养
经传代培养的人源皮肤上皮细胞80％融合后用PBS冲洗2次，加入0.25％胰蛋白酶1ml，倒置显微镜下观察细胞形态变圆，细胞间隙变大或少量细胞脱壁时加入含血清的DMEM培养液终止消化，收集细胞悬液，离心5min(800·min-1)，计数，以1×105/ml的密度接种在生物型创面基质材料上的皮肤上皮细胞层。细胞接种前，先将生物型创面基质材料在PBS中浸泡10min，然后将样品平铺于 96孔培养板中，接种后的细胞与支架复合体在37℃、5％CO2培养箱中静置3h 后，再加入适量MEM培养液，继续放培养箱培养，隔天换液一次。培养3天后， DAPI染色，倒置显微镜观察细胞形态及不同层面的生长状况。
结果显示，细胞接种到脱细胞基质1天后倒置显微镜观察发现细胞均贴附到支架材料上，人源皮肤上皮细胞在2天后可见细胞增殖生长良好，逐渐融合图(见图3,4)。3天后观察人源皮肤上皮细胞为细椭圆形，与生物型创面基质材料支架表面紧密结合图，并且已有细胞侵入支架内部图(见图5,6)。
2、生物型创面基质材料修复糖尿病鼠全层皮肤缺损实验
糖尿病慢性创面模型制备清洁级、同周龄大鼠60只，体重250～300g，大鼠禁食24h后，测定空腹血糖(FBS)正常，然后腹腔注射1％链脉佐菌素(STZ，柠檬酸及柠檬酸钠液按照1:1.32比例配置缓冲液，pH＝4.3，用于稳定药物)60 mg/kg，1次。7日后测FBS，然后每3天测定1次。有多饮、多尿表现，FBS≥16. 7mmol/L判断为阳性，每日测FBS 1次，继续监测1周，每次FBS≥16.7mmol/L 者为糖尿病模型制备成功，用于本实验。将糖尿病大鼠背部除毛，于背中部沿背中线两侧旁开1cm各做两个直径1.5cm圆形标记，沿标记做圆形切口达皮下层，完整切取全层皮肤组织，形成皮肤缺损创面，计算创面面积作为创面评估基线面积。
于第7,14,28天每组各随机选取8只大鼠脱颈法处死，取创面及创面周缘2 mm范围内的全层皮肤标本，剪取创缘交界处肉芽组织，常规切片，苏木素-伊红(HE)染色，镜下观察肉芽组织生成、新生胶原排列、上皮层形成、肉芽血管形成以及炎细胞浸润情况。每只小鼠观察4-5张切片。
采用本发明基底膜胶原材料修复糖尿病鼠全层皮肤缺损时，不同时间点创面大体观察结果如图7所示，HE染色结果如图8所示，创面愈合率如表1所示。
表1
组别 治疗后第3天 治疗后第7天 治疗后第14天 治疗后第21天 治疗后第28天
试验组 12.00±2.69 62.00±8.25* 90.00±2.27* 100.00±0* 100.00±0
对照组 10.00±3.84 40.00±7.59 78.00±4.38 89.00±3.54 98.00±2.67
注：与对照组比较：*P＜0.05
从图7可以看出，伤后第3天试验组大鼠创面即开始收缩，此后创面缩小进程较快，至伤后第21天创面基本愈合。对照组大鼠则不同，术后第3天有些个体出现创面增大或收缩不明显，而随后的愈合过程亦较为缓慢，至伤后第28 天后基本愈合。统计各时间点两组大鼠创面愈合率，结果见表1，在各个时间点上，试验组创面愈合平均面积明显大于对照组。
如图8所示，第7天实验组组织结构较清晰，开始存在少量肉芽组织和腺样结构，对照组大量炎症细胞浸润。实验组第14天试验组可见大量成纤维细胞，出现胶原束和皮肤结构，组织分层愈合良好，可见大量毛细血管生成，对照组 14天成纤维细胞数量较实验组少，存在少量炎性细胞，组织结构不明显。28天 2组创面基本愈合，细胞种类减少，存在大量胶原束，毛细血管增多，基本恢复表皮结构。
实施例10
本实施例比较了采用不同脱细胞液对动物组织进行脱细胞时，得到的基底膜胶原材料的效果。本实施例基底膜胶原材料的制备方法为：
(1)表面清洗：剪除猪小肠外壁脂肪，用自来水冲洗去除猪小肠内容物，分离出小肠黏膜下层，使用注射用水冲洗3遍，再用纯化水冲洗至表面无污渍，将冲洗后的小肠黏膜下层组织材料置于滤网滤水5分钟，滤干后，用量筒等量取体积的装置进行量取。
(2)灭菌：将猪小肠黏膜下层放入装有无菌注射用水配制的低浓度过氧乙酸-乙醇溶液消毒剂中，浸泡；所述消毒剂中，过氧乙酸的体积百分含量为 0.05-0.1％，乙醇的体积百分含量为5-30％，消毒剂和猪小肠黏膜下层体积比5-10： 1，灭菌时间为1-2h，灭菌温度范围为20-25℃。
(3)清洗过程：采用清洗液清洗步骤(2)得到的小肠黏膜下层然后采用纯化水清洗，纯化水与小肠黏膜下层的体积比为20-40:1，至检测电导率为 10μS/cm以下终止。
(4)采用脱细胞液A浸泡小肠黏膜下层8～24小时，脱细胞液A中溶质的质量分数为2～10％；脱细胞液A与小肠黏膜下层的体积比为4～30:1；然后用脱细胞液B浸泡小肠黏膜下层8～24小时，脱细胞液B由酸溶液和盐溶液组成，所述脱细胞液B中，酸的浓度为0.8～2mol/L，盐的浓度为0.8～4mol/L，脱细胞液 B与动物组织的体积比为4～30:1。
(5)清洗过程：采用清洗液进行清洗，然后采用20℃的降温的注射用水清洗，注射用水与小肠黏膜下层的体积比为：20-40:1，检测清洗注射用水与未清洗注射用水电导率之差小于1μS/cm终止。
(6)固定成型：在模具上进行，所述模具包括带针底板与压框，需要根据不同的规格尺寸选择不同的模具，将步骤(5)制备的小肠黏膜下层基质材料平铺于带针底板上，将所述压框放置于小肠黏膜下层基质材料上，压框的尺寸可为最终剪裁的尺寸或更宽，将所述带针底板和所述压框相对固定。
(7)将步骤(5)制备的小肠黏膜下层基质材料分装到西林瓶中，该步骤需要无菌转运与操作。
(8)真空冷冻干燥：在真空冷冻干燥机中进行，产品的冷冻干燥工艺需要根据不同的设备重新确认，将模具平铺于真空冷冻干燥机中，关闭冻干室的门，打开循环泵约1分钟，开启压缩机对冻干箱致冷，将步骤(6)的模具连同上面的小肠黏膜下层基质材料或者步骤(7)中分装好的西林瓶连同里面的小肠黏膜下层基质材料预冻至-50℃，保温1-2小时，然后开启真空泵，调节温度至-15℃，保温5-7小时，再调节温度至0℃，保温2小时，最后调节温度至25℃，保温4 小时，真空冷冻干燥完成，冷冻干燥装置的腔室内的压强为20-25Pa。
(9)包装：干燥材料取出后，在模具上用切割装置分别切割成 3*3cm,7*7cm,10*10cm，然后采用特卫强包装袋包装，封口机热封，贴标签，该过程需要无菌转运与操作，即得生物型创面基质材料，即为基底膜胶原材料。西林瓶取出后，盖好瓶盖，低温保存，即得基底膜胶原冻干粉。
(11)灭菌：采用钴60辐照灭菌，灭菌剂量为25kGy，灭菌6小时。
其中，脱细胞液A和脱细胞液B的组成如下表2所示，同时，测定制得的基底膜胶原材料的DNA残留量和DNA数量，结果见表2。其中，DNA残留量检测的方法为：依据生物制剂残留DNA检测方法《中国药典》2015年版第四部，采用荧光染色法检测不同试验组所提供的样品DNA残留量。DNA数量采用组织学检测，具体采用光学显微镜观察：每个试验组取三个样品分别进行HE 染色，每个切片选3个视野，在400倍光学显微镜下观察完整细胞数量除以3，平均每个视野完整细胞数量结果应小于10个。
表2
由表2可见，采用本发明的脱细胞液，脱细胞效果较好，制得的基底膜胶原材料的DNA残留量低，DNA数量少。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种基底膜胶原材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取动物组织，进行清洗后灭菌；
(2)清洗步骤(1)灭菌后的动物组织，再采用脱细胞液A对动物组织进行脱细胞处理；
(3)采用脱细胞液B对步骤(2)脱细胞处理后得到的动物组织进行脱细胞处理；
(4)将步骤(3)脱细胞处理所得动物组织置于PBS缓冲液或注射用水中，进行清洗处理；
(5)将步骤(4)清洗处理后的动物组织冻干和定型，得到基底膜胶原材料。
2.如权利要求1所述的基底膜胶原材料的制备方法，其特征在于，所述脱细胞液A中的溶质为碳酸钠、碳酸钾、EDTA三钠、EDTA四钠、磷酸钠、磷酸钾中的至少一种；
所述脱细胞液B由酸溶液和盐溶液组成，所述酸溶液中的酸为HCl、磷酸、硫酸、醋酸、乳酸、甘醇酸、草酸中的至少一种；所述盐溶液中的盐为氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾中的至少一种。
3.如权利要求2所述的基底膜胶原材料的制备方法，其特征在于，所述脱细胞液A中的溶质由(a)碳酸钠和(b)EDTA三钠或EDTA四钠组成；所述脱细胞液B中，酸溶液中的酸为盐酸，盐溶液中的盐为氯化钠，或者所述脱细胞液B中，酸溶液中的酸为甘醇酸和HCl，盐溶液中的盐为硫酸钠与氯化钠。
4.如权利要求2～3任一项所述的基底膜胶原材料的制备方法，其特征在于，所述脱细胞液A中，溶质的质量分数为2～10％；所述脱细胞液B中，酸的浓度为0.8～2mol/L，盐的浓度为0.8～4mol/L。
5.如权利要求4所述的基底膜胶原材料的制备方法，其特征在于，所述脱细胞液A由下述质量百分比的组分组成：(a)碳酸钠5％和(b)EDTA三钠或EDTA四钠0.01％-1％；所述脱细胞液B由下述浓度的组分组成：盐酸1mol/L和氯化钠1mol/L。
6.如权利要求1所述的基底膜胶原材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，脱细胞液A与动物组织的体积比为4～30:1，采用脱细胞液A浸泡动物组织8～24小时；所述步骤(3)中，脱细胞液B与动物组织的体积比为4～30:1，采用脱细胞液B浸泡动物组织8～24小时。
7.如权利要求1所述的基底膜胶原材料的制备方法，其特征在于，所述动物组织为小肠、神经、膀胱、皮肤、心包或肾脏；所述动物组织来源于猪、牛或羊。
8.如权利要求1所述的基底膜胶原材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采用消毒剂进行灭菌，所述消毒剂含有过氧乙酸、过氧化氢或乙醇溶液；所述消毒剂中，过氧乙酸的体积百分含量为0.05-1％，过氧化氢的体积百分含量为0.5-10％，乙醇的体积百分含量为5-30％；所述步骤(2)中，采用清洗液进行清洗，所述清洗液为PBS溶液或注射用水，所述PBS溶液的pH值为7.0-7.4。
9.一种采用如权利要求1～8任一项所述方法制备得到的基底膜胶原材料。
10.如权利要求9所述基底膜胶原材料在制备治疗创面修复的药物、医疗器械或化妆品中的应用。
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