CN105013019A - 一种组织工程全层皮肤及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于组织工程技术领域，公开了一种组织工程全层皮肤及其制备方法。本发明提供的组织工程全层皮肤包括表皮细胞、真皮细胞和生物支架材料；其是将所述真皮细胞复合于所述生物支架材料内部，在表面接种所述表皮细胞，培养制备获得的。该组织工程全层皮肤具有真皮层和表皮层，带有活性细胞，且表皮层中含有角质层，接近于正常皮肤，并在移植后，能够再生出完整的具有功能的人类皮肤，再生的皮肤具有毛发、皮脂腺等皮肤附属器官，可以用于炎症、溃疡、烧烫伤等原因造成的皮肤缺损的治疗，也可用于制备皮肤模型以用于疾病研究、药物测试和筛选或化妆品测试等。

Description

一种组织工程全层皮肤及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，特别涉及一种组织工程全层皮肤及其制备方法。

背景技术

皮肤是覆盖于体表和内脏器官的重要组织，是人体与外界环境接触的屏障，不仅起保护、分泌、代谢和感觉等作用，而且可参与免疫反应，维持机体内环境的稳定。炎症、溃疡、外伤、烧伤、肿瘤术后以及先天畸形等原因常会造成皮肤上的创伤，既影响美观也影响人们的生活质量。对于这些创伤目前常用的治疗方法是自体皮肤移植，这种方法不仅会在供皮区产生新的创伤，还存在自身正常皮肤来源有限和移植皮肤存活率低等限制。深度大面积的烧烫伤常会造成大面积的皮肤损伤，极易引发感染而导致患者死亡，大面积烧伤患者的皮源缺乏和严重创伤一直是临床亟待解决的难题。近年来，随着组织工程技术的发展，先后研制出了不同类型的组织工程皮肤替代物，该替代物在临床上可用于皮肤缺损的移植治疗，促进皮肤创面的愈合，减少疤痕形成，尤其在深度大面积的烧烫伤情况下，该移植物的应用能够覆盖创面，在一定程度上克服了皮肤供区不足、免疫排斥、传播疾病等各种问题，可减少体液流失，减轻痛苦，避免感染，为皮肤移植治疗创伤引起的皮肤缺损及皮肤疾病提供了新的方向；目前，组织工程皮肤的研究也成为了生命科学研究领域的热点之一。

据研究报道，组织工程皮肤包括人工表皮、人工真皮及含表皮和真皮双层结构的全层皮肤。其中，最受人们推崇的是组织工程全层皮肤，它是由表皮层和真皮层组成的双层复合人工皮肤。理想的组织工程全层皮肤，接近于天然皮肤，能够同时修复受体所缺失的真皮层和表皮层，既能够达到正常皮肤的韧性和强度，又能够抗感染。

目前，已有一些产品开始应用于临床，这些产品主要是含有一层细胞结构的产品。例如，Dermagraft^TM(Advanced Tissue Sciences,Inc.U.S.A.)是一种由真皮成纤维细胞、细胞外基质和可降解生物材料构成的人工真皮替代物，主要用于烧伤创面及糖尿病足溃疡的创面修复。其缺点在于Dermagraft只具有真皮层，不具有表皮层，移植后仍然需要一期或者二期移植自体断层皮片。

美国的Apligraf^TM(Organogenesisi,Inc.U.S.A.)人工皮肤是目前最为成熟的既含有表皮层又含有真皮层的组织工程皮肤，该组织工程皮肤以活细胞为基础，以牛胶原纤维为支架，扩增后可形成具有保护皮肤细胞的外层和含有的胶原蛋白的内层双分子层的三维结构，被用于治疗糖尿病足溃疡及下肢静性溃疡等慢性伤口。但是Apligraf^TM人工皮肤不是真正完整的皮肤，即使移植后也不能形成包含如毛发、皮脂腺等皮肤附属器官的全层皮肤。所以，现有的组织工程全层皮肤依然存在很多不足，需要进一步改进来适应临床需求。

发明内容

有鉴于此，本发明的发明目的在于提供一种组织工程全层皮肤及其制备方法，该组织工程全层皮肤具有真皮层和表皮层，带有活性细胞，且表皮层中含有角质层，接近于正常皮肤，并在移植后，能够产生皮肤附属器官如毛囊汗腺等，形成完整的功能性皮肤，可以用于炎症、溃疡、烧烫伤等原因造成的皮肤缺损的治疗，也可用于制备皮肤模型以用于疾病研究、药物测试和筛选或化妆品测试等。

为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供了一种组织工程全层皮肤，其包括表皮细胞、真皮细胞和生物支架材料；

其是将所述真皮细胞复合于所述生物支架材料内部，在表面接种所述表皮细胞，培养制备获得的。

优选地，本发明提供的组织工程全层皮肤中的真皮细胞是按照如下制备方法制备获得的，其包括以下步骤：

步骤一：采集组织样品，所述组织样品用组织消化酶消化12h-20h之后，用机械法分开表皮和真皮部分；

步骤二：取所述真皮部分剪碎后，用胶原蛋白酶酶解、过滤，收集滤液，得真皮细胞；

步骤三：取所述真皮细胞，用任何供细胞自然生长的培养基培养；当细胞生长达到在培养器皿80％-90％覆盖率时，进行传代；所述传代按1:3-6比例传代。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的组织工程全层皮肤中所用的真皮细胞的传代代数为1-6代。更为优选地，所用的真皮细胞的传代代数为2-4代。

在本发明中，真皮细胞的来源不受本发明的限制，也可以为可向真皮细胞分化的干细胞，例如，胚胎干细胞、诱导性多功能干细胞、成体干细胞(如骨髓间质干细胞、皮肤干细胞、脂肪干细胞、间充质干细胞中的一种或几种)。

优选地，本发明提供的组织工程全层皮肤中的表皮细胞是按照如下制备方法制备获得的，其包括以下步骤：

步骤1：采集组织样品，所述组织样品用组织消化酶消化12h-20h之后，用机械法分开表皮和真皮部分；

步骤2：取所述表皮部分剪碎后，用胰蛋白酶酶解、过滤，收集滤液，得表皮细胞；

步骤3：取所表皮细胞，用加入了Rock蛋白激酶抑制剂的任何供细胞自然生长的培养基培养；当细胞生长达到在培养器皿80％-90％覆盖率时，进行传代；所述传代按1:1-6比例传代；

所述Rock蛋白激酶抑制剂的添加量为其终浓度达2-10μmol/L。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的组织工程全层皮肤中所用的表皮细胞的传代代数为1-6代。更为优选地，所用的表皮细胞的传代代数为2-4代。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的组织工程全层皮肤中表皮细胞的制备方法中所用的Rock蛋白激酶抑制剂为Y-27632。

在本发明中，表皮细胞的来源不受本发明的限制，也可以来源于可向表皮细胞分化的干细胞，例如，胚胎干细胞、诱导性多功能干细胞、成体干细胞(如骨髓间质干细胞、皮肤干细胞、间充质干细胞中的一种或几种)。

优选地，本发明提供的组织工程全层皮肤中的生物支架材料为机体可接受的生物可降解材料，包括胶原蛋白、细胞外基质复合物、透明质酸、多糖、硫酸软骨素、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物中的一种或两者以上混合物。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的组织工程全层皮肤中的生物支架材料所用的生物可降解材料中胶原蛋白为鼠源胶原蛋白或牛源胶原蛋白。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的组织工程全层皮肤中的生物支架材料所用的生物可降解材料中的多糖为壳聚糖。

本发明还提供了一种组织工程全层皮肤的制备方法，其包括如下步骤：

基底层的配置：取MEM、L-谷氨酰胺、生物支架材料混合，调节pH值至pH7.0-pH7.4后，置于支撑膜上，固化，得基底层；

真皮层的配置：取MEM、L-谷氨酰胺、生物支架材料混合，调节pH值至pH7.0-pH7.4后，加入真皮细胞，置于所述基底层之上，固化之后，加入真皮培养基，培养2-4天，得真皮层；

组织工程全层皮肤的形成和成熟：取表皮细胞平铺于所述真皮层，孵育0.5h-2h，加入表皮培养基，培养2-3天；之后进行气液界面培养2-3天，即得。

优选地，本发明提供的制备方法中真皮细胞的制备方法包括以下步骤：

步骤一：采集组织样品，所述组织样品用组织消化酶消化12h-20h之后，用机械法分开表皮和真皮部分；

步骤二：取所述真皮部分剪碎后，用胶原蛋白酶酶解、过滤，收集滤液，得真皮细胞；

步骤三：取所述真皮细胞，用任何供细胞自然生长的培养基培养；当细胞生长达到在培养器皿80％-90％覆盖率时，进行传代；所述传代按1:1-6比例传代。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的组织工程全层皮肤中所用的真皮细胞的传代代数为1-6代。更为优选地，所用的真皮细胞的传代代数为2-4代。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，真皮细胞的制备方法中，步骤二中的胶原蛋白酶酶解的温度为36℃-37.5℃，优选为37℃。其中的胶原蛋白酶酶解的时间为20min-40min。

优选地，本发明提供的制备方法中表皮细胞的制备方法包括以下步骤：

步骤1：采集组织样品，所述组织样品用组织消化酶消化12h-20h之后，用机械法分开表皮和真皮部分；

步骤2：取所述表皮部分剪碎后，用胰蛋白酶酶解、过滤，收集滤液，得表皮细胞；

步骤3：取所表皮细胞，用加入了Rock蛋白激酶抑制剂的任何供细胞自然生长的培养基培养；当细胞生长达到在培养器皿80％-90％覆盖率时，进行传代；所述传代按1:1-6比例传代；

所述Rock蛋白激酶抑制剂的添加量为其终浓度达2-10μmol/L。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中所用的表皮细胞的传代代数为1-6代。更为优选地，所用的表皮细胞的传代代数为2-4代。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中表皮细胞的制备方法中所用的Rock蛋白激酶抑制剂为Y-27632。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，表皮细胞的制备方法中，步骤2中的胰蛋白酶酶解的温度为36℃-37.5℃，优选为37℃。其中的胰蛋白酶酶解的时间为20min-40min。

优选地，本发明提供的制备方法中，真皮层的配置中所述真皮培养基包括以下含量的各个组分：

优选地，本发明提供的制备方法中，组织工程全层皮肤的形成和成熟中所述表皮培养基包括以下含量的各个组分：

优选地，本发明提供的制备方法中，基底层的配置过程中所用的支撑膜为尼龙膜、硅胶膜、橡胶膜或高分子材料膜。在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中所用的支撑膜为高分子材料膜，PE膜或PET膜。

优选地，本发明提供的制备方法中，组织工程全层皮肤的形成和成熟中的孵育的温度为15℃-37.5℃，更优选为37℃。

优选地，本发明提供的制备方法中，真皮层的配置中真皮细胞的添加量为5×10⁴-1×10⁶个/mL。

优选地，本发明提供的制备方法中，组织工程全层皮肤的形成和成熟中的表皮细胞的添加数量为真皮细胞添加数量的1-10倍。

本发明还提供了一种按照本发明提供的制备方法制备获得的组织工程全层皮肤，该制备方法包括如下步骤：

基底层的配置：取MEM、L-谷氨酰胺、生物支架材料混合，调节pH值至pH7.0-pH7.4后，置于支撑膜上，固化，得基底层；

真皮层的配置：取MEM、L-谷氨酰胺、生物支架材料混合，调节pH值至pH7.0-pH7.4后，加入真皮细胞，置于所述基底层之上，固化之后，加入真皮培养基，培养2-4天，得真皮层；

组织工程全层皮肤的形成和成熟：取表皮细胞平铺于所述真皮层，孵育0.5h-2h，加入表皮培养基，培养2-3天；之后进行气液界面培养2-3天，即得。

本发明提供的组织工程全层皮肤可用于建立人的皮肤模型以用于药物测试和筛选；测试皮肤腐蚀的模型；以及建立再生人的皮肤来评价新的治疗技术，如激光治疗术、冷冻治疗术或真皮磨损术等。

本发明提供的组织工程全层皮肤可用于建立再生人的皮肤皮肤来研究药物皮肤给药方法；研究紫外线和光照对皮肤的损害；研究治疗皮肤疾病的药物；研究治疗毛发疾病的药物；研究治疗汉腺疾病的药物；研究治疗皮脂腺疾病的药物；研究皮肤抗衰老；研究皮肤消脂药物；研究皮肤静脉曲张的疾病；研究个性治疗和个性的药物筛选。

本发明提供的组织工程全层皮肤可用于建立人皮肤创伤和烧伤模型；建立糖尿病人皮肤溃疡的模型；建立毛发生长的动物模型；建立特殊皮肤疾病模型：如牛皮癣，皮肤癌，湿疹，斑秃，雄性秃发，表皮水泡病，粉刺，白化病，皮肤老化等。

本发明提供的组织工程全层皮肤可用于开发细胞产品用于临床上治疗再生毛发和皮脂腺；治疗各种秃发疾病；促进创口愈合；治疗慢性伤愈合；治疗糖尿病的皮肤溃疡；治疗疤痕组织的愈合；治疗疤痕组织并形成功能正常的汗腺，皮下组织和皮脂腺；用于无疤痕的创伤愈合；去除纹身后的皮肤愈合；治疗牛皮癣和皮肤白化病；治疗皮肤内神经的损害以及再生皮下组织来治疗皮肤老化和抗皱。

本发明提供了一种组织工程全层皮肤及其制备方法，该组织工程全层皮肤包括表皮细胞、真皮细胞和生物支架材料；其是将所述真皮细胞复合于所述生物支架材料内部，在表面接种所述表皮细胞，培养制备获得的。实验结果证实，本发明提供的组织工程全层皮肤具有真皮层和表皮层，带有活性细胞，且表皮层中含有角质层，接近于正常皮肤，在移植小鼠之后，能够再生出完整的具有功能的皮肤和毛发，再生的皮肤具有附属器官，更适合临床应用。

附图说明

图1示本发明制备获得的组织工程全层皮肤的照片；

图2示本发明制备获得的组织工程全层皮肤的组织切片图，其中1为基底胶原蛋白层、2为真皮层、3为表皮层、4为角化的表皮层；

图3示本发明制备获得的组织工程全层皮肤移植后老鼠移植处的皮肤形成情况；

图4示本发明制备获得的组织工程全层皮肤移植后老鼠移植处的皮肤的组织切片图，其中a代表表皮层；b代表真皮层；c代表角质层；1为毛发；2为皮脂腺。

具体实施方式

本发明公开了一种组织工程全层皮肤及其制备方法。本领域技术人员可以参考本文内容，使用该方法，制备获得该组织工程全层皮肤，实现其应用。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员而言是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的组织工程全层皮肤以通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能够在不脱离本发明的内容、精神和范围内对本文的组织工程全层皮肤、其制备方法和应用进行适当变更与组合来实现和应用本发明技术。

本发明提供的一种组织工程全层皮肤及其制备方法中所用到的试剂和原料均可由市场购得。

下面结合实施例对本发明作出进一步说明。

组织工程全层皮肤的制备

(1)采集源自胎儿头皮、新生儿包皮、成人的头皮或成人的包皮等含多功能表皮细胞和真皮细胞的组织样品；或者来自任何组织样品有能力形成单克隆的表皮细胞、真皮细胞以及冰冻融化后仍可以有能力形成人皮肤的细胞。

(2)将采集的新鲜的组织样品用组织消化酶(Dispase蛋白水解酶)于低温4℃过夜进行消化，第二天用机械法分开表皮和真皮部分。

(3)将表皮部分剪碎后培育在胰蛋白酶(Typsin)中，37℃水浴箱酶解30分钟后用40目孔径过滤网来分离表皮细胞；将真皮部分剪碎后培育在胶原蛋白酶中，37℃水浴箱酶解30分钟后用40目孔径过滤网来分离出多功能真皮细胞；

(4)从组织分离后的表皮细胞和真皮细胞分开培养，表皮细胞和真皮细胞可用任何可供细胞自然生长的培养基培养，包括MEM,DMEM,RPMI,F-12，CNT07等结合不同生长因子如纤维细胞生长因子(FGF),表皮细胞生长因子(EGF),B27(神经细胞培养)因子和PC-1(原代细胞培养)补充液等；推荐细胞培养基为含谷氨酰胺的DMEM/F-12培养基；表皮细胞的培养在培养基中另外加入2-10μM Rock蛋白激酶抑制剂如Y-27632，来维持表皮细胞的多功能性；表皮细胞和真皮细胞的培养环境应接近人体生理环境，培养基pH值为6-8，优选pH7.4；细胞的培养温度为30-40℃，优选为35℃-37℃；另外可结合低氧培养(2％-10％)或细胞聚集培养的方法来增强细胞的多功能性，及增加真皮细胞SOX2基因的表达。

(5)真皮细胞培养每4天换一次培养液，而表皮细胞每2天换一次培养液；当细胞生长达到在培养器皿80-90％覆盖率就进行传代；真皮细胞按1:3-6比例传代，可传1-6代；表皮细胞按1:1-6的比例传代，至少可传2-4代。

(6)培养增殖后的多功能表皮细胞和真皮细胞分别消化形成单个细胞，备用。

(7)基底层的配置：取MEM、L-谷氨酰胺、生物支架材料混合(优选为鼠胶原蛋白或牛胶原蛋白)，调节pH值至pH7.0-pH7.4后，置于PET膜上，于15℃-37℃条件下，静止放置以固化，即可得到基底层；

基底层溶液的配方以能够实现生物支架材料固化为准，优选为如下配方：

(8)真皮层的配置：取MEM、L-谷氨酰胺、生物支架材料混合(优选为鼠胶原蛋白或牛胶原蛋白)，调节pH值至pH7.0-pH7.4(以避免伤害到真皮细胞)后，加入真皮细胞(真皮细胞的用量为5×10⁴-1×10⁶个/mL，优选为1×10⁵-5×10⁵个/mL)，置于所得基底层之上，于15℃-37℃条件下，静止放置以固化，固化后，加入真皮培养基浸泡固化后的真皮层，于37℃二氧化碳培养箱中培养2-4天，得真皮层；

真皮层配置溶液的配方中的生物支架材料的浓度不高于基底层溶液的浓度，优选为如下配方：

其中的真皮培养基包括如下含量的各个组分：

该真皮培养基优选为：

(9)组织工程全层皮肤的形成和成熟：舍弃真皮培养基，静止5min-20min，尽可能使真皮层表面没有液体，以便于表皮细胞均匀附着在真皮层；取表皮细胞(真皮细胞添加数量的1-10倍)平铺于所述真皮层，于15℃-37.5℃下(优选为37℃)，孵育0.5h-2h使表皮细胞完全附着在真皮层上，加入表皮培养基，于37℃二氧化碳培养箱培养2-3天；之后进行气液界面，于37℃二氧化碳培养箱培养2-3天，即得。

其中，表皮培养基的配方包含如下含量的各个组分：

该表皮培养基的配方优选为：

其中，气液界面所用培养基包含如下含量的各个组分：

该气液界面所用培养基的配方优选为：

组织学分析

收集所得组织工程全层皮肤，所得组织工程全层皮肤的结构如图1所示。将所得组织工程全层皮肤用4％多聚甲醛固定、蔗糖脱水后，用OTC包埋，冷冻处理后做10μm组织生理切片，经苏木精-伊红染色，乙醇脱水，二甲苯透明，封片后，用光学显微镜检测所得组织工程全层皮肤的组织结构。图2为本发明制备获得的组织工程全层皮肤的结构，其中1为基底胶原蛋白层、2为真皮层、3为表皮层、4为角化的表皮层。从图中可知，本发明的组织工程全层皮肤结构紧凑，层次分明，包含了真皮层和表皮层，且表皮层中含有角质层，接近于正常皮肤。

组织工程全层皮肤的移植

从有免疫缺陷的裸鼠背上切取全层皮肤形成开放的伤口，将本发明制备获得的组织工程全层皮肤覆盖于鼠的伤口上，真皮层与伤口直接接触，表皮层在上面。每只裸鼠身上可做1个或2个移植，并将组织工程全层皮肤固定于伤口处，将涂有药膏的消毒纱布至于伤口上，并用消毒绷带包裹裸鼠。移植后每周观察老鼠移植处的皮肤形成情况并拍照记录，可观察12周到一年。移植4周后，移植处的创面已完全愈合，并形成新的皮肤，没有疤痕形成，说明可以用于无疤痕的创伤愈合。到第12周，再生皮肤的表面产生了肉眼清晰可辨的毛发。因为免疫缺陷的裸鼠不形成肉眼可见的毛发，说明新生的皮肤和毛发是来自于移植的组织工程全层皮肤的。经观察，发现长出来的毛发可以持续增长，图3为本发明制备获得的组织工程全层皮肤移植后6个月，老鼠移植处的皮肤形成情况。图4为本发明制备获得的组织工程全层皮肤移植后6个月，老鼠移植处的皮肤的组织切片染色图(苏木紫-伊红染色方法)，其中a代表表皮层；b代表真皮层；c代表角质层；1为毛发；2为皮脂腺。从图中可清晰看出，再生皮肤的结构人的皮肤结构非常相似，含有表皮层，真皮层和皮下组织层，且真皮层含有毛发、皮脂腺等附属器官。这进一步证明了本发明提供的组织工程全层皮肤带有活性细胞，能够再生出完整的具有功能的皮肤和毛发，再生的皮肤具有附属器官，更适合临床应用。

综上所述，本发明提供的制备方法成功获得了具有真皮层和表皮层，带有活性细胞，且表皮层中含有角质层的组织工程全层皮肤，该组织工程全层皮肤更接近于正常皮肤，制备方法简单，在移植之后，能够再生出完整的具有功能的皮肤和毛发，再生的皮肤具有附属器官，更有利于其推广和临床应用。

Claims (10)

1.一种组织工程全层皮肤，其特征在于，其包括表皮细胞、真皮细胞和生物支架材料；

其是将所述真皮细胞复合于所述生物支架材料内部，在表面接种所述表皮细胞，培养制备获得的。

2.根据权利要求1所述的组织工程全层皮肤，其特征在于，所述真皮细胞是按照如下制备方法制备获得的，其包括以下步骤：

步骤一：采集组织样品，所述组织样品用组织消化酶消化12h-20h之后，用机械法分开表皮和真皮部分；

步骤二：取所述真皮部分剪碎后，用胶原蛋白酶酶解、过滤，收集滤液，得真皮细胞；

步骤三：取所述真皮细胞，用任何供细胞自然生长的培养基培养；当细胞生长达到在培养器皿80％-90％覆盖率时，进行传代；所述传代按1:3-6比例传代。

3.根据权利要求1或2所述的组织工程全层皮肤，其特征在于，所述表皮细胞是按照如下制备方法制备获得的，其包括以下步骤：

步骤1：采集组织样品，所述组织样品用组织消化酶消化12h-20h之后，用机械法分开表皮和真皮部分；

步骤2：取所述表皮部分剪碎后，用胰蛋白酶酶解、过滤，收集滤液，得表皮细胞；

步骤3：取所表皮细胞，用加入了Rock蛋白激酶抑制剂的任何供细胞自然生长的培养基培养；当细胞生长达到在培养器皿80％-90％覆盖率时，进行传代；所述传代按1:1-6比例传代；

所述Rock蛋白激酶抑制剂的添加量为其终浓度达2-10μmol/L。

4.根据权利要求1所述的组织工程全层皮肤，其特征在于，所述的生物支架材料为机体可接受的生物可降解材料，包括胶原蛋白、细胞外基质复合物、透明质酸、多糖、硫酸软骨素、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物中的一种或两者以上混合物。

5.一种组织工程全层皮肤的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

基底层的配置：取MEM、L-谷氨酰胺、生物支架材料混合，调节pH值至pH7.0-pH7.4后，置于支撑膜上，固化，得基底层；

真皮层的配置：取MEM、L-谷氨酰胺、生物支架材料混合，调节pH值至pH7.0-pH7.4后，加入真皮细胞，置于所述基底层之上，固化之后，加入真皮培养基，培养2-4天，得真皮层；

组织工程全层皮肤的形成和成熟：取表皮细胞平铺于所述真皮层，孵育0.5h-2h，加入表皮培养基，培养2-4天；之后进行气液界面培养2-4天，即得。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述真皮细胞的制备方法包括以下步骤：

步骤一：采集组织样品，所述组织样品用组织消化酶消化12h-20h之后，用机械法分开表皮和真皮部分；

步骤二：取所述真皮部分剪碎后，用胶原蛋白酶酶解、过滤，收集滤液，得真皮细胞；

步骤三：取所述真皮细胞，用任何供细胞自然生长的培养基培养；当细胞生长达到在培养器皿80％-90％覆盖率时，进行传代；所述传代按1:3-6比例传代。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述表皮细胞的制备方法包括以下步骤：

步骤1：采集组织样品，所述组织样品用组织消化酶消化12h-20h之后，用机械法分开表皮和真皮部分；

步骤2：取所述表皮部分剪碎后，用胰蛋白酶酶解、过滤，收集滤液，得表皮细胞；

步骤3：取所表皮细胞，用加入了Rock蛋白激酶抑制剂的任何供细胞自然生长的培养基培养；当细胞生长达到在培养器皿80％-90％覆盖率时，进行传代；所述传代按1:1-6比例传代；

所述Rock蛋白激酶抑制剂的添加量为其终浓度达2-10μmol/L。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述真皮层的配置中所述真皮培养基包括以下含量的各个组分：

9.根据权利要求5至7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述组织工程全层皮肤的形成和成熟中所述表皮培养基包括以下含量的各个组分：

10.如权利要求5至9中任一项所述的制备方法制备获得的组织工程全层皮肤。