CN109971704A - 一种红色毛癣菌感染模型的制备方法 - Google Patents

一种红色毛癣菌感染模型的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了一种红色毛癣菌感染模型的制备方法，其包括分离包皮组织的真皮层和表皮层，并将所述表皮层消化、培养，获得人角质形成细胞，最后将所述人角质形成细胞加到胶原支架上培养形成所述组织工程皮肤模型。本发明实施例提供一种红色毛癣菌感染红色毛癣菌感染模型的制备方法及应用，其操作简单，易于观察，克服目前红色毛癣菌感染的动物模型不易观察的问题。本发明实施例红色毛癣菌感染模型的种子为人角质形成细胞，更接近人皮肤真菌感染的生物学状态。

Description

一种红色毛癣菌感染模型的制备方法
技术领域
本发明实施例涉及细胞和组织工程技术领域，具体涉及一种红色毛癣菌感染模型的制备方法。
背景技术
目前，红色毛癣菌是临床最常见的亲人性皮肤癣菌，因为，该菌具有亲人的特性，对于研究红色毛癣菌侵染动物的机制过程中，选择构建动物侵染模型进行研究，但是动物模型的构建过程比较复杂，且构建困难，并且与临床感染情况相差甚远。
近年来，随着组织工程皮肤的不断深入研究与迅速发展，在体外模拟构建组织工程皮肤感染模型来研究红色毛癣菌感染的发病机制、感染后免疫病理过程及药物疗效评价较其他模型更有优势。但是，目前并未有相应成熟的组织工程皮肤能够制备出来，并且可用于红色毛癣菌侵染动物机制的研究中，亟待研发一种新的可以应用于红色毛癣菌侵染过程研究的组织工程皮肤模型。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种红色毛癣菌感染模型的制备方法，以解决现有技术红色毛癣菌感染的动物模型不易观察，不接近皮肤真菌感染的生物学状态的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：一种红色毛癣菌感染模型的制备方法，其包括分离包皮组织的真皮层和表皮层，并将所述表皮层消化、培养，获得人角质形成细胞，最后将所述人角质形成细胞加到胶原支架上培养形成所述组织工程皮肤模型。
优选的，所述包皮组织经消毒处理后，再用含有青-链霉素双抗的缓冲液冲洗。
优选的，所述包皮组织冲洗后，去除脂肪层和结缔组织，并将其放置在DispaseⅡ中4℃消化过夜。
优选的，所述真皮层置于0.25％胰酶-EDTA中，37℃消化15-30min，并振荡数次，对所述真皮层进行消化。
优选的，所述胶原支架制备过程包括：将鼠尾胶原、10×DMEM和FBS在冰上混匀后，再与100μl 1mol/L NaOH混合均匀后形成混合物；
取所述混合物加入到Transwell小室中，37℃，5％CO2的条件下培养，凝固后，加入10％FBS的DMEM培养基继续培养2-3天，得到所述胶原支架。
优选的，所述胶原支架的表面上加入1×106个P3代所述人角质形成细胞，37℃，5％CO2的条件下，培养2-3天，获得所述红色毛癣菌感染模型。
本发明实施例具有如下优点：
本发明实施例提供一种红色毛癣菌感染模型的制备方法，其操作简单，易于观察，克服目前红色毛癣菌感染的动物模型不易观察的问题。本发明实施例的组织工程皮肤模型的种子为人角质形成细胞，更接近人皮肤真菌感染的生物学状态。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例提供的一种红色毛癣菌感染模型的制备流程图；
图2为本发明实施例的红色毛癣菌组织工程皮肤感染模型构建示意图；
图3为本发明实施例的红色毛癣菌组织工程皮肤感染模型的显微镜观察图，其中，A为显微镜下组织工程皮肤；B为显微镜下接种红色毛癣菌的组织工程皮肤；C为普通光学显微镜下组织工程皮肤上的红色毛癣菌，20X；D为培养15d的红色毛癣菌；
图4为本发明实施例的接种至胶原支架的原代人角质形成细胞的显微镜观察图，其中，A为P3代细胞接种后0h，4X；B为P3代细胞接种后0h，10X；C为P3代细胞接种后5h，4X；D：P3代细胞接种后5h，10X；
图5为本发明实施例的Transwell中的不同培养时间的红色毛癣菌组织工程皮肤感染模型的显微镜观察图，其中，A为Transwell中的组织工程皮肤为半透明状，B为培养2d后的组织工程皮肤，C为接种红色毛癣菌后的组织工程皮肤，D为第7d的红色毛癣菌组织工程皮肤；
图6为本发明实施例的红色毛癣菌组织工程皮肤HE和PAS染色的显微镜观察图，其中，A为组织工程皮肤对照组HE染色，20X；B为组织工程皮肤对照组PAS染色，20X；C为感染后第4d的红色毛癣菌组织工程皮肤HE染色，20X；D为感染后第4d的红色毛癣菌组织工程皮肤PAS染色，20X；
图7为本发明实施例的电镜下组织工程皮肤中红色毛癣菌电镜图，其中，A、B、C为放大倍率1700X；D、E、F为放大倍率5000X；G、H、I为放大倍率11500X。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1本发明实施例红色毛癣菌感染模型的制备方法
如图1所示，本发明实施中，红色毛癣菌感染模型的制备方法包括以下步骤：
1、人角质形成细胞的获得和体外培养
取健康包皮组织，在无菌操作台中首先将皮肤组织用碘伏浸泡消毒1-3min，然后用75％酒精中脱碘消毒2min，最后用含1％青-链双抗的PBS冲洗3次；
用剪刀及手术刀片尽量去除包皮组织的皮下脂肪层及结缔组织，并将皮肤切成2cm2大小，置于10mg/ml的DispaseⅡ中4℃消化过夜；
次日用镊子将消化后的皮肤进行分离真皮层与表皮层，分离后的真皮层保留用于后续成纤维细胞分离，将表皮层置于0.25％胰酶-EDTA 37℃消化15-30min，在皮肤消化期间颠倒振荡数次；
用完全DMEM培养基终止消化，于振荡器上振荡6次，去除离心管内的表皮组织，1500rmp离心5min，取沉淀，用K-SFM培养基(Gibco，10725018)重悬细胞后计数，将获得的细胞按照35000-40000个/cm2的密度接种于预先用IV型胶原包被的10cm培养皿中，置于37℃5％CO2培养箱培养；
次日更换新鲜的K-SFM培养基，待细胞长至70-80％融合时，需要进行细胞传代：首先弃去旧培养基，用无Ca、Mg的PBS清洗2遍，后用0.02％EDTA浸泡5min，吸出后加入0.25％胰酶-EDTA，37℃消化3-5min，完全DMEM培养基终止消化后离心重悬，制备单细胞悬液或按35000-40000个/cm2的密度接种，获得P3代人角质形成细胞。
2、组织工程皮肤模型的制备
在15ml离心管中预先加入100μl 1mol/L NaOH，在另一个离心管中加入7ml鼠尾胶原、2ml 10×DMEM和1ml FBS胎牛血清于冰上混匀，混匀后加入装有NaOH的离心管，并迅速混匀，得到混合物；以0.5ml/孔将上述混合物加入12mm Transwell小室内，放入37℃，5％CO2的培养箱中培养，待其凝固后，向Transwell小室内加入含10％FBS的DMEM培养基继续培养2-3天，获得胶原支架；
向胶原支架的表面上滴加1×106个第一步制备的P3代人角质形成细胞，并加入角质形成细胞培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养2-3天，待细胞融合后气液培养7天，获得组织工程皮肤模型。
实施例2利用本发明实施例组织工程皮肤模型建立红色毛癣菌感染模型
1、红色毛癣菌组织工程皮肤感染模型构建
红色毛癣菌标准菌株ATCCMYA4438，购买于美国模式培养物集存库(Americantype culture collection)，由中国医学科学院病原微生物菌(毒)种保藏中心皮研所(医学真菌保藏)分中心保藏，在SDA培养基上28℃培养15天。接种前，加入适量无菌生理盐水至菌体表面，用一次性涂布棒在菌体表面轻轻刮取，避免用力挂到琼脂，吸取菌液，过滤除去菌丝，计数，调整浓度至2×105/ml待用。
取50μl含1×104红色毛癣菌悬液滴加于实施例1制备的组织工程皮肤模型的表面，向Transwell室内加入含10％FBS的DMEM培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养7天，获得红色毛癣菌组织工程皮肤感染模型。另一组中，取50μl不含红色毛癣菌的悬液滴加于实施例1制备的组织工程皮肤模型的表面，作平行对照组。
2、对红色毛癣菌组织工程皮肤感染模型形态学评估
利用苏木精－伊红(HE)染色，步骤如下：二甲苯(Ⅰ)15min；二甲苯(Ⅱ)15min；二甲苯:无水乙醇＝1:1 2min；100％乙醇(Ⅰ)(5min；100％乙醇(Ⅱ)5min；80％乙醇5min；蒸馏水5min；苏木精液染色5min；水洗10min或流水冲洗5min；1％盐酸乙醇30s；水洗30s；蒸馏水过洗5s；0.5％伊红液染色1-3min；蒸馏水稍洗30s；80％乙醇稍洗30s；95％乙醇(Ⅰ)1min；95％乙醇1min；无水乙醇(Ⅰ)3min；无水乙醇(Ⅱ)3min；二甲苯(Ⅰ)3min；二甲苯(Ⅱ)3min；中性树胶封固。观察组织工程皮肤。取组织工程皮肤组织，用10％福尔马林溶液固定，之后石蜡包埋切片，HE染色后观察分析。
利用过碘酸雪夫染色(PAS)染色，步骤如下：石蜡切片脱蜡至水；蒸馏水洗；过碘酸酒清夜10min；自来水冲洗10min；Schiff氏液10min；流水冲洗5min；用哈瑞苏木精或迈耶苏木精染核3min，细胞核染色过深可用盐酸酒精分化；流水冲洗5min；常规脱水、透明、封固。
3、实验结果：
如图2所示，图2为红色毛癣菌组织工程皮肤感染模型构建示意图，图2模拟了在transwell中构建红色毛癣菌组织工程皮肤感染模型的步骤，首先，在transwell700中加入胶原混合物100，transwell700外加入含10％FBS的DMEM培养基200，DMEM培养基的加入体积与胶原平面齐平。之后在胶原表面加入人角质形成细胞300，将DMEM培养基替换为人角质形成细胞培养基500，即前述KSFM培养基。待细胞融合后将KSFM培养基更换为CnT-Prime 3D培养基400。并于第三天弃掉所有的培养基，重新加入CnT-Prime 3D培养基400至transwell700最低平面，接种红色毛癣菌600，使组织工程皮肤暴露于空气中气液培养7天。
如图3所示，为本发明实施例的红色毛癣菌组织工程皮肤感染模型构建的显微镜观察图，接种至组织工程皮肤后，如图3中B和C所示，显微镜下可见组织工程皮肤上的红色毛癣菌菌丝及孢子。A为显微镜下组织工程皮肤，镜下可见构建的组织工程皮肤密度均匀；B为显微镜下接种红色毛癣菌的组织工程皮肤；C为普通光学显微镜下组织工程皮肤上的红色毛癣菌，20X；D为培养15d的红色毛癣菌，菌落生长良好，形态典型。
如图4所示，为显微镜下接种至胶原支架的原代人角质形成细胞，人角质形成细胞按照1×106/ml的密度接种于12mm孔板Transwell的胶原支架上，可在1-2d完全融合。其中，A为P3代细胞接种后0h，4X；B为P3代细胞接种后0h，10X；C为P3代细胞接种后5h，4X；D：P3代细胞接种后5h，10X。
如图5所示，为Transwell中的红色毛癣菌组织工程皮肤感染模型，A中Transwell中的组织工程皮肤为半透明状，B中培养2d后组织工程皮肤的皮片会轻微皱缩，C中接种红色毛癣菌后随着时间的延长，组织工程皮肤的皮片颜色逐渐变红，D中组织工程皮肤至第7d呈现深红褐色。A为Transwell中正在培养的组织工程皮肤；B为感染后第1d的红色毛癣菌组织工程皮肤；C为感染后第4d的红色毛癣菌组织工程皮肤；D为感染后第7d的红色毛癣菌组织工程皮肤。
如图6所示，本发明实施例的红色毛癣菌组织工程皮肤HE和PAS染色。HE和PAS染色观察构建的组织工程皮肤可见表皮层次均匀、结构清晰，人角质形成细胞分化达8～10层，感染后第4d，角质层出现大量的分生孢子和菌丝，菌丝分布呈网状分布，感染几乎延伸至整个表皮，皮肤表皮表现出巨大的破坏，可以看到菌丝的入侵水平延伸进入皮肤，说明已经实现皮肤角质感染。A为组织工程皮肤对照组HE染色，20X；B为组织工程皮肤对照组PAS染色，20X；C为感染后第4d的红色毛癣菌组织工程皮肤HE染色，20X；D为感染后第4d的红色毛癣菌组织工程皮肤PAS染色，20X。
如图7所示，本发明实施例的电镜下组织工程皮肤中红色毛癣菌的电镜图，电镜下可见红色毛癣菌细胞壁及细胞器完整可见。图7中，A、B、C为放大倍率1700X；D、E、F为放大倍率5000X；G、H、I为放大倍率11500X。
本发明实施例的红色毛癣菌组织工程皮肤感染模型，制备方法简单，易于观察的红色毛癣菌感染组织工程皮肤的过程，非常接近人皮肤感染的生态学特征，为科学研究提供了非常有价值的皮肤模型。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种红色毛癣菌感染模型的制备方法，其特征在于包括分离包皮组织的真皮层和表皮层，并将所述表皮层消化、培养，获得人角质形成细胞，最后将所述人角质形成细胞加到胶原支架上培养形成所述组织工程皮肤模型。
2.如权利要求1所述的红色毛癣菌感染模型的制备方法，其特征在于，
所述包皮组织经消毒处理后，再用含有青-链霉素双抗的缓冲液冲洗。
3.如权利要求2所述的红色毛癣菌感染模型的制备方法，其特征在于，
所述包皮组织冲洗后，去除脂肪层和结缔组织，并将其放置在DispaseⅡ中4℃消化过夜。
4.如权利要求1所述的红色毛癣菌感染模型的制备方法，其特征在于，
所述真皮层置于0.25％胰酶-EDTA中，37℃消化15-30min，并振荡数次，对所述真皮层进行消化。
5.如权利要求1所述的红色毛癣菌感染模型的制备方法，其特征在于，
所述胶原支架制备过程包括：将鼠尾胶原、10×DMEM和FBS在冰上混匀后，再与100μl1mol/L NaOH混合均匀后形成混合物；
取所述混合物加入到Transwell小室中，37℃，5％CO2的条件下培养，凝固后，加入10％FBS的DMEM培养基继续培养2-3天，得到所述胶原支架。
6.如权利要求1所述的红色毛癣菌感染模型的制备方法，其特征在于，
所述胶原支架的表面上加入1×106个P3代所述人角质形成细胞，37℃，5％CO2的条件下，培养2-3天，获得所述红色毛癣菌感染模型。
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