CN106999635A

CN106999635A - 软骨修复用移植物支架及其制造方法

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Publication number: CN106999635A
Application number: CN201580064029.9A
Authority: CN
Inventors: M·凯斯蒂; M·泽诺比-黄; M·穆勒
Original assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Current assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2015-12-11
Publication date: 2017-08-01
Anticipated expiration: 2035-12-11
Also published as: EP3230044B1; ES2809457T3; HUE050420T2; CA2967162C; US20170348458A1; JP2018501845A; DK3689609T3; RS60700B1; WO2016092106A1; US10532126B2; CA2967162A1; US20230321320A1; SI3230044T1; CN106999635B; IL252771A0; JP6762936B2; AU2015359286A1; DK3230044T3; US11633518B2; PT3230044T

Abstract

本发明涉及一种提供软骨修复用移植物支架的方法，特别是在人类患者中提供软骨修复用移植物支架的方法。本发明的方法包括以下步骤：提供颗粒和/或纤维；提供胶凝化多糖的水溶液；提供哺乳动物细胞；混合所述颗粒和/或纤维、所述胶凝化多糖水溶液和所述哺乳动物细胞以获得打印混合物；并以三维形式沉积所述打印混合物。本发明还涉及通过本发明的方法获得的移植物支架和移植物。

Description

软骨修复用移植物支架及其制造方法

技术领域

本发明涉及一种三维移植物、特别是用于修复颅面容貌和损伤关节的三维移植物，以及使用计算机辅助建模和具有生物相容性墨水的三维生物打印制造患者特异性移植物的方法。

背景技术

鼻子和外耳以患者特异性方式重建是整形外科手术中最大的挑战之一，因为内部软骨结构的复杂三维性质，以及机械性能和覆盖皮肤的区域性变化。耳廓重建适用于先天性畸形、小耳症、黑素瘤相关组织牺牲和损伤，包括事故和严重烧伤。头颈部烧伤中约90％涉及耳朵。美国和欧盟最常用的全耳廓重建标准治疗方法是基于从第六、第七和第八肋骨获得的自体肋软骨的两到三阶段手术技术，其通过有限量的获得的组织尽可能地被雕刻成耳朵。通常在10岁时可以获得足够数量的肋软骨，延迟了重建手术。用于耳朵重建手术的另一种重建方法是使用有机硅植入物来避免对肋骨软骨采集的需要。然而，将无细胞支架放置在薄层皮肤下，使患者面临长期并发症的高风险。此外，不可能为每个患者提供定制的尺寸和形状，并且重建的耳朵不会像对侧耳朵那样生长而导致不对称。可行的重建策略涉及几项手术，其结果高度依赖于重建外科医生的专业知识。捐助方发病率，由于缺乏肋软骨支持引起的腹壁塌陷和与软骨获取有关的严重疼痛是常见的并发症。

另外，由于运动损伤、创伤和退行性疾病如骨关节炎，对修复骨软骨损伤有很大的临床需求。目前的治疗方法涉及骨软骨移植物的移植，所述骨移植物是自体的或获自骨库的。这种治疗具有几个缺点，包括供体位点发病率、供体组织稀缺、手术难度以及移植物由多个片段组成的事实，每个片段可能会松动或在高度上错位。

鉴于现有技术这样的状态，本发明的目的是提供用于提供患者特异性移植物的方法和装置，其改善了上述现有技术现状的缺陷。该目的通过本说明书的权利要求的主题来实现。

发明内容

根据本发明的第一方面，一种提供移植物支架、特别是用于人类患者的移植物支架的方法，所述方法包括以下步骤：

-提供颗粒和/或纤维

-提供胶凝化多糖水溶液；

-提供哺乳动物细胞；

-混合所述颗粒和/或纤维、所述胶凝化多糖水溶液和所述哺乳动物细胞以获得打印混合物；

-以三维形式沉积所述打印混合物。

根据本发明的另一方面，提供移植物的方法包括以下步骤：

-通过根据本发明第一方面或其任何具体实施方式的方法提供移植物支架，和

-在细胞培养步骤中将所述无细胞支架沉没到包含哺乳动物细胞，特别是软骨细胞、干细胞或软骨前体细胞的细胞培养基中。

根据本发明的另一方面，提供了通过本发明的任何前述方面或其任何具体实施方式获得或可获得的移植物，特别用于颅面或关节修复的方法。

根据本发明的另一方面，颅面或关节修复的方法包括针对用软骨特异性打印混合物进行三维增材制造而改进的用于患者特异性移植物的计算机模型，所述软骨特异性打印混合物包含至少一种细胞相容性聚合物、至少一种切碎的组织或其他增材颗粒和细胞，交联是通过嵌入共挤出材料中或生物墨水中的反应性基团和分子的自发或外在引发反应内在提供，这些类型中的至少一种存在于聚合物、切碎的组织和细胞中至少一种上以重建功能性和天然软骨样组织移植物。

根据本发明的一个方面，通过增材制造方法提供了一种用于更好地适合于制造的组织移植物的机械负载而创建移植物的内部聚合物梯度、孔隙率和支持区域的方法。

根据本发明的一个方面，提供了一种制造牺牲性外部支持结构以帮助打印移植物的凸悬特征的方法，其中牺牲聚合物与打印混合物共沉积并用作交联引发剂的储存器以聚合打印混合物，并在聚合后除去。

具体实施方式

本发明的第一方面涉及特别是在人类患者中提供移植物支架的方法，包括以下步骤：

-提供胶凝化多糖水溶液；

-至少提供以下之一：

o颗粒和/或纤维

o哺乳动物细胞；

-以三维形式沉积所述打印混合物。

在某些实施方式中，所述打印混合物包含胶凝化多糖水溶液和颗粒。在某些实施方式中，所述打印混合物包含胶凝化多糖水溶液和纤维。

纤维和/或颗粒，特别是当从软骨组织获取时，可以包括有助于支持移植物内细胞生长的因子。

在某些实施方式中，所述打印混合物包含胶凝化多糖水溶液以及颗粒和纤维。

在某些实施方式中，所述打印混合物包含胶凝化多糖水溶液和细胞。在某些实施方式中，所述打印混合物包含胶凝化多糖水溶液和细胞和一种或几种生长因子。发明人惊奇地发现，即使在没有软骨颗粒或纤维的情况下，提供胶凝化材料和细胞可足以维持细胞活力和增殖，特别是在存在生长因子的情况下。

在某些实施方式中，打印混合物包含胶凝化多糖水溶液以及颗粒和细胞。在某些实施方式中，所述打印混合物包含胶凝化多糖水溶液以及颗粒、纤维和细胞。

在某些实施方式中，所述颗粒由组织颗粒组成或包括组织颗粒。在某些实施方式中，所述颗粒由软骨颗粒组成或包含软骨颗粒。在某些实施方式中，所述颗粒由以冻干软骨组织构成的颗粒组成或包含以冻干软骨组织构成的颗粒。在某些实施方式中，所述颗粒由人软组织组成或包含人软组织。在某些优选实施方式中，所述颗粒由自体软骨组织组成或包含自体软骨组织。在某些优选实施方式中，所述颗粒可以是临床微粉化基质产品，包括BioCartilage、Amniofix、Alloderm-Cymetra、Cook Biotech Small Intestial Muscosa(SIS))颗粒。在某些优选实施方式中，所述颗粒可以是羟基磷灰石或磷酸钙。

在某些实施方式中，所述颗粒和/或纤维由合成聚合物制成，特别是选自聚乙二醇、聚丙二醇、形成凝胶的泊洛沙姆F108、F127、F68、F88、聚噁唑啉、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚甲基乙烯基醚-co-马来酸酐、聚丙交酯、聚-N-异丙基丙烯酰胺、聚乙醇酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸和聚烯丙胺或这些的共聚物或这些的嵌段共聚物的聚合物，或由以上衍生的聚合物。

在某些实施方式中，所述颗粒和/或纤维包含或主要由或全部由切碎的组织构成。在某些实施方式中，所述切碎的组织衍生自选自耳软骨、鼻软骨、髓核、半月板、气管、鼻软骨、肋软骨、关节软骨、滑液、玻璃体液、脑、脊髓、肌肉、结缔组织、小肠粘膜下层和肝的组织。在某些实施方式中，切碎的组织在5μm-50μm，50-200μm和200-1000μm的范围内或其组合的范围内。

在某些实施方式中，所述胶凝化多糖是结冷胶、酰化和/或硫酸化结冷胶。在某些实施方式中，所述胶凝化多糖选自瓜尔胶、肉桂胶、魔芋胶、阿拉伯胶、加沙胶、刺槐豆胶、黄原胶、硫酸黄原胶、角叉胶、硫酸角叉胶，或任何上述胶凝化多糖的混合物。

在某些实施方式中，所述胶凝化多糖溶液除了胶凝化多糖之外还包含作为添加剂的细胞相容性聚合物，特别是选自藻酸盐、藻酸盐硫酸酯、硫酸结冷胶、角叉胶、硫酸角叉胶、瓜尔胶、桂皮胶、魔芋胶、阿拉伯胶、加沙胶、刺槐豆胶、黄原胶、硫酸黄原胶、肝素、纤维蛋白、硫酸肝素、弹力蛋白、弹力蛋白原、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸、透明质酸硫酸酯、纤维素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、聚-l-赖氨酸、壳聚糖、丝和胶原的细胞相容性聚合物。

在某些实施方式中，所述添加剂与结冷胶、酰化和/或硫酸化结冷胶相结合。

结冷胶是由细菌Pseudomonas elodea生产的水溶性多糖。聚合物的重复单元是四糖，其由D葡萄糖的两个残基和L-鼠李糖和D-葡萄糖醛酸的每个残基之一组成。重复具有以下结构：[D-Glc(β1→47D-GlcA(β1→4)Djhbn-Glc(β877→u8ir)L-Rha(α1→3)]_n。

“酰化结冷胶”是本领域已知的术语，并且是指在葡萄糖单元的一些或全部5'氧位置含有乙酰基和在一些或全部2'氧位置含有甘油酸的结冷胶。见图8：酰化结冷胶(A)是细菌发酵后的原始产物结冷胶，当纯化时，酰基和甘氨酰侧链可被切割(B)。这增强了凝胶化，可以实现不同的刚度。本发明的某些实施方式将酰化和纯化的结冷胶结合在一起以实现结构的更好的灵活性。

在某些实施方式中，所述胶凝化多糖的溶液包括结冷胶或乙酰化结冷胶，或酰化结冷胶的硫酸化产物作为胶凝化多糖，以及藻酸盐、硫酸藻酸盐、硫酸结冷胶、角叉胶和/或硫酸角叉胶作为细胞相容性聚合物添加剂。

在某些实施方式中，将含有一价、二价和/或三价阳离子的盐的水溶液加入到所述胶凝化多糖中以实现凝胶化。

在某些实施方式中，所述水溶液包含10-150mmol/l的二价离子。在某些实施方式中，所述水溶液包含锶离子(Sr²⁺)。在某些实施方式中，所述水溶液包含钡离子(Ba²⁺)。在某些实施方式中，所述水溶液包含钙离子(Ca²⁺)。

在某些实施方式中，所述水溶液包含总共10-150mmol/l的二价离子。在某些实施方式中，所述水溶液包含10-150mmol/l的锶离子(Sr²⁺)，特别是15-50mmol/l的Sr²⁺。在某些实施方式中，所述水溶液包含10-150mmol/l的钡离子(Ba²⁺)，特别是15-50mmol/l的Ba²⁺。在某些实施方式中，所述水溶液包含10-150mmol/l的钙离子(Ca²⁺)，特别是15-100mmol/l的Ca²⁺。

在某些实施方式中，所述水溶液包含总计10-150mmol/l的Sr²⁺和Ba²⁺，特别是15-50mmol/l的Sr²⁺和Ba²⁺。在某些实施方式中，所述水溶液包含总计10-150mmol/l的Ca²⁺和Ba² ⁺，特别是15-50mmol/l的Ca²⁺和Ba²⁺。在某些实施方式中，所述水溶液包含总计10-150mmol/l的Sr²⁺和Ca²⁺，特别是15-50mmol/l的Sr²⁺和Ca²⁺。

在某些实施方式中，所述胶凝化多糖溶液包含生理渗透压浓度的单糖或二糖，特别是葡萄糖、甘露糖或阿拉伯糖。这种添加对于保护嵌入在打印混合物中的细胞的生存性是重要的。

在某些实施方式中，所述颗粒和/或纤维由以下组成，或包括以下：

-生物相容性或细胞相容性聚合物，和/或

-生物可再吸收性的聚合物，特别是选自PLA(聚乳酸或聚丙交酯)、DL-PLA(聚(DL-丙交酯))、L-PLA(聚(L-丙交酯))、聚乙二醇(PEG)、PGA(聚乙交酯)、PCL(聚ε-己内酯)、PLCL(聚丙交酯-co-ε-己内酯)、二氢硫辛酸(DHLA)、藻酸盐和壳聚糖的聚合物，和/或

-合成聚合物，特别是选自聚乙二醇、聚丙二醇、泊洛沙姆、聚噁唑啉、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚甲基乙烯基醚-co-马来酸酐、聚丙交酯、聚-N-异丙基丙烯酰胺、聚乙醇酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸和聚烯丙胺的聚合物或者由其衍生的聚合物；或

-天然纤维，特别是选自弹力蛋白、弹性蛋白、丝及其衍生物；

-生物相容性导电材料，特别是过渡金属钽和导电聚合物聚吡咯(PPy)。

在某些实施方式中，颗粒由上述生物聚合物在油乳液中或沉淀形成。在某些具体实施方式中，这样的生物聚合物是藻酸盐。

在某些实施方式中，所述组织颗粒源自选自耳软骨、鼻软骨、髓核、半月板、气管、鼻软骨、肋软骨、关节软骨、滑液、玻璃体液、脑、脊髓、肌肉、结缔组织、小肠粘膜下层和肝脏的组织。

在某些实施方式中，所述细胞相容性聚合物是天然聚合物。

在某些实施方式中，细胞相容性聚合物是不同酰化度的结冷胶，特别是酰化在100％至10％酰化之间，以100％为高，并且任选地包含选自藻酸盐、硫酸藻酸盐、肝素、纤维蛋白、硫酸肝素、弹性蛋白、弹性蛋白原、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸、透明质酸硫酸酯、纤维素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、聚-l-赖氨酸、壳多糖、不同类型的丝和胶原，以及它们的硫酸化形式的添加剂。在某些实施方式中，≥90％、≥95％或≥98％的所述颗粒在5μm-1000μm，特别是5μm-50μm、5μm-200μm、50μm-200μm或200μm-1000μm的范围内。

在某些实施方式中，所述纤维的长度尺寸为5μm-50μm和50-500μm，纵横比为2-1000，特别是10-500，更特别是100-500、100-1000、200-1000或500-1000的范围内。在某些实施方式中，丝纤维的直径为1μm以下，长度为以上。在本说明书的上下文中，出于术语使用的目的，纵横比定义为纤维长度与直径的比率。

在某些实施方式中，所述哺乳动物细胞是软骨细胞、软骨前体细胞或能够分化成软骨前体细胞或软骨细胞的干细胞。

在某些实施方式中，所述哺乳动物细胞选自原代自体软骨细胞、原代同种异体软骨细胞、软骨祖细胞、成软骨细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞和脂肪来源的干细胞。

在某些实施方式中，所述打印混合物包括：

-1-6％(w/v)，特别是约3％(w/v)的所述胶凝化多糖；

-0.5-10％(w/v)，特别是约4％(w/v)的所述颗粒，

-任选地，0.5-8％(w/v)，特别是约2％(w/v)的所述添加剂。

在某些实施方式中，所述打印混合物包括：

-约3％(w/v)的结冷胶；

-约4％(w/v)的软骨组织颗粒，

-约2％(w/v)的藻酸盐，10ng/ml TGBF3和

-10⁶-10⁷个软骨细胞/ml。

在某些实施方式中，所述打印混合物与牺牲聚合物一起沉积。这允许产生凸悬结构，例如在形成鼻和耳的某些特征时特别重要。

在某些实施方式中，将所述打印混合物沉积在牺牲聚合物支架上。

在某些实施方式中，所述牺牲聚合物支架与打印混合物共沉积。

在某些实施方式中，所述牺牲聚合物混合物和/或支架包含二价阳离子或其它凝胶/聚合剂。

通过将牺牲聚合物混合物扩散到打印混合物中，这些阳离子或其它凝胶/聚合剂允许快速形成支架的三维结构。

在某些实施方式中，特别是基于所述患者的对侧器官的三维计算机模型，通过3D打印方法得到三维形式和/或所述牺牲性聚合物支架。

在某些实施方式中，通过计算机断层摄影、磁共振成像、激光扫描或利用三维相机获得三维模型。

在某些实施方式中，创建了计算机模型以支持梯度负载，并创建内部结构以获得更好的细胞存活和孔隙度。

在某些实施方式中，所述聚合物支架通过增材制造方法得到。

在某些实施方式中，所述增材制造方法是喷墨打印、生物打印、挤出打印或逐层方法。

在某些实施方式中，所述聚合物支架的特征在于内部聚合物梯度、孔隙度和支持区域。

在某些实施方式中，添加另外的聚合物以增加基质液体粘度，使得墨水可以一致地挤出并且由于过滤器加压现象而不被堵塞。

在某些实施方式中，在所述细胞培养步骤之前或之后除去牺牲聚合物。

在某些实施方式中，所述组织颗粒和/或生物墨水包括生长因子或生物因子组合，特别是选自BMP-2、BMP-7、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3和/或FGF-2，和/或有丝分裂因子，特别是IGF-1，以促进愈合和再生。

在某些实施方式中，生长因子可以直接加载到生物墨水混合物中。在某些实施方式中，所述生长因子的浓度范围为0.1-5mg/ml，5-50ng/ml或50-500ng/ml的一种生长因子或几种生长因子的组合。在某些实施方式中，所述生长因子选自BMP-2、BMP-7、TGF-β1、2、3、IGF-1和/或FGF-2。

在某些实施方式中，打印混合物，特别是颗粒，包含另外的组分，特别是选自生长因子、抗氧化剂、细胞因子、药物和生物制剂的组分。

在某些实施方式中，牺牲聚合物包括引发交联的试剂，所述试剂是一价、二价和三价阳离子、酶、过氧化氢、辣根过氧化物酶、可辐射聚合的单体如苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂。

在某些实施方式中，交联引发基团存在于打印混合物中，特别是选自参与曝光、阳离子介导的交联和酶介导的交联的基团。

本发明的另一方面涉及一种提供移植物修复的方法，包括以下步骤：

-通过根据前述权利要求中任一项的方法提供移植物支架，和

本发明的另一方面涉及通过根据本发明的前述方法中的任一项的方法或任何特定实施方式或由特定实施方式提供的特征组合获得的、或可获得的移植物支架。

本发明提供了通过增材制造方法产生的患者特异性颅面重建移植物。软骨组织移植物消除了对获取软骨的需要，从而减少患者的不适，减少手术时间并允许更好地复制形状、尺寸和机械灵活性。此外，可以实现更快的组织再生和增加的细胞增殖以增强手术恢复。对于颅面应用，该技术可以与目前使用的皮肤增强治疗(即扩张器)或其它天然或合成皮肤移植物组合。

打印

根据本发明，通过利用增材制造方法(例如但不限于挤出打印、喷墨打印和其他逐层沉积方法)，基于来自患者的三维扫描模型来产生患者特异性耳和鼻移植物。使用临床计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)或其他三维成像工具，例如激光扫描仪、3D相机或这些的组合，以产生患者特异性植入物的计算机化模型。对于耳朵重建，图像可以被镜像以产生精确模拟对侧耳的计算模型，以便组织移植物生产。对于耳朵和鼻子重建，移植物模型库可用于为患者提供移植物的选择，特别是在不能进行正常对侧扫描的情况下。当使用特定尺寸减小工具通过皮肤层的厚度来减小软骨框架的尺寸以实现正确尺寸的最终移植物时，这些方法可以导致更好的美容和美学效果。增材制造方法可用于以高精度和无菌条件制备这些构建体。此外，根据患者的需要，为大型构建体中的细胞存活的内部支持结构和孔隙率可以以特定于患者的形状和/或刚度的方式加入。血管成形软骨可以被设计为承载血管结构以覆盖其附近的皮肤和其他组织以防止坏死。打印的软骨框架可以用作构建上覆组织的生物活性模板，释放生长因子和其他分泌分子以增强相邻细胞的活力。该释放可以特别设计，通过在混合物中具有硫酸化聚合物将生物因子结合到细胞附近并缓慢释放分子。

在某些实施方式中，3D形式可以作为计算机模型创建，以支持梯度的承载力，并创建内部结构以获得更好的细胞存活和孔隙度。

材料

生物墨水材料包含至少一种细胞相容性聚合物和至少一种颗粒和细胞，交联通过反应性基团和分子的自发或外部触发反应提供，这些类型中的至少一种存在于聚合物、切碎的组织和细胞的至少一种中。用于该方法的细胞相容性聚合物(以下称为“聚合物”)可以是具有必要的细胞相容性的任何合适的聚合物，即它们的存在对细胞无害。它们可以是天然的(生物聚合物)或合成材料，或它们的组合。使之能交联的必需反应基团可以已经存在于聚合物上，或者可以将聚合物改性成包括这些基团。天然聚合物的典型非限制性实例包括藻酸盐、硫酸藻酸盐、肝素、纤维蛋白、硫酸肝素、弹力蛋白、弹力蛋白原、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸、硫酸透明质酸、纤维素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、聚-l-赖氨酸、壳聚糖、明胶、不同酰化度的结冷胶、硫酸结冷胶、瓜尔胶、肉桂胶、魔芋胶、阿拉伯胶、加沙胶、刺槐豆胶、黄原胶、硫酸黄原胶、角叉胶、硫酸角叉胶，各种类型的丝和胶原蛋白。包括这些聚合物的所有硫酸化形式。

合成聚合物的典型非限制性实例包括但不限于以下聚合物或衍生自以下的聚合物：聚乙二醇、聚丙二醇、泊洛沙姆、聚噁唑啉、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚甲基乙烯基醚-co-马来酸酐、聚丙交酯、聚N-异丙基丙烯酰胺、聚乙醇酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸和聚烯丙胺。

在聚合物、颗粒和细胞中的至少一种中存在的“至少一个”基团是指所添加的反应性基团可以存在于所有这些实体上或者存在于这些实体中的任何一个上。

掺入到聚合物溶液中的颗粒可以包括但不限于尺寸范围在5-500微米之间的纤维、细胞外基质组织颗粒、和负载或未负载的珠粒。

交联

基于材料组合、颗粒和细胞的水凝胶的形成可以由许多因子或试剂引发，包括但不限于一、二、三价阳离子、酶和自由基引发剂。此外，可以采用物理和物理-化学方法，例如在制造过程中在低pH或高pH溶液和不同温度区域进行处理。

在某些实施方式中，所述打印混合物和所述聚合物支架中的任一种包含共价连接到其上的反应性基团，特别是通过自发或外部触发反应的交联促进所述打印混合物或其组分与所述颗粒连接的反应性基团，其中反应性基团存在于聚合物、切碎的组织和细胞中的至少一种上，以重建功能性和天然软骨样组织移植物。

颗粒

所使用的切碎的组织的尺寸可以是任何合适的尺寸，但是在特定的实施方式中，其为5微米-500微米，使得其可以挤出而不堵塞诸如针或阀等分配单元。用于该方法的切碎的组织可以是任何合适的组织，但是有利的是性质与软骨相似或相同的组织。合适组织的示例性和非限制性实例包括关节软骨、髓核、半月板、气管、鼻软骨、肋软骨、耳软骨、滑液、气管软骨、玻璃体液、脑、肝、脊髓、肌肉、结缔组织和皮下脂肪、髌骨内脂肪垫，小肠粘膜下层。具体的实例是弹性蛋白和糖胺聚糖含量高的组织，具体的例子是任何类型的软骨、髓核和半月板。可以通过任何合适的方法来切碎组织，示例性和非限制性方法包括均化、冻磨、干磨、切割、切碎、粉碎和切片。组织可能进行去细胞化以去除可引起急性炎症反应的表位和包括HIV在内的病原体。最近，去细胞化的组织，即细胞被杀死且其残留物被去除的组织作为支架材料的方式更简单的替代方案已经引起了人们的兴趣，其中支架由单一材料组成(Hoshiba等人“"Decellularized matrices for tissue engineering".Expert Opinionon Biological Therapy.2010；10:1717-28)。组织去细胞化使得细胞外基质的支架理想地适合于再生受伤或患病组织，因为它保留了用于重现功能所需的高分辨率结构和生物学指示。去细胞化可以例如通过使用洗涤剂、过氧化氢、氢氧化钠和酶，RNA酶和DNA酶来完成。颗粒可以通过诸如以下的非限制性方法制造：通过亲水/疏水相互作用的胶体形成、两相乳液和油界面中。纤维可以通过诸如但不限于静电纺丝、纤维挤出和纤维拉伸的方法来制造。可以通过任何合适的方法来切碎任何种类的颗粒和纤维，示例性和非限制性的方法包括均化、冷磨、干法研磨、切割、切碎、破碎和切片。这些附加组织片、颗粒和纤维可以用与载体聚合物或这些材料的组合相结合的官能团进一步改性、或被处理以暴露反应性基团，以便进行交联。此外，生长因子、抗氧化剂和药物分子可以加载到所加入的聚合物、组织片、颗粒和纤维之中或之上。

细胞

在本说明书中，术语“细胞”的使用不仅包括单个细胞，特别是哺乳动物细胞，更特别地是人类细胞，特别是自体人细胞，还包括形成球状体、团状和微组织的所述细胞的聚集体，这些是本领域熟知和常用的。用于该方法的细胞有利地是与存在于软骨组织上的细胞类似的细胞。合适的细胞类型的典型非限制性实例包括原代自体软骨细胞、原代同种异体软骨细胞、软骨祖细胞、成软骨细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞和脂肪来源的干细胞、神经嵴来源的干细胞。

打印混合材料

在本说明书的上下文中，术语“打印组合物”是指挤出物料，其包含关键构成组分：

-颗粒，由天然(任选地：干燥的)组织或纤维制成、或由生物相容性、任选生物可再吸收性聚合物制成、或由聚合物和天然组织/纤维共同制成，

-胶凝化多糖水溶液，特别是结冷胶或其衍生物的水溶液，和

-哺乳动物细胞。

根据材料的性质和最终用途，打印混合材料的组成可以在宽范围内变化。聚合物通常以0.5-20％的重量比例存在。当存在切碎的组织、颗粒或纤维时，它们通常以干燥聚合物的10-40％的重量比例或以总重量的1-20％的比例存在。当存在细胞时，它们通常以3×10⁶细胞/ml-50×10⁶细胞/ml的浓度使用。

除了上述主要组分之外，可交联材料可以包括其它材料，以赋予材料特定性质。一个特别的例子是弹力蛋白，其在耳廓和鼻腔ECM中含量丰富，以提供组织的弹性，其他实例包括加入聚合物溶液中的生长因子、细胞因子、药物、生物制品、siRNA、DNA、抗氧化剂如多酚，其可以增加组织再生。添加的生长因子可能与硫酸化聚合物或未改性聚合物结合，以增强在位于打印混合物中的细胞附近的递送和有效性。

即用形式的打印混合材料是易于热凝胶化的状态，其可以容易地应用于在制造过程中获得期望的形状。分子的粉末和冻干的切碎的组织、颗粒和纤维可以分开储存和灭菌。所有组分可以在包装之前组合或使用之前再水化，从而长时间保存生长因子和蛋白质。

形状

针对每个患者定制患者特异性组织移植物，或者可以为不希望或不可能进行患者成像的情况创建某些模型目录。从外耳廓和鼻部扫描获得的三维模型可以被修改为包含内部支持结构、用于多功能机械性质的聚合物梯度和用于在大结构中增强细胞存活的孔隙度。此外，区域可以根据刚度、生长因子混合物和浓度进行调整，例如以诱导细胞增殖的区域变化。例如，软骨移植物的周边可以更多孔或更柔软，允许更多的营养物质流入深层结构。此外，在这些构建体中也发现了区域特异性和组织类型，例如，在耳朵的耳垂中，脂肪是主要组织，并且负责机械性质。区域属性和指定的结构可以容易地以逐层方式构建。在这种分层方法中，交联机制不仅在单个层内发生，而且在相邻层之间也将发生，从而形成完全一体化的连续结构。这可以通过在与包含反应性分子储存器的载体结构接触的构建体的外围引发交联来实现。

支持

支持结构可以与打印混合材料共沉积以支持凸悬结构、引发交联或防止材料在沉积期间的干燥。支持材料可以含有交联因子，包括但不限于一、二、三价阳离子、酶和自由基引发剂。另外，可以采用物理和物理-化学方法通过支持材料相互作用来改变pH和分子浓度。构建体制造后可以洗脱支持结构。洗脱可通过但不限于温度变化、pH变化或降解分子进行。

结果是快速、有效和持久的软骨修复。直到已经实现足够的细胞ECM产生以产生天然软骨样结构，寿命是在移植物中保持机械性能的重要因素。

可以采用本公开方法的应用的典型示例包括：

-颅面缺损重建

-填充和重建部分组织损失并将其与天然组织整合；

-用患者特异性移植物重建气管(气道)、半月板或肋软骨；

-填充软骨缺损

本发明的方法的特征在于具有以下优点：

-能够产生患者特异性组织移植物用于颅面和矫形应用，例如但不限于：耳、鼻、关节软骨。

-能够调整弯曲性能以使支架与生理参数和天然组织的特定区域相匹配。

-能够包括具有更紧密聚合物和增强结构的功能性负载承载区域，以调节移植物的机械性能。

-由于消除了对获取软骨的需求，提供更好的患者满意度和降低的疼痛水平。

-利用已经含有生理学准确比例的组织特异性细胞外基质组分的复杂阵列的自体、同种异体或异种天然组织。这些颗粒主要负责刺激软骨细胞的增殖诱因。

-来自任何可能的ECM颗粒的组织片段可以掺入到水凝胶共混物中用于增材制造目的，以产生任何期望的几何形状，而不损害其生物化学组成，从而增加器官生物打印的前景。

-能够将治疗因子加入到支架中，所述治疗因子包括但不限于：药物化合物、生长因子、肽、蛋白质、糖和基因治疗载体。另外，可以包括引诱宿主细胞迁移到支架中的归巢分子。

-通过使用增材制造技术分层各种组织/组合来实现组织结构的区域组织的可能性。

将参考下面的附图和描绘了具体实施方式的非限制性示例，进一步描述本公开。

图1A)是基于患者CT模型创建的三维模型，并且在为了更好地承载而向移植物添加内部支持结构之后，B)完整组织工程化耳构造的照片，以及C)可以稳定耳朵结构以获得更自然的弯曲特性的内部支持的照片。图像B和C均采用三维生物打印制作，由切碎的软骨颗粒、结冷胶和藻酸盐组成。

图2示出了具有两种组成的生物墨水的流变学交联动力学和最终刚度。

图3示出了使用20mM氯化锶溶液的机械性能的时间依赖性，其中在拉伸下测量在每个时间点破坏时样品(n＝6)平均极限应力。此外，与阳离子源无关，阳离子(黑色＝氯化钙，灰色＝氯化锶)的浓度具有相似的交联作用。可以得出结论，机械性能高度依赖于阳离子浓度和交联时间。

图4是表示在打印工序中嵌入打印混合材料中的软骨细胞的代谢活性的图。代谢活性测定(Promega MTS单一溶液测定使用读板器(Synergy H1，Biotek)分析在几个时间点进行，阳性对照为藻酸盐1％(浅灰色)，打印混合材料对应于没有组织颗粒的打印混合材料(灰色)和打印混合材料+由直径<100μm的软骨细胞外基质颗粒组成的ECM(深灰色)。所有条件一式三份进行分析。

图5示出了共沉积的支持结构，其提供初始交联分子，例如来自任何来源的阳离子、酶、蛋白质或引发交联级联A)的其他激活分子，以及在洗脱支持体后具有凸悬特征的最终构建体B)。

图6是由颗粒、结冷胶和藻酸盐组成的完整天然尺寸组织工程鼻构造的照片。构建体在不到17分钟内利用三维生物打印制作。线之间的间距为1mm。

图7是显示在剪切之前(左)、在两个方向角对角单轴剪切之后(中间)和垂直单轴剪切之后，在3％结冷胶中10％PMMA纤维取向的明视场显微镜图像。比例棒为50微米。

图8示出了高度酰化结冷胶(A)和非酰化结冷胶(B)的结冷胶组成。

图9从左向右示出了将患者特异性三维模型在打印过程中转换成组织工程化鼻移植物。线之间的间距为1mm。

图10显示了A)藻酸盐和B)结冷胶的聚合物主链中几种程度硫酸化的傅里叶变换红外光谱(FTIR)结果。在1300cm^-1的箭头标志着硫酸化峰。在聚合物中较高的硫酸化程度下，生长因子结合增加，导致分子的更好的传递。

图11显示了具有和不具有颗粒的生物墨水组合物的流变学表征的结果。旋转测量剪切变薄a)，1秒剪切(100^-1剪切速率)两个循环后振荡中的剪切恢复b)，几种阳离子条件下单独的生物墨水离子交联c)，用20mM SrCl₂交联30分钟的样品最大储能模量G'd)。误差条表示标准偏差。

图12显示了打印结构体的拉伸和溶胀特性的测量结果。在打印的哑铃状试样上进行拉伸试验，其中喷嘴路径由黑线表示，并在溶胀后显示打印结构a)。代表性应力-应变曲线，其中在试样的中心区域发生破裂b)。基于等式(2)和(3)的生物墨水组合物的溶胀行为分别评估总保水率c)和交联后的保水率d)。标尺上的最小分割为1mm，误差条表示标准偏差。

图13显示了打印构建体和细胞增殖测定的细胞存活的测量结果。用活死染色评估打印一层厚的盘后的存活a)，其中在打印3小时后观察到80％的存活，其在第4天恢复至97％。为了评估大结构中的存活，打印了一个年轻成人尺寸大小的鼻子，并通过活死染色评估的中心切片评价了存活。观察到细胞存活率为60％。比例条5mm(左)和50μm(右)。另外，用DNA定量评估铸造圆盘中的细胞数c)，其中用生物墨水+软骨颗粒和均补充TGF-β3的组合物观察到从第1天到第21天的DNA的统计学显著增加。误差条代表标准差，显著性水平为(p<0.05)。

实施例

实施例1a：患者特异性组织移植物的生物打印

进行临床计算机断层扫描成像，得到计算的三维物体(图1)。然后将患者特异性外耳模型镜像到对侧，并生成新的3D模型。与新模型一起，产生外部支持结构模型以在打印过程中支持耳朵结构，特别是凸悬区域。支持结构被设计成与战略重要位置的墨水接触以引发交联并支持凸悬特征(图5)。支持材料的共挤出显示保持水平生物墨水线不下垂，并且在洗脱支持体之后准确保持打印形状。此外，制备更致密聚合物的内部支持结构以允许在内部结构中更好的力分布(图2、3)。所有模型都在STL转换器(RegenHU)中转换成机器代码，并转移到生物打印机(BioFactory，RegenHU)中进行打印。

使用相同的技术，本发明人已经证明了几种软骨结构包括半月板、椎间盘和鼻的打印。双组分椎间盘移植物可以用两种生物墨水组合物打印以模拟髓核和纤维环。

实施例1b：用于三维打印目的的软骨颗粒的制造

通过将薄层软骨移除到含有PBS和1％青霉素-链霉素的培养皿中，从新鲜的牛关节或耳软骨中收获软骨。将收获的软骨转移到低温磨中(Retsch)，并以30Hz的强度碾磨三个周期。收集研磨的软骨并冻干，得到可以筛分成所需粒度范围的干粉。这些颗粒可以进一步负载生长因子或其他分子，以增强增殖和其他细胞应答。负载后，将颗粒冻干并冷冻保存，以在延长的保质期内最大化生物分子的可用性。

实施例1c：打印混合材料制备和打印过程

通过将3.5％浓度的结冷胶与3％的藻酸盐组合制备打印混合材料(“Bio-Ink”)。将结冷胶针对超纯水进行透析，以尽量减少材料中的阳离子残留。在70-80℃超纯水中透析3天，每天将水更换一至两次。进一步冻干结冷胶得到干燥粉末。将纯化的结冷胶溶解在含葡萄糖的去离子水中，使其更与细胞相容，并加入藻酸盐溶液以获得聚合物的最终浓度。将聚合物共混物与ECM颗粒和6×10⁶细胞/ml混合以获得最终的打印混合材料。与阳性对照相比，该打印混合物质显著刺激细胞增殖(图4)。对于单独的生物墨水、具有或不具有生长因子TGF-β3的生物墨水+ECM，培养8周后，通过组织学和免疫染色评估软骨细胞外基质的产生。不具有生长因子TGF-β3的生物墨水+ECM刺激细胞增殖高于单独的生物墨水，这在H&E染色中是清晰可见的。生物墨水+软骨颗粒显示Alcian蓝色染色轻微增加，观察到轻微的胶原蛋白II染色，表明需要额外的生长因子刺激。在没有生长因子的颗粒周围经常看到细胞增殖，而具有TGF-β3的生物墨水+软骨颗粒没有位点特异性增殖，这表明该颗粒是有丝分裂生长因子的来源。8周后，支架的总体外观表明，生长因子刺激对软骨基质产生具有明显的作用，如通过TGF-β3补充样品的大小和不透明外观所见。两种经补充的生物墨水组合物显示软骨ECM组分显著增加，并且具有开始类似于天然软骨的细胞密度和GAG含量的区域。此外，在生长因子补充条件下，在整个移植物中胶原II沉积强烈，而在没有TGF-β3的培养样品中仅观察到细胞周围染色。进行胶原I型和茜素红染色以确定纤维软骨产生和钙化。在生物墨水+软骨颗粒和在两种TGF-β3补充的条件下都发现胶原蛋白I，这提示了一些纤维软骨的产生，这可能是由于细胞的传代。在所有情况下，钙化不存在，表明软骨细胞的软骨表型是稳定的。

将打印混合材料打印在基材上，并将支持聚合物Pluronic F127共挤出以填充随后的层。Pluronic含有20mM的SrCI₂以在与墨水接触时引发生物墨水交联。阳离子由于渗透平衡和引发交联的静电力而扩散到打印混合材料中。结构以410μm针和800mm/分钟进给速度产生。施加到挤压注射器的压力在1.2-1.4巴之间变化。将材料逐层沉积成所需形式后，在将构建体转移到37℃的细胞培养基中之前，将牺牲支持物Pluronic在20mM SrCI₂浴中洗脱数分钟。图1示出了耳软骨内部支持结构，图6显示了由该技术产生的鼻移植物。图2示出了交联后的初始储能模量为100kPa，其与高刚性水凝胶相当。

实施例2：为其机械性能和生长因子保留而优化的生物墨水组合物

生物墨水制备：将结冷胶加入到90℃含有D-葡萄糖(300mM)的超纯水中以获得3.5％的溶液，其中85％为低酰基结冷胶，25％为高酰基结冷胶。将藻酸盐加入到混合物中以获得2.5％的溶液。将沸腾烧瓶保持在90℃，同时搅拌直到溶液均相，通常1小时。在细胞混合之前将均相溶液冷却至30℃。简言之，将牛软骨细胞(4×10⁶细胞/ml)在DMEM溶液中混合，并以1:10的体积比加入到培养基内的生物墨水中以预交联生物墨水。进行混合直到溶液达到室温并装载打印注射器。

结冷胶高酰基(GG-HA)和低酰基(GG-LA)组合物(图8)有助于最终生物墨水的刚度和弹性。通过改变酰化形式之间的比例，材料可以交联更紧密的产生更坚硬的基质，而通过破坏聚合物链在交联中的紧密填充可以产生更弹性的基质。85％GG-LA、25％GG-HA组合物中这些参数对于颅面应用是最佳的，其提供高达230kPa极限应力的可调节交联性能和在68％的平均破裂应变(图3)。为了进一步优化生物墨水中的生长因子保留，将2％浓度的硫酸结冷胶(GG-3％)(图8)加入到生物墨水中。与非硫酸化生物墨水相比，该组合物在保持负载生长因子(在这种情况下为TGF-β3和FGF-2)的生物相容性方面优异。

实施例3：可选的打印材料和具有支持材料的交联过程

在辣根过氧化物酶(HRP)和过氧化氢存在下，将基础聚合物3％凝胶与结合有3％酪胺的附加的透明质酸混合在一起，以产生可酶促交联的水凝胶。在生理渗透压、具体300mM的单糖葡萄糖存在下，将物质溶解在去离子水中。浓度为4％(w/v)的羟基磷灰石颗粒加入到聚合物混合物中。当将HRP以1单位/ml浓度与生物墨水混合或者和pluronic F12730％混合物以及0.0012％的过氧化氢混合时，在HRP和过氧化氢存在下，将该生物墨水组合物进一步生物打印。逐层构建的支架在与支持结构接触时立即交联。在冷介质中洗脱支持结构，以减少细胞存在下过氧化氢的负面影响。将结构洗涤数次以使过氧化氢残余物的量最小化。

实施例4：用于生物打印的纤维增强材料

将3％结冷胶溶解在去离子水中，并将10％(w/v)聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)纤维作为切断的电纺纤维加入结冷胶溶液中。用扫描电子显微镜对纤维进行成像，以确定纤维直径约为2微米。在剪切之前(图7左侧)和两个不同的剪切方向后2分钟(图7中间和右侧)，将纤维增强的结冷胶成像。2分钟后，单轴剪切的纤维取向大大增加。此外，单轴但不是单向剪切将短于50微米的纤维定向到剪切方向，从而允许我们在基质中形成非均相的承载结构。然而，当剪切方向改变时，长于50微米的纤维不能保持剪切取向。在挤出打印期间，剪切图案在喷嘴中是单轴的和单向的，因此将纤维定向至流动方向。在流动快速停止时，我们可以保持纤维取向单轴，这将影响结构的承载能力。这些结构是自然启发的，例如关节软骨中的胶原II纤维正在改变不同软骨层的取向。

实施例4a生物墨水交联

示例性的生物墨水是与人微粉化软骨颗粒或HA颗粒(≤40μm大小)混合的结冷胶和藻酸盐的混合物。当加入一价、二价或三价阳离子时，因为螺旋聚集成连接区，通过分子的卷曲部分连接到三维网络中，而发生凝胶化(溶胶-凝胶转变)。打印过程分为三个阶段，即生物墨水预打印、打印过程和打印后交联。最初，将生物墨水装入注射器并将支持聚合物装入第二注射器。在这个阶段，少量的阳离子存在于生物墨水中以提高粘度和增强打印性能。在打印过程中，共挤出的支持物，阳离子扩散到打印结构的周边以引发交联。最终结构完成后，支持物可以在4℃阳离子补充培养基中洗脱。

实施例4b：流变学分析

阳离子相关的粘度增强和交联性能可以通过流变学和机械测试来研究。用AntonPaar MCR 301(Anton Paar，Zofingen，Switzerland)流变仪测量生物墨水、生物墨水+HA和生物墨水+软骨颗粒的流变特性，以确定剪切行为和剪切恢复。所有生物墨水显示剪切稀化行为，这对于挤出是至关重要的(图11a)。此外，所有组合物在挤出之前具有屈服点(弱凝胶形成)，这对于防止注射器中的颗粒和细胞沉淀是重要的(表1)。

	生物墨水	生物墨水+HA	生物墨水+软骨颗粒
				屈服点	15.6Pa±0.7Pa	17.7Pa±6.5Pa	122Pa±22Pa
10s终止	21％	90％	98％
				最大G'	152kPa±3.0kPa	110kPa±2.0kPa	96kPa±1.0kPa

表1.流变学测量总结。屈服点用赫歇尔/帕克利方程计算。*第二剪切序列后10秒的剪切恢复。

剪切恢复曲线(图11b)说明了打印过程后生物墨水结构的恢复。第二剪切序列后的剪切恢复10秒钟之后在生物墨水+软骨颗粒中为98％，在生物墨水+HA中为90％。同时，生物墨水单独恢复到原始模量的21％。图11c示出了单独的生物墨水的阳离子诱导的交联之后的储能模量G'，其中阳离子浓度和来源具有明显的影响。图11d示出了三种生物墨水组合物的最终储存模量。与生物墨水+软骨颗粒(96kPa±1kPa)和生物墨水+HA(10kPa±2kPa)相比，单独的生物墨水具有最高的最终储存模量(152kPa±3kPa)，这表明交联一定程度上受到颗粒的阻碍，而不管其来源如何。

实施例4c：机械性能和溶胀行为

生物打印的软骨结构的机械性能在张力下进行评估。使用具有或不具有细胞的生物墨水+HA颗粒打印拉伸哑铃状试样。试样的规格部分中的喷嘴路径(打印方向)被选择为平行于拉伸方向(图12a)。相比细胞构建体(E＝116kPa±6.8kPa)，无细胞构建体(E＝230kPa±7.0kPa)的杨氏模量显著更高(p<0.001)，表示细胞增加了构建体的依从性和/或抑制了交联。无细胞(37％±6.4％)和细胞(34％±2.1％)(p＝0.54)构建体之间的破裂应变没有差异。

定量具有和不具有颗粒的生物墨水的溶胀，以评估总保水率和凝胶交联后的保水率(图12c-d)。在37℃下溶胀长至48小时，增加水凝胶重量至样品干重的2000-3800％之间，所述样品是典型水凝胶和26％至54％之间的水凝胶交联重量。在24小时后实现完全水合状态，更具体的是生物墨水和生物墨水+软骨颗粒在5小时后完全水合，表明较快的溶胀动力学。在48小时后，单独的生物墨水和含有颗粒的组合物的溶胀比之间的比较表明对颗粒类型的依赖性。

实施例4d：生物墨水相容性

使用生物墨水+HA研究细胞生物打印过程，以排除颗粒和细胞之间的所有相互作用和增殖诱因。打印一层厚的圆盘，以评估打印后的细胞存活(图13a)，将其与混合前的细胞的初始存活进行比较。为了研究大结构中的细胞存活，打印了一个年轻人尺寸的鼻子(3.1厘米、2.6厘米和1.5厘米)，并保持在静态培养物中，直到从中央切片(最小扩散距离为5mm)评价构建体中间的细胞存活。使用颗粒的生物打印在打印3小时后显示出80％的存活，然而，在4天后，细胞存活恢复至97％，其保持直到实验结束。年轻人尺寸的鼻子移植物在支架的中心相比周边96％的生存(图13b)生存降低(在第7天为60％的活细胞)。这表明需要引入内部孔隙或渠道以增强营养运输。通过将互连孔隙引入1.5厘米高的立方体，结构中心的存活与外围一样高。可以通过将移植物内的支持聚合物挤出而将这种营养通道或工程化孔隙加入到生物打印结构中，所述支持聚合物随后可以在后续洗涤/交联步骤中被清除。使用这种技术，可以创建一个复杂的3D互连多孔网络，用于使用营养丰富的培养基灌注移植物。为了进一步增强营养物的物质传递，移植物也可以在动态生物反应器中进行预处理。

在培养21天的铸造凝胶中评价软骨颗粒和生长因子(在这种情况下为TGF-β3)补充对细胞增殖的作用。单独的生物墨水没有刺激细胞增殖；实际上在第7天DNA损失缓慢恢复。另一方面，生物墨水+软骨颗粒刺激增殖，并在21天内引起DNA的统计学显著增加(p<0.001)。补充TGF-β3的情况下，在第7天含有软骨颗粒的样品中DNA统计学显著增加(p<0.001)。在第21天，两种生物模式显示出DNA的增加，这两者之间没有统计学意义上的显著差异。

实施例4e：细胞外基质产生和软骨形成

在培养基中3周和8周后，用组织学和免疫染色评估单独生物墨水和生物墨水+软骨颗粒中软骨细胞外基质的制造。3周后的组织学评估显示，补充有TGF-β3(10ng/ml)的两种生物墨水组合物中细胞数量、GAG合成和胶原蛋白II产生明显增加。此外，在3和8周的H&E染色中清楚可见，没有生长因子的生物墨水+软骨颗粒相比单独的生物墨水更多地刺激细胞增殖。在两个时间点，生物墨水+软骨颗粒显示Alcian蓝色染色轻微增加，并且在8周时间点观察到轻微的胶原蛋白II染色，表明需要额外的生长因子刺激。经常看到细胞在没有生长因子补充的颗粒周围增殖，这表明细胞-颗粒粘附和/或颗粒中的生长因子是重要的。然而，因为在具有TGF-β3样品的生物墨水+软骨颗粒中，没有观察到位点特异性增殖，所以结果表明相反，颗粒是有丝分裂生长因子的来源，而不是特定的细胞-基质粘合剂诱发。8周后，支架的总体外观表明，生长因子刺激对软骨基质产生具有明显的影响，因为观察到不透明的外观和尺寸的增加。在8周时，两种补充的生物墨水组合物显示软骨ECM组分显着增加，并且具有已经开始类似于天然软骨的细胞密度和GAG含量的区域。此外，在生长因子补充条件下，在整个移植物中胶原II沉积强烈，而在没有TGF-β3的培养物中仅观察到细胞周围染色。在生物墨水+软骨颗粒和TGF-β3补充条件中胶原蛋白I，表明一些纤维软骨产生，这可能是由于细胞的传代。在所有情况下，钙化不存在，表明软骨细胞的软骨表型是稳定的。

实施例4f：磁共振成像

为了评估打印结构的形状保留，评估了几种MRI技术。将打印的鼻子保存在PBS中2周，以确保在T2加权MR成像之前完全溶胀。将这些图像阈值化并转换成.STL文件，并与用于打印的原始模型和打印后的软骨移植物进行比较。原始模型和打印移植物的比较说明了精确的材料挤出和详细的结构。然而，与原始模型相比，观察到稍厚的鼻孔壁。此外，当比较两个星期溶胀后的打印结构与MRI模型时，观察到鼻孔壁略微增厚，然而，没有检测到降解或形状恶化的迹象。

实施例5：生物打印工艺参数

可再现打印过程的一个重要因素是连续线的连接性。为了评估线间距的影响，必须进行线厚度的优化。测试压力、进料速率和针头直径等打印参数，将线的厚度标准化为900μm±53μm。在确定平均线厚度之后，通过打印具有不同线间距的一系列拉伸试验哑铃来研究有效线粘附。哑铃被拉伸测试直到破损，数据表明，通过增加线间距，结构缺陷的可能性增加，表明为了向打印结构提供可重现的机械性能，线应重叠约40-50％。数据表明，破损时极限应力的变化在重叠线的数量下降到20％的测试样品中没有差异，而稳定性不足以进行测试的样品数量随线间距的增加而增加。根据数据，最佳线间距受讨论中的生物墨水的，但是通过增加重叠，内部打印过程相关缺陷的可能性减少。此外，可以通过改变工艺参数如压力、打印速度和针头直径来自由选择线条厚度。

对新设计的生物墨水进行了数次机械测试，以研究影响结构和机械性能重现性的参数。用不同打印方向和载有细胞的生物墨水打印的试样的拉伸评估揭示了通过加入4×10⁶的接种密度的细胞将不改变杨氏模量、极限应力和破损应变，说明细胞的体积分数(约1％)由结实的周围基质补偿。此外，哑铃状试样相对于张力在不同的打印方向上打印，即平行于张力(0°)、垂直于张力(90°)和与张力成45°角(45°)。打印方向在组之间没有显示任何统计学上的显著差异，表明可以基于打印和工艺相关参数而不是基于最终结构的估计机械载荷来设计生物打印结构。

Claims

1.一种提供软骨修复用移植物支架、特别是在人类患者中提供软骨修复用移植物支架的方法，所述方法包括以下步骤：

-提供胶凝化多糖水溶液；

-提供以下中的至少一种：

°颗粒和/或纤维和

°哺乳动物细胞；

-混合所述胶凝化多糖水溶液、所述颗粒和/或纤维和/或所述哺乳动物细胞以获得打印混合物；

-以三维形式沉积所述打印混合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，提供颗粒和纤维中的至少一种以及哺乳动物细胞以获得所述打印混合物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述颗粒由组织颗粒组成或者包含组织颗粒，所述组织颗粒特别是软骨颗粒，更特别是由冻干软骨组织组成的颗粒，甚至更特别是人软骨组织。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述胶凝化多糖是结冷胶、酰化和/或硫酸化结冷胶、瓜尔胶、肉桂胶、魔芋胶、阿拉伯胶、加沙胶、刺槐豆胶、黄原胶、硫酸黄原胶、角叉胶、硫酸角叉胶。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述胶凝化多糖溶液包含细胞相容性聚合物作为添加剂，特别是选自藻酸盐、硫酸藻酸盐、硫酸结冷胶、角叉胶、硫酸角叉胶、瓜尔胶、桂皮胶、魔芋胶、阿拉伯胶、加沙胶、刺槐豆胶、黄原胶、硫酸黄原胶、肝素、纤维蛋白、硫酸肝素、弹力蛋白、弹力蛋白原、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸、透明质酸硫酸酯、纤维素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、聚-l-赖氨酸、壳聚糖、丝和胶原的细胞相容性聚合物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，包含与结冷胶、酰化和/或硫酸化结冷胶结合的所述添加剂。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述胶凝化多糖溶液包含生理渗透压浓度的单糖或二糖，特别是葡萄糖、甘露糖或阿拉伯糖。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述颗粒和/或纤维由以下物质组成，或者包括以下物质：

-生物相容性或生物可再吸收性的聚合物，特别是选自PLA(聚乳酸或聚丙交酯)、DL-PLA(聚(DL-丙交酯))、L-PLA(聚(L-丙交酯))、聚乙二醇(PEG)、PGA(聚乙交酯)、PCL(聚ε-己内酯)、PLCL(聚丙交酯-co-ε-己内酯)、二氢硫辛酸(DHLA)、藻酸盐、明胶和壳聚糖的聚合物，或

-弹力蛋白、弹性蛋白、丝及其衍生物；或

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述颗粒

-是衍生自选自耳软骨、鼻软骨、髓核、半月板、气管、鼻软骨、肋软骨、关节软骨、滑液、玻璃体液、脑、脊髓、肌肉和结缔组织、小肠粘膜下层肝和骨的组织的组织颗粒，或者

-是包含羟基磷灰石和/或磷酸钙的颗粒、或完全由羟磷灰石和/或磷酸钙构成的颗粒。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，≥90％、≥95％或≥98％的所述颗粒在5μm-1000μm，特别是5μm-50μm、5μm-200μm、50μm-200μm或200μm-1000μm的范围内。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述纤维的长度尺寸为5μm-50μm和50-500μm，纵横比为2-1000，特别是10-500，更特别是100-500、100-1000、200-1000或500-1000的范围内。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在所述打印混合物中提供生长因子和/或有丝分裂因子。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述生长因子和/或有丝分裂因子选自BMP-2、BMP-7、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、FGF-2和/或IGF-1。

14.根据权利要求12或13中任一项所述的方法，其中，生长因子的浓度为0.1-5ng/ml、5-50ng/ml或50-500ng/ml。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞是软骨细胞、软骨干细胞或软骨前体细胞。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞占所述打印混合物的0.3％(v/v)至3％(v/v)；特别是0.75％(v/v)至1.5％(v/v)。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述打印混合物包括：

-1-6％(w/v)，特别是约3％(w/v)的所述胶凝化多糖；

-0.5-10％(w/v)，特别是约4％(w/v)的所述颗粒，

-任选地，0.5-8％(w/v)，特别是约2％(w/v)的所述添加剂。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述打印混合物包括：

-约3％(w/v)的结冷胶；

-约4％(w/v)的颗粒，

-约2％(w/v)的藻酸盐，和

-10⁶-10⁷个软骨细胞/ml。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述打印混合物包含约10ng/ml的TGFβ3。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，沉积三维形式的所述打印混合物通过沉积所述打印混合物的线进行，其中每条线的宽度为700至1100μm，特别是约900μm，所述线重叠20％-60％，特别是40％-50％。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述打印如下沉积

-与牺牲聚合物一起沉积和/或

-沉积到牺牲聚合物支架上。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述牺牲聚合物混合物和/或牺牲聚合物支架包含二价阳离子。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述三维形式和/或所述牺牲聚合物支架通过3D打印方法得到，特别是基于所述患者的对侧器官的计算机模型。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述三维形式和/或所述聚合物支架通过增材制造方法得到。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述三维形式和/或所述聚合物支架的特征在于内部聚合物梯度、孔隙率和支持区域。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述牺牲聚合物支架与打印混合物共沉积。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述组织颗粒包括生长因子，特别是BMP-2、BMP-7、TGF-β1、2、3和/或FGF-2，和/或有丝分裂因子，特别是IGF-1，以促进愈合和再生。

28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中，所述增材制造方法是喷墨打印、生物打印、挤出打印或逐层方法。

29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述聚合物支架包括用于引发交联的试剂，所述试剂是一价、二价和三价阳离子、酶、过氧化氢、辣根过氧化物酶、可辐射聚合单体如苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂和Irgacure 2959。

30.一种提供颅面修复用移植物的方法，所述方法包括以下步骤：

-通过前述权利要求中任一项的方法提供移植物支架，和

31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞选自原代自体软骨细胞、原代同种异体软骨细胞、软骨祖细胞、成软骨细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞、神经嵴来源干细胞和脂肪来源干细胞。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在所述细胞培养步骤之前或之后除去所述牺牲聚合物支架。

33.一种可通过或通过根据权利要求1至29中任一项所述的方法获得的移植物支架。

34.一种可通过或通过根据权利要求30或31或32所述的方法获得的移植物。

35.一种用于运行根据权利要求1至29中任一项所述的方法的系统，所述系统包括适用于如权利要求1至29中任一项所述的打印混合物的三维打印的机器，以及被编程为运行根据权利要求1至29中任一项所述的方法的计算机。