ES2959245T3 - Preparación y aplicaciones de biotintas para bioimpresión 3D para la reparación de defectos óseos, a base de hidrogeles de nanofibrillas de celulosa con partículas de fosfato de calcio natural o sintético - Google Patents
Preparación y aplicaciones de biotintas para bioimpresión 3D para la reparación de defectos óseos, a base de hidrogeles de nanofibrillas de celulosa con partículas de fosfato de calcio natural o sintético Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a la preparación de biotinta compuesta de hidrogel de nanofibrillas de celulosa con partículas que contienen calcio nativo o sintético. La concentración de partículas que contienen calcio puede estar entre 1% y 40% p/v. Dicha biotinta se puede bioimprimir en 3D con o sin células humanas o animales. Se puede usar una aguja coaxial donde se puede usar hidrogel de nanofibrillas de celulosa lleno de partículas de calcio como cubierta y se puede usar otra biotinta a base de hidrogel mezclada con células como núcleo u opuesto. Estas construcciones bioimpresas en 3D exhiben una alta porosidad debido a las propiedades adelgazantes de las nanofibrillas de celulosa, lo que proporciona una excelente fidelidad de impresión. También tienen excelentes propiedades mecánicas y se manejan fácilmente como construcciones grandes para cavidades óseas específicas del paciente que deben repararse. La porosidad promueve la vascularización, que es crucial para el suministro de oxígeno y nutrientes. La porosidad también hace posible un mayor reclutamiento de células que aceleran el proceso de curación ósea. Las partículas que contienen calcio pueden aislarse de hueso autólogo, hueso alogénico o hueso xenogénico, pero también pueden aislarse de minerales o prepararse mediante síntesis. Las partículas que contienen calcio preferiblemente consisten en β-fosfato tricálcico que es reabsorbible o polvo de hueso natural, preferiblemente de origen humano o porcino. Las partículas descritas en la presente invención tienen un tamaño de partícula inferior a 400 micras, o más preferiblemente inferior a 200 micras, para hacer posible manipularlas en la boquilla de impresión sin obstrucciones y obtener una buena resolución. Las nanofibrillas de celulosa pueden ser producidas por bacterias o aisladas de plantas. Pueden ser neutros, cargados u oxidados para ser biodegradables. La biotinta se puede complementar adicionalmente con otros biopolímeros que proporcionen reticulación. Dichos biopolímeros pueden ser alginatos, quitosanos, ácido hialurónico modificado o biopolímeros derivados de colágeno modificado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Preparación y aplicaciones de biotintas para bioimpresión 3D para la reparación de defectos óseos, a base de hidrogeles de nanofibrillas de celulosa con partículas de fosfato de calcio natural o sintético
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la bioimpresión 3D, a las biotintas para bioimpresión, a las construcciones y tejidos preparados por bioimpresión, así como a las construcciones bioimpresas para su uso en tratamientos médicos en el campo de la sustitución o defecto de tejidos.
Descripción de la técnica relacionada
Existe una necesidad médica insatisfecha de procedimientos novedosos para la reparación de defectos óseos más grandes. El hueso tiene, en contraste con el cartílago, una muy buena capacidad de cicatrización, pero los defectos más grandes no se pueden reparar sin el trasplante de injertos autólogos o de material de soporte. Un ejemplo puede ser una reconstrucción de la mandíbula debido a accidentes de tráfico o cáncer. El cáncer más común que afecta a la mandíbula es el carcinoma epidermoide. De acuerdo con Cancer Research UK, en 2012 se notificaron 61.400 casos de cáncer de la cavidad oral en Europa [1], 28.260 casos se notificaron en 2014 en los Estados Unidos de América [2], La solución actual más común es el trasplante de injerto de peroné, que conlleva una serie de otras complicaciones, tales como problemas para cubrir grandes defectos de tejidos blandos. Otras soluciones pueden ser placas de titanio o injertos óseos alogénicos. Estas soluciones también tienen muchas desventajas, tales como que las placas de titanio queden expuestas a través de la piel. Además, las soluciones actuales son dolorosas para los pacientes y también son muy caras y consumen mucho tiempo para médicos y pacientes.
El hueso, un elemento estructural del cuerpo humano, también conocido como tejido duro, se compone de una fase inorgánica, que es hidroxiapatita, fibrillas de colágeno I y proteoglucanos. Hay varios tipos de células que están implicadas en el proceso de formación de los huesos. Las más importantes son los osteoblastos que producen colágeno I que se organiza en una estructura jerárquica. Otras células, tales como los osteoclastos, participan en el proceso de remodelación ósea que implica la reabsorción de la fase inorgánica. La fase inorgánica, a menudo llamada fase mineral, no se sintetiza directamente por las células, sino que se cristaliza en el microambiente creado durante el proceso de formación del hueso, también llamado osteogénesis. Cuando se deben reparar defectos grandes, es necesaria la guía de las células y esto se puede proporcionar mediante el injerto de hueso de otro sitio o la colocación de biomaterial. Tanto los materiales poliméricos biodegradables como los materiales inorgánicos se han utilizado durante muchos años como injertos óseos sintéticos o materiales de armazón.
La hidroxiapatita tiene una estructura cristalina y existe en el tejido óseo en forma de filamentos. Como cristalito se solubiliza muy lentamente. El fosfato tricálcico (TCP, del inglésTri-calcium phosphate)es un material inorgánico que se utiliza para aplicaciones de reparación dental y ósea. Existen dos formas de TCP; a-TCP y p-TCP. El a-TCP se reabsorbe más rápido que el p-TCP. El TCP presenta propiedades que lo hacen adecuado como relleno dental o relleno óseo, ya que el material, cuando se reabsorbe, proporciona iones de calcio y fosfato que son necesarios para la formación de hidroxiapatita, que es el componente principal de los huesos. Durante el proceso de reabsorción se forman huecos que pueden reemplazarse por hueso en crecimiento. Uno de los desafíos cuando se utilizan partículas inorgánicas de TCP es fusionarlas en una estructura 3D o hacerlas inyectables. El material óseo de fosfato de calcio poroso convertido en material de fraguado automático se describe, por ejemplo, en el documento US 8147860 B2 [3], El campo de esa invención es la reparación y la sustitución de huesos. Hay muchos materiales de TCP disponibles comercialmente en el mercado y algunos de ellos se han procesado para ser inyectables. Para el endurecimiento localizado, el p-TCP conocido como Easy-graft® de Sunstar Americas Inc está recubierto con ácido poli(láctico-coglicólico) y se utiliza junto con BioLinker y ha demostrado un buen rendimiento para la conservación del borde alveolar [4], Sin embargo, la procesabilidad de TCP sigue siendo un gran desafío.
Cuando las cavidades óseas grandes tienen que ser reemplazadas por hueso en crecimiento, es necesario que muchas células estén allí y sean productivas. La colocación de un armazón vacío se basa únicamente en el proceso de migración de las células madre y de su diferenciación. Muchos científicos han estudiado el uso de células madre mesenquimatosas procedentes de la médula ósea o del tejido adiposo y su diferenciación en osteoblastos. El uso de materiales de TCP es muy atractivo en este tipo de aplicaciones [5]. Los científicos han demostrado que la presencia de TCP puede estimular el proceso de diferenciación de las células madre [6]. Se necesita nueva tecnología para utilizar TCP junto con células para la reparación de grandes cavidades óseas.
La bioimpresión 3D es una tecnología emergente que ha encontrado aplicaciones en la producción de casi todos los productos industriales. La ventaja de la tecnología de impresión 3D es el proceso de fabricación de abajo hacia arriba en el que se depositan y fusionan capa por capa de material. Cualquier objeto 3D se puede diseñar o escanear y transferir a un archivo CAD que después se convierte a un formato de impresión como, por ejemplo, un archivo stl, para construir el objeto 3D deseado. Ya existen varias aplicaciones de la tecnología de impresión 3D para la producción de implantes específicos para pacientes. Una de las grandes ventajas de la impresión 3D es la capacidad de producir una estructura altamente porosa que es ventajosa cuando se implanta, ya que puede tener lugar la integración del tejido y la vascularización. Por lo tanto, los materiales de TCP se pueden imprimir en 3D con diferentes aglutinantes para hacer armazones específicos para pacientes que podrían ser ideales para la curación ósea. Sin embargo, para grandes cavidades existe una necesidad de una gran cantidad de células para acelerar el proceso de curación.
La tecnología de bioimpresión 3D se refiere a la impresión 3D mediante una tecnología de fabricación aditiva, pero que se ha desarrollado para poder imprimir con células y así fabricar tejidos y órganos. La bioimpresión 3D tiene el potencial de revolucionar la medicina y la atención sanitaria. En una configuración típica de bioimpresión 3D, un cabezal de impresión puede depositar células y otro cabezal de impresión puede dispensar material de soporte, también llamado biotinta. Hay varias funciones de la biotinta; proporcionar soporte y protección a las células durante el proceso de impresión, proporcionar propiedades reológicas adecuadas que darán como resultado una alta fidelidad de la construcción y proporcionar buenas propiedades mecánicas a la construcción. Después de la operación de bioimpresión, comienza el proceso de crecimiento del tejido. Esto incluye migración celular, adhesión celular, proliferación celular, diferenciación celular y depósito de la matriz extracelular por parte de las células. En todos esos procesos de destino celular, la biotinta que después de la bioimpresión se convierte en un armazón juega un papel fundamental.
Recientemente, los investigadores descubrieron que es ventajoso mezclar células con biotinta para producir biotinta cargada de células. Los hidrogeles son los más adecuados para dichas aplicaciones, ya que unen mucha agua y, por lo tanto, proporcionan un entorno adecuado para las células. Se han evaluado diferentes hidrogeles formadores de polímeros como biotintas para el proceso de bioimpresión 3D. Entre estos polímeros naturales los más estudiados son los alginatos, el ácido hialurónico, la agarosa, el quitosano y el colágeno. La principal limitación de todos estos hidrogeles son las propiedades reológicas. Todas las soluciones de polímeros se diluyen por cizallamiento, lo que significa que tienen una viscosidad más baja a una velocidad de cizallamiento más elevada. Pero esto no es suficiente para proporcionar una fidelidad de impresión muy elevada, que se define como líneas finas que pueden permanecer en la misma dimensión sin combarse.
La mayoría de las plantas biosintetizan nanofibrillas de celulosa como elementos estructurales. Por lo general, tienen un diámetro de 5 a 20 nm y pueden tener una longitud de micrómetros. Durante el proceso de ensamblaje de la pared celular se incorporan a una estructura compleja compuesta por otros polisacáridos (hemicelulosas) y, en el caso de la pared celular secundaria, también por lignina. Dicha estructura compuesta se puede desmontar mediante procesos químicos y. después, las nanofibrillas de celulosa se pueden aislar mediante un homogeneizador mecánico. Dichas nanofibrillas de celulosa aisladas son muy hidrófilas y tienen una superficie muy elevada. Forman hidrogeles ya con un bajo contenido de sólidos (del 2 al 3 % de materia seca). Son extremadamente viscosos al cizallamiento, pero a diferencia de la solución de polímero normal, tienen una viscosidad de cizallamiento muy baja, que es una propiedad ideal para una biotinta. Se pueden imprimir con cabezal de extrusión o cabezal de inyección de tinta, y muestran una fidelidad de impresión muy elevada [7]. Las bacterias también pueden producir nanofibrillas de celulosa. Después del proceso de purificación que elimina todas las bacterias y sus desechos, las nanofibrillas de celulosa muestran una biocompatibilidad excelente [8]. Los biomateriales basados en nanofibrillas de celulosa bacteriana han recibido varias aprobaciones de la FDA y se pueden encontrar hoy en día en aplicaciones clínicas como la membrana de reparación de la duramadre.
El documento WO 2016/100856 describe el uso de una dispersión de nanocelulosa como biotinta para la bioimpresión 3D para su uso como modelo para el estudio de enfermedades, para probar fármacos o para su uso en la reparación de tejidos. La biotinta comprende además células, por ejemplo, células madre, y puede comprender además un biopolímero como colágeno, alginato o elastina.
La bioimpresión 3D tiene un gran potencial para la reparación ósea. Recientemente se ha publicado un buen ejemplo de aplicaciones prometedoras [9] [10]. Con biotintas adecuadas, la tecnología de bioimpresión 3D pronto puede encontrar aplicaciones en la clínica para reparar defectos óseos grandes y la presente invención puede tener una contribución importante en la traducción de la tecnología de bioimpresión 3D hacia la reparación ósea.
Sumario de la invención
El alcance de esta invención se define mediante las reivindicaciones. Las realizaciones de la descripción relativas a métodos de tratamiento no están cubiertas por las reivindicaciones. Cualquier "realización" o "ejemplo" que se divulgue en la descripción, pero que no esté cubierto por las reivindicaciones, debe considerarse presentado únicamente con fines ilustrativos.
La presente invención describe la preparación de biotintas a base de hidrogeles de nanofibrillas de celulosa con partículas que contienen calcio y su uso en la bioimpresión 3D de dispositivos implantables con o sin células para curar defectos óseos grandes. Dichas biotintas también se pueden utilizar para la fabricación de modelos de tejido óseo.
Estas son las etapas implicadas en la preparación de biotinta, bioimpresión 3D e implantación de la construcción para curar el defecto óseo:
• El polvo que contiene calcio, seleccionado de HA-TCP bifásico, p-TCP, o polvo de hueso natural de origen humano o porcino, se muele en partículas menores de 400 micrómetros o preferentemente menores de 200 micrómetros. Las partículas molidas se esterilizan mediante calor o irradiación con haz de electrones.
• La dispersión de nanofibrillas de celulosa con materia seca entre el 2 y el 3 % en peso se esteriliza mediante haz de electrones y se mezcla de manera aséptica con una solución de biopolímero reticulable, eligiéndose el biopolímero adicional del grupo que comprende alginatos, ácido hialurónico, agarosa, quitosano, fibrina, colágeno y gelatina. Como biopolímeros reticulables se utilizan preferentemente el alginato o el ácido hialurónico procedente de tiramina, el fibrinógeno con trombina (para formar fibrina), el metacrilato de gelatina o el metacrilato de colágeno.
• El polvo que contiene calcio se mezcla con una dispersión basada en nanofibrillas de celulosa y el biopolímero adicional. La relación entre la fase inorgánica y la fase de polímero orgánico depende del tamaño de las partículas del componente mineral molido. De acuerdo con la invención reivindicada, la concentración del polvo que contiene calcio varía entre el 1 % y el 40 % (p/v).
El defecto óseo se explora con IRM, TC o escáner óptico.
El archivo CAD se prepara en función de la exploración y se prepara teniendo en cuenta el tamaño, el lugar, la ubicación y otros factores relevantes relacionados con la implantación.
La construcción con la porosidad adecuada se bioimprime en 3D con biotinta de fibrillas de nanocelulosa que contiene calcio y un archivo CAD, y se implanta en el defecto.
La construcción se puede bioimprimir en 3D con células.
Las células madre mesenquimatosas se pueden aislar de la médula ósea o del tejido adiposo del paciente. Las células se combinan con biotinta basada en fibrillas de nanocelulosa rellenas de partículas de calcio, preferentemente en un dispositivo aséptico automatizado, y se transfieren a una bioimpresora 3D, preferentemente en dicha sala de operaciones
• La construcción se puede imprimir con biotinta de fibrillas de nanocelulosa rellenas de partículas de calcio cargadas de células.
Se puede utilizar una aguja coaxial donde el núcleo se puede imprimir con biotinta de nanocelulosa rellena de partículas de calcio y el recubrimiento se puede imprimir con biotinta de nanocelulosa cargada de células.
La arquitectura, el diseño y los componentes de la construcción bioimpresa en 3D proporcionan una estructura sólida y estable, biocompatibilidad, y la capacidad de vascularizarse y convertirse en tejido óseo de alta calidad. El paciente recibe una construcción que inducirá la formación de hueso y reparará así el defecto grande.
De manera más específica, la presente invención se refiere a los siguientes aspectos:
En un aspecto, la invención se refiere a biotinta basada en nanofibrillas de celulosa para su uso en bioimpresión 3D, en donde la biotinta comprende partículas que contienen calcio, en donde las partículas que contienen calcio tienen un tamaño de fracción inferior a 400 micrómetros y están en forma de fosfato tricálcico p sintético, HA-TCP bifásico, o polvo de hueso natural de origen humano o porcino. De acuerdo con una realización, las partículas que contienen calcio tienen un tamaño de fracción inferior a 200 micrómetros. Las partículas que contienen calcio con un "tamaño de fracción inferior a 400 micrómetros" son partículas que contienen calcio, o polvo que contiene calcio, que, esencialmente, no incluye partículas mayores de 400 micrómetros, por ejemplo, determinadas por el tamizado de las partículas después de la molienda. Una razón para limitar el tamaño de las partículas es mantener la resolución durante la bioimpresión, es decir, con partículas de más de 400 micrómetros la resolución se ve afectada de manera negativa.
De acuerdo con la invención reivindicada, se añade a la biotinta al menos un biopolímero adicional, en donde el biopolímero se elige del grupo que comprende alginatos, ácido hialurónico y sus derivados, agarosa, quitosano, fibrina, colágeno y gelatina y sus derivados. Se añaden biopolímeros adicionales a la biotinta con fines de reticulación y/o para contribuir a las propiedades reológicas como hidrogeles.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para preparar construcciones de bioimpresión 3D que son adecuadas para su uso en implantes para reparar defectos dentales o defectos óseos en el cuerpo humano o animal que comprende las etapas de:
a) proporcionar la biotinta basada en nanofibrillas de celulosa de acuerdo con lo anterior;
b) opcionalmente, proporcionar células vivas adecuadas;
c) mezclar los componentes de las etapas a) y b) e imprimir la(s) construcción(es) con una bioimpresora; d) opcionalmente, incubar la construcción en un entorno adecuado para que las células de la construcción se diferencien.
La construcción bioimpresa en 3D puede, por ejemplo, estar en forma de rejilla o similar. La bioimpresora puede ser de cualquier tipo comercialmente disponible, tal como la bioimpresora 3D INKREDIBLE de CELLINK AB. Un ejemplo de "un entorno adecuado para que las células en la construcción se diferencien" se divulga en el ejemplo 2, pero, por supuesto, las condiciones y los reactivos utilizados pueden diferir para diferentes tipos de células. Un experto en la materia conocerá las condiciones adecuadas para diferentes tipos de células.
En una realización, la construcción de bioimpresión 3D resultante se utiliza para aplicaciones de descubrimiento de fármacos, o como modelo de enfermedad o para otros fines de investigación.
En otra realización más, la nanofibrilla de celulosa se obtiene mediante una de las siguientes alternativas: biosíntesis mediante bacterias, aislamiento a partir de madera, aislamiento a partir de pared celular primaria o aislamiento a partir de tunicados.
En una realización adicional, se utiliza una aguja coaxial en la bioimpresora para imprimir la(s) construcción(es), mediante la cual se imprime un núcleo con biotinta de nanofibrillas de celulosa rellenas con partículas de calcio y un recubrimiento se imprime con biotinta de nanofibrillas de celulosa cargadas de células. Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto, se proporciona una construcción bioimpresa en 3D, en donde dicha construcción se prepara de acuerdo con lo anterior, que comprende un núcleo y un recubrimiento, en donde el núcleo comprende la biotinta de acuerdo con lo anterior, y el recubrimiento comprende la biotinta de acuerdo con lo anterior que comprende células vivas adecuadas.
En otro aspecto más, la invención se refiere a una construcción bioimpresa en 3D que es adecuada para su uso en implantes para reparar defectos dentales o defectos óseos en el cuerpo humano o animal compuesta de biotinta de nanofibrillas de celulosa que comprende partículas de fosfato de calcio como se define en la reivindicación independiente 1 y con un tamaño de fracción inferior a 200 micrómetros, al menos un biopolímero adicional como se define en la reivindicación independiente 1 y, opcionalmente, células vivas.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a una construcción bioimpresa en 3D que es adecuada para su uso en implantes para reparar defectos dentales o defectos óseos en el cuerpo humano o animal preparada mediante el método para preparar construcciones de bioimpresión 3D de acuerdo con la invención.
En una realización relacionada con todos los aspectos de la invención, las células vivas son células madre mesenquimatosas que se diferencian en osteoblastos en las construcciones. Igualmente, los condrocitos se pueden diferenciar en osteoblastos, así como células madre pluripotentes inducidas (células iPS (del inglésinduced pluripotent stem)).
En otra realización más, las células vivas son osteoblastos.
En aún otro aspecto, la invención se refiere a una construcción bioimpresa en 3D para su uso en la implantación de la construcción bioimpresa en 3D para reparar defectos dentales o defectos óseos en seres humanos o animales (en donde
i. una construcción que comprende células vivas se utiliza para reparar un defecto óseo mediante la creación de tejido óseo vivo, y
ii. una construcción sin células vivas se utiliza para reparar un defecto dental.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un tejido óseo vivo bioimpreso en 3D preparado mediante el (los) método(s) de la invención. Por "tejido vivo" se entiende un modelo de tejido con células vivas. Por lo tanto, puede relacionarse con una estructura, tal como un armazón, con células vivas unidas a ella, o células vivas encerradas dentro de la estructura.
En una realización, el tejido comprende osteoblastos vivos y en donde los espacios entre las rejillas impresas con biotinta permiten la difusión de nutrientes, oxígeno, proteínas y/o factores de crecimiento. Los espacios entre las rejillas impresas con biotintas son importantes para permitir, por ejemplo, la vascularización. El tamaño de los espacios debe ser de al menos aproximadamente 10 micrómetros.
En otra realización, las células vivas son osteoblastos que se cultivan para formar hueso.
En aún otro aspecto, la invención se refiere a tejido vivo bioimpreso en 3D para su uso en el tratamiento de un paciente animal o humano que padece un defecto tisular, una falta de tejido o una necesidad de reemplazo de un tejido, en donde el tejido vivo bioimpreso en 3D se implanta en el tejido del paciente.
En una realización, el tejido se elige de hueso o diente.
En un aspecto más, la invención se refiere a una construcción bioimpresa en 3D para su uso como tejido vivo para su uso en el tratamiento de un paciente animal o humano que padece un defecto tisular, una falta de tejido o una necesidad de reemplazo de un tejido, en donde un tejido vivo bioimpreso en 3D de la invención se implanta en el tejido del paciente.
En una realización, el tejido se elige de hueso o diente.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos adjuntos ilustran determinados aspectos de algunas de las realizaciones de la presente invención y no deben utilizarse para limitar o definir la invención. Junto con la descripción escrita, los dibujos sirven para explicar determinados principios de la invención.
En la figura 1 se muestran construcciones impresas basadas en fosfatos de calcio de varias fuentes y varias composiciones de biotintas. Las biotintas que comprenden el fosfato de calcio tal como se define en los puntos a) y d) son conforme a la invención reivindicada. Las biotintas que comprenden el fosfato de calcio tal como se definen en los puntos b) y c) son ejemplos de referencia:
a) Polvo de hueso al 18 % (Bio-Oss) b) p-TCP al 10 % recubierto con ácido poli(láctico-co-glicólico) c) hidroxiapatita porosa procedente de algas marinas rojas al 20 % d) p-TCP sintético al 20 %
En la figura 2 se muestran los resultados de las pruebas mecánicas de construcciones impresas con nanofibrillas de celulosa/TCP.
En la figura 3 se muestra el diseño de una construcción de núcleo-recubrimiento (a), una imagen esquemática de la aguja coaxial (b) utilizada en el experimento donde el núcleo está compuesto de biotinta de nanofibrillas de celulosa/TCP al 20 % y el recubrimiento es biotinta de nanocelulosa con células madre mesenquimatosas, y una fotografía (c) de una construcción producida en dicho experimento.
En la figura 4 se muestra una construcción de núcleo-recubrimiento bioimpresa en 3D durante el cultivoin vitro(a) y los resultados de viabilidad celular después de 3 días (b), en donde los puntos claros representan células que están vivas y los puntos oscuros las células muertas. La viabilidad celular es superior al 90 %.
Descripción detallada de diversas realizaciones de la invención
La presente invención se refiere a materiales basados en nanofibrillas de celulosa a base de hidrogeles con partículas que contienen calcio natural o sintético, tal como fosfato tricálcico o polvo de hueso, y su uso como biotintas de bioimpresión 3D para reparar defectos dentales u óseos. Las biotintas basadas en hidrogeles de nanofibrillas de celulosa rellenas de partículas que contienen calcio se pueden utilizar como biotintas en el proceso de bioimpresión 3D con o sin células humanas o animales. Dichas construcciones bioimpresas se pueden implantar en defectos óseos para promover el proceso de curación ósea.
La ventaja de utilizar hidrogeles de nanofibrillas de celulosa son las propiedades extremas de viscosidad al cizallamiento, lo cual es fundamental para una fidelidad de impresión elevada. La elevada fidelidad de impresión hace posible la bioimpresión de estructuras porosas que pueden vascularizarse espontáneamente tras la implantación. La vascularización es clave para promover el proceso de curación ósea ya que la vascularización hace posible el transporte de oxígeno y nutrientes. De manera adicional, las células pueden migrar a través de la porosidad para mejorar el proceso de formación ósea. Otra ventaja de utilizar nanofibrillas de celulosa es su gran superficie y sus propiedades hidrófilas, lo que las convierte en un excelente agente aglutinante y dispersante para partículas orgánicas e inorgánicas.
Las biotintas descritas en esta invención tienen muy buenas propiedades mecánicas y excelente biocompatibilidad. La buena integridad de las estructuras bioimpresas con biotintas a base de nanofibrillas de celulosa con partículas de calcio proporciona un muy buen soporte para otra estructura de hidrogel cargado de células que se puede biofabricar con aguja coaxial. Se pueden utilizar células autólogas que incluyen células madre mesenquimatosas aisladas de médula ósea o tejido adiposo u osteoblastos. Los iones de calcio y los iones de fosfato, con origen nativo o sintético que se encuentran en las partículas de las construcciones impresas, se reabsorberán e inducirán el proceso de osteogénesis, que es un proceso clave en la formación ósea. Dichas construcciones bioimpresas con o sin células son muy eficaces en la reparación de defectos óseos más grandes. Los defectos de tamaño crítico no se pueden salvar con hueso regenerado de forma natural. En las biotintas se pueden utilizar nanofibrillas de celulosa de diferente origen. Las pueden producir bacterias o aislados a partir de madera o plantas anuales, tales como a partir de paredes celulares primarias, o aislado a partir de tunicados. Pueden ser neutras o cargadas. Se pueden oxidar y, por lo tanto, son biodegradables. La característica fundamental de las partículas de calcio es su tamaño para utilizarse como componente de la biotinta en el proceso de bioimpresión 3D. Los aglomerados grandes de más de 200 micrómetros pueden bloquear la boquilla de la impresora, lo que provocará una obstrucción. La presente memoria descriptiva describe cómo se deben seleccionar y preparar las partículas utilizadas en la biotinta, el proceso de fabricación de biotinta, la bioimpresión 3D con diferentes boquillas y las aplicaciones con y sin células para la reparación de grandes defectos óseos.
Las partículas de fosfato tricálcico p (p-TCP) se pueden obtener de varias fuentes, por ejemplo, de DePuy Synthes (sustituto de injerto óseo chronOS). El polvo de hueso natural es de origen humano o porcino. Normalmente, el material se proporciona en forma estéril e irradiado con rayos<y>. Por ejemplo, el polvo de hueso natural se obtiene de LifeNet Health (partículas corticales desmineralizadas ReadiGraft con un tamaño de molienda de 125 a 1000 micrómetros). El polvo se puede tamizar antes de su uso para obtener el tamaño de partícula deseado.
Para mezclar las nanofibrillas de celulosa y las partículas de fosfato de calcio, los componentes de la biotinta estériles se colocan dentro de una jeringuilla estéril con cierre de Luer macho. Se utiliza un conector de cierre de Luer hembrahembra empaquetado estéril para conectar ambas jeringas en la conexión de Luer macho. Este proceso de mezcla es ideal para transferir y mezclar soluciones de baja viscosidad. Los componentes de la biotinta se mezclan mediante el movimiento del contenido de las jeringuillas de una jeringuilla a otra hasta obtener una mezcla homogénea. Este proceso asegura la máxima esterilidad al facilitar un manejo libre de contaminación, ya que es un sistema cerrado, y reduce los desechos residuales en las jeringuillas.
Ejemplos
Para facilitar una mejor comprensión de la presente invención, se proporcionan los siguientes ejemplos de determinados aspectos de algunas realizaciones. De ninguna manera debe leerse que los siguientes ejemplos limitan, o definen, el alcance de la invención.
Ejemplo 1
Preparación y evaluación de biotintas
Los gránulos de fosfato tricálcico p (p-TCP) de 1,4 a 2,8 mm de tamaño de partícula se molieron en un molinillo mecánico hasta obtener un polvo y finalmente se homogeneizaron utilizando una prensa hidráulica. Se compararon otros fosfatos de calcio de diferentes fuentes. El proceso de molienda se diseñó para proporcionar un tamaño de partículas inferior a 200 micrómetros según lo determinado por el proceso de tamizado. El hidrogel de fibrillas de nanocelulosa se preparó mediante la homogeneización de una película de celulosa bacteriana que se purificó de acuerdo con los protocolos publicados en otros lugares [8], También se han evaluado nanofibrillas de celulosa aisladas de la madera. Para proporcionar una buena reticulación, se añadió entre el 10 y el 20 % de alginato en base al peso seco de las nanofibrillas de celulosa. Una biotinta normal sin fase mineral contiene entre el 2 y el 3 % en peso seco de nanofibrillas de celulosa y una mezcla de alginato. Se probaron diferentes dispositivos de mezcla. En la figura 1 se muestra un dispositivo mezclador que se construye mediante la combinación de dos cartuchos. La mezcla se logró mediante el movimiento de los pistones en los cartuchos individuales, como se ha descrito anteriormente. Se prepararon y evaluaron varias composiciones diferentes de biotintas minerales mediante la medición de las propiedades reológicas, las propiedades mecánicas y la capacidad de impresión. También se evaluaron los fosfatos de calcio de diferentes proveedores. Antes de la impresión, las mezclas con diferentes relaciones de fosfatos de calcio y biotinta de nanocelulosa se prepararon y evaluaron con respecto a las propiedades reológicas. Se seleccionaron las mejores combinaciones con respecto a las propiedades de flujo a presiones inferiores a 120 kPa. Después de mezclar, el cartucho de biotinta de nanocelulosa rellena de partículas de calcio se colocó en una bioimpresora 3D INKREDIBLE de CELLINK AB, Suecia, y se imprimió la rejilla. En la figura 1 se compara la estructura de rejillas impresas a base de biotintas con diferentes composiciones. Por la presente, las biotintas que comprenden el fosfato de calcio como se define en los puntos a) y d) son de acuerdo con la invención reivindicada. Las biotintas que comprenden el fosfato de calcio como se define en los puntos b) y c) son ejemplos de referencia.
En la figura a) se muestra la construcción impresa con biotinta que contiene un sustituto óseo (Bio-Oss) al 18 % p/v. Se puede ver que la fidelidad de impresión no es muy buena. En la figura 1b) se muestra una construcción impresa con p-TCP al 10% p/v recubierta con ácido poli(láctico-co-glicólico). La fidelidad de impresión no es muy buena, probablemente porque el recubrimiento con polímero protege las partículas de p-TCP y la dispersión en biotinta no es muy eficaz. En la figura 1c) se muestra una construcción impresa con hidroxiapatita porosa al 20 % procedente de algas marinas rojas. La fidelidad de impresión es muy pobre. En la figura 1d) se muestra una construcción impresa con biotinta que contiene p-TCP sintético al 20 %. Muestra una excelente imprimibilidad con muy alta fidelidad. Esta combinación fue seleccionada para estudios posteriores. En la figura 2 se muestra la evaluación de las propiedades biomecánicas utilizando pruebas de compresión no confinada. La prueba de compresión se realizó en discos moldeados preparados a partir de las cuatro formulaciones de tinta que se muestran en la tabla 1. Mediante una pipeta de desplazamiento positivo (Microman, Gilson, EE. UU.) y unidades de moldeado (Q-Gel bio, Lausana, Suiza), los discos se moldearon mediante la dispensación de 75 μl de biotinta en una placa de moldeado y el recubrimiento de la gota dispensada con una placa superior. Las unidades de moldeado con los discos (8 mm * 1,5 mm) se reticularon en un baño de CaCh 90 mM (Sigma-Aldrich) durante 10 min y después se sumergieron en medio Eagle basal de HyClone (Sigma-Aldrich) durante 48 h a temperatura ambiente. Después de la reticulación y el equilibrio en el medio, los discos tenían un diámetro de 8 mm y un espesor de 1,2 mm de promedio. Las dimensiones iniciales de los discos se midieron con un calibrador digital. Para el ensayo de compresión no confinada se utilizó una máquina de ensayo universal (Instron Modelo 5565A, Reino Unido) equipada con una célula de carga de 100 N, que se realizó en condiciones húmedas a temperatura ambiente. La velocidad de deformación se fijó en 10%/s y las muestras se comprimieron hasta una deformación por compresión del 40 %. Se utilizó el programa informático Bluehill (Instron) para calcular el esfuerzo y la deformación compresivas, la rigidez a la compresión (módulo tangente) al 30 % de deformación y la tensión compresiva al 30 % de deformación para todas las muestras (n = 6 por grupo). Como se muestra en el gráfico de la figura 2, la adición de p-TCP a la biotinta de fibrillas de nanocelulosa (i) que está de acuerdo con la invención reivindicada, da como resultado una mayor resistencia y rigidez a la compresión, y, por lo tanto, una mayor resistencia mecánica, en comparación con la biotinta sin p-TCP (ii) que debe considerarse como un ejemplo de referencia.
Ejemplo 2
Bioimpresión 3D de construcciones implantables
La viscosidad muy elevada de las biotintas rellenas de calcio dio como resultado una presión mucho más elevada necesaria para obtener construcciones impresas. Con el fin de utilizar biotintas con células, las estructuras de núcleo y recubrimiento (1) se diseñaron como se muestra en la figura 3a. Un posible diseño es utilizar biotinta rellena de calcio como núcleo y biotinta de nanocelulosa rellena de células como recubrimiento. En la figura 3a, la estructura 1 comprende recubrimiento exterior 2 y un núcleo interior 3. El recubrimiento exterior puede contener biotinta de nanocelulosa y células madre mesenquimatosas, y el núcleo interior 3 puede contener biotinta de nanocelulosa/p-TCP al 20 %. También se puede imprimir lo contrario. Para poder imprimir dichas estructuras se instala una aguja coaxial, véase la figura 3b. La biotinta del núcleo interior se introduce en el CI 1 y la biotinta del recubrimiento exterior se introduce en el CI 2. Antes de la bioimpresión se preparó biotinta de nanocelulosa en solución de medio DMEM. Se lavaron AD-MSC de células mesenquimatosas procedentes de tejido adiposo humano confluente con 6 ml de DPBS y después se incubaron con 6 ml de TrypLE a 37 °C. El progreso del desprendimiento celular se evaluó con un microscopio de luz confocal. La actividad de TrypLE se extinguió mediante la adición de 6 ml de medio gastado al matraz de cultivo. La solución celular se transfirió a un tubo de centrífuga de 15 ml y se centrifugó a200gdurante 5 min. Se aspiró el sobrenadante y se resuspendieron las células en 200 microlitros de DMEM y se mezclaron con dispersión de nanocelulosa al 2 % para obtener una concentración de 2 * 106 células por ml en la biotinta. Para la bioimpresión, se insertó biotinta de nanocelulosa p-TCP al 20% en el cabezal de impresión 1 (CI 1) y la biotinta cargada de células se insertó en el cabezal de impresión 2 (CI 2). Se aplicaron presiones de 105 kPa (CI 1) y 55 kPa (CI 2). Se imprimieron rejillas de 6 * 6 (espacio entre líneas de 2 mm) que consisten en 2 capas y posteriormente se reticularon durante 6 min con CaCh 100 mM. A continuación, se transfirieron a medio osteogénico y se incubaron a 37 °C y CO<2>al 5 %. El medio se cambió cada 2 a 3 días. El tratamiento con BMP-2 se inició el día 4.
La tinción se realizó con el kit LIVE/DEAD Cell Imaging de ThermoFisher Scientific, EE. UU. Las biotintas cargadas de células se lavaron en medio osteogénico sin suero durante 30 minutos a 37 °C. La solución de tinción vivo/muerto se mezcló en una relación de 1:2 con medio osteogénico sin suero, es decir, 2 ml de solución de tinción con 4 ml de medio. A continuación, se eliminó el medio de las construcciones y en su lugar se añadieron 450 ml de solución de tinción, asegurándose de que toda la construcción estuviera cubierta. Después se incubaron durante una hora a 37 °C. La solución de tinción se eliminó de las construcciones y se reemplazó con 450 ml de medio osteogénico sin suero durante una hora a 37 °C para lavar las construcciones. El medio se reemplazó con medio fresco después de 30 minutos. A continuación, se reemplazó el medio con solución de formación de imágenes de células vivas y se tomaron imágenes de las muestras con microscopía de fluorescencia confocal con filtros FITC (vivo) y Texas Red (muerto) con un aumento de 10*. En la figura 4b, en donde los puntos claros representan células vivas y los puntos oscuros representan células muertas, se muestra una viabilidad celular elevada. La construcción está lista para la implantación después de 28 días de diferenciaciónin vitro.También es posible implantar directamente una construcción libre de células o una construcción rellena de células.
Ejemplo 3
Impresión 3D utilizando polvo de hueso humano como fuente
Los ejemplos 1 y 2 se repiten utilizando polvo de hueso humano (LifeNet Health (Partículas corticales desmineralizadas ReadiGraft con un tamaño de molienda de 125 a 1000 micrómetros)) en lugar de los otros materiales de los ejemplos 1 y 2. El polvo se tamiza antes de su uso para obtener el tamaño de partícula deseado (menos de 400 micrómetros o menos de 200 micrómetros). El polvo de hueso humano se utiliza con los mismos parámetros que para las partículas de p-TCP. Se esperan los mismos resultados prometedores, es decir, excelente imprimibilidad con elevada fidelidad.
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Claims (18)
1. Una biotinta para su uso en bioimpresión 3D, en donde la biotinta comprende hidrogel basado en nanofibrillas de celulosa, partículas que contienen calcio y al menos un biopolímero adicional, eligiéndose el biopolímero adicional del grupo que comprende alginatos, ácido hialurónico, agarosa, quitosano, fibrina, colágeno y gelatina, en donde las partículas que contienen calcio tienen un tamaño de fracción inferior a 400 micrómetros, una concentración del 1 al 40 % (p/v) y están compuestas de fosfato tricálcico p, HA-TCP bifásico o polvo de hueso natural, en donde el polvo de hueso natural es de origen humano o porcino.
2. La biotinta de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichas partículas de fosfato de calcio tienen un tamaño de fracción inferior a 200 micrómetros.
3. La biotinta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el al menos un biopolímero adicional es un biopolímero reticulable elegido entre alginato o ácido hialurónico derivado de tiramina, fibrinógeno con trombina (para formar fibrina), metacrilato de gelatina o metacrilato de colágeno.
4. La biotinta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la nanofibrilla de celulosa se obtiene mediante una de las siguientes alternativas: biosíntesis mediante bacterias, aislamiento a partir de madera, aislamiento a partir de pared celular primaria o aislamiento a partir de tunicados.
5. La biotinta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además células vivas.
6. La biotinta de acuerdo con la reivindicación 5, en donde las células vivas son células madre mesenquimatosas, osteoblastos o células madre pluripotentes inducidas (iPSC).
7. Un método para preparar construcciones bioimpresas en 3D que son adecuadas para su uso en implantes para reparar defectos dentales o defectos óseos en el cuerpo humano o animal que comprende las etapas de:
a) proporcionar la biotinta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4;
b) opcionalmente, proporcionar células vivas adecuadas;
c) mezclar los componentes de la etapa a) y, opcionalmente, de la etapa b) para obtener la biotinta de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6
d) imprimir la(s) construcción(es) con una bioimpresora;
e) opcionalmente, incubar la construcción en un entorno adecuado para que las células de la construcción se diferencien.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde se utiliza una aguja coaxial en la bioimpresora para imprimir la(s) construcción(es), en donde (i) se imprime un núcleo con la biotinta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y se imprime un recubrimiento con la biotinta cargada de células de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, o (ii) se imprime un núcleo con la biotinta cargada de células de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6 y se imprime un recubrimiento con la biotinta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
9. Una construcción bioimpresa en 3D preparada por el método de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en donde la construcción se compone de la biotinta de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
10. La construcción bioimpresa en 3D de acuerdo con la reivindicación 9, en donde las células vivas son células madre mesenquimatosas que se diferencian en osteoblastos en las construcciones, o en donde las células vivas son osteoblastos o células madre pluripotentes inducidas (iPSC).
11. La construcción impresa en 3D de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, para su uso en la fabricación de un implante para reparar defectos dentales o defectos óseos en el cuerpo humano o animal.
12. Uso de la construcción bioimpresa en 3D de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10 en el descubrimiento de fármacos o como modelo de enfermedad.
13. La construcción bioimpresa en 3D de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10 para su uso en la implantación de la construcción bioimpresa en 3D para reparar defectos dentales o defectos óseos en el cuerpo humano o animal, en donde
i. una construcción que comprende células vivas se utiliza para reparar un defecto óseo mediante la creación de tejido óseo vivo, o
ii. una construcción sin células vivas se utiliza para reparar un defecto dental.
14. Una construcción bioimpresa en 3D para su uso como tejido óseo vivo preparado mediante el método de acuerdo con la reivindicación 13, opción (i).
15. La construcción bioimpresa en 3D para su uso como tejido óseo vivo de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el tejido comprende osteoblastos vivos y en donde los espacios entre las rejillas impresas con biotinta permiten la difusión de nutrientes, oxígeno, proteínas y/o factores de crecimiento.
16. La construcción bioimpresa en 3D para su uso como tejido óseo vivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15, en donde las células vivas son osteoblastos que se cultivan para formar hueso.
17. Una construcción bioimpresa en 3D para su uso como tejido vivo para su uso en el tratamiento de un paciente animal o humano que padece un defecto tisular, una falta de tejido o una necesidad de reemplazo de un tejido, en donde el tejido vivo bioimpreso en 3D comprende la biotinta de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, y se implanta en el tejido del paciente.
18. La construcción bioimpresa en 3D para su uso como tejido vivo de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el tejido se elige de hueso o diente.
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