CN110302428A - 基于活细胞3d打印的软骨-骨-骨髓复合组织结构及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于活细胞3D打印的软骨‑骨‑骨髓复合组织结构及方法，采集骨组织的生物信息，输入计算机进行仿生建模，配制适用软骨、成骨、间充质干、血管内皮等细胞的生物墨水；配制打印密致骨区域的硬材料硬材料；配制各种铸型剂；将活细胞按一定的密度接种于相应的生物墨水中；将各种类型的打印墨水分别加载于打印机料仓，设置打印参数后进行3D打印，打印成型的骨组织在组织工程仿生培养器中进行培养，一定时间后运用温控或酶控或光控的方法，于不同的时间祛除铸型剂材料，在软骨‑骨‑骨髓复合组织外部接枝人工血管，在组织工程仿生培养器内连续循环灌注培养，实现打印组织的预成熟。其实现3D打印骨组织的长期存活和生物功能。

Description

基于活细胞3D打印的软骨-骨-骨髓复合组织结构及方法
技术领域
本发明属于生物医学工程，特别涉及一种基于活细胞3D打印的软骨-骨-骨髓复合组织结构及方法。
背景技术
由于战创伤和病损造成骨缺损发病率较高, 因此在临床上需要大量的骨移植假体,骨组织的移植在所有组织器官的移植量中高居第二。目前，骨移植假体多是由金属、高分子聚合物构成，仅只在形态、外观上模拟缺损的骨骼，但并没有生物活性，常导致了移植后生理功能的严重缺陷。近年来，3D打印技术的快速发展为解决上述问题提供了可能性。生物3D打印是一种具有良好应用前景的工程化人体组织构建方法，从理论上可以实现组织结构、生物活性的高度仿生。随着生物3D打印技术的快速发展以及人们对精准医疗要求的不断提高，生物3D打印以其独有的个性化特点，越来越受到人们的广泛关注。我国目前已将3D打印技术列入技术发展的重点。
骨关节的移植是骨移植的重点和难点，这是因为骨关节是人体的复杂运动的基础，是运动功能重建的关键；而骨关节所在的骨端是由软骨、骨、骨髓组成的复杂骨组织结构，移植修复的难度大。目前，在临床上应用的骨关节移植物均为人工假体，在体内没有生物学活性，具有生物功能低下、易于损耗的特点，难以满足组织修复的要求；而现有的组织工程技术仅可构建单一组织，无法解决骨关节的复杂、严重创伤的修复问题。运用生物3D打印技术有望克服上述的难题，运用高仿生建模，实现多组织成分的复杂骨关节结构组织工程器官构建，实现骨关节的结构、功能仿生，最终实现骨关节复杂结构的再生修复。但是由于现有3D打印技术所构建组织由于缺乏血管网，难以保证大体积组织内部的营养供应，深部组织在长期培养后生物活性较低；同时，现有的生物墨水力学性能差，在大体积组织3D打印时，难以实现打印组织的机械稳定性，无法实现骨关节的生物3D打印。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于活细胞3D打印软骨-骨-骨髓复合组织的方法，通过3D打印软骨-骨-骨髓复合组织的结构成型和预血管化，以实现 3D打印骨组织的长期存活和生物功能。
本发明的另一目的是针对现有技术存在的不足，提供一种结合运用硬、软的天然高分子材料，同时利用不同材料理化性能和固化机制及时间的差异，建立多材料复合成型的错层打印工艺，解决复杂结构成型过程中材料相互干扰的问题， 并结合高仿生结构建模和多自由度机械臂路径规划，实现软骨-骨-骨髓复杂结构的 3D 打印仿生成型。
本发明的目的是这样实现的：一种基于生物3D打印制备软骨-骨-骨髓复合组织的方法，包括如下步骤：
1）建模：
采集需要打印的软骨-骨-骨髓复合组织的生物信息，输入计算机进行仿生建模，建立的几何模型包括软骨区域、密致骨区域、松质骨区域、松质骨中间的营养孔隙区域、血管壁区域、血管腔区域、组织外辅助塑性区域；
2）配料：
准备构建软骨-骨-骨髓复合组织所需的各种细胞，配制适用构建软骨-骨-骨髓复合组织所需的各种细胞的液态可固化水凝胶材料载体，将构建软骨-骨-骨髓复合组织所需的各种细胞按设定的密度分别接种于相应的液态可固化水凝胶材料载体中，配制含细胞的各种生物墨水，同时，配制用于打印软骨-骨-骨髓复合组织的密致骨区域的硬材料，以及配制用于打印组织外辅助塑性区域的第一铸型剂，配制用于打印松质骨中间的营养孔隙区域的第二铸型剂，配制用于打印血管腔区域的第三铸型剂。
3）3D打印制备软骨-骨-骨髓复合组织坯体：
将步骤1)建好的模型数据输入生物3D打印机的配套设备中，设置打印程序，将步骤2)中配制的铸型剂、硬材料以及含细胞的生物墨水分别装载到生物3D打印机的各料仓中，生物3D打印机在组织工程仿生培养器中的打印平台上进行3D打印，生物3D打印机的多个喷头按照设定的打印程序轮流喷出或挤出液体进行3D打印，喷出或挤出的液体分别在相应的条件下固化，其中，用第一铸型剂打印组织外辅助塑性区域，用第二铸型剂打印松质骨中间的营养孔隙区域，用第三铸型剂打印血管腔区域，用含软骨细胞的生物墨水打印软骨-骨-骨髓复合组织的软骨区域，用含成骨细胞和间充质干细胞的生物墨水打印软骨-骨-骨髓复合组织的松质骨区域，用含血管内皮细胞的生物墨水打印血管壁区域，用硬材料打印软骨-骨-骨髓复合组织的密致骨区域，形成软骨-骨-骨髓复合组织坯体；
4 ) 刻蚀成型：
分级刻蚀，在不同阶段采用不同的手段分别去除用于辅助组织塑性的第一铸型剂、用于营养孔隙成型的第二铸型剂以及用于血管腔成型的第三铸型剂，得到有血管网和营养孔隙的软骨-骨-骨髓复合组织；
5 )体外培养：
让刻蚀成型的有血管网和营养孔隙的软骨-骨-骨髓复合组织浸入组织工程仿生培养器灌注的培养液中进行培养，并将软骨-骨-骨髓复合组织血管网的主血管与培养液输送管连接进行循环灌流培养，实现软骨-骨-骨髓复合组织的预成熟。
打印过程中将硬材料、铸型剂、生物墨水进行错层打印，使硬材料、铸型剂、生物墨水的打印过程互不干涉。
将步骤3）的打印过程分为长周期、中周期、短周期，其中，长周期为整个软骨-骨-骨髓复合组织的打印周期，中周期为初始基础打印周期，短周期层打印周期；中周期打印过程是首先进行硬材料的基础打印，将硬材料打印到一定的高度后，进行铸型剂基础打印，将铸型剂打印到一定高度且低于硬材料的初始打印高度时，再进行生物墨水的基础打印，将生物墨水打印到一定高度且低于铸型剂高度时，使硬材料、铸型剂、生物墨水之间形成有高差的错层基础，然后在此基础上按照硬材料、铸型剂、生物墨水的先后顺序依次交错进行短周期打印，直至长周期的整个打印过程结束。
分级刻蚀去除铸型剂的手段采用酶或螯合反应或温控或光照。
液态可固化水凝胶材料载体采用对细胞友好的天然大分子材料，如甲基丙烯酸酯明胶、丙烯酸酯透明质酸中的一种或几种，使细胞可在生物墨水中存活。
硬材料为强度较高的材料，如为羟基磷灰石、聚ε - 己内酯（PCL）、丝素蛋白中的一种或几种。
铸型剂采用可控降解高分子材料，用于填充打印时的空腔和在打印组织的外部支架，发挥填充占位、暂时支撑和塑性的作用，保证打印空腔结构及大体积组织结构不会塌陷，只在打印过程中存在，打印后刻蚀祛除。
本方法通过采集需要打印的软骨-骨-骨髓复合组织的生物信息，输入计算机进行仿生建模，为3D打印制备软骨-骨-骨髓复合组织坯体提供参数依据。通过配料，配制含细胞的各种生物墨水，以及，配制用于打印软骨-骨-骨髓复合组织的密致骨区域的硬材料，配制用于打印组织外辅助塑性区域的第一铸型剂，配制用于打印松质骨中间的营养孔隙区域的第二铸型剂，配制用于打印血管腔区域的第三铸型剂，用于3D打印制备软骨-骨-骨髓复合组织坯体。然后在组织工程仿生培养器中的打印平台上进行3D打印，通过不同的铸型剂打印不同的区域为组织坯体成型建立空间，并用含不同细胞的生物墨水分别打印软骨-骨-骨髓复合组织坯体的不同区域，直至形成软骨-骨-骨髓复合组织坯体。然后再通过分级刻蚀去除铸型剂，得到有血管网和营养孔隙的软骨-骨-骨髓复合组织。让刻蚀成型的有血管网和营养孔隙的软骨-骨-骨髓复合组织浸入组织工程仿生培养器灌注的培养液中进行培养，并将软骨-骨-骨髓复合组织血管网的主血管与培养液输送管连接进行循环灌流培养，实现软骨-骨-骨髓复合组织的预成熟。从而得到生物3D打印制备成型的软骨-骨-骨髓复合组织。
本方法中的液态可固化水凝胶材料载体采用甲基丙烯酸酯明胶、丙烯酸酯透明质酸等对细胞友好的天然大分子材料，所配制出含细胞的生物墨水，细胞可在生物墨水中存活。这种生物墨水可用可见光、紫外光进行固化，并且细胞相容性好。含细胞的生物墨水中还可加入促生长细胞因子，不同的细胞加入相应的促生长细胞因子。
本方法中的硬材料为羟基磷灰石、聚ε - 己内酯（PCL）、丝素蛋白等强度较高的材料，打印时为不含细胞的打印，可采用熔融式打印，力学强度较好，冷却后固化，对打印组织结构具有骨架支撑作用。
本方法中的铸型剂采用可控降解高分子材料，用于发挥填充占位、暂时支撑和塑性的作用，填充打印时的空腔和打印组织的外部支架，铸型剂只在打印过程中存在，打印时不含细胞。打印后将铸型剂刻蚀祛除，保证打印空腔结构及大体积组织结构不会塌陷。铸型剂可以是纤维蛋白、聚N-异丙基丙烯酰胺、聚丙交酯乙交酯-聚乙二醇-聚丙交酯乙交酯溶液、普郎尼克F-127中的一种。铸型剂采用喷墨打印铸型剂。而打印后的刻蚀方式包括了酶刻蚀、光刻蚀、温度刻蚀。
本方法将的打印过程分为长周期、中周期、短周期，其中，长周期为整个软骨-骨-骨髓复合组织的打印周期，中周期为初始基础打印周期，短周期层打印周期。使3D打印过程能在中周期打印出硬材料、铸型剂、生物墨水形成有高差的初始基础，再通过短周期交错进行层打印，直至长周期的整个打印过程结束，这种方式可以避免打印过程中硬材料、铸型剂、生物墨水相互干涉，影响软骨-骨-骨髓复合组织坯体的打印成型。
由于本方法是在组织工程仿生培养器中的打印平台上进行3D打印，在打印过程中，承载打印组织的打印平台可以根据打印的速度缓缓下沉，将已固化成型的打印组织浸入到组织工程仿生培养器中的培养液中，及时得到培养，可以保持组织中细胞的活性。并且通过将软骨-骨-骨髓复合组织血管网的主血管与培养液输送管连接进行循环灌流培养，实现软骨-骨-骨髓复合组织的预成熟。
本发明还公开了一种基于生物3D打印的软骨-骨-骨髓复合组织结构，包括由软骨组织、密致骨组织、松质骨组织和组织内血管网构成的软骨-骨-骨髓复合组织，所述软骨组织由含软骨细胞的生物墨水通过3D打印成型，所述松质骨组织由含成骨细胞、间充质干细胞的生物墨水通过3D打印成型，所述松质骨组织设有营养孔隙，所述松质骨组织内的营养孔隙由铸型剂通过3D打印成型后再经刻蚀形成，所述密致骨组织由硬材料通过3D打印成型，所述血管网的血管管壁由含血管内皮细胞的生物墨水通过3D打印成型，所述血管网的血管管壁内由铸型剂通过3D打印成型有血管管腔成型支撑体，所述血管管壁内的血管管腔成型支撑体经刻蚀后形成血管管腔。
所述血管网的血管管壁内的血管管腔成型支撑体分部位由不同的铸型剂分别通过3D打印成型，血管管腔成型支撑体由不同的铸型剂成型的各部分分阶段经对应的手段刻蚀后形成血管管腔。
本发明的有益效果为：本发明提供软骨-骨-骨髓复合组织的生物3D打印，并使软骨-骨-骨髓复合组织预形成血管和营养空隙的构建方法。它通过分级刻蚀工艺，根据组织形成的规律，在不同阶段祛除功能腔道（或供养孔隙）和循环管网中的铸型剂，形成组织内弥散营养孔隙和血管网建立，实现血循环管网供养功能和深部组织营养传质。铸型剂在打印阶段具有一定的支撑强度，避免了打印过程中管腔的塌陷，保证了打印结构的稳定性，并可实现内部复杂管网的成型；该刻蚀技术具有可温控或酶控或光控的特点，实现了按照组织发育的成熟速度的不同，分阶段的可控式管腔成型；血管化的管网可通过人工血管与循环灌流装置对接，实现体外培养时组织内部的循环供养，使预置的内皮细胞在流体力学的作用下形成仿生组织的天然结构，使预置管腔具有血管化功能，预置孔隙能保证组织内部的弥散养供，实现软骨-骨-骨髓复合组织的内部营养供应，最终保证了打印的软骨-骨-骨髓复合组织的体外长期存活。
本发明采用软、硬材料的复合打印和错层打印工艺：针对以往生物墨水力学性能较差的缺点，结合运用软、硬材料进行复合打印，以硬材料为结构骨架（硬材料用于结构的支撑，内部无细胞。），以软材料即生物墨水（生物墨水细胞相容性高，故作为细胞的基质材料）为细胞基质，使打印组织兼具有良好的力学稳定性和较高的细胞相容性。本发明中有些材料是用温度进行固化的，有些材料是用光进行固化的，有的材料是热熔融冷却固化的。如果是同层打印，由于固化的速度不同，不同成分的材料可能会交互渗透，互相干扰，影响了固化的效果。同时，热熔融型的硬材料，由于采用了高温熔融，冷却需要一定的时间，如果同层打印可能会对周围的细胞造成伤害。在打印过程中使用错层打印技术，避免的材料理化性能、固化机理的不同造成的界面干扰问题，也防止了不同的固化成型技术对细胞活性的影响。
本发明通过上述生物无损刻蚀技术在大体积骨组织内形成负责营养供应的血管网，血管网在打印骨组织的外段汇集后在组织外通过接枝人工血管与培养液输送管连接进行循环灌流培养，使培养液可以充分在循环管网中灌流，保证末梢循环通道的灌注和组织的充分营养供应。同时，血管内皮细胞在流体剪切力的作用下可形成类似体内的内皮细胞间紧密连接和细胞朝向，最终形成具有生理功能的血管组织，进一步保证了深部组织的营养供应，提高打印的软骨-骨-骨髓复合组织存活性。
附图说明
图1为本发明的血管化软骨--骨骨髓复合组织胚体的结构示意图；
图2为本发明的血管化软骨--骨骨髓复合组织的结构示意图；
图3为本发明软、硬材料错层打印的一种实施例；
图4为本发明的生物无损刻蚀技术的分级刻蚀的步骤示意图。
具体实施方式
本实施例公开了一种基于生物3D打印制备软骨-骨-骨髓复合组织的方法，包括如下步骤：
1、生物信息采集与建模：
1）通过优化骨结构影像采集方法，运用灌注铸型和组学三维截面重建技术，个性化采集人胫骨平台的骨骺端的内外部结构和血循环管网的三维数据；
2）将采集的生物信息输入计算机软件，将实际组织外观与微环境表达为仿生的多材料、多尺度的几何模型，建立仿生软骨-骨-骨髓及其微血管三维数学模型。
参见图1、图2、图4，所述几何模型包括：
a.软骨区域4
b.密致骨区域6
c.松质骨（骨小梁）区域5
d.骨小梁中间的营养孔隙区域8
e.血管壁区域7
f.血管腔区域9
g.组织外辅助塑性区域10
2、含细胞的生物墨水的配制：
购买软骨细胞、成骨细胞、间充质干细胞、血管内皮细胞等。
1）软骨细胞：接枝TGF-β1的甲基丙烯酸酯明胶，其中TGF-β1的浓度为120ng/ml，甲基丙烯酸酯明胶的固含量为10%，细胞密度：2×107/ml。
2）成骨细胞、间充质干细胞：接枝BMP-2的甲基丙烯酸酯明胶，其中BMP-2的浓度为50ng/ml，甲基丙烯酸酯明胶的固含量为10%,1×107/ml。
3）血管内皮细胞：接枝VEGF的甲基丙烯酸酯明胶，其中VEGF的浓度为150ng/ml，甲基丙烯酸酯明胶的固含量为10%,细胞密度1×107/ml。
3、硬材料的配制：
将羟基磷灰石和丝素蛋白按照质量1：1比例混合，固含量为50%。
4、铸型剂的配制：
1）温度刻蚀型铸型剂：a. N-异丙基丙烯酰胺; b. 聚丙交酯乙交酯-聚乙二醇-聚丙交酯乙交酯; c.普郎尼克 F-127；
配制的聚N-异丙基丙烯酰胺和聚丙交酯乙交酯-聚乙二醇-聚丙交酯乙交酯溶液浓度为120mg/ml，在打印前将其储存在4℃冰箱中，使其保持液体状态。
2）光刻蚀型铸型剂：聚(乙烯醇)/环氧丙氧基香豆素水凝胶，固含量10%。
3）酶刻蚀型铸型剂：纤维蛋白，固含量10%。
5、3D打印：
1）喷头
3D打印机装配有多个喷头，其中
第一喷头为带有波长为365nm的紫外光源的喷墨式喷头，喷出含有软骨细胞的生物墨水。
第二喷头为带有波长为365nm的紫外光源的喷墨式喷头，喷出含有成骨细胞、间充质干细胞的生物墨水。
第三喷头为带有波长为365nm的紫外光源的喷墨式喷头，喷出含有血管内皮细胞的生物墨水。
第四喷头为挤压式喷头，挤出不含细胞的羟基磷灰石/丝素蛋白，该喷头可加热至150℃；
第五、第七喷头为喷墨式喷头，可喷出不含细胞的N-异丙基丙烯酰胺、聚丙交酯乙交酯-聚乙二醇-聚丙交酯乙交酯和普郎尼克 F-127的铸型剂，该喷头可保持4℃；
第六喷头为带有365nm/254nm的紫外光源的喷墨式喷头，可喷出聚(乙烯醇)/环氧丙氧基香豆素水凝胶、纤维蛋白和凝血酶。其中，365nm紫外光用于打印过程生物墨水的塑性固化，254nm紫外光用于刻蚀阶段去除铸型剂。
2）打印前准备：对打印机所在环境和打印舱室进行紫外光消毒1h。打开控制3D打印机的软件，载入之前建立的数学几何模型；
3）装载：将生物墨水、硬材料和铸型剂分别加入对应喷头；
4）喷出：各个喷头按照程序设定轮流喷出液滴，其中第一喷头打印软骨区域4；第二喷头打印松质骨（骨小梁）区域5，第三喷头打印血管壁区域7，第四喷头打印密致骨区域6，第五喷头打印骨小梁中间的营养孔隙区域8，第六喷头打印血管腔区域9，第七喷头打印组织外辅助塑性区域10。
其中，骨小梁中间的营养孔隙区域的铸型剂为N-异丙基丙烯酰胺，血管腔区域的铸型剂为纤维蛋白，或聚丙交酯乙交酯-聚乙二醇-聚丙交酯乙交酯(PLGA-PEG-PLGA),或普朗尼克 F-127。
5）打印流程：
墨水打印体积平均速度≥ 0.015ml/s，细胞数量≥12000 个/s，相邻细胞层间距≤0.2mm；
其中，墨水打印体积平均速度≥ 0.015ml/s，墨水打印体积平均速度指平均一秒钟内从喷头中喷到打印对象上的墨水体积，墨水打印体积平均速度用于控制打印的总时间。墨水打印细胞平均速度≥10000 个/s，墨水打印细胞平均速度指平均一秒钟内从喷头中喷到打印对象上的细胞数量，这个参数用于控制打印的坯体中细胞的密度。并且要求打印的细胞间的间距（细胞间的间距包括同一种细胞的间距以及不同细胞间的间距）≤ 0.2mm，这个参数用于控制打印的精度和打印的坯体中细胞的密度。通过上述3个条件可以确定喷头的口径以及生物墨水中细胞的密度。
打印分阶段进行，分别长、中、短周期。
长周期：整个软骨-骨-骨髓复合组织的打印周期。
中周期：为初始基础打印周期，设定一个中周期打印高度，打印过程中将硬材料1、铸型剂2、生物墨水3打印出有高差的错层基础，使后续的硬材料1、铸型剂2、生物墨水3的分别打印互不干涉。
短周期：为层打印周期。
参见图3，中周期打印过程是首先进行硬材料1的初始基础打印，将硬材料1打印到一定的高度后，进行铸型剂2基础打印，将铸型剂2打印到一定高度且低于硬材料1的初始打印高度时，再进行生物墨水3的基础打印，将生物墨水3打印到一定高度且低于铸型剂2高度时，使硬材料1、铸型剂2、生物墨水3之间形成有高差的错层基础。然后在此基础上按照硬材料1、铸型剂2、生物墨水3的先后顺序依次进行短周期打印，直至长周期的整个打印过程结束。
本实施例中，将中周期的硬材料1打印高度设定为180um，铸型剂2打印高度设定为120um，生物墨水3打印高度设定为60um，短周期的打印高度设定为60um，打印过程中运用错层打印工艺：首先将硬材料1打印到高度180um，再将铸型剂2打印打印到高度120um，然后在硬材料1和铸型剂2之间进行生物墨水打印，生物墨水打印到高度60um后即完成初始基础打印周期。随后按设定的短周期的打印高度依照硬材料1、铸型剂2、生物墨水3的先后顺序依次进行短周期打印，直至整个软骨-骨-骨髓复合组织的长周期打印过程结束。本实施例的单层打印的高度为20um，以适合单细胞打印。即首先进行初始基础硬材料的打印，硬材料打印到9层后进行铸型剂打印，铸型剂打印到6层后进行生物墨水的打印，生物墨水打印到3层后形成有高差的错层基础，然后按照硬材料、铸型剂、生物墨水的先后顺序每次各打印3层，直至最后将硬材料、铸型剂、生物墨水都按需要打印的软骨-骨-骨髓复合组织建模的生物信息打印完成。
6）固化：生物墨水和聚(乙烯醇)/环氧丙氧基香豆素水凝胶在365nm波长紫外光作用下固化；聚N-异丙基丙烯酰胺、聚丙交酯乙交酯-聚乙二醇-聚丙交酯乙交酯溶液和羟基磷灰石/丝素蛋白在打印平台上37℃固化；纤维蛋白在凝血酶作用下固化。
7）营养供应：在打印在生物3D打印机在组织工程仿生培养器中的打印平台上进行3D打印，在整个长周期中承载打印组织的平台会随着打印过程逐渐下降，将以固化成型的组织部分浸入组织工程仿生培养器中灌注的37℃的完全培养液中，打印组织与培养液的液面始终保持一定的高度差，该高度差应保持在500um或500um以上，组织工程仿生培养器的灌流系统对培养液的氧含量、pH进行监控，并不断进行循环、更新。
5、刻蚀成型：
采用分级刻蚀手段，按照组织发育的成熟速度，在不同阶段采用不同的手段分别去除用于辅助组织塑性的第一铸型剂、用于营养孔隙成型的第二铸型剂以及用于血管腔成型的第三铸型剂，得到有血管网和营养孔隙的软骨-骨-骨髓复合组织。
参见图4，打印完成后，进行分级刻蚀，具体步骤为：
1）打印完成后2小时，通过254nm的紫外光降解祛除组织外辅助塑性区域的铸型剂21，如聚(乙烯醇)/环氧丙氧基香豆素水凝胶。当然铸型剂21也可采用含香豆素基团的四臂聚乙二醇水凝胶、含胸腺嘧啶的聚丙烯酰胺水凝胶、含o-NB基团的单丙烯酸聚乙二醇水凝胶等。然后通过降温到25℃祛除营养孔隙区域的铸型剂22，如N-异丙基丙烯酰胺，以形成营养孔隙；
2）经过2-4天细胞生长与融合的过程，在培养基中加入纤溶酶祛除外周血管腔区域的铸型剂23，如纤维蛋白原、海藻酸盐水凝胶等；
3）培养第6-8天，通过降温到4℃祛除中间血管腔区域的铸型剂24，如聚丙交酯乙交酯-聚乙二醇-聚丙交酯乙交酯(PLGA-PEG-PLGA)；
4）培养第10-12天，通过降温到1℃祛除内部血管腔区域的铸型剂25，如普朗尼克 F-127，形成完整血管网，完成血管化软骨-骨-骨髓复合组织的制备。
本发明的几种铸型剂可以根据实际情况进行选择，不限于哪一种，只要选择的几种铸型剂的去除手段不同即可。根据选择的铸型剂则可以用对应的手段去除，如通过酶或螯合反应或温控或光照的手段等去除。
6、体外培养：
让刻蚀成型的有血管网和营养孔隙的软骨-骨-骨髓复合组织浸入组织工程仿生培养器灌注的培养液中进行培养，使软骨-骨-骨髓复合组织能够通过与灌注在组织工程仿生培养器中的培养液接触获取营养；并将软骨-骨-骨髓复合组织血管网的在组织的出口处汇集成的主血管，将主血管两端在组织外用PLCL/胶原制成的人工血管11进行接枝，通过人工血管11与培养液输送管连接，在脉动泵的作用下对软骨-骨-骨髓复合组织的血管网进行循环灌流培养，血管网内部的细胞接触到培养液的机会大大增加，内部的血管壁结构的形成也得到极大提高，然后在智能化仿生组织培育系统内连续循环灌注培养60天，实现软骨-骨-骨髓复合组织的预成熟。
采用本发明的方法在构建好骨组织后，进行体内移植实验进行验证，将打印组织移植至动物胫骨平台关节缺损部位，固定后，将人工血管的一段接至胫动脉，另一端接至胫静脉，随后关闭手术伤口，试验证明，采用本发明的方法构建的软骨-骨-骨髓复合组织可以在体内实现移植物长期体内存活。
如果使用提取的胫骨平台粉碎性骨折患者的自体软骨、成骨、间充质干、血管内皮等原代细胞在体外培养、扩增，然后采用本发明的方法构建骨组织，那么可以解决使用异体细胞植入导致的排异反应问题。
本发明还公开了一种基于生物3D打印的软骨-骨-骨髓复合组织结构，包括由软骨组织、密致骨组织、松质骨组织构成的软骨-骨-骨髓复合组织，以及位于软骨-骨-骨髓复合组织内的血管网，该所述软骨组织由含软骨细胞的生物墨水通过3D打印成型，所述松质骨组织由含成骨细胞、间充质干细胞的生物墨水通过3D打印成型，所述密致骨组织由硬材料通过3D打印成型，所述松质骨组织设有营养孔隙，所述松质骨组织内的营养孔隙由铸型剂通过3D打印成型后再经刻蚀形成，所述血管网的血管管壁由含血管内皮细胞的生物墨水通过3D打印成型，所述血管网的血管管壁内由铸型剂通过3D打印成型有血管管腔成型支撑体，所述血管管壁内的血管管腔成型支撑体经刻蚀后形成血管管腔。所述血管网的血管管壁内的血管管腔成型支撑体分部位由不同的铸型剂分别通过3D打印成型，血管管腔成型支撑体由不同的铸型剂成型的各部分分阶段经对应的手段刻蚀后形成血管管腔。
本发明不仅仅局限于上述实施例，在不背离本发明技术方案原则精神的情况下进行些许改动的技术方案，应落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种基于活细胞3D打印软骨-骨-骨髓复合组织的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）建模：
采集需要打印的软骨-骨-骨髓复合组织的生物信息，输入计算机进行仿生建模，建立的几何模型包括软骨区域、密致骨区域、松质骨区域、松质骨中间的营养孔隙区域、血管壁区域、血管腔区域、组织外辅助塑性区域；
2）配料：
准备构建软骨-骨-骨髓复合组织所需的各种细胞，配制适用构建软骨-骨-骨髓复合组织所需的各种细胞的液态可固化水凝胶材料载体，将构建软骨-骨-骨髓复合组织所需的各种细胞按设定的密度分别接种于相应的液态可固化水凝胶材料载体中，配制含细胞的各种生物墨水，同时，配制用于打印软骨-骨-骨髓复合组织的密致骨区域的硬材料，以及配制用于打印组织外辅助塑性区域的第一铸型剂，配制用于打印松质骨中间的营养孔隙区域的第二铸型剂，配制用于打印血管腔区域的第三铸型剂；
3）3D打印制备软骨-骨-骨髓复合组织坯体：
将步骤1)建好的模型数据输入生物3D打印机的配套设备中，设置打印程序，将步骤2)中配制的铸型剂、硬材料以及含细胞的生物墨水分别装载到生物3D打印机的各料仓中，生物3D打印机在组织工程仿生培养器中的打印平台上进行3D打印，生物3D打印机的多个喷头按照设定的打印程序轮流喷出或挤出液体进行3D打印，喷出或挤出的液体分别在相应的条件下固化，其中，用第一铸型剂打印组织外辅助塑性区域，用第二铸型剂打印松质骨中间的营养孔隙区域，用第三铸型剂打印血管腔区域，用含软骨细胞的生物墨水打印软骨-骨-骨髓复合组织的软骨区域，用含成骨细胞和间充质干细胞的生物墨水打印软骨-骨-骨髓复合组织的松质骨区域，用含血管内皮细胞的生物墨水打印血管壁区域，用硬材料打印软骨-骨-骨髓复合组织的密致骨区域，形成软骨-骨-骨髓复合组织坯体；
4 ) 刻蚀成型：
分级刻蚀，在不同阶段采用不同的手段分别去除用于辅助组织塑性的第一铸型剂、用于营养孔隙成型的第二铸型剂以及用于血管腔成型的第三铸型剂，得到有血管网和营养孔隙的软骨-骨-骨髓复合组织；
5 )体外培养：
让刻蚀成型的有血管网和营养孔隙的软骨-骨-骨髓复合组织浸入组织工程仿生培养器灌注的培养液中进行培养，并将软骨-骨-骨髓复合组织血管网的主血管与培养液输送管连接进行循环灌流培养，实现软骨-骨-骨髓复合组织的预成熟。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：打印过程中将硬材料、铸型剂、生物墨水进行错层打印，使硬材料、铸型剂、生物墨水的打印过程互不干涉。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：将步骤3）的打印过程分为长周期、中周期、短周期，其中，长周期为整个软骨-骨-骨髓复合组织的打印周期，中周期为初始基础打印周期，短周期层打印周期；中周期打印过程是首先进行硬材料的基础打印，将硬材料打印到一定的高度后，进行铸型剂基础打印，将铸型剂打印到一定高度且低于硬材料的初始打印高度时，再进行生物墨水的基础打印，将生物墨水打印到一定高度且低于铸型剂高度时，使硬材料、铸型剂、生物墨水之间形成有高差的错层基础，然后在此基础上按照硬材料、铸型剂、生物墨水的先后顺序依次交错进行短周期打印，直至长周期的整个打印过程结束。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：分级刻蚀去除铸型剂的手段采用酶或螯合反应或温控或光照。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述液态可固化水凝胶材料载体可采用对细胞友好的天然大分子材料，如甲基丙烯酸酯明胶、丙烯酸酯透明质酸中的一种或几种，使细胞可在生物墨水中存活。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：硬材料为强度较高的材料，如为羟基磷灰石、聚ε - 己内酯（PCL）、丝素蛋白中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述铸型剂采用可控降解高分子材料，用于填充打印时的空腔和在打印组织的外部支架，发挥填充占位、暂时支撑和塑性的作用，保证打印空腔结构及大体积组织结构不会塌陷，只在打印过程中存在，打印后刻蚀祛除。
8.一种基于活细胞3D打印的软骨-骨-骨髓复合组织结构，其特征在于，包括由软骨组织、密致骨组织、松质骨组织和组织内血管网构成的软骨-骨-骨髓复合组织，所述软骨组织由含软骨细胞的生物墨水通过3D打印成型，所述松质骨组织由含成骨细胞、间充质干细胞的生物墨水通过3D打印成型，所述松质骨组织内设有营养孔隙，所述松质骨组织内的营养孔隙由铸型剂通过3D打印成型后再经刻蚀形成，所述密致骨组织由硬材料通过3D打印成型，所述血管网的血管管壁由含血管内皮细胞的生物墨水通过3D打印成型，所述血管网的血管管壁内由铸型剂通过3D打印成型有血管管腔成型支撑体，所述血管管壁内的血管管腔成型支撑体经刻蚀后形成血管管腔。
9.根据权利要求8所述的基于活细胞3D打印的软骨-骨-骨髓复合组织结构，其特征在于：所述血管网的血管管壁内的血管管腔成型支撑体分部位由不同的铸型剂分别通过3D打印成型，血管管腔成型支撑体由不同的铸型剂成型的各部分分阶段经对应的手段刻蚀后形成血管管腔。
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