CN115382021A - 一种复合人工软骨支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种复合人工软骨支架及其制备方法，涉及医用生物材料技术领域，制备方法包括如下步骤：以哺乳动物的软骨为原料，制备软骨溶液；以哺乳动物的松质骨为原料，制备脱钙骨；将羟基磷灰石/透明质酸复合溶液灌注入脱钙骨的孔隙结构中，得到固体复合脱钙骨；对固体复合脱钙骨进行冷冻干燥，得到复合脱钙骨材料；将软骨溶液与复合脱钙骨材料混合，得到复合材料样品；对复合材料样品进行冷冻干燥，得到干态的复合材料样品；对干态的复合材料样品进行交联，得到复合人工软骨支架。本发明提供的复合人工软骨支架的制备方法，可以使所获得的复合人工软骨支架能够分层生长，且于不同分层获得不同的软骨功能，最终实现天然软骨结构和功能的重现。
Description
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域，具体而言，涉及一种复合人工软骨支架及其制备方法。
背景技术
关节软骨为覆盖关节面的一层闪亮的结缔组织，绝大部分关节软骨均为透明软骨，其功能为传导及分布载荷，其富有弹性并具有良好的润滑作用，可以吸收震荡，维持能承受的接触应力。
透明软骨由10％～15％的蛋白质多糖、10％～15％的胶原和70％～80％的水分组成，其中胶原主要为Ⅱ型胶原蛋白，蛋白质多糖主要以透明质酸、硫酸软骨素为主，结合有连锁蛋白、硫酸角质素等成分共同组成蛋白质多糖聚合体。软骨细胞包埋于软骨基质陷窝内，Ⅱ型胶原蛋白相互连接形成胶原纤维，纤维排列紧密且留有可供营养物质和代谢产物通过的孔隙。这些孔隙允许较小的物质如离子、葡萄糖、水等物质的进出，但不允许大分子物质如蛋白质多糖聚合体、大分子透明质酸等成分进出。因此，一旦软骨的结构发生病变，如胶原纤维排列、纤维破裂等情况发生，很难彻底治愈。
目前所见的关节软骨损伤多为骨软骨性骨折造成的裂纹或缺损。成年人的透明软骨正常情况下无血液供给，如若关节软骨发生病变，如骨性关节炎或软骨软化，血管经软骨下骨板进入未钙化的透明软骨中，会导致透明软骨组织发生严重破坏且难以自愈。此时最有效的治疗方式是彻底除去受损软骨部分，然后移植新的软骨替代材料于受损部分，促进软骨分层愈合，最终实现软骨的重建。
而目前所常见的软骨替代材料，大多为单一成分构建而成，如软骨凝胶、软骨溶液、软骨海绵等，这些成分均一的材料移植入患者软骨缺损部位时，很难诱导患者自身软骨能够分层生长，并在不同分层获得其本身所需的结构和功能。
发明内容
本发明解决的问题是现有的软骨替代材料难以诱导患者自身软骨分层生长。
为解决上述问题，本发明提供一种复合人工软骨支架的制备方法，包括如下步骤：
S1：以哺乳动物的软骨为原料，进行软骨溶液化，制备软骨溶液；
S2：以哺乳动物的松质骨为原料，通过化学处理，制备脱钙骨；
S3：将羟基磷灰石/透明质酸复合溶液灌注入所述脱钙骨的孔隙结构中，冷冻，得到固体复合脱钙骨；
S4：对所述固体复合脱钙骨进行冷冻干燥，得到复合脱钙骨材料；
S5：将所述软骨溶液与所述复合脱钙骨材料混合，冷冻，得到复合材料样品；
S6：对所述复合材料样品进行冷冻干燥，得到干态的复合材料样品；
S7：对所述干态的复合材料样品进行交联，清洗，冷冻干燥，得到复合人工软骨支架。
可选地，步骤S1包括：
S11：取哺乳动物的软骨，去除所述软骨表面的肉及骨膜，使用纯化水对获得的软骨进行清洗，得到前处理后的软骨材料；
S12：对所述前处理后的软骨材料切碎制成软骨碎块，再对所述软骨碎块进行脱细胞处理，得到脱细胞后的软骨材料；
S13：将所述脱细胞后的软骨材料于-20℃冷冻，随后置于真空冷冻干燥机将其冷冻干燥制成干态软骨材料；
S14：将所述干态软骨材料粉碎，得到软骨粉末；
S15：将所述软骨粉末与胃蛋白酶消化液进行混合，再将PH值调节至中性，得到半成品软骨溶液；
S16：对所述半成品软骨溶液进行离心处理，取上清液，于-20℃冷冻，随后进行冷冻干燥处理，得到海绵状软骨材料；
S17：将所述海绵状软骨材料裁剪至碎块，加入纯化水溶解后，再加入透明质酸、硫酸软骨素混合，得到所述软骨溶液。
可选地，对所述软骨碎块进行脱细胞处理包括：依次使用胰酶溶液、盐酸溶液对所述软骨碎块进行消化，再使用SDS溶液处理消化后的所述软骨碎块，使用纯化水对所述软骨碎块进行清洗，得到脱细胞后的软骨材料。
可选地，使用胰酶溶液对所述软骨碎块进行消化包括：使用质量分数为0.25％的胰酶溶液对所述软骨碎块进行消化，于37℃在气浴恒温震荡箱中，以转速120rpm，震荡3h。
可选地，使用盐酸溶液对所述软骨碎块进行消化包括：配制质量分数1％的盐酸溶液消化所述软骨碎块，于室温下在气浴恒温震荡箱中，以转速160rpm，震荡2h。
可选地，使用SDS溶液处理消化后的所述软骨碎块包括：使用质量分数1％的SDS溶液处理所述软骨碎块，于室温下在气浴恒温震荡箱中，以转速160rpm，震荡16h。
可选地，步骤S15中胃蛋白酶消化液的质量分数为0.5％。
可选地，步骤S2包括：
S21：取哺乳动物的松质骨，裁切，使用纯化水进行清洗，得到前处理后的松质骨；
S22：使用SDS溶液处理所述前处理后的松质骨以除去细胞，得到脱细胞后的松质骨；
S23：使用NaOH-乙醇脱脂液对所述脱细胞后的松质骨进行脱脂，得到脱脂后的松质骨；
S24：使用纯化水对所述脱脂后的松质骨进行清洗后，使用甲酸溶液进行脱钙，再使用纯化水进行清洗，得到所述脱钙骨。
可选地，步骤S7中的交联为化学交联。
本发明的另一目的在于提供一种复合人工软骨支架，通过如上所述的复合人工软骨支架的制备方法进行制备。
与现有技术相比，本发明提供的复合人工软骨支架的制备方法具有如下优势：
本发明提供的复合人工软骨支架的制备方法，可以使所获得的复合人工软骨支架能够分层生长，且于不同分层获得不同的软骨功能，最终实现天然软骨结构和功能的重现；该方法所获得的复合人工软骨支架的使用可以为医生提供一种更加便利的植入方法，减少患者的痛苦与手术过程的风险。
附图说明
图1为本发明中软骨溶液浓度与冻干后软骨层孔隙大小的对比柱状图；
图2为本发明实施例1制备的复合人工软骨支架复水后的弹性表现；
图3为本发明实施例1制备的复合人工软骨支架复水后的形态；
图4为本发明实施例1制备的复合人工软骨支架的宏观表面；
图5为本发明实施例1制备的脱钙骨的扫描电镜图一(2500倍镜下)；
图6为本发明实施例1制备的软骨层的扫描电镜图一(2500倍镜下)；
图7为本发明实施例1制备的脱钙骨的扫描电镜图二(100倍镜下)；
图8为本发明实施例1制备的软骨层的扫描电镜图二(100倍镜下)。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中表示，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为解决现有的软骨替代材料难以诱导患者自身软骨分层生长的问题，本发明提供一种复合人工软骨支架的制备方法，包括如下步骤：
S1：以哺乳动物的软骨为原料，进行软骨溶液化，制备软骨溶液；
S2：以哺乳动物的松质骨为原料，通过化学处理，制备脱钙骨；
S3：将羟基磷灰石/透明质酸复合溶液灌注入脱钙骨的孔隙结构中，冷冻，得到固体复合脱钙骨；
S4：对固体复合脱钙骨进行冷冻干燥，得到复合脱钙骨材料；
S5：将软骨溶液与复合脱钙骨材料混合，冷冻，得到复合材料样品；
S6：对复合材料样品进行冷冻干燥，得到干态的复合材料样品；
S7：对干态的复合材料样品进行交联，清洗，冷冻干燥，得到复合人工软骨支架。
本申请优选哺乳动物选自猪、牛、羊中的一种；由于脱钙骨本身孔隙结构大，虽然有良好的力学强度，但孔径过大，无法有效接种包括干细胞在内的各种细胞，加入羟基磷灰石/透明质酸复合溶液可以缩小脱钙骨过大的孔隙，并且创造有利于成骨的环境，得到的复合脱钙骨作为软骨底层有利于细胞、营养物质的进入与生长；软骨溶液具有一定的粘稠度，可以进入复合脱钙骨表层而不会深入复合脱钙骨较深层，形成脱钙骨层和软骨层，同时脱钙骨层与软骨层交融处形成缓冲层，从而可以营造出三层软骨复合结构，即脱钙骨层-缓冲层-软骨层，可以保证最终获得的复合人工软骨支架层次明显且结合牢固，更符合天然软骨本身的软骨层次结构；软骨溶液化后制成凝胶结合于脱钙骨外侧，更符合天然软骨组成，且复合脱钙骨材料作内侧，软骨凝胶作外侧可以避免纯软骨凝胶营养物质及细胞较难进入最深层而造成“死核”的现象。
本申请优选步骤S3的复合溶液中，羟基磷灰石的质量浓度范围1％～30％，透明质酸的质量浓度范围0.1％～2％，并进一步优选复合溶液与脱钙骨的质量比范围为(1～30):1；优选步骤S5中软骨溶液与复合脱钙骨材料的质量比范围为(6～60):1。
此外，现有的大部分软骨替代材料本身质地坚硬或者过于柔软，需要镶嵌或缝合使替代材料能够牢固结合在软骨缺损部位，这为患者带来了不必要的痛苦，也极大复杂了相关手术操作的困难与风险。而本申请提供的复合人工软骨支架，由于复合脱钙骨与软骨凝胶本身质软，有弹性，本申请提供的复合人工软骨支架可以通过挤压减少其体积后移植入患者的软骨缺损部位，释放对复合人工软骨支架施加的外部压力后复合人工软骨支架本身会发生膨胀，可以很好的嵌入患者软骨缺损部位，免去缝合给患者带来的不便和痛苦。
本申请以哺乳动物的软骨、松体骨以及羟基磷灰石/透明质酸复合溶液为原料，制备的复合人工软骨支架，复合脱钙骨和软骨水凝胶中含有不同的促细胞生长因子，干细胞进入人工软骨的不同层次时可以受到诱导分化为不同种类的软骨细胞；通过材料本身的生长因子，添加或改变额外的生长因子成分及比例可以使细胞分化和组织形成变得可控，最终实现复合天然软骨内组成的人工软骨。
本发明提供的复合人工软骨支架的制备方法，可以使所获得的复合人工软骨支架能够分层生长，且于不同分层获得不同的软骨功能，最终实现天然软骨结构和功能的重现；该方法所获得的复合人工软骨支架的使用可以为医生提供一种更加便利的植入方法，减少患者的痛苦与手术过程的风险。
为制备软骨溶液，本申请优选步骤S1包括：
S11：取哺乳动物的软骨，去除软骨表面的肉及骨膜，使用纯化水对获得的软骨进行清洗，得到前处理后的软骨材料；
具体的，本申请优选使用刀具去除软骨表面的肉及骨膜，以获得洁白软骨材料为处理目标，要求其表面无任何肉质残渣和微粉色的骨膜残留；使用纯化水对获得的软骨材料进行清洗，首先使用流水冲洗至软骨洁净，随后使用纯化水在气浴恒温震荡箱中于37℃，转速为200r震荡清洗4次，每次30分钟，优选料液比为1：10；
S12：对前处理后的软骨材料切碎制成软骨碎块，再对软骨碎块进行脱细胞处理，得到脱细胞后的软骨材料；本申请优选软骨碎块的体积范围为0.125mm3～8mm3。
S13：将脱细胞后的软骨材料于-20℃冷冻，优选冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机将其冷冻干燥制成干态软骨材料；优选冷冻干燥条件为真空度≤20pa，温度≤-60℃；
S14：将干态软骨材料粉碎，得到软骨粉末；优选软骨粉末的粒径范围为0.001mm3～1mm3；
S15：将软骨粉末与胃蛋白酶消化液进行混合，优选软骨粉末与胃蛋白酶消化液的质量比范围为1:(20～200)；再将pH值调节至中性，优选使用质量分数为2％的氢氧化钠溶液来对pH值进行调节，得到半成品软骨溶液；
本申请优选该胃蛋白酶消化液由胃蛋白酶粉末溶于醋酸溶液配制而成，醋酸溶液调至pH值为2～3，并进一步优选胃蛋白酶消化液的质量分数为0.5％；
本申请优选使用超声溶解仪对软骨粉末与胃蛋白酶消化液进行混合后得到的混合液进行辅助溶解，超声波频率20Khz，功率1000W，振幅
，震荡3min暂停2min；重复该操作6～10次，直至溶液均匀无固体残留；
S16：对半成品软骨溶液进行离心处理，取上清液，于-20℃冷冻，随后进行冷冻干燥处理，得到海绵状软骨材料；
本申请优选使用高速离心机对半成品软骨溶液进行离心处理，离心机离心力15000g，处理20min；取上清液加入平皿或其他容器中，置于-20℃冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机上进行冷冻干燥处理，优选冷冻干燥条件为真空度≤20pa，温度≤-60℃；处理时长大于18h，冻干后材料为海绵状软骨材料；
S17：将海绵状软骨材料裁剪至碎块，优选碎块的体积范围为0.125mm3～1cm3；加入纯化水溶解后，再加入透明质酸、硫酸软骨素混合，得到软骨溶液，并优选安软骨溶液中透明质酸的质量范围为0.1％～2％，硫酸软骨素的质量范围为1％～20％。
本申请通过步骤S16中的离心处理可以除去溶液中所含杂质，冻干得到海绵状软骨材料后，再用水溶解所获得的软骨溶液的浓度可调节至远高于步骤S15得到的半成品软骨溶液的浓度，且通过调节软骨溶液的浓度可以获得不同孔隙大小、不同孔隙密度的软骨层，从而有助于进一步扩大应用的灵活性。
通过软骨溶液所获得的复合人工软骨支架相对于通过步骤S15中半成品软骨溶液所获得的的复合人工软骨支架而言，孔隙结构更小，孔隙率更高，更有利于细胞的依附生长，相对于自然软骨来说，孔隙结构较大，更易于细胞、营养物质的进入。
本申请优选步骤S12中对软骨碎块进行脱细胞处理包括：依次使用胰酶溶液、盐酸溶液对软骨碎块进行消化，再使用SDS溶液处理消化后的软骨碎块，使用纯化水对软骨碎块进行清洗，得到脱细胞后的软骨材料。
具体的，使用胰酶溶液对软骨碎块进行消化包括：使用质量分数为0.25％的胰酶溶液对软骨碎块进行消化，其中胰酶溶液与软骨碎块质量比范围为(20～200):1；于37℃在气浴恒温震荡箱中，以转速120rpm，震荡3h。
使用盐酸溶液对软骨碎块进行消化包括：配制质量分数1％的盐酸溶液消化软骨碎块，盐酸溶液与软骨碎块质量比范围为(20～200):1于室温下在气浴恒温震荡箱中，以转速160rpm，震荡2h。
使用SDS溶液处理消化后的软骨碎块包括：使用质量分数1％的SDS溶液处理软骨碎块，SDS溶液与软骨碎块质量比范围为(20～200):1；于室温下在气浴恒温震荡箱中，以转速160rpm，震荡16h。
本申请优选依次使用胰酶溶液对软骨碎块进行消化、使用盐酸溶液对软骨碎块进行消化、使用SDS溶液处理软骨碎块一次为一个循环，重复5次循环即可脱除软骨中的细胞成分，每一步骤之间室温下进行，使用纯化水对材料清洗两次，每次清洗时长30min，160rpm。
本申请优选步骤S2包括：
S21：取哺乳动物的松质骨，裁切，使用纯化水进行清洗，得到前处理后的松质骨；
具体的，取哺乳动物，如猪的股骨近端、远端松质骨，使用纯化水对获得的松质骨流水冲洗洁净，随后裁切松质骨至略大于所需成品尺寸，随后使用纯化水在气浴恒温震荡箱中室温下，转速为200rpm震荡清洗4次，每次30min；
S22：使用SDS溶液处理前处理后的松质骨以除去细胞，得到脱细胞后的松质骨；
优选SDS溶液的质量分数为1％，优选步骤S22为：使用质量分数1％的SDS溶液处理前处理后的松质骨以除去细胞，SDS溶液与软骨碎块的质量比范围为(20～200):1；气浴恒温震荡箱中室温下，转速为160rpm，震荡16h；
S23：使用NaOH-乙醇脱脂液对脱细胞后的松质骨进行脱脂，得到脱脂后的松质骨；
本申请优选该步骤为：使用质量分数为2％的NaOH-乙醇脱脂液对脱细胞后的松质骨进行脱脂，NaOH-乙醇脱脂液与软骨碎块的质量比范围为(20～200):1，室温下，转速为160rpm，震荡24h；
S24：使用纯化水对脱脂后的松质骨进行清洗后，使用甲酸溶液进行脱钙，再使用纯化水进行清洗，得到脱钙骨；
具体的，该步骤包括：使用纯化水对脱脂后的松质骨清洗4次，每次清洗时长30min，室温下，160rpm；使用质量分数为10％的甲酸溶液脱钙，甲酸溶液与软骨碎块的质量比范围为(20～200):1；气浴恒温震荡箱中4℃，转速为100rpm，震荡72h；使用纯化水对脱钙后的松质骨进行清洗4次，每次清洗时长1h30min，室温下，160rpm，随后获得洁净的脱钙骨。
本申请优选步骤S7中的交联为化学交联，具体的，优选使用质量分数为3％的碳二亚胺溶液对所获得的干态的复合材料样品进行交联24h。
本申请优选步骤S7中对干态的复合材料样品进行交联后，对交联后材料使用纯化水在气浴恒温震荡箱中室温下，转速为160rpm，清洗48h，每3h进行换液处理；将清洗后的样品置于-20℃冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，得到复合人工软骨支架。
本申请优选步骤S7中的冷冻干燥条件为真空度≤20pa，温度≤-60℃。
本发明的另一目的在于提供一种复合人工软骨支架，该复合人工软骨支架通过如上所述的复合人工软骨支架的制备方法进行制备。
本发明提供的复合人工软骨支架，能够分层生长，且于不同分层获得不同的软骨功能，最终实现天然软骨结构和功能的重现；该复合人工软骨支架的使用可以为医生提供一种更加便利的植入方法，减少患者的痛苦与手术过程的风险。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
实施例1
本实施例提供一种复合人工软骨支架的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
S11：取猪的软骨，使用刀具去除软骨表面的肉及骨膜，以获得洁白软骨材料为处理目标，要求其表面无任何肉质残渣和微粉色的骨膜残留；使用纯化水对获得的软骨材料进行清洗，首先使用流水冲洗至软骨洁净，随后使用纯化水在气浴恒温震荡箱中于37℃，转速为200r震荡清洗4次，每次30分钟，优选料液比为1：10，得到前处理后的软骨材料；
S12：对前处理后的软骨材料切碎制成软骨碎块(碎块大小为0.125mm3～8mm3)，使用200g质量分数0.25％的胰酶溶液对5g软骨材料进行消化，在气浴恒温震荡箱中37℃，转速为120rpm，震荡3h；
配制质量分数1％的盐酸溶液，使用200g盐酸溶液对5g软骨材料进行消化，在气浴恒温震荡箱中室温下，转速为160rpm，震荡2h；
使用200g质量分数1％的SDS溶液对5g软骨材料进行处理，气浴恒温震荡箱中室温下，转速为160rpm，震荡16h；
依次使用胰酶溶液对软骨碎块进行消化、使用盐酸溶液对软骨碎块进行消化、使用SDS溶液处理软骨碎块一次为一个循环，重复5次循环脱除软骨中的细胞成分，每一步骤之间室温下进行，使用纯化水对材料清洗两次，每次清洗时长30min，160rpm；最后使用纯化水对软骨材料进行彻底清洗，在气浴恒温震荡箱中室温下，转速为200rpm，震荡清洗4次，共24h；其中前3次每3h更换新鲜的纯化水，第4次纯化水清洗15h，得到脱细胞后的软骨材料；
S13：将脱细胞后的软骨材料置于-20℃的冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机将其冷冻干燥制成干态软骨材料；
S14：使用粉碎机将干态软骨材料粉碎，得到软骨粉末(粒径0.001mm3～1mm3)；
S15：将软骨粉末与质量分数0.5％的胃蛋白酶消化液进行混合；胃蛋白酶消化液由胃蛋白酶粉末溶于醋酸溶液配制而成，醋酸溶液调至PH值为2～3；使用超声溶解仪对混合液进行辅助溶解，超声波频率20Khz，功率1000W，振幅
，震荡3min暂停2min；重复上述操作6～10次，直至溶液均匀无固体残留，使用质量分数2％的NaOH调节pH值至中性，得到半成品软骨溶液；
S16：使用高速离心机对半成品软骨溶液进行离心处理，离心机离心力15000g，处理20min；取上清液加入平皿中，置于-20℃冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机上进行冷冻干燥处理，处理时长19h，冻干后材料为海绵状软骨材料；
S17：将0.5g海绵状软骨材料裁剪至碎块(碎块大小0.125mm3～1cm3)，加入5ml纯化水溶解后，再加入0.05g透明质酸、0.1g硫酸软骨素混合，得到软骨溶液；
S21：取猪股骨近端、远端松质骨，使用纯化水对获得的松质骨流水冲洗洁净，随后裁切松质骨至略大于所需成品尺寸，随后使用纯化水在气浴恒温震荡箱中室温下，转速为200rpm震荡清洗4次，每次30min，得到前处理后的松质骨；
S22：使用质量浓度1％的SDS溶液处理松质骨材料以除去细胞，气浴恒温震荡箱中室温下，转速为160rpm，震荡16h，得到脱细胞后的松质骨；
S23：使用质量浓度2％的NaOH-乙醇脱脂液对脱细胞后的松质骨进行脱脂，室温下，转速为160rpm，震荡24h，得到脱脂后的松质骨；
S24：使用纯化水对脱脂后的松质骨清洗4次，每次清洗时长30min，室温下，160rpm；加入质量浓度10％的甲酸溶液脱钙，气浴恒温震荡箱中4℃，转速为100rpm，震荡72h；再使用纯化水对材料清洗4次，每次清洗时长1h30min，室温下，160rpm，得到脱钙骨；
S3：将获得的洁净脱钙骨修剪成所需的尺寸，随后置于孔板或其他可定型容器中；配制羟基磷灰石/透明质酸复合溶液，将其充分灌注入脱钙骨较大的孔隙结构中；取出与羟基磷灰石/透明质酸复合溶液充分混合的脱钙骨材料，置于-20℃冰箱中冷冻2h，得到固体复合脱钙骨；
S4：对固体复合脱钙骨进行冷冻干燥，得到复合脱钙骨材料；
S5：在复合脱钙骨材料中加入软骨溶液使其结合于复合脱钙骨外表面形成软骨层，将样品置于-20℃冰箱中冷冻4h，得到复合材料样品；
S6：将复合材料样品置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，得到干态的复合材料样品；
S7：使用质量浓度3％的碳二亚胺溶液对所获得的干态的复合材料样品进行交联24h；交联后材料使用纯化水在气浴恒温震荡箱中室温下，转速为160rpm，清洗48h，每3h进行换液处理；将清洗后的样品置于-20℃冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，得到复合人工软骨支架。
对本实施例过程中的中间产品以及最终产品复合人工软骨支架进行性能检测，参见图1～图8所示，本实施例制备的复合人工软骨支架可以通过挤压减少其体积后移植入患者的软骨缺损部位，释放对复合人工软骨支架施加的外部压力后复合人工软骨支架本身会发生膨胀，可以很好的嵌入患者软骨缺损部位，免去缝合给患者带来的不便和痛苦；具有分层复合结构，符合天然软骨本身的软骨层次结构。
实施例2
本实施例提供一种复合人工软骨支架的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
S11：取猪的软骨，使用刀具去除软骨表面的肉及骨膜，以获得洁白软骨材料为处理目标，要求其表面无任何肉质残渣和微粉色的骨膜残留；使用纯化水对获得的软骨材料进行清洗，首先使用流水冲洗至软骨洁净，随后使用纯化水在气浴恒温震荡箱中于37℃，转速为200r震荡清洗4次，每次30分钟，优选料液比为1：10，得到前处理后的软骨材料；
S12：对前处理后的软骨材料切碎制成软骨碎块(碎块大小为0.125mm3～8mm3)，使用200g质量分数0.25％的胰酶溶液对10g软骨材料进行消化，在气浴恒温震荡箱中37℃，转速为120rpm，震荡3h；
配制质量分数1％的盐酸溶液，使用200g盐酸溶液对10g软骨材料进行消化，在气浴恒温震荡箱中室温下，转速为160rpm，震荡2h；
使用200g质量分数1％的SDS溶液对10g软骨材料进行处理，气浴恒温震荡箱中室温下，转速为160rpm，震荡16h；
依次使用胰酶溶液对软骨碎块进行消化、使用盐酸溶液对软骨碎块进行消化、使用SDS溶液处理软骨碎块一次为一个循环，重复5次循环脱除软骨中的细胞成分，每一步骤之间室温下进行，使用纯化水对材料清洗两次，每次清洗时长30min，160rpm；最后使用纯化水对软骨材料进行彻底清洗，在气浴恒温震荡箱中室温下，转速为200rpm，震荡清洗4次，共24h；其中前3次每3h更换新鲜的纯化水，第4次纯化水清洗15h，得到脱细胞后的软骨材料；
S13：将脱细胞后的软骨材料置于-20℃的冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机将其冷冻干燥制成干态软骨材料；
S14：使用粉碎机将干态软骨材料粉碎，得到软骨粉末(粒径0.001mm3～1mm3)；
S15：将软骨粉末与质量分数0.5％的胃蛋白酶消化液进行混合；胃蛋白酶消化液由胃蛋白酶粉末溶于醋酸溶液配制而成，醋酸溶液调至PH值为2～3；使用超声溶解仪对混合液进行辅助溶解，超声波频率20Khz，功率1000W，振幅
，震荡3min暂停2min；重复上述操作6～10次，直至溶液均匀无固体残留，使用质量分数2％的NaOH调节pH值至中性，得到半成品软骨溶液；
S16：使用高速离心机对半成品软骨溶液进行离心处理，离心机离心力15000g，处理20min；取上清液加入平皿中，置于-20℃冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机上进行冷冻干燥处理，处理时长19h，冻干后材料为海绵状软骨材料；
S17：将0.9g海绵状软骨材料裁剪至碎块(碎块大小0.125mm3～1cm3)，加入5ml纯化水溶解后，再加入0.005g透明质酸、0.005g硫酸软骨素混合，得到软骨溶液；
S21：取猪股骨近端、远端松质骨，使用纯化水对获得的松质骨流水冲洗洁净，随后裁切松质骨至略大于所需成品尺寸，随后使用纯化水在气浴恒温震荡箱中室温下，转速为200rpm震荡清洗4次，每次30min，得到前处理后的松质骨；
S22：使用质量浓度1％的SDS溶液处理松质骨材料以除去细胞，气浴恒温震荡箱中室温下，转速为160rpm，震荡16h，得到脱细胞后的松质骨；
S23：使用质量浓度2％的NaOH-乙醇脱脂液对脱细胞后的松质骨进行脱脂，室温下，转速为160rpm，震荡24h，得到脱脂后的松质骨；
S24：使用纯化水对脱脂后的松质骨清洗4次，每次清洗时长30min，室温下，160rpm；加入质量浓度10％的甲酸溶液脱钙，气浴恒温震荡箱中4℃，转速为100rpm，震荡72h；再使用纯化水对材料清洗4次，每次清洗时长1h30min，室温下，160rpm，得到脱钙骨；
S3：将获得的洁净脱钙骨修剪成所需的尺寸，随后置于孔板或其他可定型容器中；配制羟基磷灰石/透明质酸复合溶液，将其充分灌注入脱钙骨较大的孔隙结构中；取出与羟基磷灰石/透明质酸复合溶液充分混合的脱钙骨材料，置于-20℃冰箱中冷冻2h，得到固体复合脱钙骨；
S4：对固体复合脱钙骨进行冷冻干燥，得到复合脱钙骨材料；
S5：在复合脱钙骨材料中加入软骨溶液使其结合于复合脱钙骨外表面形成软骨层，将样品置于-20℃冰箱中冷冻4h，得到复合材料样品；
S6：将复合材料样品置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，得到干态的复合材料样品；
S7：使用质量浓度3％的碳二亚胺溶液对所获得的干态的复合材料样品进行交联24h；交联后材料使用纯化水在气浴恒温震荡箱中室温下，转速为160rpm，清洗48h，每3h进行换液处理；将清洗后的样品置于-20℃冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，得到复合人工软骨支架。
对产品的性能检测内容参照实施例1相关内容。
实施例3
本实施例提供一种复合人工软骨支架的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
S11：取猪的软骨，使用刀具去除软骨表面的肉及骨膜，以获得洁白软骨材料为处理目标，要求其表面无任何肉质残渣和微粉色的骨膜残留；使用纯化水对获得的软骨材料进行清洗，首先使用流水冲洗至软骨洁净，随后使用纯化水在气浴恒温震荡箱中于37℃，转速为200r震荡清洗4次，每次30分钟，优选料液比为1：10，得到前处理后的软骨材料；
S12：对前处理后的软骨材料切碎制成软骨碎块(碎块大小为0.125mm3～8mm3)，使用200g质量分数0.25％的胰酶溶液对1g软骨材料进行消化，在气浴恒温震荡箱中37℃，转速为120rpm，震荡3h；
配制质量分数1％的盐酸溶液，使用200g盐酸溶液对1g软骨材料进行消化，在气浴恒温震荡箱中室温下，转速为160rpm，震荡2h；
使用200g质量分数1％的SDS溶液对1g软骨材料进行处理，气浴恒温震荡箱中室温下，转速为160rpm，震荡16h；
依次使用胰酶溶液对软骨碎块进行消化、使用盐酸溶液对软骨碎块进行消化、使用SDS溶液处理软骨碎块一次为一个循环，重复5次循环脱除软骨中的细胞成分，每一步骤之间室温下进行，使用纯化水对材料清洗两次，每次清洗时长30min，160rpm；最后使用纯化水对软骨材料进行彻底清洗，在气浴恒温震荡箱中室温下，转速为200rpm，震荡清洗4次，共24h；其中前3次每3h更换新鲜的纯化水，第4次纯化水清洗15h，得到脱细胞后的软骨材料；
S13：将脱细胞后的软骨材料置于-20℃的冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机将其冷冻干燥制成干态软骨材料；
S14：使用粉碎机将干态软骨材料粉碎，得到软骨粉末(粒径0.001mm3～1mm3)；
S15：将软骨粉末与质量分数0.5％的胃蛋白酶消化液进行混合；胃蛋白酶消化液由胃蛋白酶粉末溶于醋酸溶液配制而成，醋酸溶液调至PH值为2～3；使用超声溶解仪对混合液进行辅助溶解，超声波频率20Khz，功率1000W，振幅
，震荡3min暂停2min；重复上述操作6～10次，直至溶液均匀无固体残留，使用质量分数2％的NaOH调节pH值至中性，得到半成品软骨溶液；
S16：使用高速离心机对半成品软骨溶液进行离心处理，离心机离心力15000g，处理20min；取上清液加入平皿中，置于-20℃冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机上进行冷冻干燥处理，处理时长19h，冻干后材料为海绵状软骨材料；
S17：将0.1g海绵状软骨材料裁剪至碎块(碎块大小0.125mm3～1cm3)，加入1ml纯化水溶解后，再加入0.02g透明质酸、0.2g硫酸软骨素混合，得到软骨溶液；
S21：取猪股骨近端、远端松质骨，使用纯化水对获得的松质骨流水冲洗洁净，随后裁切松质骨至略大于所需成品尺寸，随后使用纯化水在气浴恒温震荡箱中室温下，转速为200rpm震荡清洗4次，每次30min，得到前处理后的松质骨；
S22：使用质量浓度1％的SDS溶液处理松质骨材料以除去细胞，气浴恒温震荡箱中室温下，转速为160rpm，震荡16h，得到脱细胞后的松质骨；
S23：使用质量浓度2％的NaOH-乙醇脱脂液对脱细胞后的松质骨进行脱脂，室温下，转速为160rpm，震荡24h，得到脱脂后的松质骨；
S24：使用纯化水对脱脂后的松质骨清洗4次，每次清洗时长30min，室温下，160rpm；加入质量浓度10％的甲酸溶液脱钙，气浴恒温震荡箱中4℃，转速为100rpm，震荡72h；再使用纯化水对材料清洗4次，每次清洗时长1h30min，室温下，160rpm，得到脱钙骨；
S3：将获得的洁净脱钙骨修剪成所需的尺寸，随后置于孔板或其他可定型容器中；配制羟基磷灰石/透明质酸复合溶液，将其充分灌注入脱钙骨较大的孔隙结构中；取出与羟基磷灰石/透明质酸复合溶液充分混合的脱钙骨材料，置于-20℃冰箱中冷冻2h，得到固体复合脱钙骨；
S4：对固体复合脱钙骨进行冷冻干燥，得到复合脱钙骨材料；
S5：在复合脱钙骨材料中加入软骨溶液使其结合于复合脱钙骨外表面形成软骨层，将样品置于-20℃冰箱中冷冻4h，得到复合材料样品；
S6：将复合材料样品置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，得到干态的复合材料样品；
S7：使用质量浓度3％的碳二亚胺溶液对所获得的干态的复合材料样品进行交联24h；交联后材料使用纯化水在气浴恒温震荡箱中室温下，转速为160rpm，清洗48h，每3h进行换液处理；将清洗后的样品置于-20℃冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，得到复合人工软骨支架。
对产品的性能检测内容参照实施例1相关内容。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种复合人工软骨支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：以哺乳动物的软骨为原料，进行软骨溶液化，制备软骨溶液；
S2：以哺乳动物的松质骨为原料，通过化学处理，制备脱钙骨；
S3：将羟基磷灰石/透明质酸复合溶液灌注入所述脱钙骨的孔隙结构中，冷冻，得到固体复合脱钙骨；
S4：对所述固体复合脱钙骨进行冷冻干燥，得到复合脱钙骨材料；
S5：将所述软骨溶液与所述复合脱钙骨材料混合，冷冻，得到复合材料样品；
S6：对所述复合材料样品进行冷冻干燥，得到干态的复合材料样品；
S7：对所述干态的复合材料样品进行交联，清洗，冷冻干燥，得到复合人工软骨支架。
2.如权利要求1所述的复合人工软骨支架的制备方法，其特征在于，步骤S1包括：
S11：取哺乳动物的软骨，去除所述软骨表面的肉及骨膜，使用纯化水对获得的软骨进行清洗，得到前处理后的软骨材料；
S12：对所述前处理后的软骨材料切碎制成软骨碎块，再对所述软骨碎块进行脱细胞处理，得到脱细胞后的软骨材料；
S13：将所述脱细胞后的软骨材料于-20℃冷冻，随后置于真空冷冻干燥机将其冷冻干燥制成干态软骨材料；
S14：将所述干态软骨材料粉碎，得到软骨粉末；
S15：将所述软骨粉末与胃蛋白酶消化液进行混合，再将PH值调节至中性，得到半成品软骨溶液；
S16：对所述半成品软骨溶液进行离心处理，取上清液，于-20℃冷冻，随后进行冷冻干燥处理，得到海绵状软骨材料；
S17：将所述海绵状软骨材料裁剪至碎块，加入纯化水溶解后，再加入透明质酸、硫酸软骨素混合，得到所述软骨溶液。
3.如权利要求2所述的复合人工软骨支架的制备方法，其特征在于，对所述软骨碎块进行脱细胞处理包括：依次使用胰酶溶液、盐酸溶液对所述软骨碎块进行消化，再使用SDS溶液处理消化后的所述软骨碎块，使用纯化水对所述软骨碎块进行清洗，得到脱细胞后的软骨材料。
4.如权利要求3所述的复合人工软骨支架的制备方法，其特征在于，使用胰酶溶液对所述软骨碎块进行消化包括：使用质量分数为0.25％的胰酶溶液对所述软骨碎块进行消化，于37℃在气浴恒温震荡箱中，以转速120rpm，震荡3h。
5.如权利要求3所述的复合人工软骨支架的制备方法，其特征在于，使用盐酸溶液对所述软骨碎块进行消化包括：配制质量分数1％的盐酸溶液消化所述软骨碎块，于室温下在气浴恒温震荡箱中，以转速160rpm，震荡2h。
6.如权利要求3所述的复合人工软骨支架的制备方法，其特征在于，使用SDS溶液处理消化后的所述软骨碎块包括：使用质量分数1％的SDS溶液处理所述软骨碎块，于室温下在气浴恒温震荡箱中，以转速160rpm，震荡16h。
7.如权利要求2所述的复合人工软骨支架的制备方法，其特征在于，步骤S15中胃蛋白酶消化液的质量分数为0.5％。
8.如权利要求1所述的复合人工软骨支架的制备方法，其特征在于，步骤S2包括：
S21：取哺乳动物的松质骨，裁切，使用纯化水进行清洗，得到前处理后的松质骨；
S22：使用SDS溶液处理所述前处理后的松质骨以除去细胞，得到脱细胞后的松质骨；
S23：使用NaOH-乙醇脱脂液对所述脱细胞后的松质骨进行脱脂，得到脱脂后的松质骨；
S24：使用纯化水对所述脱脂后的松质骨进行清洗后，使用甲酸溶液进行脱钙，再使用纯化水进行清洗，得到所述脱钙骨。
9.如权利要求1所述的复合人工软骨支架的制备方法，其特征在于，步骤S7中的交联为化学交联。
10.一种复合人工软骨支架，其特征在于，通过如权利要求1-9任一项所述的复合人工软骨支架的制备方法进行制备。
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