KR102416861B1 - 연골 성분을 함유하는 연골 재생용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 연골 성분을 함유하는 연골 재생용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 미분쇄된 연골 분말과, 생체적합성 고분자 또는 화학적으로 가교된 생체적합성 고분자가 물리적으로 혼합된 연골 재생용 조성물을 제공함으로써, 시술 시 연골 손상 부위에서의 형태 유지력과 사용 편이성을 증가시킬 수 있다.

Description

연골 성분을 함유하는 연골 재생용 조성물 및 그 제조방법{COMPOSITION INCLUDING CARTILAGES FOR CARTILAGE REGENERATION AND MANUFACTURING PROCESS THEREOF}

본 발명은 연골 성분을 함유하는 연골 재생용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

골관절염(Osteoarthritis)은 연골 및 주변 조직의 손상으로 인한 통증, 경직 및 기능 상실을 특징으로 하는 만성질환으로서, 고령인구 증가와 더불어 발병률이 증가하고 있다. 연골은 무신경, 무혈관 조직으로 일단 손상되면 재생이 어렵고 광범위하게 진행되므로 수술적 치료가 요구된다.

현재 적용되는 수술적 치료로는 미세천공술(microfracture), 골연골 자가 이식술(osteochondral autograft transplantation system) 또는 자가 연골세포 이식술(autologous chondrocyte implantation) 등으로 연골 손상 병변을 개선하는 방법이 사용되고 있다. 그러나, 일차적 시술인 미세천공술은 활액 혹은 세척액에 의해 쉽게 세척되어 불완전한 연골 재생이 발생할 수 있고, 체중이나 관절 운동으로 혈병(blood clot)이 쉽게 박탈 또는 마모될 수 있다. 또한, 미세천공술은 작은 연골 손상 부위에만 제한적으로 적용되며 본래 관절연골 성분인 초자연골(hyaline cartilage)이 아닌 섬유성 연골(fibrous cartilage)의 생성으로 인하여 온전한 연골재생에 대해 제한된 효과를 보인다. 한편, 골연골 자가 이식술 또는 자가 연골세포 이식술은 보다 큰 연골 손상 부위에 적용되어 높은 성공률을 보이나, 1차 시술로 자가 연골 또는 자가 연골세포의 채취 후, 2차 시술을 통한 자가 이식이라는 두 번의 시술이 필요하며 채취 과정에서 연골주변 정상 조직의 손상 문제를 항상 수반한다.

최근 주목 받고 있는 줄기세포 기반의 연골치료제는 자가 또는 동종조직으로부터 채취 및 분리한 줄기세포를 연골 손상 부위에 주입하여, 줄기세포의 연골 세포로의 분화를 통해 연골 생성을 유도하는 방법이며, 병변 부위의 적용면적 제한은 없다. 그러나, 이러한 자가 줄기세포의 경우 이식을 위한 자가 세포의 채취가 필수적이고 고비용이라는 한계 요소가 있다. 또한, 주입한 줄기세포가 정상 연골 세포로 분화하는 것이 완전히 보장되지는 않으며 시술 후 장기간에 걸친 입원과 재활이 요구된다.

상기 언급한 기존 치료 방법의 한계점을 해결하기 위해, 사람유래 연골 성분을 직접 연골 손상 부위에 시술하는 방법이 적용되고 있다. 이러한 시술법은 사후 연골조직 기증자에서 채취한 연골을 입자(particle) 및 과립(granule) 또는 미분쇄된 분말(micronized powder) 형태로 가공한 후, 멸균생리식염수 또는 환자의 자신의 혈액 내지 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma, PRP)과 혼합하여 연골 손상 부위에 주입함으로써 연골 재생을 향상시킬 수 있다.

이러한 시술법에 사용되는 상용제품 중, DeNovo-NT®(Zimmer Biomet社)는 영아부터 13세 미만인 사후 기증자의 대퇴 관절구에서 얻은 연골 조직을 평균 입도 500~1000 μm로 가공하여 멸균생리식염수에 침지상태로 포장된 인체조직 제품이다. 선행 임상 연구에 의하면, 슬개골의 외측 연골 4등급(outerbridge grade IV) 관절연골 결손을 가진 환자군에게 DeNovo-NT®를 적용한 결과, 정상 또는 그와 유사한 연골 생성을 보였다고 보고되었다.

또 다른 상용제품으로, BioCartilage®(Arthrex社)는 기증자의 연골 조직을 평균 입도 100~300 μm인 미분쇄된 분말로 가공한 인체조직 제품이다. 전임상 동물 모델 연구 결과에 의하면, 미세천공술 후 PRP와 혼합하여 전층 연골 손상에 사용하였을 때, 안전성과 생체 적합성뿐만 아니라 미세천공술을 단독으로 사용한 것보다 향상된 연골 재생을 보였다고 보고되었다.

상기의 두 사례와 같이, 사람유래 연골을 환자의 연골 손상 부위에 직접 사용하는 방법은 기존의 치료 방법과 비교하여 다음과 같은 장점을 지닌다:

① 연골 손상 부위에 본래의 관절연골 성분인 사람유래 초자연골 성분을 보충함으로써 동질의 성분을 통해 빠른 연골재생을 유도할 수 있다.

② 미세천공술만을 단독으로 시술하는 경우, 시술부위에서 섬유성 연골이 생성되는 한계점을 극복할 수 있다.

③ 환자로부터 자가 연골 조직, 자가 세포 및 자가 골막의 채취를 위한 시술 단계가 없다.

④ 기존의 줄기 세포를 사용하는 연골 치료방법에 비해 저렴하다.

한편, 상기 두 가지 사례의 사람유래 연골 치료재료 중, DeNovo-NT®는 사람연골의 수득을 영아 내지 13세 미만인 사후 기증자로부터 진행해야 하는 치료재료 수득의 제한성이 있다. 또한, 치료 재료 자체가 살아 있는 사람연골 세포를 포함하고 있으므로, 시술 후 면역 반응을 일으킬 가능성이 내재되어 있다. 치료 재료의 저장기한이 수 주일 이내로 매우 짧고 이에 따른 유통방법 역시 매우 제한적이다. 또한, 연골 입자가 단순히 멸균생리식염수에 수화된 형태로 제공되기 때문에, 수술 시 연골 손상 부위에서 형태를 유지하기 어려워 사용자 접근성 역시 매우 제한적이라는 단점이 있다.

상기 두 가지 사례의 또 다른 사람유래 연골 치료재료인 BioCartilage®도 최종 제형이 탈수된 연골 분말로 제공되기 때문에, 직접 연골 손상 부위에 적용이 불가하여 시술 시 전문의가 별도의 수작업을 통해 환자의 혈액 내지 PRP와 혼합하여 점성을 확보한 후 사용해야 하는 불편함이 따른다.

1. 미국 공개특허 2012-0239146 2. 미국 공개특허 2013-0338792

1. Tompkins M. et al., Preliminary results of a novel single-stage cartilage restoration technique: Particulated juvenile articular cartilage allograft for chondral defects of the patella. Arthroscopy, 2013, 29(10), pp. 1661-1670. 2. Fortier L. A. et al., BioCartilage improves cartilage repair compared with microfracture alone in an equine model of full-thickness cartilage loss. Am J Sports Med, 2016, 44(9), pp. 2366-2374.

이에 본 발명에서는 연골을 분쇄 및 체분리하여 제조한 미분쇄된 연골 분말의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명에서는 본 발명에 따른 미분쇄된 연골 분말이 체내에 이식될 때, 미분쇄된 분말, 입자 또는 과립 상태로 흩어지지 않고 연골 손상 부위에서 잘 응집된 상태로 이식되어, 연골 재생 효과를 극대화할 수 있는 연골 재생용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 연골을 동결건조하는 동결건조 단계;

상기 동결건조된 연골을 분쇄하는 단계; 및

상기 분쇄된 연골을 체분리하는 단계를 포함하는 미분쇄된 연골 분말의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 전술한 제조 방법에 의해 제조된 미분쇄된 연골 분말; 및

생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 포함하는 연골 재생용 조성물 제공한다.

또한, 본 발명은 전술한 제조 방법에 의해 제조된 미분쇄된 연골 분말; 및 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 혼합하는 단계를 포함하는 연골 재생용 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서는 동종 또는 이종 유래의 연골을 분쇄 및 체분리한 후, 탈지방화 및 탈세포화하여 제조한 미분쇄된 연골 분말을 사용함으로써, 면역반응 유발인자들의 잔류를 최소화할 수 있으며, 동질의 연골 조직이 안전하고 효과적으로 재생될 수 있도록 유도할 수 있는 연골 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 미분쇄된 연골 분말과, 생체적합성 고분자 또는 화학적으로 가교된 생체적합성 고분자가 물리적으로 혼합된 연골 재생용 조성물을 제공함으로써, 시술 시 연골 손상 부위에서의 형태 유지력과 사용 편이성을 증가시킬 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 연골 재생용 조성물은 미분쇄된 연골 분말이 하이드로겔(hydrogel) 성상의 부형재와 혼합되어 제조되므로, 분말, 입자 또는 과립 상태로 흩어지지 않고 연골 손상 부위에서 잘 응집된 상태로 이식되어, 연골 재생 효과를 극대화할 수 있다.

도 1은 (A) 분쇄와 체분리를 통한 미분쇄된 연골 분말의 수득 과정을 나타낸 사진 및 (B) 제조된 미분쇄된 연골 분말의 입도 분포를 측정한 그래프이다.
도 2는 미분쇄된 연골 분말에서 측정한 콜라겐과 설페이티드 글리코사미노글리칸(sulfated Glycosaminoglycan, sGAG)의 함량을 정량한 그래프이다.
도 3은 미분쇄된 연골 분말과 HA-CMC 부형재의 혼합 비율에 따른 조성물의 복소점도를 측정한 결과, 및 최대 복소점도를 가지는 혼합 비율로 제조된 연골 재생용 조성물의 시린지 출력 후 성상과 핸들링을 통한 형태 유지력을 나타낸 사진이다.
도 4는 연골 재생용 조성물을 이식한 직 후, 토끼의 무릎 관절연골 손상 부위에서 상기 조성물을 나타낸 사진이다.
도 5는 연골 재생용 조성물을 이식한 12주 후, 토끼의 무릎 관절연골 손상 부위와 적출한 후 조성물을 나타낸 사진, 및 조직학적 분석을 위하여 H&E, Safranin-O/Fastgreen 및 Masson’s trichrome 염색한 사진이다.

본 발명은 연골을 동결건조하는 동결건조 단계;

상기 동결건조된 연골을 분쇄하는 분쇄 단계; 및

상기 분쇄된 연골을 체분리하는 체분리 단계를 포함하는 미분쇄된 연골 분말의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 실시예에서는 미분쇄된 연골 분말을 제조하고, 또한, 상기 미분쇄된 연골 분말 및 생체적합성 고분자의 가교물(HA-CMC 부형재)을 포함하는 연골 재생용 조성물을 제조하여, 상기 연골 재생용 조성물이 우수한 점탄성 특성을 가짐을 확인하였다. 또한, 상기 연골 재생용 조성물에 대해 인 비보(in vivo) 실험을 진행하여 종래의 미세천공술만을 실행한 경우 대비 우수한 연골 재생 효과를 가짐을 확인하였다.

이하, 본 발명에 따른 미분쇄된 연골 분말의 제조 방법을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 미분쇄된 연골 분말(이하, 연골 분말이라 할 수 있다.)은 본 발명에 따른 제조 공정에 의해 제조되는 수 um 크기의 연골을 의미한다. 상기 연골 분말은 사전적 의미의 분말(powder)뿐만 아니라 입자(particle) 및 과립(granule)을 포함하는 의미로 사용될 수 있다.

본 발명의 미분쇄된 연골 분말의 제조 방법은 동결건조 단계; 분쇄 단계; 및 체분리 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 연골은 동종 또는 이종 유래 연골일 수 있다. 상기 동종 유래 연골은 사람유래의 연골을 의미하며, 이종은 인간 이외의 동물, 즉, 돼지, 소, 말 등의 포유류 유래의 연골을 의미할 수 있다. 본 발명에서는 사후 기증된 사람유래 연골을 사용할 수 있다.

본 발명에서는 동결건조 단계를 수해하기 전에 세척 단계를 수행할 수 있으며, 세척 용매로 멸균증류수를 사용할 수 있다. 상기 단계를 통해 연골 내의 불순물을 제거할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 동결건조 단계를 수행하기 전에 연골에서 연부 조직 및 연골막을 제거하는 단계를 수행할 수 있다.

일 구체예에서, 연골 조직 및 연골막의 제거는 블레이드(blade)와 론저(rongeur)를 사용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 블레이드로 연골과 연골의 경계면을 수직으로 절단한 후, 론저를 사용하여 건조해지지 않도록 멸균증류수로 조직 표면을 적신 상태에서 절단면의 모서리를 물어 잡아 당기는 방법으로 연골막을 제거할 수 있다

본 발명에서 동결건조 단계는 연골을 동결건조하는 단계이다.

일 구체예에서, 상기 연골은 전술한 세척, 및 연골 조직 및 연골막이 제거된 연골일 수 있다.

일 구체예에서, 동결건조는 조직(연골)이 동결된 상태에서 이를 급속 냉각후 진공으로 수분을 흡수하는 방법으로, 상기 동결건조를 수행하여 연골 내 수분을 조절할 수 있다.

일 구체예에서, 동결건조는 -50 내지 -80℃ 에서 24 내지 96 시간 동안 수행할 수 있다.

본 발명에서 분쇄 단계는 상기 동결건조된 연골을 분쇄하는 단계이다.

일 구체예에서, 분쇄는 조직 분쇄기를 사용하여 수행할 수 있다. 이때, 분쇄 시간은 30 초 내지 5 시간일 수 있다. 일 구체예에서, 분쇄 후의 연골의 입경은 1 내지 1000 μm일 수 있다.

상기 분쇄는 일회 이상 수행할 수 있다.

본 발명에서 체분리 단계는 상기 분쇄 단계에서 분쇄된 연골을 체분리하는 단계이다.

일 구체예에서, 체분리는 눈금이 100 내지 1000 μm인 체를 사용하여 수행할 수 있다.

상기 체분리는 일회 이상 수행할 수 있다.

본 발명에서는 체분리 단계를 수행한 후, 미분쇄된 연골 분말을 탈지방화하는 탈지방화 단계; 및 탈세포화하는 탈세포화 단계를 추가로 수행할 수 있다.

본 발명에서 탈지방화 단계는 지방조직에서 지질 성분을 제거하는 단계이다.

일 구체예에서, 탈지방화(delipidation)는 조직으로부터 지질 성분을 제거하는 것을 의미한다.

상기 지질 성분의 제거는 화학적 처리에 의해 수행될 수 있다.

일 구체예에서, 화학적 처리의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 탈지질 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 탈지질 용액은 극성 용매, 비극성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 포함할 수 있다. 상기 극성 용매로는 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용액을 사용할 수 있으며, 상기 알코올로 메탄올, 에탄올 또는 아이소프로필 알코올을 사용할 수 있다. 비극성 용매로는 헥산, 헵탄, 옥탄, 또는 이들의 혼합 용액을 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 탈지질 용액으로 이소프로필 알코올 및 헥산의 혼합 용액을 사용할 수 있다. 이때, 이소프로필 알코올 및 헥산의 혼합 비율은 40:60 내지 60:40일 수 있다.

상기 탈지질 용액의 처리 시간은 1 내지 30 시간, 1 내지 20 시간 또는 10 내지 20 시간일 수 있다.

본 발명에서 탈세포화 단계는 상기 탈지방화 단계에 의해 지질 성분이 제거된 연골 분말에서 세포를 제거하는 단계이다.

일 구체예에서, 탈세포화(decellularization)는 조직으로부터 세포외기질을 제외한 다른 세포 성분, 예를 들면 핵, 세포막, 핵산 등을 제거하는 것을 의미한다.

일 구체예에서, 탈세포화는 염기성 용액을 사용하여 수행할 수 있으며, 상기 염기성 용액으로 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 염기성 용액으로 수산화나트륨(NaOH)을 사용할 수 있다.

일 구체예에서, 염기성 용액의 농도는 0.01 내지 1 N, 0.06 내지 0.45 N, 0.06 내지 0.2 N, 또는 0.08 내지 1.02 N일 수 있다. 상기 농도 범위에서 세포의 제거가 용이하다.

또한, 일 구체예에서, 탈세포화 단계는 40 내지 60 분, 70 내지 200 분, 또는 90 내지 150 분 동안 수행될 수 있다. 상기 시간 범위에서 세포의 제거가 용이하다.

본 발명에서는 탈세포화 단계를 수행한 후, 필요에 따라 산성 용액으로 중화하는 중화 단계;

상기 중화가 완료된 연골 분말을 세척하는 세척 단계;

상기 세척이 완료된 연골 분말을 원심 분리하는 단계; 및

동결건조하는 단계로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 추가로 수행할 수 있다.

일 구체예에서, 원심분리 단계를 통해 탈지방화 단계 및 탈세포화 단계에서의 불순물을 제거할 수 있으며, 높은 순도의 미분쇄된 연골 분말(침전물)을 수득할 수 있다.

또한, 세척 단계 시, 세척 용액으로 멸균 증류수 및/또는 70% 에탄올을 사용할 수 있다.

일 구체예에서, 원심분리는 4,000 내지 10,000 rpm, 또는 8,000 rpm에서 5 내지 30 분, 5 내지 20 분, 또는 10분 동안 수행할 수 있다.

일 구체예에서, 동결건조는 -50 내지 -80℃ 에서 24 내지 96 시간 동안 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 전술한 미분쇄된 연골 분말의 제조 방법을 통해 제조된 미분쇄된 연골 분말에 관한 것이다.

일 구체예에서, 미분쇄된 연골 분말의 평균 입경은 100 μm 내지 900 μm, 300 내지 800 μm 또는 400 내지 700 μm일 수 있으며, 평균 입도는 100 μm 내지 900 μm일 수 있다.

본 발명의 미분쇄된 연골 분말은 관절연골 세포외기질의 주요 구성요소인 콜라겐(collagen) 및 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan(GAG))을 포함할 수 있다. 상기 콜라겐의 함량은 미분쇄된 연골 분말 전체 중량(100 중량%) 대비 30 중량% 이상, 40 내지 90 중량%, 50 내지 80 중량% 또는 60 내지 80 중량%일 수 있으며, 글리코사미노글리칸의 함량은 5 중량% 이상, 5 내지 40 중량% 또는 10 내지 30 중량%일 수 있다.

또한, 본 발명은 전술한 제조 방법에 의해 제조된 미분쇄된 연골 분말을 포함하는 연골 재생용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 연골 재생용 조성물은 상기 미분쇄된 연골 분말과 함께 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 미분쇄된 연골 분말은 전술한 제조 방법에 의해 제조된 연골 분말을 사용할 수 있으며, 평균 입경은 100 μm 내지 900 μm일 수 있다. 상기 입경 범위에서 생체 주입용으로 적합하며, 주사기로 주입이 가능하다. 또한, 미분쇄된 연골 분말은 관절연골 세포외기질의 주요 구성요소인 콜라겐(collagen) 및 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan(GAG))을 포함하므로, 연골 재생 효과가 매우 우수하다.

일 구체예에서, 미분쇄된 연골 분말의 함량은 조성물 전체 중량(100 중량부) 대비 10 내지 90 중량부, 10 내지 30 중량부 또는 20 내지 30 중량부일 수 있다. 상기 범위에서 주사기로 주입이 가능하며, 우수한 연골 재생 능력을 가질 수 있다.

본 발명에서 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물은 연골 재생용 조성물의 점탄성 특성을 향상시킬 수 있으며, 체내 부피 유지력을 향상시킬 수 있다. 본 발명에서는 이러한 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 부형제라 표현할 수 있다.

일 구체에에서, 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물는 조성물 내에서 하이드로겔 상태로 존재할 수 있으며, 이를 하이드로겔 부형제라 표현할 수 있다.

일 구체예에서, 생체적합성 고분자의 가교물은 화학적으로 가교된 한 가지 이상의 생체적합성 고분자를 의미한다.

일 구체예에서, 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물의 분자량은 10 kDa 내지 2 MDa 일 수 있다.

일 구체예에서, 생체적합성 고분자로 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 카복시메틸셀룰로스, 알지네이트 및 젤라틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.

일 구체예에서, 생체적합성 고분자의 가교물은 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 카복시메틸셀룰로스, 알지네이트 및 젤라틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자의 가교물일 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 히알루론산(Sodium hyaluronate, HA)과 카르복시메틸셀룰로스(Sodium carboxymethyl cellulose, CMC)의 가교물을 사용할 수 있다.

일 구체예에서, 생체적합성 고분자는 가교제에 의해 가교되며, 상기 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether), 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

일 구체예에서, 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물의 함량은 조성물 전체 중량(100 중량부) 대비 10 내지 90 중량부, 20 내지 80 중량부, 또는 50 내지 80 중량부일 수 있다. 상기 범위에서 생체적합성 고분자의 물성을 향상시킬 수 있으며, 또한, 체내 부피 유지력을 향상시킬 수 있다

일 구체예에서, 연골 재생용 조성물의 복소점도는 5,000 내지 100,000 Pa·s일 수 있다. 상기 복소점도는 회전형 레오미터 분석기(진동 수: 0.1~100 Hz, 온도: 25℃, 변형율: 1%)에 의해 측정된 결과값을 의미한다.

복소점도는(complex viscosity)는 진동 측정법에서 계산되는 진동수 의존적 점도로서, 상기 수치는 G'' (점성계수(손실탄성계수), viscous modulus), G'(탄성계수(저장탄성계수), elastic modulus) 및 측정하는 진동수 값이 반영된 수치이다. 본 발명에서 상기 연골 재생용 조성물의 복소점도는 20,000 내지 5,000 Pa·s 또는 35,000 내지 45,000 Pa·s일 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 연골 재생용 조성물은 주사기로의 주입 등을 통해 생체 내로 주입 또는 삽입될 수 있다. 이러한 연골 재생용 조성물은 일반적인 의료용 재료로서 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 전술한 연골 재생용 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

상기 연골 재생용 조성물의 제조 방법은 미분쇄된 연골 분말; 및 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 혼합하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 미분쇄된 연골 분말은 전술한 제조 방법에 의해 제조된 연골 분말을 사용할 수 있다.

구체적으로, 미분쇄된 연골 분말은 연골을 동결건조하는 동결건조 단계;

상기 동결건조된 연골을 분쇄하는 분쇄 단계;

상기 분쇄된 연골을 체분리하는 체분리 단계;

미분쇄된 연골 분말을 탈지방화하는 탈지방화 단계; 및

탈세포화하는 탈세포화 단계를 통해 제조될 수 있다.

본 발명에서 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물은 시중에서 시판 중인 제품을 사용할 수 있다. 또한, 상기 가교물은 생체적합성 고분자를 이용하여 실험실 등에서 제조하여 사용할 수 있다.

상기 생체적합성 고분자의 가교물은 생체적합성 고분자를 가교제를 이용하여 가교하는 가교 단계; 및

상기 가교된 가교물을 동결건조하는 동결건조 단계를 통해 제조될 수 있다.

본 발명에서 가교 단계는 생체적합성 고분자를 가교제를 이용하여 가교하는 단계이다. 상기 단계에서 생체적합성 고분자 및 가교제는 전술한 종류를 사용할 수 있다.

일 구체예에서, 생체적합성 고분자들은 아미드 결합(amide bond)을 통해 결합될 수 있다.

일 구체예에서, 가교제의 함량은 생체적합성 고분자 대비 0.5 내지 10 중량부일 수 있다.

본 발명에서는 동결건조를 수행하기 전에 가교된 반응물을 세척하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 이때, 세척 용액으로 인산완충식염수(phosphate-buffered saline(PBS)) 및/또는 멸균증류수를 사용할 수 있다.

본 발명에서 동결건조 단계는 상기 단계에서 가교된 생체적합성 고분자를 동결건조하는 단계이다.

일 구체예에서, 동결건조는 동결건조는 -50 내지 -80℃ 에서 24 내지 96 시간 동안 수행할 수 있다.

본 발명에서는 상기 동결건조된 가교물을 연골 분말과 혼합하기 전에, 상기 가교물을 멸균생리식염수 등의 용매와 혼합하여 하이드로겔을 형성할 수 있다.

본 발명에서 미분쇄된 연골 분말; 및 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물은 물리적 혼합에 의해 혼합될 수 있다.

이때, 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물은 하이드로겔의 형태일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 물리적으로 혼합된 혼합물 내에서 미분쇄된 연골 분말의 함량은 10 내지 90 중량부, 10 내지 30 중량부 또는 20 내지 30 중량부일 수 있다.

또한, 혼합물 내에서 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물의 함량은 10 내지 90 중량부, 20 내지 80 중량부, 또는 50 내지 80 중량부일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 혼합물은 동결건조된 생체적합성 고분자의 가교물을 용매에 용해시킨 후, 미분쇄된 연골 분말과 혼합하여 제조할 수 있다. 이때 용매로는 생리식염수를 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 혼합물을 멸균하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 멸균 단계를 통해 연골 재생용 조성물 내의 면역성을 제거할 수 있으며, 세균 등을 효과적으로 파괴할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 멸균 단계는 방사선을 조사하여 수행할 수 있으며, 방사선의 조사 범위는 10 내지30 kGy일 수 있다.

본 발명에서 제조된 연골 재생용 조성물은 페이스트 형상을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 전술한 연골 재생용 조성물의 사용에 관한 것이다.

본 발명에 따른 연골 재생용 조성물은 체내 이식 후 연골 재생을 유도할 수 있고, 또한, 점탄성 특성이 향상되어 체내 부피 유지력이 우수한 효과를 가진다.

따라서, 일 구체예에서, 본 발명의 연골 재생용 조성물은 주사기로의 주입 등을 통해 생체 내로 주입 또는 삽입될 수 있다.

하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범주는 하기 실시예에 한정되는 것이 아니며 첨부된 특허청구범위에 기재된 사항에 의해 도출되는 기술적 사항을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형, 수정 또는 응용이 가능하다는 것을 당업자는 이해할 수 있을 것이다.

실시예

실시예 1. 미분쇄된 연골 분말 제조

사람유래 연골을 멸균증류수로 세척하고 연부 조직 및 연골막을 제거하고 절단한 후, 동결건조(lyophilization) 공정으로 전처리하였다. 동결건조가 완료된 연골을 조직 분쇄기(power cutting mill, Pulverisette 25, FRITSCH, Germany)로 30 초 내지 5 시간 동안 분쇄하고, 눈금이 100 내지 1000 μm인 체(sieve)를 통해 체분리하였다. 상기 분쇄 및 체분리 과정을 수회 진행하여 사람유래 미분쇄된 연골 분말을 수득하였다(도 1A 참조).

실험예 1. 미분쇄된 연골 분말의 평균입도 분석

(1) 방법

실시예 1에서 제조된 미분쇄된 연골 분말의 입도를 분석하였다.

상기 미분쇄된 연골 분말 1 g 당 40 mL의 멸균증류수를 넣고 2 분간 진탕하여 분산시킨 후, 입도 분석기(particle size analyzer, LS 13 320, Beckman Coulter)를 사용하여 습식모드로 0.017~2000μm의 범위에서 평균 입도를 측정하였다.

(2) 결과

결과를 도 1B에 나타내었다.

상기 도 1B에 나타난 바와 같이, 미분쇄된 연골 분말의 크기는 1 μm이상에서부터 1000 μm까지 분포되어 있으며, 평균입도는 100 내지 900 μm의 범위에 있음을 확인할 수 있다.

실험예 2. 미분쇄된 연골 분말의 성분 분석

(1) 방법

실시예 1에서 제조된 미분쇄된 연골 분말에 함유된 관절연골 세포외기질의 주요 성분 및 함량을 확인하기 위하여, 콜라겐과 GAG의 함량을 측정하였다.

먼저, 콜라겐의 함량을 측정하기 위하여, 미분쇄된 연골 분말을 단백질 분해 효소(Proteinase K)로 처리하고, 12.1 N 염산(Hydrochloric acid, HCl, 35.0-37.0%, JUNSEI Chemical) 용액으로 110℃에서 16시간 이상 반응시킨 후, 하이드록시프롤린(hydroxyproline) 분석법을 통해 콜라겐의 함량을 정량하였다.

또한, GAG 함량을 측정하기 위해 미분쇄된 연골 분말을 Proteinase K로 60℃에서 16 시간 반응시킨 후, DMMB(1,9-dimethylmethylene blue) 분석법을 사용하여 정량하였다.

(2) 결과

결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 미분쇄된 연골 분말에서 콜라겐 및 sGAG 함량은 각각 전체 중량 대비 73.95 중량% 및 19.39 중량%인 것을 확인할 수 있다.

실시예 2. 미분쇄된 연골 분말 및 화학적으로 가교된 생체적합성 고분자를 포함하는 연골 재생용 조성물 제조

(1) 미분쇄된 연골 분말의 탈지방화 및 탈세포화

먼저, 실시예 1에서 제조된 미분쇄된 연골 분말을 탈지방화 및 탈세포화하였다.

40% 내지 60% 아이소프로필 알코올과 40% 내지 60% 헥산을 이용하여 1 내지 20 시간 동안 탈지방화 과정을 거쳤다. 지방이 제거된 조직에 0.1N 수산화나트륨(NaOH)을 처리하여 세포를 제거하였다.

(2) 화학적으로 가교된 생체접합성 고분자 제조

N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산으로 이루어진 생체유래 고분자인 히알루론산(Sodium Hyaluronate, HA)과 식물성 고분자인 카르복시메틸셀룰로스(Sodium carboxymethyl cellulose, CMC)를 가교제인 BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether, Sigma-Aldrich)와 혼합하여 HA-CMC 부형재를 제조하였다.

0.1 N 내지 1 N 농도의 NaOH 용액 100 mL당 BDDE 1 mL 내지 5 mL(1 부피% 내지 5 부피%)를 첨가하여 반응용매를 준비하였다. 준비된 반응용매에 각각 1 중량% 내지 10 중량%의 HA 및 CMC를 첨가한 후, 균질하게 혼합하여 혼합 용액을 준비했다. 상기 혼합 용액을 50℃에서 3 시간 동안 가온 반응을 진행하여 가교하였다. 가교 반응이 완료된 반응물은 투석막에 넣고 5 L의 PBS로 상온에서 투석하였다. 2 시간 후, 5 L의 50% EtOH로 교체하고 상온에서 1 시간 투석하였다. 이후 멸균증류수로 상온에서 72 시간 동안 투석하고, 동결건조하여 최종적으로 HA-CMC 부형재를 수득하였다.

(3) 페이스트 형태의 연골 재생용 조성물 제조

페이스트 형태의 연골 재생용 조성물은 상기 조성물 전체 중량 대비 10 중량% 내지 90 중량%의 미분쇄된 연골 성분을 함유할 수 있도록 혼합하였다.

동결건조가 완료된 가교된 HA-CMC 부형재를 멸균생리식염수와 혼합하여 겔화(gelation)하였다. 미분쇄된 연골 성분과 상기 겔화된 HA-CMC 부형재을 최종 혼합하여 페이스트 형태의 연골 재생용 조성물을 제조하였다.

상기 연골 재생용 조성물을 프리필드 시린지(prefilled syringe)에 충진한 후, 감마선으로 멸균하였다.

실험예 3. 미분쇄된 연골 분말 및 HA-CMC 부형재의 혼합 비율에 따른 복소점도 측정

(1) 방법

실시예 2의 (1)에서 제조된 미분쇄된 연골 분말과 실시예 2의 (2)에서 제조된 겔화된 HA-CMC 부형재의 혼합 비율에 따른 제조되는 연골 재생용 조성물의 점성을 비교하였다.

구체적으로, 회전형 레오미터(rotational rheometer, DHR-1, TA Instruments)를 사용하여, 진동수: 0.1~100 Hz, 변형율: 1%, 온도: 25℃의 조건으로 1 Hz에서의 복소점도(complex viscosity)를 측정하였다.

(2) 결과

측정 결과를 도 3 및 하기 표 1에 나타내었다.

상기 도 3 및 표 1에 나타난 바와 같이, 연골 재생용 조성물의 복소점도는 혼합비율이 10:90에서부터 25:75까지는 증가하였지만, 이후 미분쇄된 연골 분말의 증가와 HA-CMC 부형제의 감소에 따라 상기 복소점도가 감소한 것을 확인할 수 있다.

따라서, 최대의 복소점도를 나타내는 25:75를 연골 재생용 조성물을 위한 최종 혼합 비율로 선정하였다.

도 3(B)는 선정된 혼합 비율(25:75)로 제작된 연골 재생용 조성물을 시린지로부터 출력한 결과로, 상기 조성물은 페이스트 성상을 유지하며, 핸들링 시 잘 응집되어 형태가 유지됨을 확인할 수 있다.

실험예 4. in vivo 성능 검증

(1) 방법

실시예 2에서 제조된 연골 재생용 조성물(혼합비율 25:75)의 in vivo 성능을 검증하였다.

이때, 대조군으로 연골 손상 부위에 아무것도 이식하지 않은 연골 결함 군(Defect 군)과 미세천공술만을 실시한 군(microfracture 군)을 사용하였다.

상기 검증은 New Zealand white rabbit(male, 18 주령, 2.5 kg)을 사용한 실험으로 진행하였다.

실험동물의 좌,우측 무릎 관절구 표면 trochlear groove에 직경 5 mm, 깊이 2 mm의 전층 골연골 손상(full-thickness osteochondral defect)을 생성한 후, K-wire를 사용하여 미세천공술을 실시하였다. 미세천공술을 한 부위에 연골 재생용 조성물 페이스트를 이식하고 피브린글루(fibrin glue)로 도포하였다. 연골 수복 및 재생 효과를 확인하기 위하여, 이식 12 주 후 실험동물을 희생한 후 조직 염색을 실시하여 결과를 분석하였다.

(2-1) 연골 손상 부위에서의 형태 유지력 검증

도 4는 연골 재생용 조성물을 이식한 직 후, 토끼의 무릎 관절연골 손상 부위에서의 조성물을 나타낸 사진이다. 상기 도 4에서는 연골 재생용 조성물을 이식한 직 후, 연골 손상 부위를 육안 검사하여 연골 재생용 조성물의 형태 유지력을 확인할 수 있다.

도 4에 나타난 바와 같이, 육안 검사를 통해 페이스트 성상의 연골 재생용 조성물이 연골 손상 부위에서 채워져서 유지된 것을 확인할 수 있다.

(2-2) 연골 수복 및 재생 효과 검증

도 5A는 연골 재생용 조성물을 이식한 12 주 후, 토끼의 무릎 관절연골 손상 부위와 적출한 후 조성물을 나타낸 사진이다. 도 5A에서는 이식 부위를 육안 검사하여 인접한 정상 연골과의 외관상 연속성을 관찰할 수 있다.

상기 도 5 A에 나타난 바와 같이, 육안 검사 결과, 연골 재생용 조성물을 이식한 손상 부위는 대조군에 비하여 인접한 정상연골과의 외관상 연속성이 더 우수한 것을 확인할 수 있다.

한편, 도 5B는 조직학적 분석을 위하여 H&E, Safranin-O/Fastgreen 및 Masson’s trichrome 염색한 사진이다. 도 5B에서는 적출한 시료에 대하여 H&E, Safranin O/Fastgreen 및 Masson’s Trichrome 염색을 실시하여 연골 수복 효과를 확인할 수 있다.

상기 도 5B에 나타난 바와 같이, 연골 재생용 조성물이 대조군에 비하여 정상 무릎 관절연골과 유사한 세포, GAG 및 콜라겐의 생성을 보이는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 본 발명에 따른 연골 재생용 조성물의 연골 재생 효과가 상대적으로 우수한 것을 확인할 수 있다.

Claims (14)

1. 미분쇄된 연골 분말; 및
   히알루론산과 카르복시메틸셀룰로스의 가교물을 포함하며,
   상기 미분쇄된 연골 분말의 함량은 조성물 전체 중량 대비 10 내지 30 중량부이고,
   상기 히알루론산과 카르복시메틸셀룰로스의 가교물의 함량은 조성물 전체 중량 대비 50 내지 80 중량부이며,
   복소점도는 35,000 내지 45,000 Pa·s인 연골 재생용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   미분쇄된 연골 분말은 연골을 동결건조하는 동결건조 단계;
   상기 동결건조된 연골을 분쇄하는 분쇄 단계; 및
   상기 분쇄된 연골을 체분리하는 체분리 단계에 의해 제조된 것인 연골 재생용 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서,
   분쇄는 조직 분쇄기를 사용하여, 30 초 내지 5 시간 동안 수행하는 것인 연골 재생용 조성물.
   
4. 제 2 항에 있어서,
   체분리는 눈금 간격이 100 내지 1000 μm인 체를 사용하여 수행하는 것인 연골 재생용 조성물.
   
5. 제 2 항에 있어서,
   체분리 단계를 수행한 후, 미분쇄된 연골 분말을 탈지방화하는 탈지방화 단계; 및
   탈세포화하는 탈세포화 단계를 추가로 포함하는 것인 연골 재생용 조성물.
   
6. 제 1 항에 있어서,
   미분쇄된 연골 분말의 평균 입경은 100 내지 900 μm인 연골 재생용 조성물.
   
7. 제 1 항에 있어서,
   미분쇄된 연골 분말은 콜라겐 30 내지 90 중량% 및 글리코사미노글리칸 5 내지 40 중량%를 포함하는 것인 연골 재생용 조성물.
   
8. 삭제
9. 삭제
10. 제 1 항에 있어서,
    히알루론산과 카르복시메틸셀룰로스의 가교물은 가교제에 의해 가교되어 제조되며,
    상기 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether), 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 연골 재생용 조성물.
    
11. 삭제
12. 삭제
13. 미분쇄된 연골 분말; 및 히알루론산과 카르복시메틸셀룰로스의 가교물을 혼합하는 단계를 포함하며,
    상기 미분쇄된 연골 분말의 함량은 조성물 전체 중량 대비 10 내지 30 중량부이고,
    상기 히알루론산과 카르복시메틸셀룰로스의 가교물의 함량은 조성물 전체 중량 대비 50 내지 80 중량부인,
    복소점도가 35,000 내지 45,000 Pa·s인 연골 재생용 조성물의 제조 방법.
    
14. 제 13 항에 있어서,
    히알루론산과 카르복시메틸셀룰로스의 가교물은 히알루론산 및 카르복시메틸셀룰로스를 가교제를 이용하여 가교하는 가교 단계; 및
    상기 가교된 가교물을 동결건조하는 동결건조 단계를 통해 제조되는 것인 연골 재생용 조성물의 제조 방법.

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