KR101772316B1 - 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물에 대한 것으로, 천연소재로서의 높은 생체적합성에도 불구하고 연골 조직 세포외기질은 짧은 분해기간 등 물성이 취약하여 적용에 한계가 존재하기 때문에 이의 물리적 또는 화학적 처리를 통하여 물성을 증진시키는 방법을 개발하였다. 본 발명은 돼지연골 유래 세포외기질을 물리화학적 방법으로 처리하여 다양한 제형의 생체소재로 제작하였고, 또한 물리화학적 처리를 했음에도 위의 연골 특이적인 기능을 유지하는 특성을 확인하였다. 또한, 돼지연골 유래 세포외기질 소재를 이용하여 체내 안정성과 유착방지 효능이 뛰어난 유착방지제로도 활용할 수 있다.

Description

생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물{Method for preparing biocompatible porcine cartilage-derived extracellular matrix membrane having adjustable in vivo degradation rate and mechanical property and composition to prevent the adhesion between tissues and/or organs}

본 발명은 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물에 관한 것이다.

천연소재는 천연물질, 동물, 인체에서 유래한 물질로서 매우 우수한 생체적합성과 생리적 기능을 가지고 있다. 대표적인 일례로 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 들 수 있는데 이는 복잡한 인체 및 동물에서 추출된 생체재료로서 세포의 기능을 제어 혹은 조절하거나 조직의 재생을 유도할 수 있다는 특징이 있다. 따라서 천연소재로 제조된 지지체는 생체에 이식 후 염증반응이 적을 뿐 아니라, 뛰어난 생체 기능성과 생분해성 등을 제공할 수 있어 이상적인 세포치료제 혹은 조직공학용 지지체의 재료로 평가받고 있다. 최근에는 동종(allogenic) 또는 이종(xenogenic) 조직이나 장기를 채취한 후, 세포를 제거(acellularized)하여 여러 가지 형태의 지지체나 막으로 사용하는 기술이 주목을 받고 있다.

한편, 연골 유래 세포외기질은 무혈관 및 무신경 조직으로서, 다른 조직의 세포외기질에 비해 조직 특이적으로 성분의 차별성이 있다. 대표적으로 연골조직에는 혈관생성을 억제하는 콘드로모듈린(chondromodulin), 트롬보스폰딘(thrombospondin), 엔도스타틴(endostatin) 등이 풍부하며, 뿐만 아니라 세포의 부착을 방지하는 루브리신(lubricin), 비글리칸(biglycan), 데코린(Decorin), 피브로모듈린(Fibromodulin) 등이 존재하고 있다. 그러나 천연소재로서의 높은 생체적합성과 기능성에도 불구하고 연골조직 세포외기질은 분해기간 조절이 어렵고, 물성이 취약하여 인체 적용에 한계가 존재하기 때문에 이의 물리적 또는 화학적 처리를 통하여 분해성을 조절하고 물성을 증진시키는 방법의 개발이 필요하다.

유착이란 분리되어 있어야 할 장기의 조직 면이 외과적 수술이나 염증에 의해 섬유성의 조직으로 연결, 융합되는 것으로 이로 인한 합병증으로 소장폐색, 후천성 여성 불임증, 자궁 외 임신, 만성 복통, 재수술 등이 발생된다. 이러한 유착은 외과적 수술 후 50~90%에서 발생되며 유착에 의해 재수술 받는 환자가 34.6%에 이를 정도로 발생이 잦다. 유착은 조직의 손상 이후 나타나는 치유 과정과 비슷하여 치유과정의 방해 없이 유착만을 방지하는 방법이 중요하다. 유착은 수술 부위의 치유과정 중에 정상적으로 침착하는 섬유소가 상처 치유과정이 완료됐음에도 불구하고 지속적으로 발생하여 인접하고 있는 다른 조직과 결합되게 만들고 궁극적으로 혈관이 침투하여 완전한 하나의 조직 혹은 기관으로 합쳐지게 된다. 이러한 유착을 방지하기 위하여 섬유소 분해를 촉진하는 약물을 쓰기도 하지만 조직 간에 물리적인 장벽(physical barrier)을 만들어 조직을 유격시키는 유착방지소재를 사용하는 경우가 많다.

기존의 유착방지 소재는 물리적인 장벽의 역할로 생분해성 소재, 즉 셀룰로스 혹은 히알룬산을 이용한 경우가 많으며, 그 밖에 콜라겐 등의 천연 소재들이 많이 이용되고 있다. 이러한 생분해성 소재는 물을 흡수하는 성질이 있고 이로 인한 가수분해를 특징으로 하고 있으며 분해 속도가 빠르기 때문에 주로 복부의 수술 후에 사용되고 있다. 이러한 제품들은 보통 젤의 형태를 갖고 있는데 투여 부위가 넓고 손상 부위에 고정이 어려운 단점이 있어 현재 상용화된 제품의 경우 유착 방지의 효과가 높지 않다. 예를 들면, 가장 많이 사용되는 유착방지제인 Interceed의 경우 그 사용으로 인한 유착방지의 효과가 60%밖에 되지 않는다(www.ethicon.com).

한편, 조직에 따라서는 재생 기간이 오래 걸리고 장기간 운동을 요하는 부위가 있다. 근골격조직, 척추관, 치아 등인데, 이들은 각기 재생이 일어나는 기간이 다르고 운동이 일어나는 부위이므로 각 조직에 대한 유착방지제는 조직에 필요한 특성을 가져야 한다. 예를 들어, 근골격조직의 손상은 수주 혹은 수개월의 재생기간이 필요하며 이 기간동안 인대나 건의 유착을 동반하는 경우가 많으며 관절에 수술적 침습을 가하는 경우 수개월에 걸친 재활운동이 필요한 경우가 많다. 따라서 이 기간동안 분해되지 않고 잔존하여 유착을 방지할 수 있는 생체소재가 필요하다. 기존의 유착방지제는 빠른 분해성을 갖고 있어 이러한 조직에 대한 적용이 적절치 않을 수 있다.

유착의 최종 단계를 혈관화이고 이 단계에 이르러서는 유착된 조직이 완전히 하나의 조직을 이루어 불가역적으로 유착이 완성되게 된다. 따라서 손상된 조직들을 건너가는 혈관의 형성을 막는 것은 매우 중요하다. 하지만 기존의 유착방지제는 단순한 장벽의 역할을 할 뿐 생리적 기능이 없어서 궁극적으로 일어날 수 있는 혈관 침투를 방지할 수 있는 약리학적 기전을 갖고 있지 않다.

대한민국 특허공개공보 제10-2010-0041027호 (2010.04.22)

본 발명의 목적은 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 돼지연골을 분리하는 단계; 상기 분리된 돼지연골을 동결건조하여 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 돼지연골분말을 탈세포화하는 단계; 상기 탈세포화된 돼지연골분말을 산성 용액 및 펩신(pepsin)과 혼합하여 처리 후, 염기성 용액으로 중화시켜 돼지연골분말 수용액을 제조하는 단계; 상기 돼지연골분말 수용액을 가교제와 혼합하여 돼지연골 유래 세포외기질 막을 제조하는 단계; 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질 막에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물을 제공한다.

본 발명은 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물에 대한 것으로, 천연소재로서의 높은 생체적합성과 기능성에도 불구하고 연골조직 세포외기질은 분해기간 조절이 어렵고 물성이 취약하여 적용에 한계가 존재하기 때문에 이의 물리적 또는 화학적 처리 및 방사선 처리를 통하여 물성을 증진시키는 방법을 개발하였다. 본 발명은 돼지연골 유래 세포외기질을 물리화학적 방법으로 처리하여 다양한 제형의 생체소재로 제작하였고, 또한 물리화학적 처리를 했음에도 위의 연골 특이적인 기능을 유지하는 특성을 확인하였다. 또한, 돼지연골 유래 세포외기질 소재를 이용하여 체내 안정성과 유착방지 효능이 뛰어난 유착방지제로도 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조공정을 나타낸다.
도 2는 연골 세포외기질 막의 가교 전후 비교 결과이다. 세포외기질 유착방지막, (좌) 가교 전, (중) 가교 후, (우) 방사선 조사 후.
도 3은 연골 세포외기질 원천재료의 성분 분석 결과이다.
도 4는 연골 세포외기질 막의 가교 전 후에 따른 기계적 물성 분석 결과이다. (a) 연골 세포외기질막의 가교 전과 후 그리고 두께에 따른 인장강도 분석 결과이다. [위] (좌) 인장강도 측정기, (중) 인장강도 측정을 위한 샘플 재단 모양, (우) 인장강도 측정을 위한 샘플 재단기. [아래] 화학 가교 전 후에 따른 인장강도 측정 결과이다. (b) 연골 세포외기질 막의 가교에 따른 봉합강도 측정(suture strength) 결과이다.
도 5는 연골 세포외기질 막의 방사선 조사에 따른 효소 분해도 실험 결과이다.
도 6은 연골 세포외기질 막의 방사선 조사에 따른 체내 분해도 실험 결과이다.
도 7은 연골 세포외기질 막에 대한 혈관 내피 세포부착 실험 결과이다.
도 8은 마우스 맹장 유착 모델을 이용한 생체 내 효과 확인 시험 결과이다. (a) 마우스 맹장 유착 모델 실험 과정 및 세포외기질 막 이식 과정을 나타낸다. (b) 세포외기질 막 이식 1주일 후 대조군과의 비교 사진이다. (c) 세포외기질 막 이식 1주일 후 대조군과의 조직학적 분석 비교 사진이다.

본 발명은 돼지연골을 분리하는 단계; 상기 분리된 돼지연골을 동결건조하여 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 돼지연골분말을 탈세포화하는 단계; 상기 탈세포화된 돼지연골분말을 산성 용액 및 펩신(pepsin)과 혼합하여 처리 후, 염기성 용액으로 중화시켜 돼지연골분말 수용액을 제조하는 단계; 상기 돼지연골분말 수용액을 가교제와 혼합하여 돼지연골 유래 세포외기질 막을 제조하는 단계; 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질 막에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 가교제는 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 방사선을 조사하는 단계는 5 내지 100KGy 감마선을 조사할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 상기 돼지연골 유래 세포외기질 막에 방사선을 처리함으로써, 생체 내 막의 분해 속도 및 물성을 조절할 수 있고, 멸균 효과를 얻을 수도 있다.

본 발명의 방법의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 탈세포하는 단계는 물리적 탈세포 방법, 화학적 탈세포 방법 또는 물리적 및 화학적 방법을 조합한 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 한다.

상기 물리적 탈세포 방법은 동결-해동법, 초음파 처리, 또는 물리적 교반을 포함한다. 상기 화학적 탈세포 방법은 상기 돼지연골 유래 분말을 저장액, 음이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, DNase, RNase 또는 트립신으로 처리하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 탈세포하는 단계는 약 0~50 ℃의 온도 범위에서 수행하는 것이 바람직하다.

상기 화학적 탈세포 방법에 있어서, 상기 저장액은 트리스 HCl(Tris HCl)(pH 8.0) 용액이고, 상기 음이온성 계면활성제는 소디움도데실설페이트(SDS), 소디움데옥시초레이트(sodium deoxycholate), 또는 트리톤 X-200(Triton X-200)이며, 상기 비이온성 계면활성제는 트리톤 X-100(Triton X-100)이고, 상기 양이온성 계면활성제는 CHAPS, 술포베타인-10(Sulfobetaine-10, SB-10), 술포베타인-16(SB-16), 또는 트리-n-부틸포스페이트(Tri-n-butyl phosphate)일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물을 제공한다.

상세하게는, 상기 돼지연골 유래 세포외기질은 수술 부위의 섬유화와 염증을 억제하여 유착 형성을 방지할 수 있다.

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이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실시예 1> 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조

1. 돼지연골의 분리

돼지연골 유래 세포외기질 파우더를 제작하기 위해 EN 12442의 "Animal tissues and their derivatives utilized in the manufacture of medical devices, part 1; Analysis and management of risk, part 2; controls on sourcing, collection and handling"을 참조하여 기준에 부합하는 시설의 돼지 무릎 연골을 구입하여 사용하였다.

2. 돼지연골의 분리 및 분쇄

돼지연골분말의 제조공정은 다음과 같다.

돼지 연골에서 연골을 잘라내어 연골 조각 (약 20 X 30 mm)을 만들고 여기에 생리식염수를 이용하여 10분간 3회 세척하여 -80℃에 냉동시킨 뒤 3일간 동결건조 시켰다. 건조된 연골 조각을 동결분쇄기(JAI, JFC-300, JAPAN)를 사용하여 약 10 ㎛ 사이즈로 동결 분쇄하여 -80℃에 보관하였다.

3. 돼지연골분말의 물리화학적 탈세포화

돼지연골분말에 존재하는 세포 및 유전물질을 제거하고, 순수한 세포외기질 성분만을 얻기 위해 다음과 같이 탈세포화 과정을 수행하였다.

상기에서 제조한 돼지연골분말을 10 g 당 저장액 (Hypotonic buffer) 500 ml을 처리하여 200 rpm으로 4℃에서 4시간 동안 교반하였다. 연골분말을 침전시켜 분리시키기 위해서 원심분리기(US-21SMT, Vision, Korea)를 사용하여 10,000 rpm에서 30분간 처리하였다.

상층액을 제거한 뒤 연골분말을 0.1% SDS (Sodium dodecyl sulfate, Bio-rad, USA) 용액에 첨가하여 200 rpm으로 4℃에서 2시간 동안 교반하였다. SDS 처리가 끝난 뒤 연골분말은 3차 증류수를 이용하여 5회 반복하여 세척하였고 세척수의 교환은 전술한 바와 같은 원심분리조건으로 진행하였다.

다음으로, 500 U/ml의 DNase (Sigma, USA) 200 ml을 처리하여 200 rpm으로 37℃ 배양기에서 12시간 동안 교반하였다. Dnase 처리 후 전술한 바와 같이 3차 증류수를 이용하여 5회 세척하였다.

탈세포화된 연골분말은 -80℃ 초저온 냉동장치에서 냉각한 후 3일간 동결건조하였다. 건조된 연골분말은 전술한 바와 같은 방법으로 파쇄하여 최종적으로 약 10 ㎛ 사이즈의 연골분말 파우더를 수득하고 필요시까지 -80℃에서 보관하였다.

4. 효소를 이용한 수용성 연골분말제조

탈세포화된 연골분말 4 g 당 100 ml의 염산수용액에 펩신(Pepsin; sigma, USA)을 처리하여 200 rpm으로 4℃에서 24시간 교반하였다.

펩신(pepsin) 처리 후, NaOH 용액을 이용하여 pH 7.4로 중화시켰다. 수용화된 연골분말은 투석막 (MWCO 1000, Spectrolab, USA)에 넣은 뒤 3차 증류수에 200 rpm으로 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 그 후 수용화된 연골분말을 용기에 담아 -80℃ 초저온 냉동장치에서 냉각시킨 후 3일간 동결건조하였다. 수용화 처리된 연골분말은 전술한 바와 같은 방법으로 약 10㎛ 사이즈를 갖는 파우더로 분쇄하여 최종적으로 -80℃ 냉동장치에 필요시까지 보관하였다.

5. 돼지연골 세포외기질 막의 제조

상기에서 제작한 수용성 연골분말 1.3 g을 3차 증류수 100 ml 에 처리한 후 200 rpm 으로 상온에서 1시간 동안 교반한다.

연골분말 수용액을 원심분리기 용기에 넣은 후 3000 rpm에서 10분간 처리하였다. pipet을 이용하여 상층액을 100 X 100 mm 사각형 실리콘 몰드에 35 ml씩 분주한 뒤 clean bench에서 48시간동안 건조 시켰다.

건조된 막 6 mg 당 0.1% 글루타르알데히드 용액(Glutaraldehyde solution; Sigma, USA) 1 ml을 처리하여 100 rpm으로 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 가교된 막은 6 mg 당 1 ml의 PBS 용액으로 3회 반복하여 100 rpm으로 30분간 세척한 뒤 이어서 3차 증류수를 이용하여 3회 세척하였다. 세척한 막은 6 mg 당 1 ml의 4M NaCl 용액을 처리하여 100 rpm으로 상온으로 30분간 처리하였다. 세척이 완료된 막은 clean bench에서 테프론 필름위에 펴서 건조 시켜 최종적으로 약 30 ㎛의 두께를 갖는 돼지연골 세포외기질 막을 제조하였다.

돼지연골 세포외기질 막의 제조공정은 도 1과 같으며, 연골 세포외기질 막의 가교 전후 비교 결과는 도 2와 같다.

6. 돼지연골 세포외기질 막의 방사선 처리(막의 분해도 조절 및 멸균)

상기에서 제작한 세포외기질 막을 은박으로 포장한 후 선량 5KGy~100KGy로 감마선 조사 시행하였다.

< 실시예 2> 연골 세포외기질 원천재료의 성분 분석

연골 세포외기질 공정 과정에 따른 원천재료의 성분분석 결과, 연골 세포외기질에 가장 많은 비중을 차지하고 있는 콜라겐과 당단백 성분의 손실이 없이 유지되고 있는 것을 확인하였다. 콜라겐은 산성용액과 펩신효소에 원천재료를 용해하여 sirius red assay를 통하여 측정하였으며, 당단백은 papain 용액에 녹여 DMMB assay를 통해 측정하였다(도 3).

< 실시예 3> 연골 세포외기질 막의 가교 전 후에 따른 기계적 물성 분석

1. 연골 세포외기질막의 가교 전과 후 그리고 두께에 따른 인장강도 분석

유착방지제로 사용되는 막은 수술부위를 충분히 보호할 수 있는 물리적 성질이 중요하기 때문에 식약처 가이드라인을 바탕으로 제품특성에 맞는 인장강도 검사를 실시하였다(도 4a).

도 4a와 같이, 재단된 세포외기질 막을 인장강도 측정기를 통하여 인장강도의 정도를 ultimate force값으로 나타내어 도표화 하였다. 결과에서 보듯이, 세포외기질 막의 두께가 증가 할수록 인장강도가 향상되었으며, 화학적 가교를 통해서도 유의성 있게 물리적 강도가 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 방사선 조사 처리된 시료의 인장강도 측정에서도 방사선 조사선량에 따라서 물리적 강도의 조절이 가능한 것을 확인하였다(도 4a).

2. 연골 세포외기질 막의 가교에 따른 봉합강도 측정 (suture strength)

유착방지용 막은 시술부위에 고정이 되어야 효과적으로 유착방지 효과를 낼 수 있기 때문에 수술시에 봉합을 하더라도 부서지지 않고 결딜 수 있는 강도가 필요하다. 봉합강도는 따로 식약처에 규정이 되어 있지 않기 때문에 자체적으로 봉합강도를 측정할 수 있는 프로토콜을 확립하여 측정하였다. 봉합강도 측정은 아래와 같이 필름을 재단하여 필름에 수술실을 이용하여 봉합 한 뒤 인장강도 측정기에 각각 수술실과 세포외기질 막을 부착하여 인장 강도를 측정하는 방법으로 진행하였다. 측정 결과 가교 후 세포외기질 막의 봉합강도가 가교 전 보다 유의성 있게 증가하는 것을 확인하였다(도 4b).

< 실시예 4> 연골 세포외기질 막의 방사선 조사에 따른 효소 분해도 실험

유착방지용 막은 시술부위에 따라 분해기간이 달라지므로 장기 특이적으로 유착방지 효과를 내기 위해서는 각 장기별 분해기간이 조절된 유착방지제를 사용해야 한다. 연골 세포외기질 막의 방사선 조사선량에 따라 분해도 조절이 가능한지 확인하기 위하여 체외에서 콜라겐분해효소를 처리한 뒤 시간에 따른 분해거동을 시험하였다. 실험은 각기 다른 방사선 조사선량으로 처리한 연골 세포외기질 막을 1X1cm로 자른 뒤 콜라겐 분해효소로 처리한 PBS에 처리하여 2주간 경과를 관찰하였다(도 5 좌). 또한 2주간 콜라겐 분해효소로 처리한 시료를 원심분리하여 상층액의 하이드로시 프롤린 (Hydroxy proline) 의 양을 분석하여 세포외기질 막의 주요성분인 콜라겐의 분해도를 측정하였다(도 5 우). 측정결과 방사선 조사선량에 따라 콜라겐분해효소 처리 시 세포외기질 막의 분해도가 조절되는 것을 확인하였다.

< 실시예 5> 연골 세포외기질 막의 방사선 조사에 따른 체내 분해도 실험

세포외기질 막의 방사선 조사에 따른 체내 생분해도의 차이를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다.

도 1에서 제작한 연골 세포외기질 막과 연골 세포외기질에 방사선 조사된 막의 이오가스 멸균을 실시하였다. 그리고 각각의 막을 Rat의 피하를 절개한 후 이식시킨 뒤 다시 봉합하여 4주간 생분해도를 관찰하였다. 그 결과, 방사선 조사에 따라 체내 피하에서의 생분해도가 조절되는 것을 확인하였다(도 6).

<실시예 6> 연골 세포외기질 막에 대한 혈관 내피 세포부착 실험

도 1에서 제작한 연골 세포외기질 막을 이용하여 유착 기전에서 작용되는 혈관 내피 세포의 부착 차이를 다음과 같이 확인하였다.

도 1에서 제작한 연골 세포외기질 막과 cover glass를 직경 5mm의 별개의 24 well 디쉬에 부착시킨 뒤 건조시켜 고정하고, 이오가스 멸균을 실시하였다. 그리고 각각 막이 코팅된 디쉬와 cover glass 그리고 코팅되지 않은 24 well plate에 2x10⁴ 혈관 내피세포를 이식하여 24시간 동안 부착을 시켰다. 그 후 각 표면에 부착된 세포를 calein 염색을 한 뒤 형광현미경을 통해 관찰하였다. 그 결과, 세포 외기질 막을 코팅한 디쉬에서 covel glass와 well plate에 비하여 세포 부착이 억제되는 것을 확인하였다(도 7).

< 실시예 7> 마우스 맹장 유착 모델을 이용한 생체 내 효과 확인 시험

(1) 8주령된 C57BL6 마우스를 이용하여 유착모델을 제작하였다. 마우스 복부의 피부층과 근육층을 각각 절개한 뒤, 근육층과 피부층을 봉합하여 손상된 조직 사이에서 유착이 발생하는 모델을 만들어서 유착 효과를 확인하였다. 유착 조직은 1주에 발생되었으며 근육과 피부를 강하게 부착 시키는 유착 모델이 형성되었다(도 8a).

(2) 상기에서 제작된 피하 유착 모델에서 근육층과 피부층 사이 유착 조직이 형성되는 부위에 연골 세포외기질 막을 이식한 후 1주 결과를 확인하였다. 유착만 유도한 그룹에서는 1주에서 유착 조직이 상처를 감싸고 두껍게 생성되었다. 연골 세포외기질막을 이식한 경우 근육층과 피부층이 분리되었으며 유착조직 또한 형성되지 않은 것을 볼 수 있다(도 8b).

(3) 상기에서 획득한 조직을 헤마톡실린과 에오신 염색을 통해서 세포와 세포질 염색을 실시하였다. 그 결과 연골 세포외기질 막 자체에 세포가 집중 되면서 근육층과 피부층을 물리적으로 방어하면서 두 조직 사이에 유착 조직이 형성되지 못하게 하는 역할을 하였다(도 8c).

Claims (5)

1. 돼지연골을 분리하는 단계;
   상기 분리된 돼지연골을 동결건조하여 분쇄하는 단계;
   상기 분쇄된 돼지연골분말을 탈세포화하는 단계;
   상기 탈세포화된 돼지연골분말을 산성 용액 및 펩신(pepsin)과 혼합하여 처리 후, 염기성 용액으로 중화시켜 돼지연골분말 수용액을 제조하는 단계;
   상기 돼지연골분말 수용액을 가교제와 혼합하여 돼지연골 유래 세포외기질 막을 제조하는 단계; 및
   상기 돼지연골 유래 세포외기질 막에 5 내지 100KGy 감마선을 조사하는 단계를 포함하는 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 가교제는 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)인 것을 특징으로 하는 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법.
3. 삭제
4. 제1항 또는 제2항에 따라 제조된 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막.
5. 제4항에 있어서, 상기 돼지연골 유래 세포외기질 막은 조직의 유착 형성을 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막.

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