KR20150067518A - 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하여 수술 후 유착 방지용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동물 무릎연골 세포 유래의 세포외 기질막(chondrocyte derived extracellular membrane; ECM)을 유효성분으로 함유하여 외과수술 후 유착 형성 방지용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물 무릎연골 세포 유래의 세포외 기질막(chondrocyte derived extracellular membrane; ECM)은 사시증 환자의 외과수술 후 상처부위의 섬유화와 염증을 억제하여 유착 형성을 방지함으로써 외과수술 후 수술부위의 유착에 의한 합병증을 예방할 수 있다.

Description

연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하여 수술 후 유착 방지용 조성물{Composition for preventing of postoperative adhesion comprising chondrocyte-derived extracellular matrix membrane}

본 발명은 동물 무릎연골 세포 유래의 세포외 기질막(chondrocyte derived extracellular membrane; ECM)을 함유하여 수술 후 유착 형성 예방 또는 치료에 제공되는 조성물에 관한 것이다.

외과수술 후 조직의 유착은 장기를 포함하는 조직의 정상적인 운동을 방해하기 때문에 외과수술 후의 합병증 중에서도 중요한 문제로 파악되고 있다.

건의 수술에 있어서 유착은 운동장애를 초래하고 복강내 수술 후 장기 유착은 장폐색이나 동통등의 합병증의 원인이 된다. 특히 안구 사시증 수술의 경우 수술 후 유착은 수술 실패의 중요한 원인으로 한번 발생한 유착은 회복이 어려우며 심각한 유착형성은 외안근에 영향을 주어 안구 운동성에 문제를 일으킨다. 또한 유착 진행에 의한 복시가 일어난 경우, 가능한 많은 흉터를 제거하는 재수술이 필요하지만, 사시증 수술 후 유착이 발생한 경우 재수술과 수술 후 적응에 어려움이 있으며, 재수술을 진행한다 하여도 완벽한 복시 치료가 어렵다. 그러므로, 보다 안정적으로 외과수술의 성공률 향상을 위해서 수술 후 염증과 유착 예방을 위한 연구가 필요하다.

사시증 수술 후 유착은 부주의한 수술진행, 반복적인 재수술, 과도한 출혈, 봉합 재료의 이물 반응 및 수술 후 감염이 원인이 된다. 따라서, 신중하며 비외상적인 외과적 기술이 수술 후 유착을 예방하는 가장 좋은 방법이나, 그럼에서도 불구하고 수술의 이차적 외상성 조직 손상, 출혈 및 염증이 불가피하며, 수술 후 어느 정도의 유착은 자연스러운 현상이다.

상기 문제점과 같은 외과적 유착을 해결하기 위하여 양막, 수퍼라마이드(Supramide Extra®; Jackson, Alexandra, VA, USA),실리콘 슬리브, 폴리글락틴 910 메쉬(Vicryl mesh®, Ethicon Inc., Somerville, NJ, USA), 폴리펩타이드 슬리브, 산화 재생 셀룰로오르 슬리브(Interceed®, Johnson and Johnson Medical Inc., Arlington, TX, USA), 소디움 하이알루로네이트 및 Seprafilm®(Genzyme, Cambridge, MA, USA)와 같은 물리적 장벽을 이용하거나 미토마이신 C와 5-플루오로우라실과 같은 항대사길항 물질이 사용되고 있으나, 상기 물리적 장벽은 전위 또는 재유착과 같은 문제점이 있으며, 항대사길항 물질 역시 공막괴사 또는 각막 상피세포 손상과 같은 심각한 합병증의 위험이 있다.

따라서, 사시증 수술을 포함한 외과적 수술 후 유착 예방 또는 치료를 위한 보다 안전하고 효과적인 방법의 개발이 필요한 실정이다.

한국 공개특허 제10-20008-7022628호 공보

본 발명은 연골세포 유래의 세포외 기질막(chondrocyte derived extracellular membrane; ECM)을 유효성분으로 함유하는 조성물을 이용하여 수술 후 상처부위에 형성되는 유착을 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 연골세포 유래의 세포외 기질막(chondrocyte derived extracellular membrane; ECM)을 안구의 사시증 수술 후 수술 부위의 섬유화와 염증을 억제하여 유착 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

상기 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하여 수술 후 유착 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

구체예로 상기 수술은 사시증 수술일 수 있다.

상기 연골세포 유래 세포외 기질막은 동물의 무릎 관절 연골 세포에서 분비되어 형성된 연골세포 유래 세포외 기질일 수 있다.

상기 연골세포 유래 세포외 기질막은 수술 부위의 섬유화와 염증을 억제하여 유착 형성을 방지할 수 있다.

또한 상기 연골세포 유래 세포외 기질막은 연고, 분말, 겔, 필름, 슬랩, 랩 및 스펀지 형태의 이식재 또는 차단제로 제공되어 수술 부위의 유착 형성을 방지할 수 있다.

본 발명에 따른 동물 무릎연골 세포 유래의 세포외 기질막(chondrocyte derived extracellular membrane; ECM)을 함유하는 조성물을 이용하여 외과수술 환자의 수술 부위의 섬유화와 염증을 억제함으로써 수술 후 조직의 유착을 방지하여 수술 부위의 유착형성에 의한 합병증, 치료지연 및 재수술 어려움과 같은 문제를 예방할 수 있다.

도 1은 하기 실시예 1의 방법으로 제조된 둥근 모양의 얇은 필름 형태의 세포 유래 ECM 막의 모습이다.
도 2는 세포 유래 ECM 막을 토끼 눈의 절제된 결막과 외안근 사이에 삽입한 모습이다.
도 3은 사시 수술 후 2주차 광학 현미경 분석 결과로 A와 C는 수술-ECM 처리 그룹이며 B와 D는 수술-ECM 비처리 그룹으로 A와 B는 염증 정도를 확인하기 위해 수행한 헤마톡실린-에오신 염색 결과이며, C와 D는 섬유화 정도를 비교하기 위해 수행한 메이슨 트리크롬 염색결과이다.
도 4는 사시 수술 후 4주차 광학 현미경 분석 결과로 A와 C는 수술-ECM 처리 그룹이며 B와 D는 수술-ECM 비처리 그룹으로 A와 B는 염증 정도를 확인하기 위해 수행한 헤마톡실린-에오신 염색 결과이며, C와 D는 섬유화 정도를 비교하기 위해 수행한 메이슨 트리크롬 염색결과이다.
도 5는 사시 수술 후 6주차 광학 현미경 분석 결과로 A와 C는 수술-ECM 처리 그룹이며 B와 D는 수술-ECM 비처리 그룹으로 A와 B는 염증 정도를 확인하기 위해 수행한 헤마톡실린-에오신 염색 결과이며, C와 D는 섬유화 정도를 비교하기 위해 수행한 메이슨 트리크롬 염색결과이다.

본 발명은 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하여 수술 후 유착 방지용 조성물을 제공한다. 보다 상세하게는 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하여 사시증 수술 환자의 수술 후 유착 방지용 조성물을 제공한다.

상기 연골세포 유래 세포외 기질막은 동물의 무릎 관절 연골 세포에서 분비되어 형성된 연골세포 유래 세포외 기질일 수 있으며, 상기 연골세포 유래 세포외 기질막은 수술 부위의 섬유화와 염증을 억제하여 유착 형성을 방지할 수 있다.

보다 상세하게는 토끼의 안구에 사시 수술 후 연골세포 유래 세포외 기질 막(ECM)을 결막과 외안근 사이에 삽입한 수술 후 ECM 처리 그룹(수술-ECM 처리 그룹)과 대조군으로 수술 후 연골세포 유래 세포외 기질막(ECM)을 처리하지 않은 수술 후 ECM 비처리 그룹(수술-ECM 비처리 그룹)의 섬유화와 염증 정도를 확인한 결과, 표2 및 도 3 내지 도 5와 같이 수술-ECM 처리그룹이 ECM 비처리그룹 보다 섬유화 정도 및 염증의 정도가 낮은 것을 확인할 수 있었으며 유착 정도를 나타내는 표 1의 결과와 같이 수술-ECM 처리 그룹의 외안근과 결막사이의 유착이 억제된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 연골세포 유래 세포외 기질막(ECM)은 외과수술 후 수술 부위의 섬유화와 염증 억제를 통하여 유착 형성을 방지하는데 효과적임이 확인되었다.

상기 효과를 나타내는 연골세포 유래 세포외 기질막(ECM)은 연고, 분말, 겔, 필름, 슬랩, 랩 및 스펀지 형태의 이식재 또는 차단제로 제공되어 수술 부위의 유착 형성을 방지할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

하기의 참조예는 본 발명에 따른 각각의 실시예에 적용되는 참조예를 제공하기 위한 것이다.

< 참조예 > 통계 분석

두 그룹의 염증 및 섬유화를 수치화하여 비교하였다.

수술-ECM 처리 그룹과 수술-ECM 비처리 그룹 사이의 염증 및 섬유화의 점수 비교는 the Wilcoxon signed rank test를 이용하여 분석하고 P < 0.05의 값을 유의한 값으로 보았으며 그 결과를 ± 평균의 표준 편차로 나타내었다.

< 실시예 1> 동물 준비

2.0kg의 12 주령 뉴질랜드 알비노 토끼 24마리를 Orient Bio Laboratory Animals (Daejeon, Korea)에서 구입하여 사용하였다.

토끼 도착 후 7일 동안 아무것도 첨가하지 않은 탈 이온수와 일반 식이를 하였다. 모든 실험 과정은 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 준수하여 설계되었으며, NIH에서 발간한 실험 동물 관리 및 사용에 대한 지침서를 따랐다.

< 실시예 2> 세포 유래 ECM 막 제조

2 주령 돼지의 무릎 연골로부터 연골세포를 분리하여 배양하였다. 연골세포 유래 ECM 막을 배양 플레이트에서 분리하고 원심분리하여 굳힌 다음 펠렛 형 구조물을 배양하였다. 배양된 연골 구조물을 동결건조하여 세포 구성물질을 제거하고 무세포 다공성 막을 제조하였다.

완벽한 세포 구성물질 제거를 확인하기 위하여, 4',6-디마이디노-2-페닐린돌(DAPI) 형광 염료(Invitrogen, USA)로 염색하여 ECM 막 안의 데옥시리보뉴클레익산(DNA)함량을 정량하였다.

정량결과 DAPI의 양성 염색이 발견되지 않았으며 이를 통하여 생체막으로부터 모든 동물 연골세포가 효과적으로 제거되었음이 확인되었다.

상기 연골세포 유래 ECM 막을 안구 표면에 사용할 수 있도록 얇고 반투명의 막으로 제작하고 감마 방사선으로 살균하여 실험에 사용하였다.

< 실시예 3> 동물 사시 수술

총 24 마리의 수컷 뉴질랜드 알비노 토끼를 사용하였으며, 전 실험 과정에서 토끼를 틸레타민/졸라제팜(Zoletil®Virbac, Carros, France: 50mg/kg body weight), 자일라진(Rompun® Bayer, Leverkusen, Germany: 10mg/kg body weight) 및 아트로핀 황산염(Jeil, Daegu, korea: 0.5mg/kg)을 근육내에 주사하여 마취시켰다. 또한 하기 모든 외과적 수술은 0.5% 프로파라카인 하이드록시클로라이드(Alcaine® Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, TX, USA)를 추가 국소 마취하여 시행하였다.

먼저, 24마리 토끼의 오른쪽 눈에 외안근 절제술을 시행하였다. 절제술 전에 눈꺼풀을 폴리비닐피롤리드온아이오다인(polyvinylpyrrolidoneiodine)으로 소독하고 윤부 각막주위절개술 후 외안근을 자메슨후크(Jameson hook)로 분리해내고 근육간의 연결을 절개하였으며 같은 모양과 크기로 절개하여 표준화하였다.

6-0 폴리글락틴(Vicryl®Ethicon, Somerville, NJ, USA) 봉합 물질을 이용하여 두 단일 팔 봉합을 근육 정지점으로부터 후방 근육의 3mm 경계 부분에 위치하도록 하여 사각 매듭으로 고정하였다.

수술-ECM 처리 그룹은 상기 실시예 2와 같이 제조한 세포 유래의 ECM 막 6×6 mm를 수화시킨 후 도 2와 같이 연골세포 유래의 ECM 막의 미끄러짐을 예방하기 위해서 추가적인 봉합 없이 절제된 근육의 상층 표면과 결막 사이에 위치시켰다.

또한 결막의 상처부위는 8-0 폴리글락틴(Vicryl®Ethicon, Somerville, NJ, USA)으로 봉합하여 폐쇄하였다.

반면, 대조군인 수술-ECM 비처리 그룹은 상기 동일한 외과적 수술을 24마리 토끼의 왼쪽 눈에 시행한 후 세포 유래 ECM 막을 처리하지 않았다.

상기 수술 과정이 끝난 후에 오플록사신 연고(Tarivid® Santen Pharmaceutical Company, Osaka, Japan)를 외과적으로 수술된 눈의 국소부위에 처방하고 2mg의 겐타마이신을 허벅지 근육에 즉시 주사하였다. 그런 다음, 레보플록사신(Cravit® Santen Pharmaceutical Company, Osaka, Japan)을 하루에 3회씩 일주일 동안 국소 투여하였다.

< 실시예 4> 병리조직학적 분석

4-1. 병리조직학적 분석을 위한 시료준비

상기 실시예 3과 같이 외과적으로 처리된 근육 주위에 형성된 수술 후 유착에 대한 세포 유래 ECM 막의 억제효과를 확인하기 위하여 토끼 안구의 병리학적 분석을 수행하였다.

병리조직학적 조사는 수술 후 2, 4 및 6주의 토끼 8마리에 펜토바르비탈 염 250 mg을 귀 정맥을 통하여 빠르게 관류시켜 희생시키고 8마리 토끼의 16개 안구의 결막, 결막하 공간 조직 및 절제된 외안근이 부착되어 있는 전위 부분을 적출한 후 안구를 완충 포르말린 용액을 이용하여 하룻밤 동안 고정시키고 파라핀에 깊숙이 박았다.

각막, 공막, 결막 및 외안근을 포함한 전위 부분을 4μM두께로 수직 절편 후 슬라이드에 올려 건조시켰다.

4-2. 조직 염색 확인

각각의 안구의 절제된 외안근의 정지점으로부터 후방 2mm의 연속적인 3조각 을 이용하였다. 각각 4μM두께의 조직에 염증 분석을 위하여 헤마톡실린-에오신 염색하였으며 또한 콜라겐 섬유를 확인하기 위하여 메이슨 트리크롬 염색을 수행한 후 염증과 섬유화 정도를 보고되어진 방법(Ozkan et al)에 따라 0 내지 4 등급으로 분류하였다.

염증 반응은 림프구, 혈장세포, 조직구 및 다핵백혈구로 구성되었으며 염증 등급에 따라, 등급 0은 염증반응 없음; 등급 1은 상피세포 아래 약간의 림프구와 혈장세포; 2는 상피세포 아래 밀집되어있을 뿐만 아니라 가벼운 염증으로 림프구, 혈장세포 및 다핵백혈구 침투; 등급 3은 등급 2에 추가로 상피세포 안에 호중구; 등급 4는 상피내 뿐만 아니라 상피하에 궤양과 높은 농도의 림프구, 혈장세포, 다핵백혈구 및 조직구의 정도로 등급화하였다.

또한 섬유화는 콜라겐 형성량을 기초로하여 0 내지 4 등급으로 분류하였으며, 등급 0은 섬유화 없음; 등급 1은 가벼운 근육주변의 섬유화 반응(콜라겐 염색을 통해서만 발견가능한 근육 바로 옆 얇은 밴드); 등급 2는 쉽게 확인되는 두꺼운 밴드; 등급 3은 잘 발달 되고 밀집한 콜라겐 밴드; 등급 4는 대부분의 영역을 대체한 심각한 섬유화 정도로 분류하였다.

4-3. 결과

토끼의 안와 변화를 조사하기 위하여 매일 모니터링하였다.

모든 토끼는 유착 평가와 병리조직학적 조사를 위한 희생 전까지 건강하게 생존하였으며 일반 식이를 하였다. 대부분 눈의 각막 외과수술 부위에서 가벼운 충혈이 확인된 반면, 희생된 토끼의 근육 부검에서 안구, 안구주위 또는 안와에 주목할만한 변화는 발견되지 않았으며 뿐만 아니라 전체적인 변화도 확인되지 않았다.

수거된 수술-ECM 처리그룹을 확인한 결과, 수술 2주 후 수술-ECM 처리그룹의 세포 유래 ECM 막은 절제된 근육의 상층 표면과 결막 사이에 적절하게 위치해 있었다. 반면, 수술 후 4주차에서는 세포 유래 ECM 막일 완전히 흡수되어 발견되지 않았다.

또한 결막과 외안근 사이의 유착 등급을 확인한 결과, 표 1과 같이 수술-ECM 처리그룹은 수술 2주 후의 유착정도는 1.60이었으며, 수술 4주 후는 1.73, 수술 6주 후는 1.78로 나타난 반면, 대조군인 수술-ECM 비처리그룹의 결막과 외안근 사이의 유착 정도는 수술 2주 후는 2.83, 수술 4주 후는 2.89 및 수술 6주 후는 2.93으로 확인되었다. 또한 외안근과 공막의 유착 정도를 확인한 결과, 표 1을 참고로 하면 수술-ECM 처리그룹의 유착 정도는 수술 2주 후 2.49였으며, 수술 4주 후는 2.64, 수술 6주 후는 2.71로 나타난 반면, 수술-ECM 비처리그룹은 각각 2.95, 3.04 및 3.10으로 확인되었다.

상기 결과로부터 연골세포 유래 ECM 막은 수술 후 결막과 외안근 사이의 유착을 억제하는 것으로 확인되었다.

현미경 분석결과 어떠한 시료에서도 근육 괴사는 발견되지 않았다.

반면, 현미경 분석 결과를 통한 두 그룹의 염증 및 섬유화 등급을 점수로 나타낸 표 2를 참조하면, 외안근과 결막 하에 연결된 조직의 병리학적 분석결과 수술 2주 후와 4주 후의 수술-ECM 처리그룹의 염증 정도가 수술-ECN 비처리그룹 보다 약간 높게 나타났으나 수술 후 2주, 4주 및 6주의 P 값은 각각 P=0.52, P=0.55 ,P=0.82로 통계적으로 유의한 차이가 없었다.

또한 섬유화 평가에서 수술-ECM 처리그룹이 수술-ECN 비처리그룹 보다 적게 섬유화가 형성된 것을 표 2 및 도 3 내지 도 5로 확인하였다.

수술 2주 후, 수술 4주 후 및 수술 6주 후 두 그룹의 조직학적 분석을 통한 유착정도 비교

시간	유착부위	수술-ECM 처리그룹	수술-ECN 비처리그룹	P*
2주 후	C/M	1.60±0.52	2.83±0.73	0.01
	M/S	2.49±0.71	2.95±0.67	0.72
4주 후	C/M	1.73±0.66	2.89±0.55	0.03
	M/S	2.64±0.52	3.04±0.61	0.79
6주 후	C/M	1.78±0.72	2.93±0.54	0.04
	M/S	2.71±0.63	3.10±0.59	0.82

C/M:결막과 외안근 사이의 유착, M/S:외안근과 공막 사이의 유착

P*:Wilcoxon signed rank test

수술 2주 후, 수술 4주 후 및 수술 6주 후 두 그룹의 조직학적 분석을 통한 염증 및 섬유화 정도 비교

시간	유착부위	수술-ECM 처리그룹	수술-ECN 비처리그룹	P*
2주 후	염증	2.00±1.00	1.60±0.89	0.52
	섬유화	1.80±0.84	2.80±0.45	0.04
4주 후	염증	1.40±0.55	1.20±0.45	0.55
	섬유화	1.20±0.84	2.60±0.55	0.03
6주 후	염증	0.75±0.46	0.86±0.83	0.82
	섬유화	0.75±0.46	1.88±0.61	0.02

P*:Wilcoxon signed rank test

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

1. 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하는 수술 후 유착 방지용 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 수술은 사시증 수술인 것을 특징으로 하는 수술 후 유착 방지용 조성물.
3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 연골세포 유래 세포외 기질막은 동물의 무릎 관절 연골 세포에서 분비되어 형성된 연골세포 유래 세포외 기질인 것을 특징으로 하는 유착 방지용 조성물.
4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 연골세포 유래 세포외 기질막은 수술 부위의 섬유화 및 염증을 억제하여 유착 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 유착 방지용 조성물.
5. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 연골세포 유래 세포외 기질막은 연고, 분말, 겔, 필름, 슬랩, 랩 및 스펀지 형태로 이루어진 군에서 선택되어진 형태의 이식재 또는 차단제로 제공되는 것을 특징으로 하는 유착 방지용 조성물.
   

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