WO2017155328A1 - 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물 - Google Patents

생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2017155328A1
WO2017155328A1 PCT/KR2017/002563 KR2017002563W WO2017155328A1 WO 2017155328 A1 WO2017155328 A1 WO 2017155328A1 KR 2017002563 W KR2017002563 W KR 2017002563W WO 2017155328 A1 WO2017155328 A1 WO 2017155328A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
extracellular matrix
cartilage
derived
porcine
porcine cartilage
Prior art date
Application number
PCT/KR2017/002563
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
민병현
김영직
송보람
윤희웅
정성린
임윤묵
박종석
권희정
Original Assignee
아주대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아주대학교산학협력단 filed Critical 아주대학교산학협력단
Priority to JP2018567556A priority Critical patent/JP6961629B2/ja
Priority to US16/083,564 priority patent/US20190070336A1/en
Priority to EP17763589.3A priority patent/EP3427765A4/en
Priority to CN201780016682.7A priority patent/CN108834404A/zh
Publication of WO2017155328A1 publication Critical patent/WO2017155328A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3633—Extracellular matrix [ECM]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/005—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
    • A61L2/0011—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using physical methods
    • A61L2/0029—Radiation
    • A61L2/0035—Gamma radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3612—Cartilage, synovial fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3645—Connective tissue
    • A61L27/3654—Cartilage, e.g. meniscus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/04—Macromolecular materials
    • A61L31/043—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking

Definitions

  • the present invention relates to a biocompatible porcine cartilage-derived extracellular matrix membrane manufacturing method capable of controlling degradation rate and physical properties in vivo, and an anti-adhesion composition containing the porcine cartilage-derived extracellular matrix as an active ingredient.
  • Natural materials are derived from natural materials, animals and the human body and have very good biocompatibility and physiological functions.
  • An example is an extracellular matrix (ECM), which is a biomaterial extracted from a complex human body and an animal, and is characterized by controlling or regulating the function of a cell or inducing tissue regeneration. Therefore, the support made of natural materials has been evaluated as an ideal cell therapeutic or tissue engineering support because it can provide excellent bio-functionality and biodegradability as well as less inflammatory response after implantation into a living body.
  • ECM extracellular matrix
  • allogenic or xenogenic tissues or organs have been harvested, and then, acellularized and attracted attention have been used for various types of scaffolds or membranes.
  • cartilage-derived extracellular matrix is avascular and nerve-free tissue, there is a tissue-specific distinction compared to the extracellular matrix of other tissues.
  • cartilage tissue is rich in chondroimodulin, thrombospondin, and endostatin that inhibit angiogenesis, as well as lubricin and beaglely, which prevent cell adhesion. Biglycan, decorin, fibromodulin and the like.
  • the extracellular matrix of cartilage tissue is difficult to control the degradation period, and due to its weak physical properties, there is a limit to application to the human body. The development of a method to make it necessary.
  • Adhesion means that the tissues of the organs that should be separated are connected and fused to the fibrous tissue by surgery or inflammation. Complications are small bowel obstruction, acquired female infertility, ectopic pregnancy, chronic abdominal pain, and reoperation. . These adhesions occur in 50-90% of the patients after surgery, and the frequency of reattachment is 34.6%. Adhesion is similar to the healing process that occurs after tissue damage, so it is important to prevent adhesion only without interrupting the healing process. Adhesions continue to occur during the healing of the surgical site, even though the wound healing process is complete, resulting in binding to other adjacent tissues, and ultimately invading the blood vessels into one complete tissue or organ. . In order to prevent such adhesion, drugs that promote fibrin breakdown are used, but anti-adhesion materials are often used to create a physical barrier between tissues and to space the tissues.
  • biodegradable materials that is, cellulose or hyaluronic acid, as a physical barrier, and other natural materials such as collagen are used.
  • biodegradable materials have the property of absorbing water and are characterized by hydrolysis and are used mainly after abdominal surgery because of their rapid decomposition rate.
  • These products usually have the form of a gel, which has a disadvantage of having a wide administration site and difficult fixation at an injured site.
  • Interceed the most commonly used anti-adhesion agent, produces only 60% of its anti-adhesion effect (www.ethicon.com).
  • the final stage of adhesion is vascularization and by this stage the adherent tissue becomes a single tissue, irreversibly completing the adhesion. Therefore, it is very important to prevent the formation of blood vessels across damaged tissues.
  • existing anti-adhesion agents serve as simple barriers and do not have a pharmacological mechanism that prevents vascular invasion that can ultimately occur due to lack of physiological function.
  • An object of the present invention is to provide a biocompatible porcine cartilage-derived extracellular matrix membrane manufacturing method capable of controlling degradation rate and physical properties in vivo and an anti-adhesion composition containing the porcine cartilage-derived extracellular matrix as an active ingredient.
  • the present invention comprises the steps of separating the pig cartilage; Freeze-drying and grinding the separated pork cartilage; Decellularizing the ground pig cartilage powder; Mixing the decellularized porcine cartilage powder with an acidic solution and pepsin, and then neutralizing it with a basic solution to prepare an aqueous porcine cartilage powder solution; Preparing a porcine cartilage-derived extracellular matrix membrane by mixing the aqueous solution of pig cartilage with a crosslinking agent; And it provides a biocompatible porcine cartilage-derived extracellular matrix membrane manufacturing method that can control the degradation rate and physical properties in vivo comprising the step of irradiating the pig cartilage-derived extracellular matrix membrane.
  • the present invention provides a composition for preventing adhesion, comprising a pig cartilage-derived extracellular matrix prepared by the above method as an active ingredient.
  • the present invention relates to a biocompatible porcine cartilage-derived extracellular matrix membrane manufacturing method capable of controlling degradation rate and physical properties in vivo, and to an anti-adhesion composition containing the porcine cartilage-derived extracellular matrix as an active ingredient, having high biocompatibility as a natural material.
  • the extracellular matrix of cartilage tissues is difficult to control the degradation period and the physical properties are limited. Therefore, the method has been developed to improve the physical properties through physical or chemical treatment and radiation treatment.
  • the porcine cartilage-derived extracellular matrix was treated with physicochemical methods to produce biomaterials of various formulations, and the physicochemical treatment was performed to confirm the characteristics of maintaining cartilage specific functions.
  • it can also be used as an anti-adhesion agent having excellent stability in the body and anti-adhesion effect using porcine cartilage-derived extracellular matrix material.
  • Figure 1 shows a pig cartilage-derived extracellular matrix membrane manufacturing process of the present invention.
  • Figure 2 is a comparison result before and after crosslinking of the cartilage extracellular matrix membrane. Extracellular matrix anti-adhesion film, before (left) crosslinking, after (middle) crosslinking, (right) after irradiation.
  • Figure 3 is a component analysis of the cartilage extracellular matrix source material.
  • Figure 6 is a result of in vivo disassembly experiment according to the irradiation of the cartilage extracellular matrix membrane.
  • Figure 7 shows the results of vascular endothelial cell adhesion to the cartilage extracellular matrix membrane.
  • Figure 8 is a result of confirming the effect in vivo using the mouse cecum adhesion model.
  • (a) Mouse cecal adhesion model experimental procedure and extracellular matrix membrane transplantation process are shown.
  • (b) One week after extracellular matrix membrane transplantation, comparison with control group.
  • (c) 1 week after extracellular matrix membrane transplantation.
  • the present invention comprises the steps of separating the pig cartilage; Freeze-drying and grinding the separated pork cartilage; Decellularizing the ground pig cartilage powder; Mixing the decellularized porcine cartilage powder with an acidic solution and pepsin, and then neutralizing it with a basic solution to prepare an aqueous porcine cartilage powder solution; Preparing a porcine cartilage-derived extracellular matrix membrane by mixing the aqueous solution of pig cartilage with a crosslinking agent; And it provides a biocompatible porcine cartilage-derived extracellular matrix membrane manufacturing method that can control the degradation rate and physical properties in vivo comprising the step of irradiating the pig cartilage-derived extracellular matrix membrane.
  • the crosslinking agent may be glutaraldehyde, but is not limited thereto.
  • the step of irradiating the radiation may be irradiated with 5 to 100KGy gamma rays, but is not limited thereto.
  • the step of decellularizing is characterized in that it is performed by a physical decellularization method, a chemical decellularization method or a combination of physical and chemical methods.
  • the physical decellularization methods include freeze-thaw, sonication, or physical agitation.
  • the chemical decellularization method is characterized in that the porcine cartilage derived powder is treated with a stock solution, anionic surfactant, nonionic surfactant, cationic surfactant, DNase, RNase or trypsin.
  • the decellularizing step is preferably performed at a temperature range of about 0 ⁇ 50 °C.
  • the stock solution is Tris HCl (pH 8.0) solution
  • the anionic surfactant is sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium deoxycholate, or Triton X-200
  • the nonionic surfactant is Triton X-100
  • the cationic surfactant is CHAPS, sulfobeta-10 (Sulfobetaine-10, SB- 10), sulfobetaine-16 (SB-16), or tri-n-butyl phosphate.
  • the present invention provides a composition for preventing adhesion, comprising a pig cartilage-derived extracellular matrix prepared according to the above method as an active ingredient.
  • porcine cartilage-derived extracellular matrix can prevent the formation of adhesion by inhibiting fibrosis and inflammation of the surgical site.
  • the composition may be provided in the form of ointment, powder, gel, film, slab, wrap or sponge to prevent adhesion formation at the surgical site.
  • porcine cartilage-derived extracellular matrix powders For the preparation of porcine cartilage-derived extracellular matrix powders, see EN 12442, "Animal tissues and their derivatives utilized in the manufacture of medical devices, part 1; Analysis and management of risk, part 2; controls on sourcing, collection and handling". The pig knee cartilage of the facility that meets the criteria was purchased and used.
  • Pig cartilage powder manufacturing process is as follows.
  • Cartilage was cut from pork cartilage to make cartilage pieces (about 20 X 30 mm), washed three times with physiological saline for 10 minutes, frozen at -80 ° C and lyophilized for 3 days.
  • the dried cartilage pieces were lyophilized to a size of about 10 ⁇ m using a freeze mill (JAI, JFC-300, JAPAN) and stored at -80 ° C.
  • the pig cartilage powder prepared above was treated with 500 ml per 10 g of a stock solution (Hypotonic buffer) and stirred at 200 rpm for 4 hours at 4 ° C. In order to precipitate and separate the cartilage powder, it was treated for 30 minutes at 10,000 rpm using a centrifuge (US-21SMT, Vision, Korea).
  • cartilage powder was added to 0.1% SDS (Sodium dodecyl sulfate, Bio-rad, USA) solution and stirred at 200 ° C. for 2 hours at 200 rpm. After the SDS treatment, the cartilage powder was washed 5 times using tertiary distilled water, and the exchange of the wash water was performed under the centrifugal conditions as described above.
  • SDS Sodium dodecyl sulfate, Bio-rad, USA
  • the decellularized cartilage powder was lyophilized for 3 days after cooling in an -80 ° C cryogenic freezer.
  • the dried cartilage powder was crushed in the same manner as described above to finally obtain a cartilage powder powder of about 10 ⁇ m size and stored at -80 °C until needed.
  • Soluble cartilage powder was placed in a dialysis membrane (MWCO 1000, Spectrolab, USA) and stirred in distilled water at 200 rpm for 24 hours at 200 rpm. Thereafter, the received cartilage powder was placed in a container, cooled in a -80 ° C cryogenic freezer, and lyophilized for 3 days. Soluble cartilage powder was pulverized into a powder having a size of about 10 ⁇ m in the same manner as described above and finally stored in a -80 ° C. freezer until needed.
  • aqueous cartilage powder prepared above was treated with 100 ml of tertiary distilled water, followed by stirring at 200 rpm for 1 hour at room temperature.
  • the aqueous solution of cartilage powder was placed in a centrifuge container and treated at 3000 rpm for 10 minutes.
  • the supernatant was dispensed 35 ml into a 100 X 100 mm square silicone mold using a pipet and dried for 48 hours on a clean bench.
  • the extracellular matrix membrane prepared above was packaged with silver foil and subjected to gamma irradiation with a dose of 5KGy ⁇ 100KGy.
  • Membrane used as anti-adhesion agent was important to the physical properties that can sufficiently protect the surgical site because the tensile strength test according to the product characteristics based on the KFDA guidelines (Fig. 4a).
  • the cut extracellular matrix membrane was plotted by indicating the degree of tensile strength as the ultimate force value through a tensile strength meter. As shown in the results, the tensile strength was improved as the thickness of the extracellular matrix membrane was increased, and the physical strength was also significantly increased through chemical crosslinking. In addition, even in the measurement of the tensile strength of the irradiated sample, it was confirmed that the physical strength can be adjusted according to the radiation dose (FIG. 4A).
  • the anti-adhesion membrane must be fixed to the surgical site to effectively prevent anti-adhesion. Therefore, even when sutured during surgery, strength that can be broken without breaking is required. Since the seal strength is not specified in the KFDA, it was established by establishing a protocol that can measure the seal strength on its own. Suture strength measurement was performed by cutting the film as shown below and then suture the film using an operating room and attaching the operating room and the extracellular matrix membrane to the tensile strength meter to measure the tensile strength. As a result of the measurement, the sealing strength of the extracellular matrix membrane was significantly increased after crosslinking (FIG. 4B).
  • the adhesion prevention film with controlled degradation time for each organ should be used for long-term specific adhesion prevention effect.
  • the degree of degradation can be controlled according to the radiation dose of the cartilage extracellular matrix membrane.
  • cartilage extracellular matrix membranes treated with different radiation doses were cut to 1 ⁇ 1 cm and treated with PBS treated with collagenase to observe the course of 2 weeks (Fig. 5 left).
  • the samples treated with collagenase for 2 weeks were centrifuged to analyze the amount of hydroxyproline in the supernatant to determine the degree of degradation of collagen, which is a major component of the extracellular matrix membrane (FIG. 5).
  • the degree of degradation of the extracellular matrix membrane was controlled when the collagenase was treated according to the radiation dose.
  • cartilage extracellular matrix membrane prepared in Figure 1 was confirmed the difference in adhesion of vascular endothelial cells acting in the adhesion mechanism as follows.
  • the cartilage extracellular matrix membrane and cover glass prepared in FIG. 1 were attached to a separate 24 well dish having a diameter of 5 mm, dried and fixed, and sterilized with IOS. And 2x10 4 vascular endothelial cells were transplanted into membrane coated dish, cover glass and uncoated 24 well plate and attached for 24 hours. After that, the cells attached to each surface were stained with calein and observed through a fluorescence microscope. As a result, it was confirmed that cell adhesion was inhibited in the dish coated with the extracellular matrix membrane as compared to the covel glass and the well plate (FIG. 7).
  • An adhesion model was constructed using 8-week-old C57BL6 mice. After cutting the skin layer and the muscle layer of the mouse abdomen, the muscle layer and the skin layer were sutured to make a model in which adhesion occurs between the damaged tissue and confirmed the adhesion effect. Adhesion tissue was generated at 1 week and an adhesion model was formed to strongly adhere muscles and skin (FIG. 8A).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

본 발명은 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물에 대한 것으로, 천연소재로서의 높은 생체적합성에도 불구하고 연골 조직 세포외기질은 짧은 분해기간 등 물성이 취약하여 적용에 한계가 존재하기 때문에 이의 물리적 또는 화학적 처리를 통하여 물성을 증진시키는 방법을 개발하였다. 본 발명은 돼지연골 유래 세포외기질을 물리화학적 방법으로 처리하여 다양한 제형의 생체소재로 제작하였고, 또한 물리화학적 처리를 했음에도 위의 연골 특이적인 기능을 유지하는 특성을 확인하였다. 또한, 돼지연골 유래 세포외기질 소재를 이용하여 체내 안정성과 유착방지 효능이 뛰어난 유착방지제로도 활용할 수 있다.

Description

생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물
본 발명은 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물에 관한 것이다.
천연소재는 천연물질, 동물, 인체에서 유래한 물질로서 매우 우수한 생체적합성과 생리적 기능을 가지고 있다. 대표적인 일례로 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 들 수 있는데 이는 복잡한 인체 및 동물에서 추출된 생체재료로서 세포의 기능을 제어 혹은 조절하거나 조직의 재생을 유도할 수 있다는 특징이 있다. 따라서 천연소재로 제조된 지지체는 생체에 이식 후 염증반응이 적을 뿐 아니라, 뛰어난 생체 기능성과 생분해성 등을 제공할 수 있어 이상적인 세포치료제 혹은 조직공학용 지지체의 재료로 평가받고 있다. 최근에는 동종(allogenic) 또는 이종(xenogenic) 조직이나 장기를 채취한 후, 세포를 제거(acellularized)하여 여러 가지 형태의 지지체나 막으로 사용하는 기술이 주목을 받고 있다.
한편, 연골 유래 세포외기질은 무혈관 및 무신경 조직으로서, 다른 조직의 세포외기질에 비해 조직 특이적으로 성분의 차별성이 있다. 대표적으로 연골조직에는 혈관생성을 억제하는 콘드로모듈린(chondromodulin), 트롬보스폰딘(thrombospondin), 엔도스타틴(endostatin) 등이 풍부하며, 뿐만 아니라 세포의 부착을 방지하는 루브리신(lubricin), 비글리칸(biglycan), 데코린(Decorin), 피브로모듈린(Fibromodulin) 등이 존재하고 있다. 그러나 천연소재로서의 높은 생체적합성과 기능성에도 불구하고 연골조직 세포외기질은 분해기간 조절이 어렵고, 물성이 취약하여 인체 적용에 한계가 존재하기 때문에 이의 물리적 또는 화학적 처리를 통하여 분해성을 조절하고 물성을 증진시키는 방법의 개발이 필요하다.
유착이란 분리되어 있어야 할 장기의 조직 면이 외과적 수술이나 염증에 의해 섬유성의 조직으로 연결, 융합되는 것으로 이로 인한 합병증으로 소장폐색, 후천성 여성 불임증, 자궁 외 임신, 만성 복통, 재수술 등이 발생된다. 이러한 유착은 외과적 수술 후 50~90%에서 발생되며 유착에 의해 재수술 받는 환자가 34.6%에 이를 정도로 발생이 잦다. 유착은 조직의 손상 이후 나타나는 치유 과정과 비슷하여 치유과정의 방해 없이 유착만을 방지하는 방법이 중요하다. 유착은 수술 부위의 치유과정 중에 정상적으로 침착하는 섬유소가 상처 치유과정이 완료됐음에도 불구하고 지속적으로 발생하여 인접하고 있는 다른 조직과 결합되게 만들고 궁극적으로 혈관이 침투하여 완전한 하나의 조직 혹은 기관으로 합쳐지게 된다. 이러한 유착을 방지하기 위하여 섬유소 분해를 촉진하는 약물을 쓰기도 하지만 조직 간에 물리적인 장벽(physical barrier)을 만들어 조직을 유격시키는 유착방지소재를 사용하는 경우가 많다.
기존의 유착방지 소재는 물리적인 장벽의 역할로 생분해성 소재, 즉 셀룰로스 혹은 히알룬산을 이용한 경우가 많으며, 그 밖에 콜라겐 등의 천연 소재들이 많이 이용되고 있다. 이러한 생분해성 소재는 물을 흡수하는 성질이 있고 이로 인한 가수분해를 특징으로 하고 있으며 분해 속도가 빠르기 때문에 주로 복부의 수술 후에 사용되고 있다. 이러한 제품들은 보통 젤의 형태를 갖고 있는데 투여 부위가 넓고 손상 부위에 고정이 어려운 단점이 있어 현재 상용화된 제품의 경우 유착 방지의 효과가 높지 않다. 예를 들면, 가장 많이 사용되는 유착방지제인 Interceed의 경우 그 사용으로 인한 유착방지의 효과가 60%밖에 되지 않는다(www.ethicon.com).
한편, 조직에 따라서는 재생 기간이 오래 걸리고 장기간 운동을 요하는 부위가 있다. 근골격조직, 척추관, 치아 등인데, 이들은 각기 재생이 일어나는 기간이 다르고 운동이 일어나는 부위이므로 각 조직에 대한 유착방지제는 조직에 필요한 특성을 가져야 한다. 예를 들어, 근골격조직의 손상은 수주 혹은 수개월의 재생기간이 필요하며 이 기간동안 인대나 건의 유착을 동반하는 경우가 많으며 관절에 수술적 침습을 가하는 경우 수개월에 걸친 재활운동이 필요한 경우가 많다. 따라서 이 기간동안 분해되지 않고 잔존하여 유착을 방지할 수 있는 생체소재가 필요하다. 기존의 유착방지제는 빠른 분해성을 갖고 있어 이러한 조직에 대한 적용이 적절치 않을 수 있다.
유착의 최종 단계를 혈관화이고 이 단계에 이르러서는 유착된 조직이 완전히 하나의 조직을 이루어 불가역적으로 유착이 완성되게 된다. 따라서 손상된 조직들을 건너가는 혈관의 형성을 막는 것은 매우 중요하다. 하지만 기존의 유착방지제는 단순한 장벽의 역할을 할 뿐 생리적 기능이 없어서 궁극적으로 일어날 수 있는 혈관 침투를 방지할 수 있는 약리학적 기전을 갖고 있지 않다.
본 발명의 목적은 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명은 돼지연골을 분리하는 단계; 상기 분리된 돼지연골을 동결건조하여 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 돼지연골분말을 탈세포화하는 단계; 상기 탈세포화된 돼지연골분말을 산성 용액 및 펩신(pepsin)과 혼합하여 처리 후, 염기성 용액으로 중화시켜 돼지연골분말 수용액을 제조하는 단계; 상기 돼지연골분말 수용액을 가교제와 혼합하여 돼지연골 유래 세포외기질 막을 제조하는 단계; 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질 막에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물을 제공한다.
본 발명은 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물에 대한 것으로, 천연소재로서의 높은 생체적합성과 기능성에도 불구하고 연골조직 세포외기질은 분해기간 조절이 어렵고 물성이 취약하여 적용에 한계가 존재하기 때문에 이의 물리적 또는 화학적 처리 및 방사선 처리를 통하여 물성을 증진시키는 방법을 개발하였다. 본 발명은 돼지연골 유래 세포외기질을 물리화학적 방법으로 처리하여 다양한 제형의 생체소재로 제작하였고, 또한 물리화학적 처리를 했음에도 위의 연골 특이적인 기능을 유지하는 특성을 확인하였다. 또한, 돼지연골 유래 세포외기질 소재를 이용하여 체내 안정성과 유착방지 효능이 뛰어난 유착방지제로도 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조공정을 나타낸다.
도 2는 연골 세포외기질 막의 가교 전후 비교 결과이다. 세포외기질 유착방지막, (좌) 가교 전, (중) 가교 후, (우) 방사선 조사 후.
도 3은 연골 세포외기질 원천재료의 성분 분석 결과이다.
도 4는 연골 세포외기질 막의 가교 전 후에 따른 기계적 물성 분석 결과이다. (a) 연골 세포외기질막의 가교 전과 후 그리고 두께에 따른 인장강도 분석 결과이다. [위] (좌) 인장강도 측정기, (중) 인장강도 측정을 위한 샘플 재단 모양, (우) 인장강도 측정을 위한 샘플 재단기. [아래] 화학 가교 전 후에 따른 인장강도 측정 결과이다. (b) 연골 세포외기질 막의 가교에 따른 봉합강도 측정(suture strength) 결과이다.
도 5는 연골 세포외기질 막의 방사선 조사에 따른 효소 분해도 실험 결과이다.
도 6은 연골 세포외기질 막의 방사선 조사에 따른 체내 분해도 실험 결과이다.
도 7은 연골 세포외기질 막에 대한 혈관 내피 세포부착 실험 결과이다.
도 8은 마우스 맹장 유착 모델을 이용한 생체 내 효과 확인 시험 결과이다. (a) 마우스 맹장 유착 모델 실험 과정 및 세포외기질 막 이식 과정을 나타낸다. (b) 세포외기질 막 이식 1주일 후 대조군과의 비교 사진이다. (c) 세포외기질 막 이식 1주일 후 대조군과의 조직학적 분석 비교 사진이다.
본 발명은 돼지연골을 분리하는 단계; 상기 분리된 돼지연골을 동결건조하여 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 돼지연골분말을 탈세포화하는 단계; 상기 탈세포화된 돼지연골분말을 산성 용액 및 펩신(pepsin)과 혼합하여 처리 후, 염기성 용액으로 중화시켜 돼지연골분말 수용액을 제조하는 단계; 상기 돼지연골분말 수용액을 가교제와 혼합하여 돼지연골 유래 세포외기질 막을 제조하는 단계; 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질 막에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 가교제는 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 방사선을 조사하는 단계는 5 내지 100KGy 감마선을 조사할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 돼지연골 유래 세포외기질 막에 방사선을 처리함으로써, 생체 내 막의 분해 속도 및 물성을 조절할 수 있고, 멸균 효과를 얻을 수도 있다.
본 발명의 방법의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 탈세포하는 단계는 물리적 탈세포 방법, 화학적 탈세포 방법 또는 물리적 및 화학적 방법을 조합한 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 한다.
상기 물리적 탈세포 방법은 동결-해동법, 초음파 처리, 또는 물리적 교반을 포함한다. 상기 화학적 탈세포 방법은 상기 돼지연골 유래 분말을 저장액, 음이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, DNase, RNase 또는 트립신으로 처리하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 탈세포하는 단계는 약 0~50 ℃의 온도 범위에서 수행하는 것이 바람직하다.
상기 화학적 탈세포 방법에 있어서, 상기 저장액은 트리스 HCl(Tris HCl)(pH 8.0) 용액이고, 상기 음이온성 계면활성제는 소디움도데실설페이트(SDS), 소디움데옥시초레이트(sodium deoxycholate), 또는 트리톤 X-200(Triton X-200)이며, 상기 비이온성 계면활성제는 트리톤 X-100(Triton X-100)이고, 상기 양이온성 계면활성제는 CHAPS, 술포베타인-10(Sulfobetaine-10, SB-10), 술포베타인-16(SB-16), 또는 트리-n-부틸포스페이트(Tri-n-butyl phosphate)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 돼지연골 유래 세포외기질은 수술 부위의 섬유화와 염증을 억제하여 유착 형성을 방지할 수 있다.
바람직하게는, 상기 조성물은 연고, 분말, 겔, 필름, 슬랩, 랩 또는 스펀지 형태로 제공되어 수술 부위의 유착 형성을 방지할 수 있다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
<실시예 1> 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조
1. 돼지연골의 분리
돼지연골 유래 세포외기질 파우더를 제작하기 위해 EN 12442의 "Animal tissues and their derivatives utilized in the manufacture of medical devices, part 1; Analysis and management of risk, part 2; controls on sourcing, collection and handling"을 참조하여 기준에 부합하는 시설의 돼지 무릎 연골을 구입하여 사용하였다.
2. 돼지연골의 분리 및 분쇄
돼지연골분말의 제조공정은 다음과 같다.
돼지 연골에서 연골을 잘라내어 연골 조각 (약 20 X 30 mm)을 만들고 여기에 생리식염수를 이용하여 10분간 3회 세척하여 -80℃에 냉동시킨 뒤 3일간 동결건조 시켰다. 건조된 연골 조각을 동결분쇄기(JAI, JFC-300, JAPAN)를 사용하여 약 10 ㎛ 사이즈로 동결 분쇄하여 -80℃에 보관하였다.
3. 돼지연골분말의 물리화학적 탈세포화
돼지연골분말에 존재하는 세포 및 유전물질을 제거하고, 순수한 세포외기질 성분만을 얻기 위해 다음과 같이 탈세포화 과정을 수행하였다.
상기에서 제조한 돼지연골분말을 10 g 당 저장액 (Hypotonic buffer) 500 ml을 처리하여 200 rpm으로 4℃에서 4시간 동안 교반하였다. 연골분말을 침전시켜 분리시키기 위해서 원심분리기(US-21SMT, Vision, Korea)를 사용하여 10,000 rpm에서 30분간 처리하였다.
상층액을 제거한 뒤 연골분말을 0.1% SDS (Sodium dodecyl sulfate, Bio-rad, USA) 용액에 첨가하여 200 rpm으로 4℃에서 2시간 동안 교반하였다. SDS 처리가 끝난 뒤 연골분말은 3차 증류수를 이용하여 5회 반복하여 세척하였고 세척수의 교환은 전술한 바와 같은 원심분리조건으로 진행하였다.
다음으로, 500 U/ml의 DNase (Sigma, USA) 200 ml을 처리하여 200 rpm으로 37℃ 배양기에서 12시간 동안 교반하였다. Dnase 처리 후 전술한 바와 같이 3차 증류수를 이용하여 5회 세척하였다.
탈세포화된 연골분말은 -80℃ 초저온 냉동장치에서 냉각한 후 3일간 동결건조하였다. 건조된 연골분말은 전술한 바와 같은 방법으로 파쇄하여 최종적으로 약 10 ㎛ 사이즈의 연골분말 파우더를 수득하고 필요시까지 -80℃에서 보관하였다.
4. 효소를 이용한 수용성 연골분말제조
탈세포화된 연골분말 4 g 당 100 ml의 염산수용액에 펩신(Pepsin; sigma, USA)을 처리하여 200 rpm으로 4℃에서 24시간 교반하였다.
펩신(pepsin) 처리 후, NaOH 용액을 이용하여 pH 7.4로 중화시켰다. 수용화된 연골분말은 투석막 (MWCO 1000, Spectrolab, USA)에 넣은 뒤 3차 증류수에 200 rpm으로 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 그 후 수용화된 연골분말을 용기에 담아 -80℃ 초저온 냉동장치에서 냉각시킨 후 3일간 동결건조하였다. 수용화 처리된 연골분말은 전술한 바와 같은 방법으로 약 10㎛ 사이즈를 갖는 파우더로 분쇄하여 최종적으로 -80℃ 냉동장치에 필요시까지 보관하였다.
5. 돼지연골 세포외기질 막의 제조
상기에서 제작한 수용성 연골분말 1.3 g을 3차 증류수 100 ml 에 처리한 후 200 rpm 으로 상온에서 1시간 동안 교반한다.
연골분말 수용액을 원심분리기 용기에 넣은 후 3000 rpm에서 10분간 처리하였다. pipet을 이용하여 상층액을 100 X 100 mm 사각형 실리콘 몰드에 35 ml씩 분주한 뒤 clean bench에서 48시간동안 건조 시켰다.
건조된 막 6 mg 당 0.1% 글루타르알데히드 용액(Glutaraldehyde solution; Sigma, USA) 1 ml을 처리하여 100 rpm으로 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 가교된 막은 6 mg 당 1 ml의 PBS 용액으로 3회 반복하여 100 rpm으로 30분간 세척한 뒤 이어서 3차 증류수를 이용하여 3회 세척하였다. 세척한 막은 6 mg 당 1 ml의 4M NaCl 용액을 처리하여 100 rpm으로 상온으로 30분간 처리하였다. 세척이 완료된 막은 clean bench에서 테프론 필름위에 펴서 건조 시켜 최종적으로 약 30 ㎛의 두께를 갖는 돼지연골 세포외기질 막을 제조하였다.
돼지연골 세포외기질 막의 제조공정은 도 1과 같으며, 연골 세포외기질 막의 가교 전후 비교 결과는 도 2와 같다.
6. 돼지연골 세포외기질 막의 방사선 처리(막의 분해도 조절 및 멸균)
상기에서 제작한 세포외기질 막을 은박으로 포장한 후 선량 5KGy~100KGy로 감마선 조사 시행하였다.
<실시예 2> 연골 세포외기질 원천재료의 성분 분석
연골 세포외기질 공정 과정에 따른 원천재료의 성분분석 결과, 연골 세포외기질에 가장 많은 비중을 차지하고 있는 콜라겐과 당단백 성분의 손실이 없이 유지되고 있는 것을 확인하였다. 콜라겐은 산성용액과 펩신효소에 원천재료를 용해하여 sirius red assay를 통하여 측정하였으며, 당단백은 papain 용액에 녹여 DMMB assay를 통해 측정하였다(도 3).
<실시예 3> 연골 세포외기질 막의 가교 전 후에 따른 기계적 물성 분석
1. 연골 세포외기질막의 가교 전과 후 그리고 두께에 따른 인장강도 분석
유착방지제로 사용되는 막은 수술부위를 충분히 보호할 수 있는 물리적 성질이 중요하기 때문에 식약처 가이드라인을 바탕으로 제품특성에 맞는 인장강도 검사를 실시하였다(도 4a).
도 4a와 같이, 재단된 세포외기질 막을 인장강도 측정기를 통하여 인장강도의 정도를 ultimate force값으로 나타내어 도표화 하였다. 결과에서 보듯이, 세포외기질 막의 두께가 증가 할수록 인장강도가 향상되었으며, 화학적 가교를 통해서도 유의성 있게 물리적 강도가 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 방사선 조사 처리된 시료의 인장강도 측정에서도 방사선 조사선량에 따라서 물리적 강도의 조절이 가능한 것을 확인하였다(도 4a).
2. 연골 세포외기질 막의 가교에 따른 봉합강도 측정 (suture strength)
유착방지용 막은 시술부위에 고정이 되어야 효과적으로 유착방지 효과를 낼 수 있기 때문에 수술시에 봉합을 하더라도 부서지지 않고 결딜 수 있는 강도가 필요하다. 봉합강도는 따로 식약처에 규정이 되어 있지 않기 때문에 자체적으로 봉합강도를 측정할 수 있는 프로토콜을 확립하여 측정하였다. 봉합강도 측정은 아래와 같이 필름을 재단하여 필름에 수술실을 이용하여 봉합 한 뒤 인장강도 측정기에 각각 수술실과 세포외기질 막을 부착하여 인장 강도를 측정하는 방법으로 진행하였다. 측정 결과 가교 후 세포외기질 막의 봉합강도가 가교 전 보다 유의성 있게 증가하는 것을 확인하였다(도 4b).
<실시예 4> 연골 세포외기질 막의 방사선 조사에 따른 효소 분해도 실험
유착방지용 막은 시술부위에 따라 분해기간이 달라지므로 장기 특이적으로 유착방지 효과를 내기 위해서는 각 장기별 분해기간이 조절된 유착방지제를 사용해야 한다. 연골 세포외기질 막의 방사선 조사선량에 따라 분해도 조절이 가능한지 확인하기 위하여 체외에서 콜라겐분해효소를 처리한 뒤 시간에 따른 분해거동을 시험하였다. 실험은 각기 다른 방사선 조사선량으로 처리한 연골 세포외기질 막을 1X1cm로 자른 뒤 콜라겐 분해효소로 처리한 PBS에 처리하여 2주간 경과를 관찰하였다(도 5 좌). 또한 2주간 콜라겐 분해효소로 처리한 시료를 원심분리하여 상층액의 하이드로시 프롤린 (Hydroxy proline) 의 양을 분석하여 세포외기질 막의 주요성분인 콜라겐의 분해도를 측정하였다(도 5 우). 측정결과 방사선 조사선량에 따라 콜라겐분해효소 처리 시 세포외기질 막의 분해도가 조절되는 것을 확인하였다.
<실시예 5> 연골 세포외기질 막의 방사선 조사에 따른 체내 분해도 실험
세포외기질 막의 방사선 조사에 따른 체내 생분해도의 차이를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다.
도 1에서 제작한 연골 세포외기질 막과 연골 세포외기질에 방사선 조사된 막의 이오가스 멸균을 실시하였다. 그리고 각각의 막을 Rat의 피하를 절개한 후 이식시킨 뒤 다시 봉합하여 4주간 생분해도를 관찰하였다. 그 결과, 방사선 조사에 따라 체내 피하에서의 생분해도가 조절되는 것을 확인하였다(도 6).
<실시예 6> 연골 세포외기질 막에 대한 혈관 내피 세포부착 실험
도 1에서 제작한 연골 세포외기질 막을 이용하여 유착 기전에서 작용되는 혈관 내피 세포의 부착 차이를 다음과 같이 확인하였다.
도 1에서 제작한 연골 세포외기질 막과 cover glass를 직경 5mm의 별개의 24 well 디쉬에 부착시킨 뒤 건조시켜 고정하고, 이오가스 멸균을 실시하였다. 그리고 각각 막이 코팅된 디쉬와 cover glass 그리고 코팅되지 않은 24 well plate에 2x104 혈관 내피세포를 이식하여 24시간 동안 부착을 시켰다. 그 후 각 표면에 부착된 세포를 calein 염색을 한 뒤 형광현미경을 통해 관찰하였다. 그 결과, 세포 외기질 막을 코팅한 디쉬에서 covel glass와 well plate에 비하여 세포 부착이 억제되는 것을 확인하였다(도 7).
<실시예 7> 마우스 맹장 유착 모델을 이용한 생체 내 효과 확인 시험
(1) 8주령된 C57BL6 마우스를 이용하여 유착모델을 제작하였다. 마우스 복부의 피부층과 근육층을 각각 절개한 뒤, 근육층과 피부층을 봉합하여 손상된 조직 사이에서 유착이 발생하는 모델을 만들어서 유착 효과를 확인하였다. 유착 조직은 1주에 발생되었으며 근육과 피부를 강하게 부착 시키는 유착 모델이 형성되었다(도 8a).
(2) 상기에서 제작된 피하 유착 모델에서 근육층과 피부층 사이 유착 조직이 형성되는 부위에 연골 세포외기질 막을 이식한 후 1주 결과를 확인하였다. 유착만 유도한 그룹에서는 1주에서 유착 조직이 상처를 감싸고 두껍게 생성되었다. 연골 세포외기질막을 이식한 경우 근육층과 피부층이 분리되었으며 유착조직 또한 형성되지 않은 것을 볼 수 있다(도 8b).
(3) 상기에서 획득한 조직을 헤마톡실린과 에오신 염색을 통해서 세포와 세포질 염색을 실시하였다. 그 결과 연골 세포외기질 막 자체에 세포가 집중 되면서 근육층과 피부층을 물리적으로 방어하면서 두 조직 사이에 유착 조직이 형성되지 못하게 하는 역할을 하였다(도 8c).

Claims (5)

  1. 돼지연골을 분리하는 단계;
    상기 분리된 돼지연골을 동결건조하여 분쇄하는 단계;
    상기 분쇄된 돼지연골분말을 탈세포화하는 단계;
    상기 탈세포화된 돼지연골분말을 산성 용액 및 펩신(pepsin)과 혼합하여 처리 후, 염기성 용액으로 중화시켜 돼지연골분말 수용액을 제조하는 단계;
    상기 돼지연골분말 수용액을 가교제와 혼합하여 돼지연골 유래 세포외기질 막을 제조하는 단계; 및
    상기 돼지연골 유래 세포외기질 막에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 가교제는 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)인 것을 특징으로 하는 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 방사선을 조사하는 단계는 5 내지 100KGy 감마선을 조사하는 것을 특징으로 하는 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따라 제조된 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 연고, 분말, 겔, 필름, 슬랩, 랩 및 스펀지로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 형태인 것을 특징으로 하는 유착방지용 조성물.
PCT/KR2017/002563 2016-03-11 2017-03-09 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물 WO2017155328A1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018567556A JP6961629B2 (ja) 2016-03-11 2017-03-09 生体内分解率及び物性の調節が可能な生体適合性豚軟骨来由細胞外基質膜の製造方法
US16/083,564 US20190070336A1 (en) 2016-03-11 2017-03-09 Method for producing extracellular matrix membrane derived from biocompatible porcine cartilage capable of regulating in vivo decomposition rate and physical properties, and composition for preventing adhesion containing extracellular matrix derived from porcine cartilage as active ingredient
EP17763589.3A EP3427765A4 (en) 2016-03-11 2017-03-09 METHOD FOR PRODUCING EXTRACELLULAR MATRIX MEMBRANE OBTAINED FROM BIOCOMPATIBLE PIG CARTILAGE CAPABLE OF CONTROLLING IN VIVO DECOMPOSITION RATE AND PHYSICAL PROPERTIES, AND COMPOSITION FOR PREVENTING ADHESION CONTAINING EXTRACELLULAR CARRINOUS MATRIX
CN201780016682.7A CN108834404A (zh) 2016-03-11 2017-03-09 可调节体内降解速率以及物理性质的生物相容性猪软骨衍生细胞外基质膜制造方法及包含猪软骨衍生细胞外基质作为有效成分的防粘连用组合物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2016-0029579 2016-03-11
KR1020160029579A KR101772316B1 (ko) 2016-03-11 2016-03-11 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017155328A1 true WO2017155328A1 (ko) 2017-09-14

Family

ID=59760222

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2017/002563 WO2017155328A1 (ko) 2016-03-11 2017-03-09 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20190070336A1 (ko)
EP (1) EP3427765A4 (ko)
JP (1) JP6961629B2 (ko)
KR (1) KR101772316B1 (ko)
CN (1) CN108834404A (ko)
WO (1) WO2017155328A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10939362B2 (en) 2018-01-11 2021-03-02 Mediatek Inc. Apparatuses and methods for system information (SI) request through a contention-based random access procedure

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102038434B1 (ko) * 2018-01-16 2019-10-30 한국원자력연구원 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법 및 이를 이용하여 분해도가 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막
KR102333417B1 (ko) 2019-08-27 2021-12-02 주식회사 도프 동물지방 유래 세포외기질 및 동물지방 유래 세포외기질 보존액
WO2022093877A1 (en) * 2020-10-26 2022-05-05 Briopryme Biologics, Inc. Preparation and use of tissue matrix derived powder
KR102416861B1 (ko) * 2020-02-28 2022-07-07 주식회사 엘앤씨바이오 연골 성분을 함유하는 연골 재생용 조성물 및 그 제조방법
US20230121257A1 (en) * 2020-02-28 2023-04-20 L&C Bio Co., Ltd. Composition comprising cartilage ingredient for regeneration of cartilage and preparation method therefor
CN111840642B (zh) * 2020-07-15 2022-04-01 四川大学 一种软骨脱细胞基质复合支架的制备方法及其应用
KR102549899B1 (ko) * 2021-02-19 2023-07-03 한국원자력연구원 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법 및 이를 이용하여 접착력이 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100041027A (ko) * 2008-10-13 2010-04-22 아주대학교산학협력단 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 다공성 3차원 지지체
KR20130134447A (ko) * 2012-05-31 2013-12-10 리젠프라임 주식회사 신규한 나노섬유막 및 이의 제조방법
KR20150067518A (ko) * 2013-12-10 2015-06-18 인제대학교 산학협력단 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하여 수술 후 유착 방지용 조성물
WO2015143310A1 (en) * 2014-03-21 2015-09-24 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods for preparation of a terminally sterilized hydrogel derived from extracellular matrix
KR20150114422A (ko) * 2014-03-31 2015-10-12 아주대학교산학협력단 표면개질된 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4633558A (en) * 1986-02-27 1987-01-06 Wittek Industries, Inc. Cam action tool for applying a spring clamp
JPH01502081A (ja) * 1987-01-15 1989-07-27 レスカ−デン　インコ−ポレ−テツド 動物軟骨の加工方法
JP3536295B2 (ja) * 1999-01-21 2004-06-07 ニプロ株式会社 縫合可能な組織再生誘導型癒着防止膜
JP4595279B2 (ja) * 2001-12-13 2010-12-08 ニプロ株式会社 癒着防止膜
JP2010279574A (ja) * 2009-06-05 2010-12-16 Nipro Corp 癒着防止膜
KR101269618B1 (ko) * 2011-04-12 2013-06-05 한스바이오메드 주식회사 포유류의 연골조직에서 유래한 생체이식재
CN102188748B (zh) * 2011-04-29 2014-02-26 成都军区昆明总医院 一种新型软骨细胞外基质膜及其制备方法
GB201215725D0 (en) * 2012-09-04 2012-10-17 Univ Leeds Composite connective tissue and bone implants
WO2015048317A1 (en) * 2013-09-25 2015-04-02 The Children's Mercy Hospital Decellularized hyaline cartilage powder for tissue scaffolds

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100041027A (ko) * 2008-10-13 2010-04-22 아주대학교산학협력단 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 다공성 3차원 지지체
KR20130134447A (ko) * 2012-05-31 2013-12-10 리젠프라임 주식회사 신규한 나노섬유막 및 이의 제조방법
KR20150067518A (ko) * 2013-12-10 2015-06-18 인제대학교 산학협력단 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하여 수술 후 유착 방지용 조성물
WO2015143310A1 (en) * 2014-03-21 2015-09-24 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods for preparation of a terminally sterilized hydrogel derived from extracellular matrix
KR20150114422A (ko) * 2014-03-31 2015-10-12 아주대학교산학협력단 표면개질된 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3427765A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10939362B2 (en) 2018-01-11 2021-03-02 Mediatek Inc. Apparatuses and methods for system information (SI) request through a contention-based random access procedure

Also Published As

Publication number Publication date
EP3427765A4 (en) 2020-01-15
JP2019508213A (ja) 2019-03-28
EP3427765A1 (en) 2019-01-16
KR101772316B1 (ko) 2017-08-29
JP6961629B2 (ja) 2021-11-05
CN108834404A (zh) 2018-11-16
US20190070336A1 (en) 2019-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017155328A1 (ko) 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물
ES2762118T3 (es) Andamiajes tisulares regenerativos
EP2884944B1 (en) Reinforced placental tissue grafts and methods of making and using the same
US8668703B2 (en) Medical devices incorporating collagen inhibitors
CN106163531B (zh) 将表面改性的软骨细胞衍生细胞外基质膜作为有效成分包含的组合物在防止粘连中的应用
EP3349814B1 (en) Non-gelling soluble extracellular matrix with biological activity
US20180200405A1 (en) Methods of preparing ecm scaffolds and hydrogels from colon
JP2016504932A (ja) 非哺乳動物組織からの脱細胞化生体材料
Jayasuriya et al. Fabrication and characterization of novel hybrid organic/inorganic microparticles to apply in bone regeneration
Wu et al. Mechanically stable surface-hydrophobilized chitosan nanofibrous barrier membranes for guided bone regeneration
KR20180134897A (ko) 염증성 장 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물
AU2020235627A1 (en) Acoustic extracellular matrix hydrogels and their use
Bhat et al. Evaluation of cross‐linked chitosan microparticles for bone regeneration
WO2016047834A1 (ko) 연부조직 수복용 매트릭스 및 그 제조방법
US20100015226A1 (en) Bioresorbable hydrogel
JP2009513290A (ja) 強膜バックリングバンドとその製造方法
Zhang et al. Biomedical Application of Decellularized Scaffolds
ES2308709T3 (es) Membranas de colageno multimicrolaminares.
Coletta et al. Synthetic three-dimensional scaffold for application in the regeneration of bone tissue
Qu et al. PLLA-COI multilayer nanofiber membrane for anti-adhesion of the Achilles tendon
Ferencz et al. Abdominal hernia repair with poly (succinimide) and with its cysteamine crosslinked nanofiber hernia meshes. A preliminary experimental study
Hassan et al. Application of Aloe vera gel blended polymer-collagen scaffolds for bone tissue engineering
WO2022086209A1 (ko) 생착 향상을 위한 접착성 이식재
RU2817049C1 (ru) Остеокондуктивное и остеоиндуктивное биокомпозиционное покрытие имплантов для ускорения консолидации переломов животных
Khaqan Zia Characterization of Hydrogels Derived from Extra Cellular Matrix of Umbilical Cord for its Application in Tissue Engineering

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018567556

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2017763589

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017763589

Country of ref document: EP

Effective date: 20181011

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17763589

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1