KR102038434B1 - 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법 및 이를 이용하여 분해도가 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막 - Google Patents

동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법 및 이를 이용하여 분해도가 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법 및 이를 이용하여 분해도가 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물 연골 유래 세포외기질 막을 과산화수소 용액에 침지하는 단계 및 과산화수소 용액에 침지된 동물 연골 유래 세포외기질 막에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법; 및 상기 본 발명의 방법에 의해 분해도가 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막에 관한 것이다.

Description

동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법 및 이를 이용하여 분해도가 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막{Method for adjusting degradation rate of animal cartilage-derived extracellular matrix membrane and animal cartilage-derived extracellular matrix membrane having adjustable degradation rate by using the same}
본 발명은 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법 및 이를 이용하여 분해도가 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막에 관한 것으로, 보다 상세하게는 방사선에 의한 콜라겐의 변형을 수반하지 않는 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법 및 이를 이용하여 분해도가 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막에 관한 것이다.
세포외기질(extracellular matrix)은 동물, 인체에서 유래한 물질로서 매우 우수한 생체적 합성과 생리적 기능을 가지고 있다. 따라서 세포외기질로 제조된 막은 생체에 이식 후 염증반응이 적을 뿐 아니라, 뛰어난 생체기능성과 생분해성 등을 제공할 수 있어 이상적인 세포치료제 혹은 약물전달 및 조직공학용 지지체의 재료로 평가 받고 있다.
연골 유래 세포외기질은 무혈관 및 무신경 조직으로서, 다른 조직의 세포외기질에 비해 조직 특이적으로 성분의 차별성이 있다. 대표적으로 연골조직에는 혈관생성을 억제하는 콘드로모듈린(chondromodulin), 트롬보스폰딘(thrombospondin), 엔도스타틴(endostatin) 등이 풍부하며, 뿐만 아니라 세포의 부착을 방지하는 루브리신(lubricin), 비글리칸(biglycan), 데코린(Decorin), 피브로모듈린(Fibromodulin) 등이 존재하고 있다. 그러나 천연소재로서의 높은 생체적합성과 기능성에도 불구하고 연골조직 세포외기질은 분해기간 조절이 어렵고, 물성이 취약하여 인체 적용에 한계가 존재하기 때문에 이의 물리적 또는 화학적 처리를 통하여 분해성을 조절하고 물성을 증진시키는 방법의 개발이 필요하다.
그러나 천연소재로서의 높은 생체적합성과 기능성에도 불구하고 화학적 처리를 통해 가교된 세포외기질 막은 분해 기간 및 물성 조절이 어렵고, 잔존하는 화학첨가물에 의해 인체독성 및 염증 발생으로 인해 인체 적용에 한계가 존재하기 때문에 이의 인체 무해한 물리적 또는 화학적 처리를 통하여 분해성이 조절된 조성물의 개발이 필요하다.
이와 관련하여 한국특허 제10-1772316호는 방사선을 이용한 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법을 개시하고 있으나, 동물의 연골 유래 세포외기질 막에 실제 상기 특허와 같이 방사선만을 가하는 경우, 낮은 선량에서는 분해도 조절 효과가 거의 획득되지 않으며, 높은 선량에서는 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 주성분인 콜라겐 성분에 변성이 유발되어 막의 물성이 저하되는 문제가 발생한다.
따라서, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 물성을 유지하면서 분해도를 조절할 수 있는 기술이 개발되는 경우 관련 분야에서 널리 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
이에 본 발명의 한 측면은 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 상기 분해도 조절 방법을 이용하여 분해도가 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 동물 연골 유래 세포외기질 막을 과산화수소 용액에 침지하는 단계; 및 과산화수소 용액에 침지된 동물 연골 유래 세포외기질 막에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기 본 발명의 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법에 의해 분해도가 조절된, 분해도가 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막이 제공된다.
본 발명에 의하면, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 물성을 유지하면서 분해도를 조절할 수 있으며, 따라서 본 발명에 의해 분해도가 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막을 이용하여 체내 안정성과 유착방지 효능이 뛰어난 유착방지제로 활용할 수 있다. 나아가, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해 조절 시 관련 기술의 문제점인 안전성, 재현성 및 대량 생산에 대한 문제를 극복할 수 있다.
도 1은 방사선 조사된 돼지연골 탈세포 세포외기질 필름의 SEM 이미지 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 1의 좌측은 방사선 조사 전, 도 1의 우측은 방사선 조사 후의 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 방사선 조사된 돼지연골 세포외기질 필름의 성분 변화 분석을 위한 FTIR 그래프를 나타낸 것이다.
도 3은 방사선 선량에 따른 돼지연골 세포외기질 필름의 분해도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 과산화수소 수용액의 농도에 따른 돼지연골 세포외기질 필름의 분해도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 방사선의 총 선량 및 시간 당 선량이 콜라겐 변형에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 물성을 유지하면서 분해도를 조절할 수 있는 방법이 제공되며, 본 발명은 특히 과산화수소와 방사선 조사를 이용하는 것이다.
본 발명에 있어서, "연골 유래 세포외기질"은 "연골 유래 탈세포 세포외기질 막"과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, "막"은 "필름"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
단백질 등의 유기물 산화력을 갖는 과산화수소는 약산으로서 수산기 라디칼(OH·)로 분해되므로 높은 반응성 자유 라디칼을 형성할 수 있다. 이러한 전환은 온도가 낮으며 어두운 조건 하에서 천천히 발생하지만, 본 발명에서는 자외선(UV), 감마선, 전자선 등의 방사선 조사에 의해 상기 반응성 자유 라디칼을 형성을 유도한다.
본 발명의 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법은 동물 연골 유래 세포외기질 막을 과산화수소 용액에 침지하는 단계; 및 과산화수소 용액에 침지된 동물 연골 유래 세포외기질 막에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 것이다.
본 발명에 사용되는 상기 과산화수소 용액은 0.01 내지 3wt% 농도의 과산화수소 수용액일 수 있으며, 바람직하게 상기 과산화수소 용액은 0.1 내지 1wt% 농도의 과산화수소 수용액일 수 있다.
보다 상세하게, pH가 6.0 내지 7.0 범위이며, 농도가 0.3 내지 3.0 %인 과산화수소(H2O2)수, 예를 들어 농도가 1 내지 2%인 과산화수소수를 그대로 사용하거나, 과산화수소수:물의 중량비가 1:99 또는 과산화수소수의 중량이 그 이상이 되도록 혼합하여 사용할 수 있으며, 예를 들어 과산화수소수:물의 중량비가 100 : 0, 75:25, 50:50, 25:75, 0초과 :100과 같은 비율로 혼합할 수 있다.
과산화수소 수용액이 포함되지 않는 경우에는, 방사선을 조사하여도 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 분해율이 미미하며, 한편, 과산화수소 용액의 농도가 증가할수록 과산화수소가 물에 분해되어 형성되는 HO2·는 단백질과 반응성이 매우 크므로, 단백질의 산화가 증가 되어 가수분해가 증가되는 것을 관찰할 수 있으나, 과산화수소 수용액 내 과산화수소의 농도가 3%를 초과하는 경우에는 방사선 조사 시 물과 과산화수소의 산화반응 증가로 인해 동물의 연골 유래 세포외기질의 단백질의 변성이 일어나는 문제가 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방사선을 조사하는 단계는 감마선, 전자선, 자외선 및 X선으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 방사선에 의해 수행되는 것으로, 바람직하게는 감마선에 의해 수행되는 것이다. 또한 상기 감마선은 코발트(Co)-60, 크립톤(Kr)-85, 스트론튬(Sr)-90, 및 세슘(Cs)-137으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방사성 동위원소로부터 방출될 수 있으며, 바람직하게는 상기 감마선은 코발트(Co)-60일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 상기 방사선을 조사하는 단계는 0 초과 25kGy 이하의 총 선량으로 수행되는 것이 바람직하며, 예를 들어 5 kGy 이상 25 kGy 미만, 10 내지 20 kGy의 총 선량으로 수행될 수 있다. 상기 방사선을 조사하는 단계에 있어서 총 선량이 25 kGy를 초과하는 경우에는 방사선 조사에 의해 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 주성분인 콜라겐이 변형되어 실질적인 콜라겐 함량 및 분자량이 감소하게 되며, 그 결과 동물의 연골 유래 세포외기질 막이 물성 및 생화학적 물질이 감소하게 되는 문제가 있다.
나아가, 상기 방사선을 조사하는 단계는 시간 당 0 초과 10kGy 이하의 선량으로 수행되는 것이 바람직하며, 예를 들어 시간 당 100Gy 내지 10kGy의 선량으로 수행될 수 있다. 시간 당 방사선 조사 선량이 10kGy를 초과하는 경우에는 총 선량이 25 kGy 이하인 경우에도 콜라겐이 변형 및 이에 따른 실질적인 콜라겐 함량 감소가 발생할 수 있다.
연골의 세포외기질에는 다른 조직의 세포외기질에 비해 조직 특이적으로 세포의 부착을 방지하는 루브리신, 비글리칸, 디코린, 피브로모듈린 등이 존재하고 있어서 장기와 장기 사이의 유착방지 효과를 향상시킬 수 있다. 한편, 본 발명에 사용될 수 있는 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 재료는 바람직하게는 인간을 제외한 동물로부터 획득할 수 있고, 예를 들어 돼지, 말, 소 등의 동물로부터 획득될 수 있는 것이나, 특히 제한되는 것은 아니며, 돼지 연골 유래 세포외기질 막인 것이 보다 바람직하다.
상기 동물의 연골 유래 세포외기질 막은 화학적 가교된 동물의 연골 유래 세포외기질 막일 수 있으며, 상기 화학적 가교를 수행할 수 있는 가교제는 특히 제한되는 것은 아니며, 글루타르알데히드, EDC (1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide), 제니핀(genipin) 등일 수 있으며, 특히 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 의하면, 상술한 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법에 의해 분해도가 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막이 제공된다.
동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절은 분해도 조절 전 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 성분 및 바람직한 물성을 가능한 유지하는 것이 전제되어야 하는 것으로, 본 발명에 의하면 분해도가 조절되면서도 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 성분이 변형되지 않고 유지되며, 바람직한 물성도 유지될 수 있다.
보다 상세하게, 본 발명에 의해 분해도가 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막은 본래의 콜라겐 함량이 80% 이상 유지되는 것으로, 분해도 조절을 위한 과정에서 콜라겐의 변형 및 변성이 최소화될 수 있다.
동물의 연골 유래 세포외기질 막의 주성분이 콜라겐이므로, 콜라겐의 변형 및 변성이 발생되는 경우 동물의 연골 유래 세포외기질 막은 분해도는 조절되지만, 물성이 저하되는 문제가 발생한다.
한편, 본 발명에 의해 상기 분해도가 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막은 인장강도 물성이 1 N 내지 7 N 범위인 것으로, 바람직한 본래의 물성 저하가 분해도 조절 과정에서 최소화되는 것이다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 연골 유래 세포외기질 분말의 제조
돼지로부터 연골 유래 세포외기질 파우더를 제작하기 위해 EN 12442의 "Animal tissues and their derivatives utilized in the manufacture of medical devices, part 1; Analysis and management of risk, part 2; controls on sourcing, collection and handling"을 참조하여 기준에 부합하는 시설의 돼지 무릎 연골을 구입하여 사용하였다.
돼지 연골에서 연골을 잘라내어 연골 조각 (약 20 X 30 mm)을 만들고 여기에 생리식염수를 이용하여 10분간 3회 세척하여 -80℃에 냉동시킨 뒤 3일간 동결건조 시켰다. 건조된 연골 조각을 동결분쇄기(JAI, JFC-300, JAPAN)를 사용하여 약 10 ㎛ 사이즈로 동결 분쇄하여 -80℃에 보관하였다.
돼지연골분말에 존재하는 세포 및 유전물질을 제거하고, 순수한 세포외기질 성분만을 얻기 위해 다음과 같이 탈세포화 과정을 수행하였다.
이를 위해 상기에서 제조한 돼지연골분말을 10g 당 저장액(Hypotonic buffer) 500 ml을 처리하여 200 rpm으로 4℃에서 4시간 동안 교반하였다. 연골분말을 침전시켜 분리시키기 위해서 원심분리기(US-21SMT, Vision, Korea)를 사용하여 10,000 rpm에서 30분간 처리하였다. 상층액을 제거한 뒤 연골분말을 0.1% SDS (Sodium dodecyl sulfate, Bio-rad, USA) 용액에 첨가하여 200 rpm으로 4℃에서 2시간 동안 교반하였다. SDS 처리가 끝난 뒤 연골분말은 3차 증류수를 이용하여 5회 반복하여 세척하였고 세척수의 교환은 전술한 바와 같은 원심분리조건으로 진행하였다. 다음으로, 500 U/ml의 DNase (Sigma, USA) 200 ml을 처리하여 200 rpm으로 37℃ 배양기에서 12시간 동안 교반하였다. DNase 처리 후 전술한 바와 같이 3차 증류수를 이용하여 5회 세척하였다. 탈세포화된 연골분말은 -80℃ 초저온 냉동장치에서 냉각한 후 3일간 동결건조하였다. 건조된 연골분말은 전술한 바와 같은 방법으로 파쇄하여 최종적으로 약 10 ㎛ 사이즈의 연골분말 파우더를 수득하고 필요 시까지 -80℃에서 보관하였다.
탈세포화된 연골분말 4g 당 100 ml의 염산수용액에 펩신(Pepsin; sigma, USA)을 처리하여 200 rpm으로 4℃에서 24시간 교반하였다. 펩신(pepsin) 처리 후, NaOH 용액을 이용하여 pH 7.4로 중화시켰다. 수용화된 연골분말은 투석막(MWCO 1000, Spectrolab, USA)에 넣은 뒤 3차 증류수에 200 rpm으로 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 그 후 수용화된 연골분말을 용기에 담아 -80℃ 초저온 냉동장치에서 냉각시킨 후 3일간 동결건조하였다. 수용화 처리된 연골분말은 전술한 바와 같은 방법으로 약 10㎛ 사이즈를 갖는 파우더로 분쇄하여 최종적으로 -80℃ 냉동장치에 필요시까지 보관하였다. 이렇게 획득된 연골 유래 세포외기질 분말은 수용성이다.
2. 돼지 연골 유래 세포외기질 ( PCAM ) 막의 제조
상기 1.에 의해 획득한 수용성 돼지연골분말 1.3 g을 3차 증류수 100 ml 에 처리한 후 200 rpm으로 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 돼지연골분말 수용액을 원심분리기 용기에 넣은 후 3000 rpm에서 10분간 처리하였다. 피펫(pipet)을 이용하여 상층액을 100 X 100 mm 사각형 실리콘 몰드에 35 ml씩 분주한 뒤 클린 벤치(clean bench)에서 48시간 동안 건조시켰다. 건조된 막 6 mg 당 0.1% 글루타르알데히드 용액(Glutaraldehyde solution; Sigma, USA) 1 ml을 처리하여 100 rpm으로 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 가교된 막은 6 mg 당 1 ml의 PBS 용액으로 3회 반복하여 100 rpm으로 30분간 세척한 뒤 이어서 3차 증류수를 이용하여 3회 세척하였다. 세척한 막은 6 mg 당 1 ml의 4M NaCl 용액을 처리하여 100 rpm으로 상온으로 30분간 처리하였다. 세척이 완료된 막은 클린 벤치(clean bench)에서 테프론 필름위에 펴서 건조 시켜 최종적으로 약 30 ㎛의 두께를 갖는 돼지연골 세포외기질 막을 제조하였다.
3. 과산화수소 용액의 제조
증류수와 과산화수소(H2O2)를 다양한 중량비로 조합하여 과산화수소 수용액을 제조하였다. 본 실험에서는 1% 과산화수소(H2O2)를 사용하였다.
증류수와 상기 1% 과산화수소를 중량비로 100:0, 75:25, 50:50, 25:75, 0:100와 같이 혼합하여 각각의 과산화수소 수용액을 제조 하였다.
4. 돼지연골 탈세포 세포외기질 ( PCAM ) 막에 대한 방사선 조사
상기 3.에서 제조된 다양한 농도의 과산화수소 수용액을 50 ml 유리병에 담고, 여기에 2.에서 획득된 가교된 돼지연골 세포외기질 막을 넣은 후 방사선을 0, 1, 5, 10, 25, 50 kGy의 선량으로 각각 조사하였다.
이때 상기 방사선은 감마선 (60CO, MDS Nordion, Canada, IR 221 n wet storage type C-188, 한국원자력연구원 정읍 방사선연구소)을 사용하였고, 25 kGy (선량률; 10 kGy/hr)로 조사하였다.
방사선 조사 후 가교된 돼지연골 탈세포 세포외기질 필름을 3차 증류수를 이용하여 3회 세척하였다. 세척이 완료된 막은 클린벤치에서 테프론 필름 위에 펴서 건조 시켜 최종적으로 생분해성을 갖는 돼지연골 탈세포 세포외기질 필름을 제조하였다.
5. 돼지연골 세포외기질 ( PCAM ) 막의 형태학적 분석
방사선(감마선) 조사된 돼지연골 세포외기질 필름의 표면을 금으로 진공코팅 처리 후, 주사전자현미경(FE-SEM, Hitachi S-4800, Japan)을 통해 확대하여 관찰하였다.
증류수와 상기 1% 과산화수소를 중량비 100:0, 75:25, 50:50, 25:75, 0:100 로 혼합한 과산화수소 수용액에 담지된 글루타르알데히드 용액으로 가교된 돼지연골 탈세포 세포외기질 필름을 조사 선량 25 kGy(선량률; 10 kGy/hr)로 방사선 조사 후 상온 건조하여 그 표면을 주사전자현미경(SEM, Scanning Electron Microscopy)을 통해 이미지화 하여 분석하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이 방사선 조사(조사 선량: 25 kGy) 전후 SEM 이미지를 통하여 상온 건조된 필름의 표면을 분석한 결과 필름의 표면 변화는 없는 것을 확인하였다.
본 실험 결과는 방사선 조사 조건에서는 방사선 조사로 인한 생분해 조절 및 멸균 공정을 동시에 처리가 가능하며 방사선 선량과 산화제에 대한 형태학적 변화가 없는 것으로 해석될 수 있다.
6. 돼지연골 탈세포 세포외기질 ( PCAM ) 필름의 화학결합도 분석
방사선(감마선) 선량에 따른 돼지연골 탈세포 세포외기질 필름에서의 화학적 변화를 측정하기 위해 ATR-FTIR (TENSOR 37 Spectrophotometer BRUKER, Germany)를 사용하였고, DLa TGS 디텍터(detector)를 사용하여 4000-600 cm-1 파장 범위를 주사회수 64회, 분해능 4 cm-1의 조건으로 시료들을 분석하였다.
방사선 조사 시 과산화수소 수용액에 함침된 돼지연골 세포외기질 막을 상온 건조하여 성분 분석 및 결합도를 확인하기 위해 FT-IR (Tensor 37, Bruker, Germany)로 분석을 실시하였으며, 그 결과 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 성분 분석 및 화학구조를 분석해 본 결과 필름의 표면 변화는 없는 것을 확인하였다.
특히, 돼지연골 세포외기질의 단백질의 아마이드 피크인 3700~3000 cm-1과 1600~1700 cm-1의 위치가 변화되지 않는 것으로 보아 성분 및 화학구조 변화가 없는 것으로 해석될 수 있다. 한편, 과산화수소에 의해 단백질이 산화되면서 OH 라디칼이 형성으로 인해 3000 cm-1 피크가 증가 되는 것을 확인하였다. 본 실험 결과는 방사선 조사 조건에서는 방사선 조사로 인한 생분해 조절 및 멸균 공정을 동시에 처리가 가능하며 방사선 선량과 산화제에 대한 화학구조 및 성분 변화가 없는 것을 알 수 있다.
7. 돼지연골 탈세포 세포외기질 ( PCAM ) 필름의 분해도 측정
방사선(감마선) 선량과 과산화수소 수용액의 농도에 따른 돼지연골 탈세포 세포외기질 필름의 분해도 변화를 측정하기 위해, 필름을 2 cm x 4 cm 동일 크기로 잘라 필름 무게를 측정한 후 50 ml 유리병에 필름을 넣고, 필름이 들어있는 유리병에 과산화수소 수용액을 넣어 뚜껑을 닫고, 이를 37℃ 수조에 넣은 후 시간 경과에 따른 무게 변화를 측정하였다.
분해도는 하기 식 (1)에 나타낸 바와 같이 침지 전후 필름의 무게 차이를 필름의 초기 무게로 나누어 백분율로 나타낸 것이다.
Figure 112018005229719-pat00001
...식(1)
(1) 방사선 선량에 따른 분해도
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 방사선 조사되지 않은 필름은 4주 동안 분해율이 4% 미만인 것을 확인할 수 있었다.
한편, 과산화수소가 물에 분해되어 형성되는 HO2·는 단백질과 반응성이 매우 크므로, 방사선 선량이 증가할수록 단백질의 산화가 증가 되어 가수분해가 증가되는 것을 관찰할 수 있었다. 한편, 방사선 50 kGy 조사된 필름에서 급격히 무게가 감소되는 것을 확인하였다.
(2) 산화제 농도에 따른 분해도
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 과산화수소 용액이 포함되지 않은 증류수에서 방사선 조사된 필름은 4주 동안 분해율이 2% 미만인 것을 확인할 수 있었다.
한편, 과산화수소 용액의 농도가 증가할수록 과산화수소가 물에 분해되어 형성되는 HO2·는 단백질과 반응성이 매우 크므로, 단백질의 산화가 증가 되어 가수분해가 증가되는 것을 관찰 할 수 있었다.
분해기간 1주부터 과산화수소 용액의 농도가 증가할수록 급격히 필름의 무게가 감소되는 것을 확인하였다.
8. 높은 선량의 방사선 조사에 의한 콜라겐 변형 확인
상기 7.(1)에서 나타난 바와 같이 방사선 50 kGy 선량이 조사된 필름에서 무게 변화가 급격히 발생하였으며, 이러한 변화가 돼지연골 탈세포 세포외기질(PCAM) 필름의 주성분인 콜라겐의 변형을 수반하는지 여부를 확인하기 위해 과산화수소 수용액 내에서 방사선이 조사된 돼지연골 탈세포 세포외기질(PCAM) 필름의 콜라겐 함량을 확인하였다.
이때 콜라겐 함량은 산성 용액과 펩신 효소에 재료를 용해하여 시리어스 레드 어세이(sirius red assay) 방법을 통해 확인하였다.
본 실험은 증류수와 상기 1% 과산화수소를 중량비 100:0, 75:25, 50:50, 25:75, 0:100 로 혼합한 과산화수소 수용액에서 25kGy 및 50 kGy의 선량으로 방사선을 조사한 돼지연골 탈세포 세포외기질(PCAM) 필름을 대상으로 수행하였으며, 이때 상기 방사선 선량은 시간 당 400Gy, 1kGy 및 10kGy로 적용하여, 시간 당 선량이 콜라겐 변형에 미치는 영향을 함께 확인하였다. 한편, 비교를 위해 돼지연골 탈세포 세포외기질 (PCAM)의 콜라겐 함량을 대조군으로 설정하였다.
그 결과 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 25kGy의 선량에서는 콜라겐의 함량이 유지되나, 50 kGy에서는 콜라겐 함량이 감소되었으며, 나아가 시간 당 선량이 증가함에 따라 콜라겐 양의 감소가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
보다 상세하게, 총 조사 선량이 25kGy인 경우 콜라겐의 함량은 약 20% 감소하였고, 시간 당 조사 선량 변화에 따른 유의적인 차이는 없는 반면, 총 조사 선량이 50kGy인 경우 20% 초과의 콜라겐이 감소하였고, 시간 당 조사 선량 증가에 따라 콜라겐 감소량이 급격해지는 것을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (12)

  1. 동물 연골 유래 세포외기질 막을 과산화수소 용액에 침지하는 단계; 및
    과산화수소 용액에 침지된 동물 연골 유래 세포외기질 막에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 과산화수소 용액은 0.01 내지 3wt% 농도의 과산화수소 수용액인, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 과산화수소 용액은 0.1 내지 1wt% 농도의 과산화수소 수용액인, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 방사선을 조사하는 단계는 감마선, 전자선, 자외선 및 X선으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 방사선에 의해 수행되는, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 방사선을 조사하는 단계는 0 초과 25kGy 이하의 총 선량으로 수행되는, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 방사선을 조사하는 단계는 시간 당 0 초과 10kGy 이하의 선량으로 수행되는, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 동물의 연골 유래 세포외기질 막은 돼지 연골 유래 세포외기질 막인, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 동물의 연골 유래 세포외기질 막은 화학적 가교된 동물의 연골 유래 세포외기질 막인, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 화학적 가교는 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)에 의해 수행되는, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 분해도 조절 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
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