KR101810586B1 - 장기 유착 방지용 조성물 및 이를 이용한 주입형 수화겔 - Google Patents

Abstract

본 발명은 장기 유착 방지용 조성물 및 이를 이용한 주입형 수화겔에 관한 것으로, 보다 상세하게는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose, CMC), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 및 물을 포함하는, 장기 유착 방지용 조성물; 및 상기 장기 유착 방지용 조성물에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 장기 유착 방지용 주입형 수화겔의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

장기 유착 방지용 조성물 및 이를 이용한 주입형 수화겔{COMPOSITION FOR PREVENTING SURGICAL ADHESIONS AND INJECTABLE HYDROGEL USING THE SAME}

본 발명은 장기 유착 방지용 조성물 및 이를 이용한 주입형 수화겔에 관한 것으로, 안전성, 재현성 및 대량 생산성이 증가된 장기 유착 방지용 조성물 및 이를 이용한 주입형 수화겔에 관한 것이다.

수화겔이란 일반적으로 다량의 수분 혹은 생물학적 체액을 함유할 수 있는 삼차원의 친수성 고분자 망상 구조를 의미한다. 수화겔이 주입형으로 이용되기 위해서는 기본적으로 체외에서는 보통의 유체와 같이 유동성을 가지고 있을 것을 요구하며, 이를 통해 주입 후에는 주입된 부위에 안정하게 유지되는 특성을 필요로 한다.

한편, 주입형 수화겔은 의료 분야에서 다양한 기능을 발휘하고 있는데 의료용 충진제로부터 삼차원 구조를 이용한 기관 및/또는 조직 재생에 이르기까지 폭넓게 이용된다. 의료용 충진제로서의 수화겔은 조직공학용 지지체를 둘러싸서 공간을 채우거나, 또는 유착 방지를 위해 사용된다.

유착이란 조직과 조직 사이의 비정상적인 결합을 말하는데, 일반적으로 개복 수술 후 유착의 발생 빈도가 높고, 각종 후유증이 발생한다. 유착 방지를 위해 약물 혹은 물리적 유착 방지제가 존재하지만 약물은 항염증제, 섬유소 용해제 등의 사용으로 인해 상처 치유 과정이 저해되는 등의 문제점이 있고, 물리적 유착 방지제의 경우 액상, 필름(막) 형태 등이 있는데 액상의 경우 목적으로 하는 부위로부터 흘러내림 등에 의해 이탈하여 큰 효과를 볼 수 없고, 필름 형태의 경우 적용 영역의 크기나 형태에 제한이 있고, 나아가 부착 후 조직의 움직임 때문에 고정하기가 어려운 문제점이 있다.

한국공개특허출원 제2006-0011503호는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)와 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 주성분으로 함을 특징으로 하는 장기 유착 방지 수화겔을 개시하고 있으나, 이때 개시된 수화겔은 높은 함량의 소디움 카르복시메틸셀룰로오스로 인하여 고체형 필름(막)형 장기 유착 방지제로만 구현할 수 있으며, 움직임이 많은 조직의 유착에 있어서 필름(막) 형태의 유착 방지제는 장의 움직임에 따라 고정이 이루어지지 않아 유착 방지 효과가 저하되는 문제가 있다.

따라서, 기존의 유착방지제와는 달리 액체와 고체의 중간 정도의 점성을 가져 내부 장기에 도포 시 흘러내리지 않고, 나아가 장기의 형태에 제한되지 않는 주입형 수화겔 유착방지제가 제공되는 경우 관련 분야에서 널리 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

이에 본 발명의 한 측면은 화학적 가교제 처리 없이 안정하고 효율적으로 제조될 수 있는 장기 유착 방지용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 측면은 화학적 가교제 처리 없이 안정하고 효율적으로 제조될 수 있는 장기 유착 방지용 주입형 수화겔을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 측면은 화학적 가교제 처리 없이 안정하고 효율적으로 제조될 수 있는 장기 유착 방지용 주입형 수화겔의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 견지에 의하면, 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose, CMC), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 및 물을 포함하는, 장기 유착 방지용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기 장기 유착 방지용 조성물을 이용하여 제조된, 장기 유착 방지용 주입형 수화겔이 제공된다.

본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose, CMC), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 및 물을 혼합하여 장기 유착 방지용 조성물을 제공하는 단계; 및 상기 장기 유착 방지용 조성물에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 장기 유착 방지용 주입형 수화겔의 제조 방법이 제공된다.

본 발명에 의한 장기 유착 방지용 조성물 및 이를 이용한 주입형 수화겔은 전자기파의 일종으로 투과력이 높은 감마선 이온화 에너지를 사용하여 가교를 수행하여 잔여 물질에 대한 독성 우려가 없고, 조사와 동시에 밀봉된 상태에서도 멸균을 할 수 있어서 보다 안전하고 효율적으로 제작이 가능하며, 필름형 유착 방지제에 비하여 적용 범위의 제한이 없고, 조절된 점도 범위로 인해 목적으로 하는 부위에 안정하게 유지될 수 있다.

도 1은 본 발명의 주입형 수화겔의 제조 공정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 주입형 수화겔의 혼합 비율에 따른 점도 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 주입형 수화겔의 성분 함량과 감마선 조사에 따른 화학적 성분 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 주입형 수화겔의 세포 부착 여부를 확인하기 위한 생&사(Live & Dead) 실험의 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 유착 방지 효과를 확인하기 위해 랫트의 맹장과 인접 조직에 수화겔을 펴 바른 후 경과를 확인하는 과정을 나타내는 것이다.
도 6은 접착력 측정을 위해 각 점막에 수화겔을 펴 바른 후 H&E 염색을 시행한 결과 사진을 나타낸 것이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의하면, 이온화 에너지를 사용하여 가교를 수행할 수 있어 화학적 가교 물질 등과 같은 잔여 물질에 대한 독성 우려가 없고, 방사선 조사와 동시에 밀봉된 상태에서도 멸균을 할 수 있어서 보다 안전하고 효율적으로 제작이 가능하며, 특히 필름형 유착 방지제에 비하여 적용 범위의 제한이 없고, 조절된 점도 범위로 인해 목적으로 하는 부위에 안정하게 유지될 수 있는 장기 유착 방지용 조성물 및 이를 이용한 수화젤이 제공된다.

본 발명의 장기 유착 방지용 조성물은 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose, CMC), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 및 물을 포함하는 것으로, 방사선 이온화에너지에 의해 물리적 가교가 이루어지며 조직 접착성이 뛰어난 천연 고분자인 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)에 세포 부착을 방해하는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 그리고 유착방지 효과를 극대화하기 위해 무혈관 무신경 조직인 연골의 세포외기질을 분말화하여 사용하였다.

본 발명에 사용되는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 고분자의 치환도는 0.5~2.8인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하기로는 0.8~2.8의 것이다. 치환도가 0.5 미만인 경우에는 방사선에 의해 가교(cross-linking)가 되지 않으며, 치환도가 2.8을 초과하게 되는 경우에는 친수성 유기 용매에 용해되기 때문에 불균일한 반응이 발생되어 바람직하지 않다.

폴리에틸렌글리콜(PEG)은 수화겔의 유연성 향상과 수화겔의 가교도를 적절히 조절하는 특징이 있다. 본 발명에 따라 수화겔의 일 구성요소로 사용되는 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 200~5,000인 것이 바람직하다. 분자량이 200 미만인 경우에는 고분자 용액의 점도가 매우 낮아 겔화율도 낮고 겔 강도도 낮아 체내에서 액상으로 독성을 일으켜 염증을 유발할 우려가 있다. 또한, 폴리에틸렌글리콜은 인체 내에서 분해될 수 있어야 하는데, 분자량이 5,000을 초과하게 되면 신장에서 걸러지지 않을 우려가 있어 바람직하지 않다.

나아가, 연골의 세포외기질에는 다른 조직의 세포외기질에 비해 조직 특이적으로 세포의 부착을 방지하는 루브리신, 비글리칸, 디코린, 피브로모듈린 등이 존재하고 있어서 장기와 장기 사이의 유착방지 효과를 향상시킬 수 있다.

한편, 본 발명에 사용될 수 있는 동물의 연골 유래 세포외기질 분말은 바람직하게는 인간을 제외한 동물로부터 획득할 수 있고, 예를 들어 말, 소, 돼지 등의 동물로부터 획득될 수 있는 것이나, 특히 제한되는 것은 아니며, 돼지의 연골 유래 세포외기질 분말인 것이 보다 바람직하다.

본 발명에서는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose, CMC), 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 동물의 연골 유래 세포외기질 분말의 조성을 조절하여 주입형 유착 방지제 제조에 적합한 조성물을 획득할 수 있다.

보다 상세하게, 본 발명의 상기 조성물의 중량%는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스 3.69 내지 8.75 중량%, PEG 2.4 내지 8.6 중량%, 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 0.01 내지 3.0 중량% 및 잔부의 물을 포함하는 것이며, 보다 바람직하게는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스 5.0 내지 7.0 중량%, PEG 4.0 내지 7.0 중량%, 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 0.01 내지 3.0 중량% 및 잔부의 물을 포함하는 것이다.

상기 본 발명의 장기 유착 방지용 주입형 수화겔에 있어서, 동물의 연골 유래 세포외기질 분말이 0.01 중량% 미만으로 포함되는 경우에는 항유착 효과가 불충분한 문제가 있으며, 3.0 중량%를 초과하여 포함되는 경우에는 CMC와 PEG 그리고 PCP의 화학 결합 반응으로 인해 점도가 과도하게 증가된 고체형 수화겔이 형성되어 주입에 적합한 물성의 수화겔이 획득될 수 없게 된다.

한편, 상기 소디움 카르복시메틸셀룰로오스와 폴리에틸렌글리콜은 중량비가 65 : 35 초과 내지 25 : 75인 것이 바람직하고, 이때 '초과'의 의미는 폴리에틸렌글리콜의 중량비가 35인 경우를 초과하는 양으로 포함되는 것을 의미하는 것이며, 즉 이 경우 상기 소디움 카르복시메틸셀룰로오스는 중량비가 65 미만인 것으로, 예를 들어 64 : 36인 것이다. 나아가 상기 소디움 카르복시메틸셀룰로오스와 폴리에틸렌글리콜은 중량비는 60 : 40 내지 30 : 70 인 것이 보다 바람직하며, 소디움 카르복시메틸셀룰로오스가 상기 범위 미만으로 포함되는 경우에는 방사선 조사 후 수화겔의 점도가 과도하게 상승하고 고체 형태에 가까워지므로 주입형 장기 유착 방지용 수화겔이 획득되지 않는 문제가 있으며, 상기 범위를 초과하여 포함되는 경우에는 주사기에서 고체 형성으로 인해 수화겔이 빠져 나오지 않거나 수화겔이 바져 나오면서 겔이 형태가 부서지는 현상이 일어난다.

본 발명에 의하면, 상술한 바와 같이 장기 유착 방지용 조성물을 이용하여 제조된 장기 유착 방지용 주입형 수화겔이 제공된다.

본 발명의 상기 장기 유착 방지용 주입형 수화겔의 점도는 20 내지 120 P(g/cm·s) 인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 28 내지 113 P(g/cm·s) 인 것으로, 점도가 상기 범위 미만인 경우에는 장기에 적용 시 유착 방지가 필요한 대상 영역으로부터 이탈하는 문제가 있고, 점도가 상기 범위를 초과하는 경우에는 주입에 적합하지 않거나 넓은 범위의 영역에 적용이 어려워지고, 나아가 유착 부위 주변에 충분히 퍼지지 않는 문제가 있다.

본 발명의 장기 유착 방지용 조성물은 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose, CMC), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 및 물을 혼합하여 장기 유착 방지용 조성물을 제공하는 단계; 및 상기 장기 유착 방지용 조성물에 방사선을 조사하는 단계를 포함하여 제조된다.

이때, 상기 동물의 연골 유래 세포외기질 분말은, 동물의 연골을 분리하는 단계; 상기 분리된 연골을 동결건조 후 1차 분쇄하는 단계; 상기 1차 분쇄된 연골분말을 탈세포화 하여 순수한 세포외기질 성분을 획득하는 단계; 상기 탈세포화된 연골분말을 산성 용액 및 펩신(pepsin)과 혼합하여 처리 후, 염기성 용액으로 중화시켜 수용화 연골 분말 수용액을 제조하는 단계; 및 수용화 연골분말 수용액을 동결건조 후 2차 분쇄하여 수용화 연골 분말을 획득하는 단계를 포함하는 과정에 의해 획득될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 상세하게, 동물의 연골을 분리하는 단계는 연골을 분리하여 조각을 내고 생리 식염수 등을 이용하여 세척하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 분리된 연골을 동결건조 후 1차 분쇄하는 단계는 동결분쇄기를 이용하여 수행될 수 있으며, 특히 제한되는 것은 아니나 예를 들어 약 -100 내지 -20 ℃의 온도에서 약 1 내지 100 μm, 바람직하게는 약 5 내지 50 μm 의 평균 입경을 갖는 분말로 분쇄될 수 있다.

상기 1차 분쇄된 연골분말을 탈세포화 하여 순수한 세포외기질 성분을 획득하는 단계는 연골분말에 존재하는 세포 및 유전물질을 제거하고, 순수한 세포외기질 성분만을 얻기 위해 수행되는 것으로, 예를 들어 연골 분말을 유전물질을 제거을 위하여 당 저장액 (Hypotonic buffer) 처리하고, 원심분리기를 이용하여 원심분리한 후 상층액을 제거하고, 수집된 연골 분말을 세포 제거를 위하여 SDS (Sodium dodecyl sulfate) 용액에 첨가한 후 증류수 등으로 세척할 수 있다. 추가로, DNase 처리 후 세척하고, 동결분쇄기를 이용하여 약 -100 내지 -20 ℃의 온도에서 약 1 내지 100μm, 바람직하게는 약 5 내지 50 μm의 평균 입경을 갖는 분말로 분쇄될 수 있다.

후속적으로 상기 탈세포화된 연골분말을 산성 용액 및 펩신(pepsin)과 혼합하여 처리 후, 염기성 용액으로 약 pH 7.4로 중화시켜 수용화 연골 분말 수용액을 제조하는 단계를 수행하고, 나아가 획득된 수용화 연골분말 수용액을 동결분쇄기를 이용하여 약 -100 내지 -20 ℃의 온도에서 약 1 내지 100μm, 바람직하게는 약 5 내지 50 μm 의 평균 입경을 갖는 분말로 동결건조 후 2차 분쇄하여 수용화 연골 분말을 획득하는 단계를 통해 최종적인 연골 유래 세포외기질 분말을 획득할 수 있다.

상기 1차 분쇄하는 단계 및 2차 분쇄하는 단계는 분말의 평균 입경이 1 내지 100μm 이가 되도록 수행되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 평균 입경 5 내지 50 μm의 분말이 되도록 수행되는 것이다. 상기 분말의 입경이 1 μm 미만인 경우에는 균일한 형태와 크기의 조절이 쉽지 않은 문제가 있고, 100 μm를 초과하는 경우에는 총 표면적 감소로 인해 항유착 효과가 떨어지는 문제가 있다.

한편, 상기 장기 유착 방지용 조성물을 제공하는 단계는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스와 폴리에틸렌글리콜을 물에 용해하여 수용액을 제조하는 단계; 동물의 연골 유래 세포외기질 분말을 물에 분산시켜 수분산액을 제조하는 단계; 및 상기 수용액과 상기 수분산액을 혼합하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다.

상기 소디움 카르복시메틸셀룰로오스와 폴리에틸렌글리콜은 중량비가 65 : 35 초과내지 25 : 75 인 것이 바람직하고, 60 : 40 내지 30 : 70 인 것이 보다 바람직하며, 수용액 내 고형분 함량은 10 내지 14 중량%인 것이 바람직하다.

고형분 함량이 상기 범위 미만이 경우에는 점도가 낮아 조직에 부착성이 저하되는 문제가 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우에는 점도가 높아져 주입형으로 적용할 수 있는 수화겔이 획득될 수 없는 문제가 있다.

한편, 상기 수분산액은 동물의 연골 유래 세포외기질 분말을 0.01 내지 3.0 중량%의 함량으로 포함하는 것이 바람직하며, 동물의 연골 유래 세포외기질 분말이 0.01 중량% 미만으로 포함되는 경우에는 항유착 효과가 불충분한 문제가 있으며, 3.0 중량%를 초과하여 포함되는 경우에는 CMC와 PEG 그리고 PCP의 화학 결합 반응으로 인해 점도가 과도하게 증가된 고체형 수화겔이 형성되어 주입에 적합한 물성의 수화겔이 획득될 수 없게 된다.

또한, 상기 수용액과 상기 수분산액을 혼합하는 단계는 상기 수용액: 수분산액을 95:5 내지 85:15의 부피비로 혼합하여 수행되는 것이 바람직하며, 상기 수분산액이 상기 범위 미만으로 포함되는 경우에는 상대적으로 소디움 카르복시메틸셀룰로오스 및 폴리에틸렌글리콜의 함량이 증가하여 고체형에 가까운 수화겔이 형성되는 문제가 있으며, 상기 수분산액이 상기 범위를 초과하여 포함되는 경우에는 상기 동물의 연골 유래 세포외기질 분말이 과량 포함되는 경우와 동일한 문제가 발생할 수 있다.

상기와 같이 획득된 장기 유착 방지용 조성물은 이후 방사선을 조사하여 수화겔을 획득할 수 있다. 본 발명에 있어서는 수화겔의 제조를 위해 일반 가교제의 사용이 전혀 요구되지 않으며, 방사선 조사를 통해 가교가 수행될 수 있다. 이때 상기 방사선을 조사하는 단계는 총 선량 10 내지 25kGy로 조사되는 것이 바람직하며, 바람직하게는 20 내지 25kGy로 조사되는 것이다. 방사선 조사 시 총 선량이 10 kGy 미만인 경우에는 본 발명의 조성물로부터 주입형 유착방지제로서 요구되는 점도 범위의 수화겔을 획득할 수 없는 문제가 있으며 25kGy를 초과하는 경우에는 동물의 연골유래 세포외기질 분말에 포함된 콜라겐, 히알론산 등의 성분이 이온화에너지에 의해 분해되는 문제가 있다.

나아가, 상기 방사선을 조사하는 단계는 5 내지 25 kGy/hr로 수행되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 7 내지 20 kGy/hr로 수행되는 것이다. 방사선 조사 시 시간 당 선량이 5 kGy/hr 미만인 경우에는 수화겔 형태가 획득되지 않는 문제가 있으며, 25 kGy/hr 를 초과하는 경우에는 연골유래 세포외기질 분말 성분이 분해되는 문제가 있다.

이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

하기 기재된 데이터에서 모든 값은 평균 값 ±표준편차(s.d.)로 나타내었다.

실시예 1

1. 연골 유래 세포외기질 분말의 제조

(1) 연골의 분리

돼지로부터 연골 유래 세포외기질 파우더를 제작하기 위해 EN 12442의 "Animal tissues and their derivatives utilized in the manufacture of medical devices, part 1; Analysis and management of risk, part 2; controls on sourcing, collection and handling"을 참조하여 기준에 부합하는 시설의 돼지 무릎 연골을 구입하여 사용하였다.

(2) 연골의 분리 및 분쇄

돼지 연골에서 연골을 잘라내어 연골 조각 (약 20 X 30 mm)을 만들고 여기에 생리 식염수를 이용하여 10분간 3회 세척하여 -80℃에 냉동시킨 뒤 3일간 동결건조 시켰다. 건조된 연골 조각을 동결분쇄기(JAI, JFC-300, JAPAN)를 사용하여 약 10 ㎛ 사이즈로 동결 분쇄하여 -80℃에 보관하였다.

(3) 연골분말의 물리화학적 탈세포화

돼지연골분말에 존재하는 세포 및 유전물질을 제거하고, 순수한 세포외기질 성분만을 얻기 위해 다음과 같이 탈세포화 과정을 수행하였다.

이를 위해 상기에서 제조한 돼지 연골분말을 10 g 당 저장액 (Hypotonic buffer) 500 ml을 처리하여 200 rpm으로 4℃에서 4시간 동안 교반하였다. 연골분말을 침전시켜 분리시키기 위해서 원심분리기(US-21SMT, Vision, Korea)를 사용하여 10,000 rpm에서 30분간 처리하였다. 상층액을 제거한 뒤 연골분말을 0.1% SDS (Sodium dodecyl sulfate, Bio-rad, USA) 용액에 첨가하여 200 rpm으로 4℃에서 2시간 동안 교반하였다. SDS 처리가 끝난 뒤 연골분말은 3차 증류수를 이용하여 5회 반복하여 세척하였고 세척수의 교환은 전술한 바와 같은 원심분리조건으로 진행하였다. 다음으로, 500 U/ml의 DNase (Sigma, USA) 200 ml을 처리하여 200 rpm으로 37℃ 배양기에서 12시간 동안 교반하였다. Dnase 처리 후 전술한 바와 같이 3차 증류수를 이용하여 5회 세척하였다. 탈세포화된 연골분말은 -80℃ 초저온 냉동장치에서 냉각한 후 3일간 동결건조하였다. 건조된 연골분말은 전술한 바와 같은 방법으로 파쇄하여 최종적으로 약 10 ㎛ 사이즈의 연골분말 파우더를 수득하고 필요 시까지 -80℃에서 보관하였다.

(4) 효소를 이용한 수용성 연골분말제조

탈세포화된 연골분말 4 g 당 100 ml의 염산수용액에 펩신(Pepsin; sigma, USA)을 처리하여 200 rpm으로 4℃에서 24시간 교반하였다. 펩신(pepsin) 처리 후, NaOH 용액을 이용하여 pH 7.4로 중화시켰다. 수용화된 연골분말은 투석막 (MWCO 1000, Spectrolab, USA)에 넣은 뒤 3차 증류수에 200 rpm으로 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 그 후 수용화된 연골분말을 용기에 담아 -80℃ 초저온 냉동장치에서 냉각시킨 후 3일간 동결건조하였다. 수용화 처리된 연골분말은 전술한 바와 같은 방법으로 약 10㎛ 사이즈를 갖는 파우더로 분쇄하여 최종적으로 -80℃ 냉동장치에 필요시까지 보관하였다. 이렇게 획득된 연골 유래 세포외기질 분말은 수용성이다.

2. 장기 유착 방지용 주입형 수화겔의 제조

(1) 시약 및 재료

본 실험에서 사용된 소디움 카복시메틸셀룰로스나트륨(Sodium carboxymethyl cellulose, CMC, DS=1.2, Mw. 250,000) 와 폴리에틸렌 글리콜(PEG, Mw 4,400~4,800)은 시그마-알드리치 사(Sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고 본 발명에 사용된 동물 유래 세포외기질 분말은 돼지 연골 유래 세포외기질 분말(PCP-ws, Porcine cartilage powder-water soluble)로써 상기 1.에서 개시된 공정에 의해 제조된 것으로 리젠프라임^㈜에서 제공받아 따로 정제과정 없이 사용하였으며 용매로 사용된 물은 3차 증류수를 사용하였다. 세포독성 실험에서 사용된 세포는 NIH3T3 세포(ATCC^® CRL-1658TM, mouse embryo fibroblast)이고 10% 소태아혈청(FBS, GIBCO, NY, USA)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(GIBCO, NY, USA)을 첨가한 DMEM-HG(Dulbecco's modified eagle medium with 4.5 g · L^-1 glucose, GIBCO, NY, USA) 배지를 사용하였다. 배양된 세포의 배양기(dish)와의 분리에 트립신-EDTA(GIBCO, NY, USA)와 PBS(phosphate buffered saline, GIBCO, NY, USA)을 이용하였다. 세포독성 평가를 위해 사용된 시약은 CCK-8(Cell counting kit-8 assay, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)이다.

(2) 장기 유착 방지용 주입형 수화겔의 제조

CMC와 PEG를 아래 표 1에 표시된 조성비로 혼합하여 3차 멸균 증류수에 용해시켜 전체 고형분의 농도를 12.3 wt%로 고정하였다[Ref.J-H. L., et al., Journal of applied polymer science, 96, 1138-1145, 2005]. 여기에 0.123 wt% 돼지 연골 유래 세포외기질 분말(PCP-ws) 용액을 CMC-PEG 용액과 90:10이 되도록 유성원심혼합기(Planetarycentrifugal mixer, Awatori Rentaro, ARE-310, THINKY Corporration, Japan)를 이용하여 균일하게 혼합하여 장기 유착 방지용 조성물을 획득하였다.

주입형 수화겔의 제조를 위한 배합 조성

		CMC (중량비): PEG (중량비)
비교예 1	Cp 0	79	21
비교예 2	Cp 1	75	25
비교예 3	Cp 2	65	35
실시예 1	Cp 3	55	45

이때, 상기 믹서는 3분 동안 1700 rpm 속도가 1 세트가 되게 하여 1회~2회 정도 실시하였다.

상기와 같이 혼합된 장기 유착 방지용 조성물을 실린지에 담아서 다른 화학적 가교결합제 없이 방사선에 의해서만 가교시켜 주입형 수화겔을 획득하였다. 이때 상기 방사선은 감마선 (⁶⁰CO, MDS Nordion, Canada, IR 221 n wet storage type C-188, 한국원자력연구원 정읍 방사선연구소)을 사용하였고, 25 kGy (선량률; 10 kGy/hr)로 조사하였다.

3. 장기 유착 방지용 주입형 수화겔의 점도 측정

감마선 조사에 의해 가교된 주입형 수화겔의 소디움 카복시메틸셀룰로스나트륨과 폴리에틸렌 글리콜 함량 비율에 따라 점도가 어떻게 변하는지를 분석하기 위해 유동계(rheometer, ARES strain-controlled rheometer, TA Instrument, INC., USA)를 이용하였다. 우선 각 조성에 맞게 제작된 주입형 수화겔을 콘 및 평판의 기하학적 구조(cone and plate geometry)로 설정 후 측정하였다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이 소디움 카복시메틸셀룰로스나트륨의 함량이 많고 폴리에틸렌 글리콜 함량이 낮을수록 점도는 점점 높아져 실린지에 넣은 상태에서 생체에 주입 시 뭉쳐지는 현상이 발생할 우려가 있다.

한편, 실시예 1과 같이 소디움 카복시메틸셀룰로스나트륨과 폴리에틸렌 글리콜의 중량비가 55:45 비율로 혼합된 경우 주입형 수화겔로써 바람직한 점도를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

4. 주입형 수화겔의 성분 함량에 따른 결합도 분석

상기 2.에서 제조된 주입형 수화겔(CMC/PEG-PCP)에서 소디움 카복시메틸셀룰로스나트륨과 폴리에틸렌 글리콜과 돼지 연골 유래 세포외기질 분말의 성분 분석 및 함유량에 따른 결합도 등의 화학적 변화를 측정하기 위해 ATR-FTIR (TENSOR 37 Spectrophotometer BRUKER, Germany)를 사용하였고, DLa TGS 검출기(detector)를 사용하여 4000-600 cm^-1 파장 범위를 주사 회수 64회, 분해능 4 cm^-1의 조건으로 시료들을 분석하였다.

그 결과 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 방사선 조사 전후에도 혼합 조성분의 화학적 구조 변화가 없는 것으로 보아 25 kGy 미만에서는 생체조직 단백질인 PCP가 화학구조적으로 안전하다는 것을 확인하였다. 또한, PCP 이 혼합된 모든 군에서 항유착 효과가 있는 것을 확인하였다.

5. 주입형 수화겔의 세포 부착 및 증식여부 평가

장기 유착 방지용 주입형 수화겔은 표면에 세포가 부착 및 증식되지 않아야 한다. 이를 테스트하기 위해 섬유아세포를 이용하여 실험을 수행하였다. 24 웰 플레이트에 각 표본의 조건에 따른 주입형 수화겔을 올리고 1시간 후 다시 거둬내어 바닥을 코팅하는 방식으로 실험을 진행하였다. 이렇게 코팅된 플레이트 바닥 위에 상기 세포들을 분포시켜 부착 및 증식 여부를 생 & 사 균주(live & dead stain) 염색을 통해 현미경을 사용하여 확인하였다.

도 4에 나타난 바와 같이 PEG의 양이 증가하고 CMC 양이 감소할수록 세포가 적게 붙는 것은 PEG가 조직의 유착 시 조직 세포의 증식을 억제해줌으로써 유착을 방지된다는 것을 확인할 수 있었고, 방사선 선량에 따라 CMC의 함량에 따라 점도를 조절할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 대조군에서 세포 배양 접시에 자라는 군보다 PCP가 함유된 모든 수화겔에서 세포가 잘 붙지 않는다는 것을 확인하였다. 한편, 주입을 위한 물성으로 실시예 1의 혼합 비율이 우수한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한 모든 그룹에서 죽은 세포는 거의 발견되지 않았다.

6. 수화겔의 장기 유착 시험

도 5에 나타난 바와 같이 실험용 랫트의 맹장과 인접한 복벽에 상처를 내고, 각 시험군을 랫트 20마리로 하여, 한 시험군에는 수화겔을 사용하지 않고(대조군), 다른 한 시험군에는 실시예 1의 주입형 수화겔을 상처를 낸 부위에 도포하고(실험군) 7일 후, 부검하여 유착 정도를 알아보았다. 유착 정도의 평가는 수술된 부위에서의 복벽과 맹장의 부착된 정도를 확인하고 조직학 염색을 통해 평가하였다.

도 6에 나타난 바와 같이 7일 후 부검하여 확인한 결과, 대조군에서는 복벽과 맹장이 강력하게 붙어 있는 것을 확인하였으며, 주입형 수화겔을 도포한 실험군은 농도에 따른 변화 없이 모두 복벽과 맹장이 분리되는 것을 확인하였다.

또한, 도 6에 나타난 바와 같이 조직학 염색을 통해서도 대조군은 복벽과 맹장 사이에 유착 조직이 형성되어 두 조직이 결합되어 있는 것을 확인하였으나, 주입형 수화겔을 도포한 실험군은 모두 복벽과 맹장이 명확하게 분리되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

특히, 실험군 중에서도 실시예 1의 수화겔을 적용한 경우는 비교예 1의 수화겔을 적용한 경우에 비하여 복벽과 맹장이 더욱 명확하게 분리되어 있으며, 따라서 본 발명에 의한 실시예 1의 경우 비교예 1에 비하여 유착 방지능이 현저하게 향상된 것을 확인할 수 있다.

Claims (15)

1. 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose, CMC), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 0.01 내지 3.0 중량% 및 잔부의 물을 포함하며,
   상기 소디움 카르복시메틸셀룰로오스와 폴리에틸렌글리콜은 중량비가 64 : 36 내지 25 : 75인, 점도 20 내지 120 P(poise)의, 주입형 장기 유착 방지용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 소디움 카르복시메틸셀룰로오스는 3.69 내지 8.75 중량% 및 상기 PEG는 2.4 내지 8.6 중량%로 포함되는, 주입형 장기 유착 방지용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 동물의 연골 유래 세포외기질 분말은 돼지의 연골 유래 세포외기질 분말인, 주입형 장기 유착 방지용 조성물.
   
4. 삭제
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 장기 유착 방지용 조성물을 이용하여 제조된, 주입형 장기 유착 방지용 주입형 수화겔.
   
6. 삭제
7. 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose, CMC), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 0.01 내지 3.0 중량% 및 잔부의 물을, 상기 소디움 카르복시메틸셀룰로오스와 폴리에틸렌글리콜의 중량비 64 : 36 내지 25 : 75의 범위에서 혼합하여 장기 유착 방지용 조성물을 제공하는 단계; 및
   상기 장기 유착 방지용 조성물에 방사선을 조사하는 단계
   를 포함하는, 점도 20 내지 120 P(poise)의, 장기 유착 방지용 주입형 수화겔의 제조 방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 동물의 연골 유래 세포외기질 분말은
   동물의 연골을 분리하는 단계;
   상기 분리된 연골을 동결건조 후 1차 분쇄하는 단계;
   상기 1차 분쇄된 연골분말을 탈세포화하여 순수한 세포외기질 성분을 획득하는 단계;
   상기 탈세포화된 돼지연골분말을 산성 용액 및 펩신(pepsin)과 혼합하여 처리 후, 염기성 용액으로 중화시켜 수용화 연골 분말 수용액을 제조하는 단계; 및
   수용화 연골분말 수용액을 동결건조 후 2차 분쇄하여 수용화 연골 분말을 획득하는 단계
   를 포함하는 과정에 의해 획득되는, 장기 유착 방지용 주입형 수화겔의 제조 방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 1차 분쇄하는 단계 및 2차 분쇄하는 단계는 분말의 평균 입경이 1 내지 100 μm가 되도록 수행되는, 장기 유착 방지용 주입형 수화겔의 제조 방법.
   
10. 제7항에 있어서, 장기 유착 방지용 조성물을 제공하는 단계는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스와 폴리에틸렌글리콜을 물에 용해하여 수용액을 제조하는 단계;
    동물의 연골 유래 세포외기질 분말을 물에 분산시켜 수분산액을 제조하는 단계; 및
    상기 수용액과 상기 수분산액을 혼합하는 단계
    를 포함하여 수행되는, 장기 유착 방지용 주입형 수화겔의 제조 방법.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 수용액 내 고형분 함량은 10 내지 14 인, 장기 유착 방지용 주입형 수화겔의 제조 방법.
    
12. 삭제
13. 제10항에 있어서, 상기 수용액과 상기 수분산액을 혼합하는 단계는 수용액 : 수분산액을 95:5 내지 85:15의 부피비로 혼합하여 수행되는, 장기 유착 방지용 주입형 수화겔의 제조 방법.
    
14. 제7항에 있어서, 상기 방사선을 조사하는 단계는 총 선량 10 내지 25kGy로 조사되는, 장기 유착 방지용 주입형 수화겔의 제조 방법.
    
15. 제7항에 있어서, 상기 방사선을 조사하는 단계는 5 내지 25 kGy/hr로 수행되는, 장기 유착 방지용 주입형 수화겔의 제조 방법.

Images