KR20180029021A - 장기 유착 방지용 수화겔 및 이를 이용한 수화겔 필름 - Google Patents

Abstract

본 발명은 장기 유착 방지용 수화겔 및 이를 이용한 수화겔 필름에 관한 것으로, 보다 상세하게는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose, CMC), 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 및 물을 포함하는 장기 유착 방지용 수화겔; 및 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose, CMC), 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 및 물을 혼합하여 장기 유착 방지용 수화겔을 제공하는 단계, 상기 장기 유착 방지용 수화겔을 필름 형태로 성형하는 단계 및 필름 형태로 성형된 장기 유착 방지용 수화겔에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 장기 유착 방지용 수화겔 필름의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

장기 유착 방지용 수화겔 및 이를 이용한 수화겔 필름{HYDROGEL FOR PREVENTING SURGICAL ADHESIONS AND HYDROGEL FILM USING THE SAME}

본 발명은 장기 유착 방지용 수화겔 및 이를 이용한 수화겔 필름에 관한 것으로, 특히 필름 형태로 제조가 가능하여 안전성, 재현성 및 대량 생산성이 증가된 장기 유착 방지용 수화겔 및 이를 이용한 수화겔 필름에 관한 것이다.

유착이란 조직과 조직 사이의 비정상적인 결합을 말하는데, 일반적으로 개복 수술 후 유착 발생 빈도가 높고, 이와 같은 장기 유착은 각종 후유증 유발, 유착 박리를 위한 재수술 등의 문제점을 야기한다. 이러한 유착을 방지하기 위한 방법으로는 수술 시 상처를 최소화하거나 항염제의 사용 혹은 섬유소 형성을 막기 위한 혈전증 치료제인 조직형 혈전 용해제(Tissue Plasminogen Activator; tPA)를 활성화시키는 방법이 있고, 최근에는 물리적 장벽(physical barrier, colonization)을 사용하는 방법이 개발되어 사용되고 있다. 상기 물리적 장벽은 조직의 상처가 치유되는 동안 인접한 조직 사이에 유착이 형성되는 것을 막아 준다.

일반적으로, 상기와 같은 유착 방지 재료로 사용하기 위해서는 상처가 치유되는 기간 동안 유착 방지 역할을 한 다음 생분해되어야 한다. 즉, 상기와 같은 물리적 장벽은 상처의 치유가 끝난 후에 분해 또는 흡수되어 제거되어야 하는데, 이 경우 장벽(barrier)용 재료 자체 혹은 그 분해 산물이 인체에 무해하여야 한다. 그러나, 지금까지 사용된 유착방지제는 상처 치유 기간 중에 너무 빨리 생분해되거나 생체적합성이 부족하여 만족스런 결과를 보여주지 못했다.

일례로, 존슨 앤 존슨(Johnson & Johnson) 사는 재생 셀룰로오스(oxidized regenerated cellulose)를 직물로 직조하여 만든 인터시드 티씨7(Interceed TC7)을 시판하고 있다. 그러나, 이 물질은 혈액이 풍부한 환경에서는 적용할 수 없는데, 그러한 환경에서는 장벽 기능을 상실하기 때문이다. 아울러, 여러 동물 실험(J. of Surgical Research, 68, 126-132, 1997) 및 임상 실험 결과를 보면 장기 유착 방지에 대한 효과는 미미한 것으로 나타나고 있다.

미국 등록특허 제6,133,325호에서도 카르복시메틸셀룰로오스와 폴리에틸렌옥사이드를 물에 용해시키고 건조하여 막을 제조하는 유착 방지막에 대해 개시하고 있다. 그러나, 상기 재료는 중성의 용액에서 쉽게 용해되는 문제점 때문에 장시간 유착 방지 효과를 기대하기는 어려웠다. 한편, 미국 등록특허 제5,017,229호, 제5,527,893호 및 제5,760,200호 등에서는 폴리사카라이드의 일종인 히아루론산(hyaluronic acid, HA) 및 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose, CMC)를 이용한 유착 방지 방법에 대하여 개시하고 있다. HA와 CMC를 주요 성분으로 하고 여기에 EDC(1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)를 반응시키면 그 일부가 카르복시 말단기와 반응하여 양전하를 띠게 되고 이것이 음전하를 띠는 카르복시 말단기와 반응하여 자발적으로 다가전해질 착물(polyelectrolyte complex)을 형성하게 된다. 이는 고분자 내에 양전하와 음전하가 공존하는 형태의 화합물로 이런 형태의 화합물은 고분자 내의 이온 결합에 의해 쉽게 분해되거나 용해되지 않는 수화겔 구조를 갖게 된다. 상기 수화겔을 건조시키면 큰 흡수성을 가지며 생체 내에서 쉽게 분해되지 않는 방지막이 만들어진다.

그러나, 이때 사용되는 EDC는 생체 독성을 갖고 있으므로, 제조 공정 중에 이를 제거하기 위하여 오랜 시간 동안 투석을 해야 하며, 인체 적용 시 염증이나 이물 반응과 같은 독성을 일으킬 수 있고, 2차적인 멸균 작업을 따로 해야 하는 번거로움이 존재하였고, 원료인 히아루론산은 매우 고가의 물질이므로 제조되는 필름의 원가가 높아지는 문제점이 있다. 또한, 상기 등록특허에 의하여 제조된 필름은 건조시의 유연성 및 강도가 약하여 매우 부서지기 쉬우며 수화 반응(hydration)이 진행되면서 빠른 속도로 겔화(gelation)되므로, 일단 수분이 존재하는 생체 조직에 적용한 후에는 다시 떼어 내어 재시술을 할 수 없는 등 취급 및 시술에 어려움이 있었다. 따라서, 생체 내 독성을 유발할 수 있는 화학적 가교제 처리 없이 안정하고 효율적으로 제조될 수 있는 장기 유착 방지용 수화겔 및 필름이 제공되는 경우 관련 분야에서 널리 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

이에 본 발명의 한 측면은 화학적 가교제 처리 없이 안정하고 효율적으로 제조될 수 있는 장기 유착 방지용 수화겔을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 측면은 화학적 가교제 처리 없이 안정하고 효율적으로 제조될 수 있는 장기 유착 방지용 수화겔 필름을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 견지에 의하면, 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose, CMC), 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 및 물을 포함하는, 장기 유착 방지용 수화겔이 제공된다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose, CMC), 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 및 물을 혼합하여 장기 유착 방지용 수화겔을 제공하는 단계; 상기 장기 유착 방지용 수화겔을 필름 형태로 성형하는 단계; 및 필름 형태로 성형된 장기 유착 방지용 수화겔에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 장기 유착 방지용 수화겔 필름의 제조 방법이 제공된다.

본 발명에 의한 장기 유착 방지용 수화겔 및 이를 이용한 수화겔 필름은 전자기파의 일종으로 투과력이 높은 감마선 이온화 에너지를 사용하여 가교를 수행하여 잔여 물질에 대한 독성 우려가 없고, 조사와 동시에 밀봉된 상태에서도 멸균을 할 수 있어서 보다 안전하고 효율적으로 제작이 가능하여, 안전성, 재현성 및 대량 생산성이 현저하게 향상될 수 있다.

도 1은 본 발명의 수화겔 필름의 제조 공정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 주사전사현미경을 통한 수화겔 필름의 표면 분석 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 수화겔 필름 내 포함된 돼지 연골 유래 세포외기질 분말 농도에 따른 겔화율 그래프를 도시한 것이다.
도 4는 수화겔 필름에 포함된 돼지 연골 유래 세포외기질 분말 농도에 따른 팽윤도 그래프를 도시한 것이다.
도 5는 수화겔 필름의 강도를 측정한 그래프를 도시한 것이다.
도 6은 수화겔 필름의 성분 함량 분석을 위한 FTIR 그래프를 도시한 것이다.
도 7은 수화겔 필름에 세포를 이식한 1일 후 세포의 생 및 사 균주(live & dead strain) 염색을 결과를 나타낸 것이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의하면, 감마선, 전자선 등의 방사선 이온화 에너지를 사용하여 가교를 수행할 수 있어 화학적 가교 물질 등과 같은 잔여 물질에 대한 독성 우려가 없고, 방사선 조사와 동시에 밀봉된 상태에서도 멸균을 할 수 있어서 보다 안전하고 효율적으로 제작이 가능하여 안전성, 재현성 및 대량 생산성이 현저하게 향상된 장기 유착 방지용 수화겔 및 수화겔 필름이 제공된다.

본 발명의 장기 유착 방지용 수화겔은 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose, CMC), 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 및 물을 포함하는 것으로, 접착성을 향상시키기 위해 천연고분자인 소디움 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC)를 주 재료로 사용하였고, 이와 함께 유착방지 효과를 높이기 위해 무혈관 무신경 조직인 연골의 세포외기질을 분말화하여 사용하였다.

연골의 세포외기질에는 다른 조직의 세포외기질에 비해 조직 특이적으로 세포의 부착을 방지하는 루브리신, 비글리칸, 디코린, 피브로모듈린 등이 존재하고 있어서 장기와 장기 사이의 유착방지 효과를 향상시킬 수 있다.

한편, 본 발명에 사용될 수 있는 동물의 연골 유래 세포외기질 분말은 바람직하게는 인간을 제외한 동물로부터 획득할 수 있고, 예를 들어 돼지, 말, 소 등의 동물로부터 획득될 수 있는 것이나, 특히 제한되는 것은 아니며, 돼지의 연골 유래 세포외기질 분말인 것이 보다 바람직하다.

본 발명에서는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose, CMC)의 농도, 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 농도 및 이들의 혼합 비율을 조절하여 필름형 유착 방지제 제조에 적합한 수화겔을 획득할 수 있다.

상기 소디움 카르복시메틸셀룰로오스는 물의 중량을 기준으로 15 내지 30 중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 18 내지 25 중량%, 더욱 바람직하게는 약 20 중량%의 함량으로 포함되는 것이다. 상기 소디움 카르복시메틸셀룰로오스는 추후 방사선 조사 시 가교가 이루어지도록 하는 물질로써, 그 함량이 물의 중량을 기준으로 15 중량% 미만인 경우에는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스 화학 결합의 가교도가 낮아 수화겔이 필름형으로 형태를 유지할 수 없게 되며, 30 중량%를 초과하는 경우에는 가교도의 증가로 수분 함량이 증가되어 기계적인 물성이 약해지므로 역시 필름 형태로 성형하기 어려워진다.

한편, 상기 동물의 연골 유래 세포외기질 분말은 물과 소디움 카르복시메틸셀룰로오스의 중량을 기준으로 0.5 내지 5 중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 2.5 내지 4.5 중량%의 함량이고, 더욱 바람직하게는 약 3.5 중량% 함량인 것이다. 상기 연골 유래 세포외기질 분말의 함량이 0.5 중량% 미만인 경우에는 항유착 효과가 미미한 문제가 있으며, 5 중량%를 초과하는 경우에는 방사선 조사 시 소디움 카르복시메틸셀룰로오스의 분자 결합 반응을 연골 유래 세포외기질 분말이 방해함으로써 가교도가 낮아져 수화겔이 필름형으로 형태를 유지할 수 없게 된다.

또한, 상기 소디움 카르복시메틸셀룰로오스와 동물의 연골 유래 세포외기질 분말의 중량비는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스: 동물의 연골 유래 세포외기질 분말의 중량비 = 4:1 내지 40:1인 것이 바람직하고, 4:5 내지 40:9인 것이 보다 바람직하며, 더욱 바람직하게는 약 40:7인 것이다. 소디움 카르복시메틸셀룰로오스를 기준으로 상기 동물의 연골 유래 세포외기질 분말의 중량비가 상기 범위 미만의 함량으로 포함되는 경우에는 항유착 효과가 미미한 문제가 있으며, 상기 범위를 초과하여 과량으로 포함되는 경우에는 방사선 조사 시 소디움 카르복시메틸셀룰로오스의 분자 결합 반응을 연골 유래 세포외기질 분말이 방해함으로써 가교도가 낮아죠 수화겔이 필름형으로 형태를 유지할 수 없게 된다.

본 발명에 의하면, 상술한 바와 같이 장기 유착 방지용 수화겔을 이용하여 제조된 수화겔 필름이 제공된다.

본 발명의 장기 유착 방지용 수화겔 필름은 보다 상세하게, 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose, CMC), 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 및 물을 혼합하여 장기 유착 방지용 수화겔을 제공하는 단계; 상기 장기 유착 방지용 수화겔을 필름 형태로 성형하는 단계; 및 필름 형태로 성형된 장기 유착 방지용 수화겔에 방사선을 조사하는 단계를 포함하여 제조된다.

이때, 상기 동물의 연골 유래 세포외기질 분말은, 동물의 연골을 분리하는 단계; 상기 분리된 연골을 동결건조 후 1차 분쇄하는 단계; 상기 1차 분쇄된 연골분말을 탈세포화하여 순수한 세포외기질 성분을 획득하는 단계; 상기 탈세포화된 연골분말을 산성 용액 및 펩신(pepsin)과 혼합하여 처리 후, 염기성 용액으로 중화시켜 수용화 연골 분말 수용액을 제조하는 단계; 및 수용화 연골분말 수용액을 동결건조 후 2차 분쇄하여 수용화 연골 분말을 획득하는 단계를 포함하는 과정에 의해 획득될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 상세하게, 동물의 연골을 분리하는 단계는 연골을 분리하여 조각을 내고 생리식염수 등을 이용하여 세척하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 분리된 연골을 동결건조 후 1차 분쇄하는 단계는 동결분쇄기를 이용하여 수행될 수 있으며, 특히 제한되는 것은 아니나 예를 들어 약 -100 내지 -20 ℃의 온도에서 약 1 내지 100 μm, 바람직하게는 약 5 내지 50 μm 의 평균 입경을 갖는 분말로 분쇄될 수 있다.

상기 1차 분쇄된 연골분말을 탈세포화하여 순수한 세포외기질 성분을 획득하는 단계는 연골분말에 존재하는 세포 및 유전물질을 제거하고, 순수한 세포외기질 성분만을 얻기 위해 수행되는 것으로, 예를 들어 연골 분말을 유전물질의 제거를 위하여 당 저장액 (Hypotonic buffer) 처리하고, 원심분리기를 이용하여 원심분리한 후 상층액을 제거하고, 수집된 연골 분말을 세포의 제거를 위하여 SDS (Sodium dodecyl sulfate) 용액에 첨가한 후 증류수 등으로 세척할 수 있다. 추가로, DNase 처리 후 세척하고, 동결분쇄기를 이용하여 약 -100 내지 -20 ℃의 온도에서 약 1 내지 100μm, 바람직하게는 약 5 내지 50 μm 의 평균 입경을 갖는 분말로 분쇄될 수 있다.

후속적으로 상기 탈세포화된 연골분말을 산성 용액 및 펩신(pepsin)과 혼합하여 처리 후, 염기성 용액으로 약 pH 7.4로 중화시켜 수용화 연골 분말 수용액을 제조하는 단계를 수행하고, 나아가 획득된 수용화 연골분말 수용액을 동결분쇄기를 이용하여 약 -100 내지 -20 ℃의 온도에서 약 1 내지 100μm, 바람직하게는 약 5 내지 50 μm 의 평균 입경을 갖는 분말로 동결건조 후 2차 분쇄하여 수용화 연골 분말을 획득하는 단계를 통해 최종적인 연골 유래 세포외기질 분말을 획득할 수 있다.

상기 1차 분쇄하는 단계 및 2차 분쇄하는 단계는 분말의 평균 입경이 약 1 내지 100μm, 바람직하게는 5 내지 20 μm가 되도록 수행되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 평균 입경 5 내지 15 μm의 분말이 되도록 수행되는 것이다. 상기 분말의 입경이 1 μm 미만인 경우에는 균일한 형태와 크기의 조절이 어려운 문제가 있고, 100μm 를 초과하는 경우에는 총 표면적 감소로 인해 항유착 효과가 저하되는 문제가 있다.

상기와 같이 획득된 장기 유착 방지용 수화겔은 필름 형태로 성형하고, 이루 방사선을 조사하여 수화겔 필름을 획득할 수 있다.

상기 장기 유착 방지용 수화겔을 필름 형태로 성형하는 단계는 예를 들어, 도포, 압출 성형법, 필름 캐스팅법 등의 방법에 의해 성형될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 고분자수지 팩에 넣고 평평하게 필름 형태로 제조할 수도 있다.

본 발명에 있어서는 수화겔의 제조를 위해 일반 가교제의 사용이 전혀 요구되지 않으며, 방사선 조사를 통해 가교가 수행될 수 있다. 이때 상기 방사선을 조사하는 단계는 총 선량 10 내지 25kGy로 조사되는 것이 바람직하며, 바람직하게는 20 내지 25kGy로 조사되는 것이다. 방사선 조사 시 총 선량이 10kGy 미만인 경우에는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스, 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 및 물 혼합액이 수화겔로 원활하게 형성되지 않는 문제가 있으며, 25kGy를 초과하는 경우에는 콜라겐, 히알론산 등과 같은 동물의 연골유래 세포외기질분말의 성분이 이온화에너지에 의해 분해되는 문제가 있다.

나아가, 상기 방사선을 조사하는 단계는 5 내지 25 kGy/hr로 수행되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 7 내지 20 kGy/hr로 수행되는 것이다. 방사선 조사 시 시간 당 선량이 5 kGy/hr 미만인 경우에는 수화겔이 원활하게 형성되지 않는 문제가 있으며, 25 kGy/hr 를 초과하는 경우에는 연골 유래 세포외기질 분말의 화학구조 자체가 분해될 수 있는 문제가 있다.

이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

1. 연골 유래 세포외기질 분말의 제조

(1) 연골의 분리

돼지로부터 연골 유래 세포외기질 파우더를 제작하기 위해 EN 12442의 "Animal tissues and their derivatives utilized in the manufacture of medical devices, part 1; Analysis and management of risk, part 2; controls on sourcing, collection and handling"을 참조하여 기준에 부합하는 시설의 돼지 무릎 연골을 구입하여 사용하였다.

(2) 연골의 분리 및 분쇄

돼지 연골에서 연골을 잘라내어 연골 조각 (약 20 X 30 mm)을 만들고 여기에 생리식염수를 이용하여 10분간 3회 세척하여 -80℃에 냉동시킨 뒤 3일간 동결건조 시켰다. 건조된 연골 조각을 동결분쇄기(JAI, JFC-300, JAPAN)를 사용하여 약 10 ㎛ 사이즈로 동결 분쇄하여 -80℃에 보관하였다.

(3) 연골분말의 물리화학적 탈세포화

돼지연골분말에 존재하는 세포 및 유전물질을 제거하고, 순수한 세포외기질 성분만을 얻기 위해 다음과 같이 탈세포화 과정을 수행하였다.

이를 위해 상기에서 제조한 돼지연골분말을 10 g 당 저장액 (Hypotonic buffer) 500 ml을 처리하여 200 rpm으로 4℃에서 4시간 동안 교반하였다. 연골분말을 침전시켜 분리시키기 위해서 원심분리기(US-21SMT, Vision, Korea)를 사용하여 10,000 rpm에서 30분간 처리하였다. 상층액을 제거한 뒤 연골분말을 0.1% SDS (Sodium dodecyl sulfate, Bio-rad, USA) 용액에 첨가하여 200 rpm으로 4℃에서 2시간 동안 교반하였다. SDS 처리가 끝난 뒤 연골분말은 3차 증류수를 이용하여 5회 반복하여 세척하였고 세척수의 교환은 전술한 바와 같은 원심분리조건으로 진행하였다. 다음으로, 500 U/ml의 DNase (Sigma, USA) 200 ml을 처리하여 200 rpm으로 37℃ 배양기에서 12시간 동안 교반하였다. Dnase 처리 후 전술한 바와 같이 3차 증류수를 이용하여 5회 세척하였다. 탈세포화된 연골분말은 -80℃ 초저온 냉동장치에서 냉각한 후 3일간 동결건조하였다. 건조된 연골분말은 전술한 바와 같은 방법으로 파쇄하여 최종적으로 약 10 ㎛ 사이즈의 연골분말 파우더를 수득하고 필요 시까지 -80℃에서 보관하였다.

(4) 효소를 이용한 수용성 연골분말제조

탈세포화된 연골분말 4 g 당 100 ml의 염산수용액에 펩신(Pepsin; sigma, USA)을 처리하여 200 rpm으로 4℃에서 24시간 교반하였다. 펩신(pepsin) 처리 후, NaOH 용액을 이용하여 pH 7.4로 중화시켰다. 수용화된 연골분말은 투석막 (MWCO 1000, Spectrolab, USA)에 넣은 뒤 3차 증류수에 200 rpm으로 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 그 후 수용화된 연골분말을 용기에 담아 -80℃ 초저온 냉동장치에서 냉각시킨 후 3일간 동결건조하였다. 수용화 처리된 연골분말은 전술한 바와 같은 방법으로 약 10㎛ 사이즈를 갖는 파우더로 분쇄하여 최종적으로 -80℃ 냉동장치에 필요시까지 보관하였다. 이렇게 획득된 연골 유래 세포외기질 분말은 수용성이다.

2. 장기 유착 방지용 수화겔 및 이를 이용한 수화겔 필름의 제조

(1) 시약 및 재료

본 실험에서 사용된 카복시메틸셀룰로스나트륨(Sodium carboxymethyl cellulose, CMC, DS=1.2, Mw. 250,000)는 Sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고 본 발명에 사용된 동물 유래 세포외기질 분말은 돼지 연골 유래 세포외기질 분말(PCP-ws, Porcine cartilage powder-water soluble)로써 상기 1.에서 개시된 공정에 의해 제조된 것으로 리젠프라임^㈜에서 제공받아 따로 정제과정 없이 사용하였으며 용매로 사용된 물은 3차 증류수를 사용하였다. 세포독성 실험에서 사용된 세포는 NIH3T3 세포(ATCC^® CRL-1658TM, mouse embryo fibroblast)이고 10% 소태아혈청(FBS, GIBCO, NY, USA)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(GIBCO, NY, USA)을 첨가한 DMEM-HG(Dulbecco's modified eagle medium with 4.5 g?L^-1 glucose, GIBCO, NY, USA) 배지를 사용하였다. 배양된 세포의 배양기(dish)와의 분리에 트립신-EDTA(GIBCO, NY, USA)와 PBS(phosphate buffered saline, GIBCO, NY, USA)을 이용하였다. 세포독성 평가를 위해 사용된 시약은 CCK-8(Cell counting kit-8 assay, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)이다.

(2) 장기 유착 방지용 수화겔의 제조

CMC를 3차 증류수에 20 중량%가 되도록 첨가 후 유성원심혼합기(Planetarycentrifugal mixer, Awatori Rentaro, ARE-310, THINKY Corporration, Japan)를 이용하여 점성이 강한 CMC 용액을 제작하였다. 그 후, CMC 용액에 돼지 연골 유래 세포외기질 분말(CMC/PCP-ws)을 0(비교예 1), 0.1(비교예 2), 0.5 중량%(실시예 1) 농도로 첨가 후 다시 믹서를 이용하여 혼합하였다. 이때, 믹서는 3분 동안 1700 rpm 속도가 1 세트가 되게 하여 4회~5회 정도 실시하여 수화겔 용액을 획득하였다.

(3) 장기 유착 방지용 수화겔 필름의 제조

상기 2.(2)에서 획득한 CMC/PCP-ws 수화겔 용액을 폴리에틸렌 팩에 넣고 평평하게 필름형태로 성형 후, 다른 화학적 가교결합제 없이 방사선 가교에 의해서만 수화겔로 제조하였다. 방사선은 감마선 (⁶⁰CO, MDS Nordion, Canada, IR 221 n wet storage type C-188, 한국원자력연구원 정읍 방사선연구소)을 사용하였고, 25 kGy (선량률; 10 kGy/hr)로 조사하였다. 제조된 CMC/PCP-ws 수화겔은 폴리에틸렌 팩을 제거 한 후 상온에서 12 시간 동안 건조하여 패치형 수화겔 필름으로 제작하였다.

실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2로부터 상기와 같은 공정에 의해 제조된 수화겔 필름을 각각 제조예 1, 비교제조예 1 및 비교제조예 2라 한다.

3. 장기 유착 방지용 수화겔 필름의 형태학적 분석

감마선 조사에 의해 가교된 수화겔 필름을 동결건조기(-89^oC, VAC. 5 mTorr, 220 V, Bondiro, ilshin BioBase Co.Ltd., Korea)로 2일간 동결건조하였다. 건조된 수화겔 필름의 표면에 대하여 금으로 진공코팅 처리 후, 돼지 연골 유래 세포외기질 분말의 함량에 따른 표면의 변화를 주사전자현미경(FE-SEM, Scanning Electron Microscopy, Hitachi S-4800, Japan)을 통해 확대하고, 이미지화하여 분석하였다.

그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이 3 차원적인 다공성 구조를 가진 막이 획득되었으며, 돼지 연골 유래 세포외기질 분말을 포함하지 않은 비교제조예 1의 필름은 동결건조 하였을 때 CMC의 가교도 증가에 따른 물의 함수량이 높기 때문에 동결 시 물 결정이 크고 많으며, 나아가 동결 건조 시 물이 승화되기 때문에 기공이 균일하나 다소 큰 것을 확인할 수 있고, 돼지 연골 유래 세포외기질 분말 0.1 중량%를 포함하는 비교제조예 2의 필름은 비교제조예 1의 필름에 비해 기공 사이즈가 더욱 크고 불균일 한 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 돼지 연골 유래 세포외기질 분말 0.5 중량%를 포함하는 본 발명의 제조예 1의 필름은 CMC의 함량의 감소로 기공 사이즈가 현저하게 작고 촘촘해지는 것을 확인할 수 있었다.

현재 장기 유착 방지 시술에 사용 되고 있는 유착방지막의 주요성분이 CMC인 점을 고려해 볼 때 화학적 가교제가 필요 없는 본 발명을 적용하는 경우 생체안정성 및 생체적합성이 우수할 것으로 예측할 수 있다.

4. 장기 유착 방지용 수화겔 필름의 겔화율 측정

감마선 조사에 의해 가교된 본 발명의 수화겔 필름의 겔화율 측정을 위해 필름의 초기 무게(W_i)를 재고 증류수에 48 시간 동안 침지시킨 후 셀룰로오스 종이로 수화겔 표면의 물을 닦은 후 팽윤된 젤을 오븐에 넣어 40^oC에서 48시간 건조시켜 건조된 젤 무게(W_d)를 측정 후 하기 식(1)에 대입하여 수화겔의 겔화율(Gel fraction)을 백분율로 나타내었다.

식(1)

수화겔의 겔화율 측정 결과를 도 3에 나타내었으며, 이온화 에너지 25 kGy 일 때, 비교제조에 1에서는 95% 정도의 겔화율을 나타내었지만, 돼지 연골 유래 세포외기질 분말의 함량이 증가할수록 겔화율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 본 실험 결과는 방사선 이온화에너지에 의해 가교되는 성분은 CMC 성분으로 돼지 연골 유래 세포외기질 분말의 함량이 증가할수록 CMC 성분의 전체적인 함량이 감소되기 때문에 가교율이 떨어지는 것을 알 수 있었다. 이와 같이 가교율이 저하되는 것은 생분해성의 조절이 가능함을 의미하는 것이므로, 본 발명의 수화겔은 이와 같은 겔화율의 조절에 의해 생체 내에서의 생분해성 조절이 가능한 것을 알 수 있다.

5. 장기 유착 방지용 수화겔 필름의 팽윤도 측정

본 발명의 수화겔 필름을 바이오펀치(Biopunch)를 이용하여 2 cm x 2 cm 동일 크기로 준비하고 24 well 크기로 둥글게 펀칭한 후, 수화겔 필름을 상온에서 증류수에 각각 침지시킨 후 시간 경과에 따른 무게 변화를 평형에 이를 때까지 측정하여, 환경의 변화에 수화겔의 팽윤도가 어떻게 변하는지 분석하였다.

이때, 수화겔의 팽윤도(Degree of Swelling)는 하기 식 (2)에 나타낸 바와 같이 팽윤된 겔(W_s)의 무게와 필름의 무게(W_d)차를 필름의 무게(W_d)로 나누어 백분율로 나타내었다.

식(2)

또한, 실제 인비트로(in vivo)로 실험 전 생리 식염수에 수화시킨 후 사용하므로 수화겔 필름의 수화 시 두께 변화를 측정하였다.

그 결과 도 4에 나타난 바와 같이 수화겔은 증류수 상에서는 물의 흡수가 단시간에 급격하게 이루어져 초반에 건조된 수화겔의 물 흡수율이 1000배 이상 팽창하는 것을 관찰하였다.

한편, 체내 수분과 유사한 환경의 PBS상이나 세포가 자라기 위해 필요한 DMEM 배지에 적용한 수화겔은 증류수상에서 보다 600배 이하의 팽윤도를 보이고 급격하게 팽창하는 현상은 증류수에 비해 방사선에 의해 가교된 CMC 하이드로겔이 이온을 함유하고 있는 PBS, DMEM 배지에서 분자 결합력이 증가되어 수분 팽윤도가 감소되는 것을 관찰할 수 있었다.

본 실험 결과 이온화에너지 선량이 25 kGy일 때, CMC만 단독으로 포함하는 비교제조예1의 경우보다 돼지 연골 유래 세포외기질 분말이 추가되었을 때 팽윤도가 감소하는 것을 알 수 있었으며, 이러한 결과는 방사선 이온화에너지에 이에서 가교되는 성분은 CMC 성분으로 전체적인 양이 감소 되기 때문에 가교율과 팽윤도가 동시에 떨어지는 것을 확인한 것이다.

6. 장기 유착 방지용 수화겔의 강도 측정

수화겔 필름을 수화시킨 후 물리적인 자극을 견뎌내는 힘이 어느 정도 인지 분석하기 위해 수화겔을 필름으로 건조시켜 PBS에 수화 후 다시 수화겔화시켜 강도를 측정하여 물리적인 자극을 견뎌내는 힘이 얼마나 되는지 확인하였다.

이때 텍스처 분석기(Texture analyser, TX-XT2i, stable microsystem Co. Ltd. Surrey England)를 이용하여 측정 하였고, 강도와 탄성도를 측정하기 위한 수화겔 시편의 두께는 평균 1 mm, 지름은 3 cm로 하였다.

그 결과 도 5에 도시한 바와 같이 이온화에너지 선량이 25 kGy일 때, CMC만 단독으로 포함하는 비교제조예1의 경우보다 돼지 연골 유래 세포외기질 분말이 추가되었을 때 돼지 연골 유래 세포외기질 분말 함량이 증가할수록 기계적 물성이 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 본 실험 결과는 CMC의 함량이 감소가 되더라도 CMC와 돼지 연골 유래 세포외기질 분말의 물리화학적 가교반응을 통해 물성이 향상됨을 나타내는 것이다.

7. 장기 유착 방지용 수화겔 내 성분의 함량에 따른 결합도 분석

수화겔 필름에서 돼지 연골 유래 세포외기질 분말의 함량에 따른 수화겔의 성분 분석 및 결합도를 포함하는 화학적 변화를 측정하기 위해 수화겔을 동결건조 시킨 후 ATR-FTIR (TENSOR 37 Spectrophotometer BRUKER, Germany)로 분석을 실시하였고, DLa TGS 검출기(detector)를 사용하여 4000-600 cm^-1 파장 범위를 주사회수 64회, 분해능 4 cm^-1의 조건으로 시료들을 분석하였다.

도 6은 수화겔 필름의 성분 함량 분석을 위한 FTIR 그래프를 나타낸 것으로, 25 kGy 방사선 조사에 의해 가교된 수화겔 필름의 화학적 분석 결과 방사선에 의해 구조가 변형되거나 분해되지 않은 것을 확인할 수 있었다. 한편, 이온화에너지에 의해 물리적 가교되는 수화겔의 CMC와 수용성 연골 조직 생체재료인 돼지 연골 유래 세포외기질 분말 혼합된 수화겔의 화학적인 표면 분석에 의하면 돼지 연골 유래 세포외기질 분말의 함량이 증가할수록 1600~1700 cm^-1 에서 단백질의 아마이드 피크의 확인을 통해 균일한 하이드로겔이 제조된 것을 확인할 수 있었다.

8. 수화겔의 세포 부착 및 증식여부 평가

장기 유착 방지용 수화겔 필름의 표면은 세포의 부착 및 증식을 저해해야 한다. 이를 테스트하기 위해 섬유아세포(fibrobast)를 이용하여 실험을 수행하였다. 24 웰 플레이트에 재단된 재료를 넣고 재료 위에 섬유아세포를 이식하여 실험을 수행하였다. 세포를 이식한 후 1일 후 세포의 생존 및 죽은 균주(live & dead strain) 염색을 통해 관찰하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.

실험 결과 수화겔 필름으로 코팅한 바닥에는 대조군으로 세포 배양 기판(cell sulture plate)과 비교하였을 때 세포의 부착이 일어나지 않았으며, 또한 죽어있는 세포도 관찰되지 않는 것을 확인할 수 있었다.

이는 본 발명의 수화겔 필름이 장기 유착 방지에 효과를 보인다고 해석될 수 있는 것이다. 한편, 본 발명의 모든 수화겔에서의 세포 독성은 없었으며, 수화겔에서 용출된 용액에서 돼지 연골 유래 세포외기질 분말의 함량이 증가하더라도 세포 독성은 없는 것을 확인하였다.

이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (9)

1. 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose, CMC) 15 내지 30 중량%, 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 0.5 내지 5 중량% 및 잔부의 물로 이루어진, 장기 유착 방지용 수화겔.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 동물의 연골 유래 세포외기질 분말은 돼지의 연골 유래 세포외기질 분말인, 장기 유착 방지용 수화겔.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 소디움 카르복시메틸셀룰로오스와 동물의 연골 유래 세포외기질 분말의 중량비는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스: 동물의 연골 유래 세포외기질 분말의 중량비 = 4:1 내지 40:1인, 장기 유착 방지용 수화겔.
   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 장기 유착 방지용 수화겔을 이용하여 제조된, 장기 유착 방지용 수화겔 필름.
   
5. 소디움 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose, CMC) 15 내지 30 중량%, 동물의 연골 유래 세포외기질 분말 0.5 내지 5 중량% 및 잔부의 물을 혼합하여 장기 유착 방지용 수화겔을 제공하는 단계;
   상기 장기 유착 방지용 수화겔을 필름 형태로 성형하는 단계; 및
   필름 형태로 성형된 장기 유착 방지용 수화겔에 방사선을 조사하는 단계
   를 포함하는 장기 유착 방지용 수화겔 필름의 제조 방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 동물의 연골 유래 세포외기질 분말은
   동물의 연골을 분리하는 단계;
   상기 분리된 연골을 동결건조 후 1차 분쇄하는 단계;
   상기 1차 분쇄된 연골분말을 탈세포화하여 순수한 세포외기질 성분을 획득하는 단계;
   상기 탈세포화된 돼지연골분말을 산성 용액 및 펩신(pepsin)과 혼합하여 처리 후, 염기성 용액으로 중화시켜 수용화 연골 분말 수용액을 제조하는 단계; 및
   수용화 연골분말 수용액을 동결건조 후 2차 분쇄하여 수용화 연골 분말을 획득하는 단계
   를 포함하는 과정에 의해 획득되는, 장기 유착 방지용 수화겔 필름의 제조 방법.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 1차 분쇄하는 단계 및 2차 분쇄하는 단계는 분말의 평균 입경이 1 내지 100 μm가 되도록 수행되는, 장기 유착 방지용 수화겔 필름의 제조 방법.
   
8. 제5항에 있어서, 상기 방사선을 조사하는 단계는 총 선량 10 내지 25kGy로 조사되는, 장기 유착 방지용 수화겔 필름의 제조 방법.
   
9. 제5항에 있어서, 상기 방사선을 조사하는 단계는 5 내지 25 kGy/hr로 수행되는, 장기 유착 방지용 수화겔 필름의 제조 방법.

Images