KR20180045843A - 3d 프린팅 맞춤형 골지지체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 제조방법 및 이에 의해 제조된 3D 프린팅 맞춤형 골지지체를 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 3D 프린팅 맞춤형 골지지체는 생체적합성 및 세포부착능이 우수하며, 골견손부에 이식하였을 경우, 뛰어난 골형성능력을 나타낸다.

Description

3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 제조방법{Preparation Method of Customized Bone Graft for 3D Printing}
본 발명은 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 제조방법에 관한 것이다.
2012년 기준 글로벌 산업용 3D 프린터 산업 규모는 22억 400만 달러 수준이며, 연평균 19.3% 이상의 고속성장을 통해 2021년에는 133억 달러에 달할 전망이다. 특히, 분야별 3D 프린팅 기술 활용을 살펴보면 구강악안면외과, 성형외과, 정형외과 등 다양한 분야에 활용될 수 있으며, 향후 의료분야에 대한 비중은 환자 맞춤형 기술이 가능한 장점으로 점차 증가할 것으로 예상된다. 기존의 선행연구에서 PCL 재료를 통한 조직재생용 인공지지체의 개발에 성공했다면, 본 발명에서는 골재생에 특이적 유도능을 가진 생분해성 유/무기 복합재료와 생체적합성 콜라겐을 이용한 3D 프린팅 공정 기술 확립 및 이의 최적화를 시도하였다. PCL 소재로 제작된 3D 프린팅 인공지지체는 환자 맞춤형으로 제작되어 많은 연구가 진행되었지만, 결손부위가 골 조직으로 재생되기에는 한계가 있는 것으로 분석되고 있다.
본 발명은 이종골을 사용하여 3D 프린팅 맞춤형 골지지체를 제조하고자 예의 연구노력하였다. 그 결과, 이종골을 나노수준으로 분쇄하여 HA(hydroxyapatite) 나노입자를 제조하고, 이를 용융된 PCL과 혼합하여 PCL/HA 지지체를 제작한 다음, EDC/NHS 가교된 콜라겐 용액과 반응시켜 생체적합성 및 세포부착능이 우수한 3D 프린팅 맞춤형 골지지체를 제조할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 제조된 3D 프린팅 맞춤형 골지지체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 제조방법을 제공한다:
(a) 이종골을 분쇄하여 HA(hydroxyapatitde) 나노입자를 제조하는 단계;
(b) 콜라겐을 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide)/NHS(N-hydroxysuccinimide) 용액과 반응시키고, 셀룰로오스 투석막에서 중화 및 세척하여 가교반응을 실시하는 단계;
(c) HA 나노입자를 용융된 PCL(polycaprolactone)과 혼합하고 3D 프린터를 이용하여 골지지체를 제작하는 단계; 및
(d) 골지지체를 상기 EDC/NHS 가교된 콜라겐 용액과 반응시키는 단계.
본 발명은 이종골을 사용하여 3D 프린팅 맞춤형 골지지체를 제조하고자 예의 연구노력하였다. 그 결과, 이종골을 나노수준으로 분쇄하여 HA 나노입자를 제조하고, 이를 용융된 PCL과 혼합하여 PCL/HA 지지체를 제작한 다음, EDC/NHS 가교된 콜라겐 용액과 반응시켜 생체적합성 및 세포부착능이 우수한 3D 프린팅 맞춤형 골지지체를 제조할 수 있음을 규명하였다.
본 발명은 나노 수준의 돼지 뼈 유래 이종골을 사용하여 3D 프린팅 맞춤형 골지지체를 제조하고, PCL과 혼합하여 환자맞춤형 3D 프린팅 PCL/HA 지지체를 제작한 다음, EDC/NHS 가교된 콜라겐 용액과 반응시켜 생체적합성 및 세포부착능이 우수한 3D 프린팅 맞춤형 골지지체를 제조할 수 있음을 규명함으로써 기존의 선행연구에서 PCL 재료를 이용한 3D 프린팅 골지지체의 단점인 골재생에 대한 한계를 극복하였다.
본 발명의 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 제조방법을 각 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): HA 나노입자의 제조
본 발명에 따르면, 우선 이종골을 분쇄하여 HA 나노입자를 제조한다.
본 발명에서 사용되는 이종골은 소 뼈, 말 뼈 및 돼지 뼈로 구성된 군에서 선택된다. 바람직하게는 이종골로서 돼지 해면질골을 이용한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, HA 나노입자를 제조하기 위해 막자사발을 이용하여 이종골을 간 다음, 물에 분산시킨 후 초고속 나노입자 분산기 및 1 mm 지르코늄볼을 밀링(milling)하여 나노 수준으로 분쇄한다. 제조된 HA 나노입자는 100-300 nm, 보다 바람직하게는 200-300 nm의 크기를 나타낸다.
단계 (b): 콜라겐 가교반응
돼지피부로부터 추출한 콜라겐을 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide)/NHS(N-hydroxysuccinimide) 용액과 반응시키고, 셀룰로오스 투석막에서 중화 및 세척하여 가교반응을 실시한다.
돼지피부로부터 콜라겐을 추출하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있다. 바람직하게는 하기 실시예 1-2에 기재된 내용에 따라 추출한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 돼지피부로부터 추출한 콜라겐 용액을 EDC/NHS 용액과 pH 5.5 조건에서 반응시키고, 셀룰로오스 투석막에서 1-2일 동안 중화 및 세척하여 가교반응을 실시한다.
본 발명에서 콜라겐의 가교반응은 액체상태에서 실시되므로 균일하게 반응이 진행된다.
단계 (c): 골지지체 제조
상기 단계 (a)에서 제조된 HA 나노입자를 용융된 PCL은 바람직하게는 1:9 내지 4:6(w/w)의 비율로 혼합한다. 보다 바람직하게는 1:9 내지 3:7(w/w), 가장 바람직하게는 2:8(w/w)의 비율로 혼합한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, HA 나노입자와 용융된 PCL를 혼합한 다음, 분사용 시린지에 넣고 120-150 온도를 유지한다. 바람직하게는 130-140, 보다 바람직하게는 135 온도를 유지한다. 그 다음, PCL/HA 지지체를 압출식 3D 프린터를 이용하여 제작한다. PCL/HA 지지체의 크기 및 모양은 이식되는 위치에 따라 다양하게 제작될 수 있다.
단계 (d): 골지지체와 콜라겐 용액 반응
3D 프린터를 통해 제작된 PCL/HA 지지체에 EDC/NHS 가교된 콜라겐 용액을 반응시킨 후 동결건조하여 최종적으로 3D 프린팅 맞춤형 골지지체를 제작한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 3D 프린팅 맞춤형 골지지체를 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 제조방법 및 이에 의해 제조된 3D 프린팅 맞춤형 골지지체를 제공한다.
(b) 본 발명의 방법에 의해 제조된 3D 프린팅 맞춤형 골지지체는 생체적합성 및 세포부착능이 우수하며, 골결손부에 이식하였을 경우, 뛰어난 골형성 능력을 나타내므로 골이식재로서 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 유기물을 제거한 돼지 해면질골을 이용하여 제조한 HA 나노입자의 전자현미경 사진이다.
도 1b는 입자 크기가 다른 TCP 분말, Bio-OSS 분말, 유기물을 제거한 돼지 해면질골 분말(PBP)과 PCL/PLGA를 혼합하여 제작된 PCL/PLGA/TCP, PCL/PLGA/Bio-OSS 및 PCL/PLGA/PBP 3D 골지지체의 형태학적 특징을 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 사진이다.
도 1c는 도 1b의 PCL/PLGA/TCP, PCL/PLGA/Bio-OSS 및 PCL/PLGA/PBP 3D 골지지체의 세포 친화도 평가를 위해 CCK-8 분석을 실시한 결과이다.
도 2는 PCL/TCP, PCL/HA 및 Col-PCL/HA 3D 프린팅 맞춤형 골지지체 개발 과정에 대한 공정도이다.
도 3은 3D 프린팅 골지지체의 압축강도 평가 결과이다.
도 4a는 PCL/TCP, PCL/HA 및 Col-PCL/HA 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 세포 증식을 평가한 결과이다.
도 4b는 PCL/TCP에 대하여 세포배양 7일째 세포를 염색하고 형광현미경 및 콘포칼 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 4c는 PCL/HA에 대하여 세포배양 7일째 세포를 염색하고 형광현미경 및 콘포칼 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 4d는 Col-PCL/HA 3D 프린팅 맞춤형 골지지체에 대하여 세포배양 7일째 세포를 염색하고 형광현미경 및 콘포칼 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 5는 토끼 골결손 모델에서 PCL/TCP, PCL/HA 및 Col-PCL/HA 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 성능평가 결과이다.
도 6a는 토끼 골결손 모델에서 PCL/TCP, PCL/HA 및 Col-PCL/HA 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 Micro-CT의 분석(BV) 결과이다.
도 6b는 토끼 골결손 모델에서 PCL/TCP, PCL/HA 및 Col-PCL/HA 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 Micro-CT의 분석(Tb.Th) 결과이다.
도 6c는 토끼 골결손 모델에서 PCL/TCP, PCL/HA 및 Col-PCL/HA 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 Micro-CT의 분석(Tb.N) 결과이다.
도 6d는 토끼 골결손 모델에서 PCL/TCP, PCL/HA 및 Col-PCL/HA 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 Micro-CT의 분석(Tb.Sp) 결과이다.
도 7a는 토끼 골결손 모델에서 대조군(Critical defect group)에 대하여 비탈회 조직표본 제작 후에 광학현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7b는 토끼 골결손 모델에서 PCL/TCP에 대한 성능평가를 위해 비탈회 조직표본 제작 후에 광학현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7c는 토끼 골결손 모델에서 PCL/HA에 대한 성능평가를 위해 비탈회 조직표본 제작 후에 광학현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7d는 토끼 골결손 모델에서 Col-PCL/HA 3D 프린팅 맞춤형 골지지체에 대한 성능평가를 위해 비탈회 조직표본 제작 후에 광학현미경으로 관찰한 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 3D 프린팅 맞춤형 골지지체 개발
1-1. HA(Hydroxyapatite) 나노입자 제조
유기물을 제거한 돼지 해면질골을 막자사발을 이용하여 뼈 분말을 분쇄하고 500 ml 물에 분산시킨 후에, 초고속 나노 입자 분산기(Ultra-high nano-disperser, Laboratory Agitator Mill MiniCer, NETZSCH) 및 1 mm 지르코늄볼을 이용하여 3시간 밀링(2,500 rpm, feed level 4, 1.2 bar)하였으며, 이를 3회 반복하여 HA 나노입자를 제조하였다(200-300 nm).
1-2. 입자 크기에 따른 3D 프린팅을 이용하여 제작된 골지지체의 세포 친화도 평가
Bio-OSS 골식재와 유기물을 제거한 돼지 해면질골(PBP)을 1 ㎛ - 100 ㎛의 입자로 만들어 PCL/PLGA와 무게비 2:8로 균일하게 혼합하고, 준비된 재료를 분사용 시린지에 넣고 3D 프린팅 PCL/PLGA/Bio-OSS 및 PCL/PLGA/PBP 골지지체를 제작하였다. TCP(b-tricalcium phosphate nanopowder, Berkeley Advanced Biomaterials Inc. USA)는 분말 그대로 PCL/PLGA와 무게비 2:8로 균일하게 혼합하여 동일한 방법으로 3D 프린팅 PCL/PLGA/TCP 골지지체를 제작하였다(도 1b).
100 ㎛ 이하로 만들어진 Bio-OSS 입자와 PBP의 입자의 주사전자현미경(SEM) 사진을 촬영한 결과, Bio-OSS 입자와 PBP의 입자는 TCP 입자(100 nm)에 비해 크기가 크며, 불규칙한 형태로 관찰되었다.
균질한 모양의 TCP 입자로 제작된 3D 프린팅 PCL/PLGA/TCP 골지지체는 불규칙한 모양이면서 크기가 큰 입자로 제작된 PCL/PLGA/Bio-OSS 및 PCL/PLGA/PBP 골지지체에 비해서 주사전자현미경(SEM) 사진에서 모양이 균질하면서 표면이 거친 것을 볼 수 있었다(도 1b).
인간 유래 중배엽 줄기세포를 이용한 CCK-8 kit assay 분석에서 입자의 표면이 균질하고 크기가 작을수록 세포 증식률은 점점 증가하는 양상을 보였다(도 1c).
따라서 3D 프린팅에 골지지체에 사용되는 무기물 입자 형태와 크기는 세포 증식률에 영향이 있다는 것이 증명되어서, HA(Hydroxyapatite) 나노입자로 제조된 3D 프린팅 골지지체는 골형성에 긍정적인 영향을 줄 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
1-2. 콜라겐 추출 및 가교
돼지피부에 아세트산 및 펩신 처리하여 콜라겐을 추출한 후, 1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide (EDC)/N-hydroxysuccinimide (NHS)를 이용하여 가교반응시켰다.
생체의료용 콜라겐 추출은 다음의 방법에 따라 실시하였다.
1) 돈피 채취
시료는 도축장에서 돼지 피부를 제공받아 사용하였다.
돼지의 등쪽 피부를 수술용 칼을 이용하여 채취한다. 박피된 피부는 신선한 피부, 즉 사용 전 1일 이내에 박피한 것으로 바람직한 것은 5시간 이내에 사용되는 것을 말한다.
2) 돈피 팽윤
채취된 피부 조직을 폭 5 cm, 길이 15 cm의 크기로 절단한 후 1 M(pH 2.18) 아세트산 용액에 담근 다음, 4에서 24시간 동안 팽윤(swelling)시켜 상피층 및 피하 지방을 제거한다.
3) 세척 및 보관
분리된 진피는 멸균 증류수로 세척한 후, 체에 걸러서 물기를 제거한 후에 50 g 씩 포장하여 -80에서 보관한다.
4) 콜라겐 추출
냉동보관된 진피를 해동시킨 후, 99% 에탄올에 담궈 4에서 24시간 동안 소독 및 탈지한다. 진피(dermis)(50 g)와 아세트산(0.5 M, pH 2.31) 2.5 L를 준비하고, 분쇄기에 진피 조각과 0.5 M 아세트산을 혼합하여 분쇄한다. 그 후에 용액에 펩신(5 g, ≥400 units/mg)을 처리하고 4에서 24시간동안 교반한다.
5) 진공여과
30수 광목(7겹)에서 진공여과하여 불순물(털 등)을 제거한다.
6) 콜라겐 침전
진공여과한 용액 100 ㎖에 NaCl(5 M, 17.5 ㎖) 용액을 점적으로 첨가하고 4에서 12시간 교반 후에 콜라겐 침전물을 획득한다.
7) 원심분리
침전물을 7,000 rpm, 4에서 10분간 원심 분리하여 펠렛을 획득한다.
8) 셀룰로오스 투석
펠렛 50 ml를 인산나트륨 완충액(mixing & dilution solution with 0.2M NaH2PO4 and 0.2 M Na2HPO4 , pH 7.4) 250 ml와 99% 에탄올 50 ml에 희석한 후 셀룰로오스 투석막에 튜빙하여 증류수 7 L에 24시간동안 투석한다. 증류수는 총 3회 교환하도록 한다.
9) 동결건조
상기 방법으로 얻어진 투석 결과물을 12,500 rpm, 4에서 1시간 동안 원심분리한 후 상층액을 급속 동결시킨 후에 2-3일 동안 동결건조시킨다.
콜라겐을 순수하게 이용하여 만드는 제품의 경우에는 물성(인장강도, 탄성, 분해성 등)이 약하여 물성이 요구되는 시술에는 다소 어려움이 있다. 따라서 외과적 수술에 있어서 조작을 쉽게 하고 생체 내에서의 빠른 분해를 막기 위해서는 분자간의 가교결합(cross-link)이 필요하다.
방법으로는 크게 화학적 가교제를 이용하는 방법(글루타르알데하이드, 헥사메틸렌디이소시아네이트, 카보디이마이드 등과 반응)과 물리적인 방법(탈수열처리, 자외선이나 마이크로파 등을 조사)이 있다. 이러한 가교반응은 석회화와 조직 내 염증반응을 유발할 가능성이 있으므로 생체 외(in vitro)에서 이루어진 가교결합으로 기계적·물리적 물성은 향상시켰지만, 부작용 없이 생체적합성이 유지되는 것에 대한 연구들은 아직도 진행 중에 있다.
특히 화학적 가교방법은 특별한 장비없이 가교반응을 쉽게 유도할 수 있으므로 콜라겐 기반 생체재료 연구 및 개발에 널리 쓰이고 있다. 부작용으로는 가교반응 후 잔류물질에 의해 세포 및 조직 독성이 나타날 수 있다. 현재 일반적으로 사용되는 가교제로 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)를 꼽을 수 있는데, 이는 콜라겐 분자간 가교결합을 유도한 후 세척 과정에서 모두 제거되기 때문에 잔류물에 의한 세포독성이 상대적으로 적기 때문이다. EDC에 의한 가교반응의 효율을 N-hydroxysuccinimide(NHS)의 사용으로 높일 수 있다.
일반적으로 EDC/NHS를 이용한 콜라겐 기반 생체재료의 가교반응 과정은 다음과 같다. 1) 원하는 농도의 콜라겐 용액 제조(중화반응은 선택적), 2) 콜라겐 기반 생체재료 제작 및 건조, 3) 1을 EDC 및 NHS 용액과 반응시킴(pH 5.5), 4) 중화(최적의 EDC 가교반응을 위해 pH 5.5 환경에서 반응시킴. 따라서 생체적용을 위해서는 산성을 중화시켜야 함) 및 미반응 물질과 반응 후 산물을 제거하기 위한 세척, 5) 건조를 실시한다.
본 발명에서 생체의료용 콜라겐 가교반응은 다음의 방법에 따라 실시하였다.
1) 원하는 농도의 콜라겐 용액을 제조한다.
2) 1)을 EDC 및 NHS 용액과 반응시킨다(pH 5.5).
3) 실온(20)에서 셀룰로오스 투석막에서 1-2일 동안 중화 및 세척한다.
4) 콜라겐 기반 생체재료 제작 및 건조한다.
기존의 방법과의 차이점은 고체상태에서 EDC/NHS 가교반응을 진행시키므로 제품의 두께가 두꺼운 경우 내부에서는 상대적으로 가교반응이 미약하게 일어날 수 있고, 중화 및 세척도 불완전할 수 있다. 이는 결과적으로 생체재료의 질을 떨어뜨리고 세포 및 조직 독성을 일으킬 가능성도 있다.
그러나 본 발명자가 개발한 방법은 EDC/NHS 가교반응을 고체가 아닌 액체상태(콜라겐 용액)에서 진행시킴으로 기존 방법에 비해 균일한 반응을 유도할 수 있고, 투석을 통해 중화 및 세척을 함으로써 기존 방법에서 나타날 수 있는 부작용을 최소화할 수 있다.
1-3. 3D 프린팅을 위한 재료 준비
HA 또는 β-TCP(average diameter: 100 nm, Berkeley Advanced Biomaterials Inc., Berkeley, CA, USA) 입자를 용융된 PCL(19561-500G, 43,000-50,000 Mw; Polysciences Inc., Warrington, PA, USA)과 무게비 2:8로 균일하게 혼합하고, 준비된 재료를 분사용 시린지에 넣고 135의 온도를 유지하였다.
1-4. 3D 프린팅을 이용한 지지체 제작
PCL/TCP 또는 PCL/HA 지지체는 압출식 3D 프린터(extrusion-based 3D printing system)를 이용하여 제작하였다. 토끼 요골(radius) 결손부에 이식하기 위하여 직경 4 mm, 길이 20 mm의 원통형 지지체로, 분사된 가닥의 두께는 300 ㎛, 공극의 크기는 400 ㎛ 크기로 제작하였다. 콜라겐 코팅된 PCL/HA 지지체는 3D 프린팅된 PCL/HA 지지체를 EDC/NHS 가교된 콜라겐 용액과 24시간 반응시킨 후 동결건조하여 제작하였다(도 2).
실시예 2: 3D 프린팅 골지지체 성능평가
2-1. 3D 프린팅 골지지체의 압축강도 평가
PCL/TCP 또는 PCL/HA 지지체를 5 x 5 x 5 mm 크기로 제작하고, 일부 PCL/HA 지지체는 EDC/NHS 가교된 콜라겐 용액과 24시간 반응시킨 후 동결건조하였다. 각 샘플의 압축강도는 crosshead의 이동속도를 1 mm/min로 설정하고 만능시험기(Instron3304, Instron, USA)를 이용하여 측정하였다.
압축강도 평가 결과, 도 3에서 확인할 수 있듯이, PCL/HA < PCL/TCP < Col-PCL/HA 순으로 높은 압축 강도를 나타냈다. PCL/TCP 지지체가 PCL/HA 지지체에 비해 높은 압축강도를 가지지만 Col-PCL/HA가 PCL/TCP 지지체보다 높은 압축강도를 가지는 것을 볼 때, 콜라겐 코팅이 압축강도를 상당히 증가시키는 것으로 판단된다.
2-2. 3D 지지체에서의 세포 증식 평가
MG63 세포는 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 들어간 DMEM 배지를 사용하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 지지체에 대한 세포 부착을 확인하기 위해 1 x 105 세포/스캐폴드로 분주한 후 세포를 배양하였다. 배양 후 1, 3, 7일에 CCK 시약을 30 μl씩 처리한 다음 배양기에서 2시간 동안 반응시킨 후 멀티플레이트 분석기를 사용하여 450 nm 파장에서 측정하였다.
도 4a에서 확인할 수 있듯이, 세포배양 기간이 증가함에 따라 세포의 양도 증가함을 통해 지지체가 세포독성이 없음을 확인할 수 있었고, 세포배양 7일째 결과를 통해 콜라겐 코팅된 PCL/HA 지지체가 다른 군에 비해 유의적으로 세포 친화도가 높음을 확인할 수 있었다. 도 4b 내지 도 4d에서 확인할 수 있듯이, 세포배양 7일째 세포를 염색하고 형광현미경 및 컨포칼 현미경 사진에서도 동일한 결과를 얻을 수 있었다.
2-3. 토끼 골결손 모델에서 3D 지지체의 골형성능력 평가
토끼 요골(radius) 골간에 20 mm 길이의 골결손부를 형성한 후, PCL/TCP, PCL/HA 또는 콜라겐 코팅된 PCL/HA(Col-PCL/HA) 지지체를 각각 이식하였다. 이식부에서 지지체의 움직임을 최소화하기 위해 와이어를 이용하여 고정하였다. 이식 8주 후 토끼를 희생시켜 이식부를 단순방사선촬영하고, 조직을 채취한 후 마이크로-CT 분석 및 비탈회 조직표본 제작 후, 조직학적 분석을 실시하였다.
도 5는 토끼 요골에 20 mm 골결손부를 형성한 직후 및 3D 지지체 고정 후의 사진으로 8주 후 일반 방사선 사진, 마이크로-CT 사진이다.
분석결과, 도 6a 내지 도 6d에서 확인할 수 있듯이, PCL/TCP, PCL/HA, Col-PCL/HA 순으로 골형성 능력이 증가함을 확인하였다. 또한, 도 7a 내지 도 7d에서 확인할 수 있듯이, 비탈회 조직표본 제작 후, 조직학적 분석한 결과에서도 PCL/TCP, PCL/HA, Col-PCL/HA 순으로 골형성 능력이 증가함을 확인하였다.

Claims (8)

  1. 다음의 단계를 포함하는 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 제조방법:
    (a) 이종골을 분쇄하여 HA(hydroxyapatitde) 나노입자를 제조하는 단계;
    (b) 콜라겐을 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide)/NHS(N-hydroxysuccinimide) 용액과 반응시키고, 셀룰로오스 투석막에서 중화 및 세척하여 가교반응을 실시하는 단계;
    (c) HA 나노입자를 용융된 PCL(polycaprolactone)과 혼합하고 3D 프린터를 이용하여 골지지체를 제작하는 단계; 및
    (d) 골지지체를 상기 EDC/NHS 가교된 콜라겐 용액과 반응시키는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 이종골은 소뼈, 조류뼈, 말뼈 및 돼지뼈로 구성된 군에서 선택된 것인, 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 콜라겐은 돼지피부로부터 추출한 것인, 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 HA 나노입자는 이종골을 분쇄하고 물에 분산시킨 후, 초고속 나노 입자 분산기(Ultra-high nano-disperser) 및 지르코늄볼로 밀링(milling)하여 수득한 100-300 nm의 HA 나노입자인 것인, 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 HA 나노입자와 용융된 PCL은 1:9 내지 2:8(w/w)의 비율로 혼합하는 것인, 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 HA 나노입자와 용융된 PCL를 혼합한 다음, 분사용 시린지에 넣고 120-150 온도를 유지하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 제조방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 제조방법은 단계 (d) 이후 동결건조하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 3D 프린팅 맞춤형 골지지체의 제조방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 3D 프린팅 맞춤형 골지지체.
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