KR20130049742A

KR20130049742A - 형질전환 돼지 뼈를 이용한 골 이식용 세라믹 입자, 그 제조방법 및 상기 입자를 포함하는 생체의료용 세라믹재료

Info

Publication number: KR20130049742A
Application number: KR1020120123493A
Authority: KR
Inventors: 강성수; 최석화; 손준식; 심경미; 김세은
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2011-11-04
Filing date: 2012-11-02
Publication date: 2013-05-14
Also published as: KR101379894B1

Abstract

본 발명은 골 세라믹 입자 및 이를 이용한 생체의료용 골이식 재료에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인간에 대한 초급성, 급성혈관성 및 세포매개성 면역거부 현상이 없도록 형질 전환된 돼지의 뼈를 원료로 제조된 형질전환 돼지 뼈를 이용한 골 이식용 세라믹입자, 그 제조방법 및 상기 입자를 포함하는 생체의료용 세라믹재료에 관한 것이다.

Description

형질전환 돼지 뼈를 이용한 골 이식용 세라믹 입자, 그 제조방법 및 상기 입자를 포함하는 생체의료용 세라믹재료{Bone graft materials using transgenic pig bone, method of preparing the same, and ceramic materials for biomedical application comprising the same, and }

본 발명은 골 세라믹 입자 및 이를 이용한 생체의료용 골이식 재료에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인간에 대한 초급성, 급성혈관성 및 세포매개성 면역거부 현상이 없도록 형질 전환된 돼지의 뼈를 원료로 제조된 형질전환 돼지 뼈를 이용한 골 이식용 세라믹 입자, 그 제조방법 및 상기 입자를 포함하는 생체의료용 세라믹재료에 관한 것이다.

생체이식용 세라믹은 생체적합성과 기계적 물성이 고분자보다 우수하여 현재까지도 경조직인 골(bone) 결손 및 회손 부위의 재생 및 치료를 목적으로 하는 치과, 정형 및 성형외과에서 가장 널리 사용되고 있는 생체재료이다. 세라믹은 크게 산화계와 비산화계 세라믹으로 나눌 수 있으며 이중 인체에 가장 널리 사용되고 있는 세라믹들로는 인산칼슘과 생활성 유리, 알루미나, 지르코니아 및 이들의 복합체들이다. 그리고 인산칼슘계는 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite, HA), 제삼인산칼슘(tricalcium phosphate, TCP), 제사인산칼슘(tetracalcium phosphate, TTCP), 제이인산칼슘(dicalcium phosphate, DCP) 등이 있고 생활성 유리로는 유리를 기본으로 하는 실리카 계열(silica-based glasses), 인산계열(phosphate-based glasses)과 유리 세라믹 등이 있다.

또한 세라믹은 인간과 동물의 골, 어류의 골, 조개 및 오징어 등의 패각 또는 산호 및 계란껍질 등으로부터 얻을 수 있으며, 이중 인간과 동물의 골로부터 채취된 세라믹은 다양한 처리를 통하여 인체 골 재생을 위해 적용되고 있다. 특히 가장 널리 사용되고 있는 인산칼슘계의 HA는 인체 골 구성성분 중 가장 많은 부분을 차지하며 칼슘/인의 몰 비율이 1.67로서 인체 골과 유사한 함량 비를 가진다. 또한 HA는 생체활성이 우수하여 골세포의 점착, 확산, 증식 등의 골전도성 및 생체적합성이 우수한 세라믹으로 알려져 있다.

현재 인체의 골재생 및 치료에 사용되는 세라믹 원료는 이종골(Xenograft)에서 유래된 세라믹을 가장 많이 사용하고 있다. 즉, 소나 송아지 등 다른 종의 개체에서 채취한 골을 원료로 사용하고 있으나 면역거부반응, 인수공통성 질환의 전파가능성, 공급한계 등의 단점이 존재하며, 특히 최근에 이슈화가 되고 있는 광우병 파동에서 완전히 자유롭지 못하다. 또 다른 근원으로서 동종골(Allograft)은 타인(죽은 사람의 뼈를 기증받아 채취)의 골을 사용하는 것으로서 골 대체 효과가 비교적 우수하나 질병전파가능성, 기증자에 대한 불명확성, 채취 한계 등으로 사용자에게 심적 부담을 가중시키고 있다. 자가골(Autograft)은 골 대체 효과는 가장 우수하나 환자의 인체 내에서 채취를 해야 하는 2차 수술의 필연성 및 2차 수술에 의한 후유증 등이 존재할 수 있고, 인공 합성골은 천연골에 비해 골 대체 효과가 상당히 낮다는 단점이 있다. 또한 저렴한 가격, 질병전파 및 면역거부 반응에서 자유로울 수 있으나, 느린 골 재생 및 골질의 문제, 비흡수성 또는 너무 빠른 흡수성에 의한 주변조직 및 이식부위에서의 이물반응에 대해서 많은 논란의 소지를 가지고 있다.

한편, 현대 산업의 급속한 발달에 의해 양적인 팽창을 거듭해온 지금 인류의 삶의 질을 향상시키려는 요구를 충족시키기 위해서 인간의 건강과 장수의 해법을 찾을 수 있는 바이오 의학산업이 매우 각광을 받고 있다. 이러한 바이오 의학 산업에서 형질전환기법이 중요한 위치를 차지하고 있다. 형질전환기법을 이용한 의학산업으로서의 응용에는 대표적으로 이종장기의 생산을 들 수 있다. 인간의 수명이 늘어나면서, 혹은 유전적 결함에 의해서 심장이나 간장 등 주요 장기의 이상증상을 가진 환자가 늘어나고 있다. 현대의 눈부신 이식 외과술에 의해 장기이식은 더 이상 독점적 기술이 아닌 의학의 한 분야로 자리 잡게 되었다. 문제는 이식용 장기의 공급원으로 현재까지 유일한 수단은 뇌사 상태의 타인에게서 제공받는 것이지만, 공급 받을 수 있는 장기의 수는 한정적이어서 많은 환자들의 수요를 충족하지 못하고 있다.

이에 지난 수십 년 동안 인간의 장기와 해부학적 구조 및 생리특성이 유사한 돼지의 장기를 이용하는 방안이 연구되고 있으나 면역체계가 인간과 상이하여 돼지의 장기를 그대로 이용할 수 없는 문제가 있다. 즉, 돼지의 장기가 사람의 체내에 들어가면 돼지 장기에서 항원성 단백질을 발현하여 사람의 면역반응을 활성화시켜 면역거부반응을 야기하게 된다. 이러한 문제를 해결하고자 유전자적증기술을 이용하여 돼지의 체세포에서 면역거부 관련 유전자(α-gal)를 제거하고, 유전자적증된 이 세포를 복제하여 태어난 돼지로부터의 장기는 사람의 체내에서 초급성 면역거부 현상을 나타내지 않는다. 이러한 면역거부반응의 제거는 이들로부터 얻어지는 장기를 인체에 보다 안전하게 이용하고자 하는 것이나, 이들로부터 얻어지는 골을 생체의료용으로 이용하고자 하는 연구는 전 세계적으로 전무한 실정이다.

그 결과 지난 수년 동안 세라믹 재료의 주 연구초점은 보다 안전한 세라믹 원료의 개발보다는 의료용으로서 상호 기공들이 연결된 높은 다공성을 갖는 블록(block) 또는 입자(particle) 형태의 골 대체재를 개발하는 것이었었다. 그 노력에 힘입어 인공합성 세라믹 또는 천연 골로부터 채취된 세라믹 원료를 이용하여 입자 제거법[Flautre 등, J Mater Sci Mater Med, 12, 679-682(2001)], 액체질소법[Hone 등, J Mater Sci Mater Med, 22, 349-355(2011)], 기포형성법[Li 등, J Biomed Mater Res, 61, 109-120(2002)], 고분자 스펀지 템플레이트법[Appleford 등, Biomaterials, 28, 4788-4794(2007)], Computer aided desing (CAD) 시스템을 이용한 프로토타이핑법(Rumpler 등, J Biomed Mater Res, 81A, 40-50(2007)] 등으로 다공성 세라믹 재료를 제조할 수 있게 되었으며, 최근에는 생분해성 고분자와 결합된 유무기 복합체(또는 하이브리드)로 이루어진 생체이식용 재료들이 개발되고 있다.

최근까지 생체의료용 세라믹 원료 및 골이식 재료에 대한 물리적 기능은 다양한 가공공정의 개발로 인해 괄목할만한 진척이 이루어진 상황이나 새로운 경로로부터 얻을 수 있는 세라믹 원료에 대한 연구개발은 많이 결여되어 있다. 특히 앞서 기술한 바와 같이 현재 사용되고 있는 다양한 경로로부터 채취된 세라믹보다 인체에 안전하게 적용할 수 있는 새로운 경로로부터 채취된 세라믹 원료 개발 및 이를 이용한 생체의료용 세라믹 골이식 재료는 앞으로는 더욱 중요한 관건이 되고 있다.

본 발명자들은 상기 종래 세라믹 원료의 문제점을 해결하기 위해 연구 노력한 결과, 기존 세라믹 원료의 문제점인 인체 적용 시 불안한 요인들 즉 면역거부반응, 질병전파 가능성, 낮은 생체적합성, 공급의 어려움 등이 대폭 낮아진 세라믹 원료에 대한 기술을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 돼지의 체세포에서 면역거부 관련 유전자(α-gal)를 제거하고, 유전자 적증된 이 세포를 복제하여 태어난 돼지 즉 형질전환된 돼지로부터 추출된 뼈를 원료로 사용함으로써 인체에 적용시 초급성, 급성혈관성 및 세포매개성 면역거부반응이 발생하지 않는 골 이식용 세라믹입자, 그 제조방법 및 상기 입자를 포함하는 생체의료용 세라믹재료를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인체의 유전자에 최적화되도록 형질 전환된 돼지의 뼈를 원료로 이용함으로써 기존의 인공합성 세라믹 또는 인간 및 동물의 뼈, 산호, 어패류 등으로부터 채취된 세라믹보다 조직재생 및 치유에 안전하게 사용할 수 있고 기존 세라믹 입자와 혼합하여 사용할 수 있어 충분한 공급이 가능한 골 이식용 세라믹입자, 그 제조방법 및 상기 입자를 포함하는 생체의료용 세라믹재료를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 또 목적은 높은 생체적합성을 갖고, 질병전파 가능성이 거의 없는 골 이식용 세라믹입자, 그 제조방법 및 상기 입자를 포함하는 생체의료용 세라믹재료를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 현재까지 장기만 사용될 뿐 전부 폐기되던 형질 전환된 돼지의 뼈를 재활용할 수 있어 환경적인 오염원을 대폭 감소시킬 수 있는 골 이식용 세라믹입자, 그 제조방법 및 상기 입자를 포함하는 생체의료용 세라믹재료를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인체의 골 대체재 및 수복재로서 형질 전환된 돼지의 뼈를 그대로 포함하는 생체의료용 세라믹재료를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 인간에 대한 초급성, 급성혈관성 및 세포매개성 면역거부 현상이 제거되도록 재조합 DNA 기술과 생식세포공학적 방법에 의해 형질 전환된 형질전환 돼지 유래 뼈의 분말을 포함하는 골 이식용 세라믹 입자를 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 뼈의 분말은 상기 형질 전환 돼지 유래 뼈에 함유된 유기물을 포함하는 뼈의 분말 및 상기 형질 전환 돼지 유래 뼈에 함유된 유기물이 제거된 뼈의 분말 중 어느 하나이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 뼈의 분말은 직경이 100 nm 내지 3 cm 범위이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 뼈의 분말은 탈미네랄공정, 항생제처리, 항균제 처리 및 방사선조사 중 하나 이상이 수행된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 골 이식용 세라믹 입자는 공지된 세라믹분말을 더 포함한다.

또한, 본 발명은 골 이식용 세라믹 입자를 제조하는 방법에 있어서, 인간에 대한 초급성, 급성혈관성 및 세포매개성 면역거부 현상이 제거되도록 재조합 DNA 기술과 생식세포공학적 방법으로 형질 전환된 형질전환 돼지로부터 뼈를 추출하는 단계; 및 상기 추출된 뼈를 절단한 후 분쇄하여 뼈 분말을 제조하는 단계를 포함하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 뼈 분말에 함유된 유기물을 제거하는 단계를 더 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 뼈 분말에 함유된 유기물을 제거하는 단계는 화학적처리단계 또는 열처리단계 중 어느 하나를 포함하여 수행된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 화학적처리단계는 상기 뼈 분말에 대해 수행되는 탈지공정, 탈단백공정 및 수열처리공정을 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 탈지공정은 상기 뼈 분말 또는 상기 탈단백공정을 거친 뼈 분말을 클로로포름, 아세톤, 에탄올 또는 메탄올로 포함된 그룹에서 선택된 2개 이상을 0.1 내지 1 (v/v)의 혼합 비율로 만든 용액에 침지시켜 처리한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 탈단백공정은 상기 뼈 분말 또는 상기 탈지공정을 거친 뼈 분말을 1 내지 10% 농도를 갖는 차아염소산나트륨 용액에 침지시켜 처리한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 수열처리공정은 상기 탈지공정 및 상기 탈단백공정을 거친 뼈 분말을 100℃ 내지 200℃에서 1 내지 3시간 동안 수열 처리하여 수행된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 열처리단계는 상기 뼈 분말을 600℃ 내지 1300℃에서 1 내지 10시간 동안 처리하여 수행된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 뼈 분말에 함유된 유기물을 제거하는 단계는 상기 화학적처리단계 또는 열처리단계를 수행하기 전에 수행되는 전처리단계를 더 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 전처리단계는 상기 뼈 분말을 3 내지 80% 농도를 갖는 화학약품에 침지시켜 1 내지 72시간 동안 4℃ 내지 100℃에서 처리한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 화학약품은 과산화수소 수용액, 우레아 하이드로겐 퍼옥사이드, 소듐 퍼카보네이트 및 유, 무기에 과산화수소가 결합되어 있는 비등성 화합물 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 뼈 분말을 탈미네랄화하는 공정을 더 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 탈미네랄화공정은 5 내지 50부피% 농도의 질산, 황산, 염산, 인산 및 이들의 혼합물 중 어느 하나를 사용하여 1 내지 24시간 동안 처리한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 뼈 분말을 10 내지 100 부피% 농도의 물, 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이들의 혼합 용액 중 어느 하나를 사용하여 10분 내지 3시간 범위로 수세하는 수세처리단계를 더 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 뼈 분말에 대해 항생제처리단계, 항균제 처리단계 및 방사선조사단계 중 하나 이상을 더 수행한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 항생제처리단계 및 항균제 처리단계는 상기 뼈 분말을 3 내지 30 부피%의 항생제 및 항균제로 10분 내지 1시간 동안 처리한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 뼈 분말과 공지된 세라믹 입자를 혼합하는 단계를 더 포함한다.

또한, 본 발명은 골 이식용 세라믹 입자, 상술된 제조방법으로 제조된 골 이식용 세라믹 입자, 또는 형질전환 돼지 유래 뼈를 포함하는 생체의료용 세라믹재료를 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 골 이식용 세라믹 입자는 고분자물질과 복합되어 포함된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 고분자물질은 폴리다이옥사논, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리카프락톤, 락트산-글리콜산 공중합체, 글리콜산-트라이메틸카보네이트, 글리콜산-ε-카프로락톤, 폴리글리코네이트, 폴리글락틴, 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 이들의 혼합물, 및 이들의 공중합체 ; 콜라젠, 젤라틴, 키틴/키토산, 알지네이트, 알부민, 히알루론산, 헤파린, 피브리노겐, 셀롤로오스, 덱스트란, 펙틴, 폴리라이신, 폴리에틸렌이민, 덱사메타손, 콘드로이친 설페이트, 라이소자임, DNA, RNA, RGD 등의 단백질 유도체; 지질, 성장인자, 성장 호르몬, 펩타이드 의약품, 단백질 의약품, 소염진통제, 항암제, 항바이러스제, 성호르몬, 항생제, 항균제 및 이들의 화합물 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 생체의료용 세라믹재료는 블록, 필름, 필라멘트, 섬유, 멤브레인, 메쉬, 직포/부직포, 니트, 알갱이, 입자, 플레이트, 볼트/너트, 못, 또는 이들의 복합체의 형태를 갖는다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 생체의료용 세라믹재료는 0.1 nm 내지 5 mm의 기공크기를 갖는 5 내지 98%의 다공도를 갖는다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 생체의료용 세라믹재료는 인공뼈, 인공관절, 뼈시멘트, 턱뼈, 안면부위의 소형뼈, 심장 밸브, 혈관, 임플란트, 지대주, 충진재, 도재, 브라켓, 코어, 포스트를 포함하는 경조직 재생을 위한 지지체, 조인트, 뼈고정 디바이스, 척추 고정 디바이스 중 어느 하나 이상으로 성형된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 형질전환 돼지 유래 뼈는 환자 인체에 필요한 형태로 가공하기 위해 추출된 뼈를 깎거나 추출된 뼈에 고분자물질 또는 골 이식용 세라믹 입자를 부착한다.

본 발명은 다음과 같은 우수한 효과를 갖는다.

먼저, 본 발명에 의하면 돼지의 체세포에서 면역거부 관련 유전자(α-gal)를 제거하고, 유전자 적증된 이 세포를 복제하여 태어난 돼지 즉 형질전환된 돼지로부터 추출된 뼈를 원료로 사용함으로써 인체에 적용시 초급성, 급성혈관성 및 세포매개성 면역거부반응이 발생하지 않는다.

또한, 본 발명에 의하면 인체의 유전자에 최적화되도록 형질 전환된 돼지의 뼈를 원료로 이용함으로써 기존의 인공합성 세라믹 또는 인간 및 동물의 뼈, 산호, 어패류 등으로부터 채취된 세라믹보다 조직재생 및 치유에 안전하게 사용할 수 있고 기존 세라믹 입자와 혼합하여 사용할 수 있어 충분한 공급이 가능하다.

또한, 본 발명에 의하면 높은 생체적합성을 갖고, 질병전파 가능성이 거의 없다.

또한, 본 발명에 의하면 현재까지 장기만 사용될 뿐 전부 폐기되던 형질 전환된 돼지의 뼈를 재활용할 수 있어 환경적인 오염원을 대폭 감소시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 인체의 골 대체재 및 수복재로서 형질 전환된 돼지의 뼈를 그대로 포함시켜 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 기존 골 대체재보다 저렴한 양질의 세라믹 원료를 제공함으로써 국민보건의료사업 촉진 및 국가산업에 이바지할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 실시예1에 따라 제조된 형질전환 돼지 유래 뼈를 이용한 유기물이 제거된 세라믹 입자의 형태학적 특징을 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 사진이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 형질전환 돼지 유래 뼈를 이용한 유기물이 제거된 세라믹 입자 표면의 칼슘/인의 비율을 분석한 EDS(energy dispersive spectrometer) 프로파일이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에 따라 제조된 형질전환 돼지 유래 뼈를 이용한 유기물이 함유된 세라믹 입자의 형태학적 특징을 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예2에 따라 제조된 형질전환 돼지 유래 뼈를 이용한 유기물이 함유된 세라믹 입자 표면의 칼슘/인의 비율을 분석한 EDS(energy dispersive spectrometer) 프로파일이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따라 얻어진 유기물이 함유된 형질전환 돼지 유래 뼈 분말을 처리한 세포를 대상으로 ELISA를 통해 TNF-α를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 얻어진 유기물이 함유된 형질전환 돼지 유래 뼈 분말을 처리한 세포를 대상으로 ELISA를 통해 IL-1β를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따라 얻어진 유기물이 함유된 형질전환 돼지 유래 뼈 분말을 처리한 세포를 대상으로 TNF-α의 mRNA를 real time PCR로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따라 얻어진 유기물이 함유된 형질전환 돼지 유래 뼈 분말을 처리한 세포를 대상으로 IL-1β의 mRNA를 real time PCR로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.

먼저, 본 발명에서 '치유' 또는 '치료'는 증상의 경감 또는 개선, 질환 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 다른 이로운 치료 결과 등을 모두 포함하는 의미로 사용된다.

또한 본 발명에서 '생체의료용'은 인체에 직접적으로 삽입되는 모든 재료를 포함할 뿐만 아니라, 인체에 직접적으로 삽입되지 않는 생체진단용 기기 및 용구 등까지 포함하는 의미로 사용된다.

이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

본 발명의 기술적 특징은 골 이식용 세라믹 입자를 제조하기 위한 원재료로서 인간에 대한 초급성, 급성혈관성 및 세포매개성 면역거부 현상이 제거된 형질 전환 돼지로부터 추출된 뼈를 사용함으로써 이종골 및 동종골 유래 세라믹입자보다 인체에 안전하게 사용할 수 있고, 자가골 유래 세라믹입자에 비해 공급이 원활하며, 인공 합성 세라믹입자 보다 생체적합성이 우수한 골 이식용 세라믹 입자를 제공하는 것에 있다.

따라서, 본 발명의 골 이식용 세라믹 입자는 인간에 대한 초급성, 급성혈관성 및 세포매개성 면역거부 현상이 제거되도록 재조합 DNA 기술과 생식세포공학적 방법에 의해 형질 전환된 형질전환 돼지 유래 뼈의 분말을 포함한다.

여기서, 형질전환 돼지는 전통적인 교배가 아니라 재조합 DNA 기술과 생식세포공학적 방법에 의하여 새로운 유전 형질을 얻게 된 돼지를 포함하는 것으로 보다 구체적으로는 체세포 형질전환, 즉 새로이 얻은 유전형질이 그 동물에서는 나타나지만 다음세대로는 전달되지 않는 것과 생식세포 형질전환, 즉 형질전환된 세포가 생식세포로 전이되도록 하여 새로운 유전형질이 당대뿐 아니라 후세까지 전달되도록 전환된 모든 돼지로부터 채취되는 골을 포함한다. 더욱 상세하게는 전핵주입 방법, 바이러스 벡터이용 방법, 배아줄기세포를 이용하는 방법, 핵이식 방법, 정자를 이용하는 방법 등을 이용하여 형질전환된 돼지 유래 뼈를 사용하는 것이나 이에 꼭 한정 하는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 형질전환 돼지는 기존 돼지와는 다르게 인간에 대한 면역반응이 낮아지게 하는 모든 방법을 포함하여 형질 전환된 돼지를 의미한다. 그리고 형질전환 돼지에서 골의 채취는 모든 부위의 골을 사용할 수 있다. 구체적으로 앞 및 뒷다리 골, 등 골, 머리 골, 갈비 골, 꼬리 골, 연골, 치아 등을 사용할 수 있지만 이에 꼭 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 골 이식용 세라믹 입자에 포함되는 형질 전환 돼지 유래 뼈 분말은 형질 전환 돼지 유래 뼈에 함유된 유기물을 포함한 것이거나 형질 전환 돼지 유래 뼈에 함유된 유기물을 포함하지 않은 것일 수 있으며, 경우에 따라서는 탈미네랄공정, 항생제처리, 항균제 처리 및 방사선조사 중 하나 이상이 수행될 수 있다.

본 발명의 골 이식용 세라믹 입자에 포함되는 형질 전환 돼지 유래 뼈 분말은 직경이 100nm 내지 3cm일 수 있고, 바람직하게는 400 nm 내지 1 cm 로 입자크기를 제어하여 사용할 수 있으나 인체적용 부위별 용도에 따라 달라질 수 있으므로 이에 꼭 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 골 이식용 세라믹 입자는 형질 전환 돼지 유래 뼈 분말100%로 이루어질 수도 있지만, 필요에 따라서는 형질 전환 돼지 유래 뼈 분말 대비 공지된 세라믹 입자를 1 내지 99 중량% 범위에서 사용할 수 있다. 바람직하게는 형질 전환 유래 돼지 뼈분말 대비 10 내지 90 중량% 범위에서 사용하는 것이나 이에 꼭 한정하는 것은 아니다.

여기서 공지된 세라믹 입자는 동종골, 이종골, 자가골에서 유래된 세라믹 및 인공합성 세라믹으로 바람직하게는 인산칼슘계 세라믹, 생활성 유리, 알루미나, 지르코니아 및 이들의 복합체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

인산칼슘계 세라믹은 하이드록시아파타이트(HA), 제삼인산칼슘(TCP), 제사인산칼슘(TTCP), 제이인산칼슘(DCPA) 등이 있다.

생활성 유리는 생물 활성의 특징을 보이는 임의의 유리를 지칭하며, 원래는 점착성이 아니지만 시뮬레이션된 체액 또는 트리스히록시메틸아미노메탄 완충액과 같은 적절한 생체 내 및 실험실 환경에 노출되었을 때 경성 및 연성 조직 모두에 점착성 결합을 형성하는 능력이 있는 무정형 고체 물질이다.

구체적으로 생활성 유리는 유리를 기본으로 하는 실리카 계열(silica-based glasses), 인산계열(phosphate-based glasses)과 유리 세라믹(glass ceramics) 등이 있다.

보다 바람직하게는 세라믹 원료로서 미국의약안전청(FDA) 승인물질인 HA, TCP, TTCP, DCPA, 지르코니아, 알루미나, 실리카, 유리 세라믹 및 이들의 복합체, 실리카/유리, 실리카/인산칼슘계 복합체 등을 이용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 골 이식용 세라믹 입자 제조방법은 형질 전환된 형질전환 돼지로부터 뼈를 추출하는 단계; 및 상기 추출된 뼈를 절단한 후 분쇄하여 뼈 분말을 제조하는 단계를 포함하는데, 경우에 따라서는 추출된 뼈로부터 상기 뼈에 함유된 유기물을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.

따라서, 1) 형질 전환 돼지 유래 뼈에 함유된 유기물을 제거하지 않은 분말로 제조하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법 및 2)형질 전환 돼지 유래 뼈에 함유된 유기물을 제거한 분말로 제조하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법으로 나누어 구체적으로 살펴본다.

1) 형질 전환 돼지 유래 뼈에 함유된 유기물을 제거하지 않은 분말로 제조하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법

본 발명에서 형질 전환 돼지 유래 뼈는 톱, 칼 등을 이용하여 골만을 적절한 방법으로 회수할 수 있으며 기타 이물질(육류, 털, 지방 등)이 크게 함유하지 않고 회수될 수 있는 모든 방법을 포함한다. 이때 사용될 수 있는 형질전환 돼지의 크기는 제한이 없으며 뼈를 회수하기에 적당한 크기면 모두 사용될 수 있다.

회수된 형질 전환 돼지 유래 뼈는 적당한 방법(톱, 칼 등) 등을 이용하여 절단한 다음 바로 분쇄기를 이용하여 분쇄하거나 액체질소에 절단된 형질 전환 돼지 유래 뼈를 침지한 후 동결상태에서 분쇄기를 이용하여 입자로 제조할 수 있다. 이때 입자의 크기는 사용되는 분쇄기의 조건을 변경하여 제어할 수 있다. 제조되는 입자의 크기는 100 nm 내지 3 cm 범위에서 사용할 수 있고 바람직하게는 400 nm 내지 1 cm 범위로 입자크기를 제어하여 사용하는 것이나 인체적용 부위별 용도에 따라 달라질 수 있으므로 이에 꼭 한정하는 것은 아니다.

제조된 뼈 분말은 필요에 따라서 탈미네랄화공정(deminerallization process)이 수행될 수 있다. 뼈 분말의 탈미네랄화 공정에 사용될 수 있는 약품은 질산, 황산, 염산, 인산 및 이들의 혼합용액을 사용할 수 있으며 5 내지 80 부피%의 농도로 사용되며, 1 내지 24시간 동안 침지하여 사용될 수 있다.

경우에 따라서는 뼈의 분쇄과정에서 형성된 기름 등의 이물질을 제거하기 위해 수세과정이 수행될 수 있다. 수세에 사용될 수 있는 용액은 물, 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이들의 혼합 용액 등이며 이들을 10 내지 100 부피%의 농도로 사용하여 10분 내지 3시간 동안 처리될 수 있다. 또한 수세효과를 높이기 위하여 초음파 세척기를 이용할 수 있다. 바람직하게는 30 내지 100 부피% 농도의 에탄올에 침치하여 초음파 세척기에 넣고 10 내지 1시간 동안 수세하는 것으로 이를 1 내지 5번 범위에서 반복하는 것이다.

수세가 완료된 형질전환 돼지 유래 뼈 분말(입자)은 바로 인체 적용부위에 이식할 수도 있으며 또한 장기간 보관을 위해 동결건조기를 이용하여 건조한 뒤 진공 데시게이터 또는 -20도씨 이하에서 냉동보관 하는 것이 바람직하다.

상기 유기물이 함유된 형질전환 돼지 유래 뼈 입자는 필요에 따라 항생제, 항균제 처리 및 방사선조사(감마선조사)가 수행될 수 있다. 형질전환 돼지 유래 뼈의 소독에 사용될 수 있는 약품은 페니실린계, 세펨계, 반코마이신, 스트렙토마이신, 바시트라신, 그라미시딘, 플라보포스폴리폴계, 폴리믹신계, 폴리에텔계, 니토로이미다졸계, 니트로후란계, 퀴놀론계, 리팜피신, 설포나마이드, 트리메토프림, 아미노글리코사이드계, 페니콜계, 린코사마이드계, 마크로라이드계, 스트렙토그라민계, 플로이로무틸린계, 테트라사이크린계 및 이들의 혼합물 등이 있으며 바람직하게는 이들로부터 1종 이상을 사용하여 3 내지 30 V%의 농도로 10분 내지 1시간 동안 처리할 수 있다.

2)형질 전환 돼지 유래 뼈에 함유된 유기물을 제거한 분말로 제조하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법

1) 형질 전환 돼지 유래 뼈에 함유된 유기물을 제거하지 않은 분말로 제조하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법에 상술된 바와 같이, 형질 전환 돼지로부터 뼈를 회수한 후 분말화한 뼈 분말을 대상으로 화학적처리단계 또는 열처리단계에 의해 뼈 분말에 함유된 유기물 및 기타 이물질(천연색소, 기름 등)을 제거할 수 있다. 경우에 따라서는 화학약품처리단계 또는 열처리단계를 수행하기 전에 전처리단계를 먼저 수행할 수도 있다.

먼저, 화학적처리단계는 뼈 분말에 대해 수행되는 탈지공정, 탈단백공정 및 수열처리공정을 포함하는데, 탈지공정 또는 탈단백공정은 어느 하나를 먼저 수행하여도 무방하다.

탈지공정은 뼈 분말에 포함된 유기물 중 지질을 제거하기 위한 것으로 탈지 공정에 사용될 수 있는 화학약품은 탈지에 효과적인 모든 화학약품을 포함한다. 바람직하게는 뼈 분말 또는 탈단백공정을 거친 뼈 분말을 클로로포름, 아세톤, 에탄올 또는 메탄올로 포함된 그룹에서 선택된 2개 이상을 0.1 내지 1 (v/v)의 혼합 비율로 만든 용액에 침지시켜 처리하는 것이다. 특히 동적상태에서 24시간 내지 72시간 범위로 처리하는 것이 바람직할 수 있다.

탈단백공정은 뼈 분말에 포함된 유기물 중 단백질을 제거하기 위한 것으로 탈단백 공정에 사용될 수 있는 화학약품 또한 탈단백에 효과적인 모든 화학약품을 포함한다. 바람직하게는 뼈 분말 또는 탈지공정을 거친 뼈 분말을 1 내지 10% 농도를 갖는 차아염소산나트륨 용액에 침지시켜 처리하는 것인데, 특히 동적 상태에서 48시간 내지 96시간 범위로 처리하는 것이 바람직할 수 있다.

이와 같은 탈지공정 및 탈단백공정은 화학 약품처리시 각 단계별 유기약품의 제거를 위해 수세공정이 더 포함될 수 있다. 각 단계에서 뼈 속에 남아 있는 유기약품은 증류수로 여러 번 세척하여 제거할 수 있으며 바람직하게는 증류수에 화학약품 처리된 돼지 뼈를 침지하여 동적상태에서 24시간 내지 72시간 수세하는 것이다. 그리고 필요에 따라서는 2시간 내지 4시간 범위에서 증류수를 여러 번 교체하여 수세하는 과정을 포함한다.

수열처리공정은 탈지공정 및 탈단백공정을 거친 뼈 분말을 100℃ 내지 200℃에서 1 내지 3시간 동안 수열 처리하여 수행되는데, 수열처리를 통해 잔유된 유기물 및 화학약품을 제거할 수 있다.

다음으로, 열처리단계는 상술된 바와 같이 형질 전환 돼지로부터 뼈를 회수한 후 분말화한 뼈 분말을 화학약품을 사용하지 않고 바로 열처리하여 뼈 안의 유기물을 제거하는 공정이다. 열처리는 유기물이 타는 온도 이상인 200℃ 내지 1500℃ 범위에서 1 내지 24시간 범위에서 수행될 수 있는데, 바람직하게는 600℃ 내지 1300℃ 범위에서 1 내지 10시간 범위에서 열처리 하는 것이다. 열처리단계가 수행된 후 분쇄 등을 통해 열처리된 뼈 분말의 입도를 조정하기 위한 입도조정단계를 더 포함할 수 있다.

경우에 따라서는 뼈 분말에 함유된 유기물을 제거하기 위해 화학적처리단계 또는 열처리단계를 수행하기 전에 전처리단계를 더 포함할 수 있는데, 전처리단계는 뼈 분말을 3 내지 80% 농도를 갖는 화학약품에 침지시켜 1 내지 72시간 동안 4℃ 내지 200℃에서 처리하는 것이다.

전처리단계에서 사용되는 화학약품은 과산화수소 수용액, 우레아 하이드로겐 퍼옥사이드, 소듐 퍼카보네이트 및 유ㅇ무기에 과산화수소가 결합되어 있는 비등성 화합물 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 과산화수소를 수용액을 사용하는 경우 5 내지 80 부피% 농도의 것이 바람직하다. 또한 처리시간은 각각의 골 부위 특성에 맞게 조절할 수 있으며 일반적으로 4℃ 내지 100℃에서 1 내지 72시간 동안 에서 처리할 수 있다. 이때 필요에 따라서는 과산화수소의 분해를 촉진하기 위해서 초음파, 카탈라아제, 소다회, 망초 등을 적정량 첨가할 있다. 바람직하게는 10℃ 내지 90℃에서 1 내지 48시간동안 처리하는 것이나 이에 꼭 한정하는 것은 아니다.

이 후 수행되는 화학처리되거나 열처리된 뼈 분말에 대한 처리는 상술된 바와 동일하므로 상세한 설명은 생략하기로 한다.

본 발명의 생체의료용 세라믹재료는 형질전환 돼지 유래 뼈 분말을 포함하는 골 이식용 세라믹 입자 또는 형질전환 돼지 유래 뼈를 포함한다.

이 때 골 이식용 세라믹 입자는 순수한 형질전환 돼지 유래 뼈 분말만으로 구성될 수도 있고, 기존 세라믹 입자와 혼합하여 구성될 수도 있다. 이때 필요에 따라서 열처리과정을 수행할 수 있다. 열처리과정은 600℃ 내지 1500℃ 범위에서 1 내지 3시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.

특히 생체의료용 세라믹재료는 형질전환 돼지 유래 뼈 분말을 포함하는 경우, 골 이식용 세라믹 입자는 고분자물질과 복합되어 포함되는데 고분자물질은 폴리다이옥사논, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리카프락톤, 락트산-글리콜산 공중합체, 글리콜산-트라이메틸카보네이트, 글리콜산-ε-카프로락톤, 폴리글리코네이트, 폴리글락틴, 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 이들의 혼합물, 및 이들의 공중합체 ; 콜라젠, 젤라틴, 키틴/키토산, 알지네이트, 알부민, 히알루론산, 헤파린, 피브리노겐, 셀롤로오스, 덱스트란, 펙틴, 폴리라이신, 폴리에틸렌이민, 덱사메타손, 콘드로이친 설페이트, 라이소자임, DNA, RNA, RGD 등의 단백질 유도체; 지질, 성장인자, 성장 호르몬, 펩타이드 의약품, 단백질 의약품, 소염진통제, 항암제, 항바이러스제, 성호르몬, 항생제, 항균제 및 이들의 화합물 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다.

골 이식용 세라믹 입자를 생체의료용 재료로 사용할 경우 어떤 형태로도 적용할 수 있는데, 예를 들어 블록, 필름, 필라멘트, 섬유, 멤브레인, 메쉬, 직포/부직포, 니트, 알갱이, 입자, 플레이트, 볼트/너트, 못 등이 될 수 있으며 두 가지 이상의 형태가 복합된 형태도 가능하다.

또한 생체의료용 세라믹재료는 완전 비다공성이거나, 또는 5 내지 98% 범위의 다공도를 갖는 것으로서 0.1 nm 내지 5 mm 범위의 기공크기를 갖는 것일 수 있다.

또한 생체의료용 세라믹재료는 유화법, 상분리법, 용매확산법, 압축법, 입자제거법, 액체질소법, 기포형성법, 고분자 스펀지 템플레이트법, 용융방사법, 용매 방사법, 습식 및 건식 방사법, 용융 성형법, 용매 성형법, 입자 첨가법, 또는 컴퓨터 이용 설계 시스템을 이용한 프로토타이핑법으로 제조된 생체의료용 및 산업용 무기/유기 복합체 재료일 수 있다.

본 발명의 생체의료용 세라믹재료가 형질전환 돼지 유래 뼈를 포함하는 경우, 상기 뼈는 형질전환 돼지로부터 추출된 뼈를 분쇄하지 않고 추출된 그대로의 형태를 유지하면서 상술된 골 이식용 세라믹 입자 제조방법에서 수행된 각 단계 중 필요한 단계를 수행한 다음 환자 인체에 필요한 형태로 가공 즉 추출된 뼈를 깎거나 추출된 뼈에 고분자물질 또는 골 이식용 세라믹 입자를 부착하여 사용될 수 있다.

이와 같은 본 발명의 생체의료용 세라믹재료는 인공뼈, 인공관절, 뼈시멘트, 턱뼈, 안면부위의 소형뼈, 심장 밸브, 혈관, 임플란트, 지대주, 충진재, 도재, 브라켓, 코어, 포스트를 포함하는 경조직 재생을 위한 지지체, 조인트, 뼈고정 디바이스, 척추 고정 디바이스 중 어느 하나 이상으로 성형되어 조직재생, 상처 치유, 질병 치료에 사용될 수 있을 뿐만 아니라 의료용 기구에 사용될 수 있다. 또한 기타 응용관련 약물전달용, 혈관조영제, 미세전자기계 시스템(MEMS), 항균성 충전재, 하이브리드 복합체를 위한 세라믹 재료 등으로 사용될 수 있다.

실시 예 1-1

형질전환 돼지 유래 뼈에 함유된 유기물이 제거된 골 이식용 세라믹 입자를 열처리단계를 이용하여 다음과 같이 제조하였다.

먼저, 형질전환 돼지의 대퇴골을 회수하여 2 cm의 길이로 절단하였다. 절단된 형질전환 돼지 유래 뼈를 10% 과산화수소 수용액에 침지하여 24시간 동안 상온에서 처리하였다. 이어서 증류수로 3번 수세한 다음 동결건조기를 이용하여 건조하였다. 건조된 형질전환 돼지 유래 뼈를 고온 열처리기에 넣고 1000℃에서 3시간 동안 열처리 하였다. 그 다음 분쇄기(Retsch, MM400, 독일)를 이용하여 30초 동안 분쇄하였다. 분쇄된 형질전환 돼지 유래 뼈 입자는 100% 아세톤에 침지하여 초음파 세척기에 넣고 30분 동안 처리하여 입자에 포함되어 있을 수 있는 이물질을 제거하였다. 이어서 증류수로 여러 번 수세한 후 동결건조기를 이용하여 건조시켜 골 이식용 세라믹 입자를 제조하였다.

실시 예 1-2

형질전환 돼지 유래 뼈에 함유된 유기물이 제거된 골 이식용 세라믹 입자를 화학적처리를 이용하여 다음과 같이 제조하였다.

먼저, 형질전환 돼지의 대퇴골을 회수하여 2 cm의 길이로 절단 하고 액체질소에 넣어 동결한 다음 분쇄기를 이용하여 입자화 하였다. 이어서 상기 실시 예 1-1과 같이 과산화수소 수용액을 이용하여 색소 및 이물질을 제거한 다음 증류수로 72시간 동안 동적상태에서 증류수를 여러 번 갈아주면서 세척하였다. 그리고 60℃에서 24시간 진공 건조하여 전처리가 완료된 돼지 뼈 분말을 제조하였다.

전처리가 완료된 돼지 뼈 분말의 탈지공정은 다음과 같이 행하였다. 전처리가 완료된 2 g의 돼지 뼈 입자를 50 mL의 클로로포름/메탄올 (1:1 v/v) 용액에 침지하고 24시간 동안 130 rpm로 흔들어 주어 돼지 뼈 분말에 함유된 지방을 제거하였다. 이어서 증류수에 24시간 동안 130 rpm으로 흔들어주면서 잔유약품을 제거하였다. 이때 증류수는 2시간 단위로 갈아주면서 잔유약품을 제거하였다. 그리고 60℃에서 24시간 진공 건조하여 탈지가 완료된 돼지 뼈 입자를 제조하였다.

탈지처리가 완료된 돼지 뼈 분말의 탈단백 공정은 다음과 같이 행하였다. 탈지가 완료된 2 g의 돼지 뼈 분말을 4% (w/v)의 sodium hypochlorite 수용액에 침지하고 72시간 동안 130 rpm로 흔들어 주어 돼지 뼈 분말에 함유된 단백질을 제거하였다. 이어서 증류수에 72시간 동안 130 rpm으로 흔들어주면서 잔유약품을 제거하였다. 이때 증류수는 2시간 단위로 갈아주면서 잔유약품을 제거하였다. 그리고 120℃에서 3시간 동안 압력하에서 수열처리 한 다음 60℃에서 24시간 진공 건조하여 탈지가 완료된 돼지 뼈 분말을 제조하였다. 탈지 및 탈단백 처리 후 수열 처리된 돼지 뼈 분말은 -20℃에서 냉동 보관하였다.

실시 예 2

형질전환 돼지 유래 뼈에 함유된 유기물이 포함된 골 이식용 세라믹 입자( 유기물이 함유된 형질전환 돼지 유래 뼈 분말 포함)를 다음과 같이 제조하였다.

형질전환 돼지로부터 경골을 회수하여 2 cm의 크기로 절단하였다. 절단된 돼지 경골을 증류수로 수세하였다. 이어서 액체질소에 30분 동안 침지하여 동결시킨 다음 분쇄기(Retsch, MM400, 독일)에 넣고 1분 동안 분쇄하였다. 그 다음 100% 에탄올을 사용하여 여러 번 수세한 다음 증류수로 수세하여 에탄올을 제거하고 페니실린과 스트렙토마이신이 1:1로 혼합한 10% 수용액에 30분 동안 침지하였다. 이어서 -80℃의 냉동고에 넣어 동결시킨 다음 동결건조기에 넣고 48시간 동안 건조시켜 최종 유기물이 함유된 형질전환 돼지 유래 뼈에 함유된 유기물이 포함된 골 이식용 세라믹 입자를 제조하였다.

실시 예 3

형질전환 돼지 유래 뼈 분말 및 HA 입자를 포함하는 골 이식용 세라믹 입자 복합 다공성 세라믹 지지체를 다음과 같이 제조하였다.

실시예1에서 제조된 골 이식용 세라믹 입자와 인공합성 세라믹인 HA 입자를 50:50 중량%로 혼합한 5g의 혼합 세라믹입자를 3% 폴리비닐알코올(PVA) 수용액 10 mL에 첨가하여 24시간 동안 교반기를 이용해 균일하게 분산시켜 세라믹 슬러리를 제조하였다. 이어서 슬러리의 온도를 50℃로 상승시켜 5 mL의 물을 연속적으로 증발시켰다. 그 다음 60 ppi (pore per inch) 폴리우레탄 스펀지에 슬러리를 코팅하여 24시간 동안 상온 건조시킨 뒤 1200℃에서 3시간 열처리하여 최종적으로 형질전환 돼지 유래 뼈 분말 및 HA 입자를 포함하는 생체의료용 세라믹재료(골 이식용 세라믹 입자 복합 다공성 세라믹 담체)를 제조하였다.

실시 예 4

형질전환 돼지 유래 뼈 분말 및 TCP 입자를 포함하는 골 이식용 세라믹 입자 복합 비다공성 세라믹 지지체를 다음과 같이 제조하였다.

형질전환 돼지 유래 뼈 분말은 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하여 최종 입자크기가 5 ㎛가 되게 하였다. 그리고 인공합성 세라믹인 TCP 입자와 50:50 중량%로 혼합한 2 g을 원통형 금속틀에 넣고 5 MPa로 압축하여 디스크 형태로 제조한 뒤 1200℃에서 3시간 열처리하여 디스크 형상의 생체의료용 세라믹재료(형질전환 돼지 유래 뼈 분말/TCP 입자 복합 비다공성 세라믹 디스크)를 제조하였다.

실시 예 5

형질전환 돼지 유래 뼈 분말/HA/TCP 입자 복합 다공성 그래뉼을 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

형질전환 돼지 유래 뼈 분말은 실시 예 1과 동일하게 제조하여 최종 입자크기가 평균 10 ㎛가 되게 하였다. 이어서 제조된 형질전환 돼지 유래 뼈 분말과 인공합성 세라믹인 HA 및 TCP 입자를 50:30:20 중량%로 혼합하여 실시 예 3과 동일한 방법으로 세라믹 슬러리를 제조하였다. 제조된 세라믹 슬러리를 실린지에 옮겨 담고 18 G 크기의 중공을 갖는 팁(tip)을 이용하여 액체질소에 방울방울 떨어트렸다. 액체질소에서 고체화된 세라믹 입자를 회수하여 동결건조 한 다음 1100℃에서 열처리하여 최종적으로 그래뉼 형태의 생체의료용 세라믹재료(형질전환 돼지 유래 뼈 분말/HA/TCP 입자 복합 다공성 그래뉼)을 제조하였다.

실시 예 6

형질전환 돼지 유래 뼈 분말/이종골/TCP 입자를 포함하는 골 이식용 세라믹 입자 복합 다공성 세라믹 지지체를 다음과 같이 제조하였다.

형질전환 돼지 유래 뼈 분말은 실시 예 1과 동일한 방법으로 제조하였다. 이종골로서 송아지 뼈에서 채취한 세라믹과 인공합성 세라믹인 TCP 입자를 형질전환 돼지 유래 뼈 분말과 30:30:40 중량%로 혼합하여 실시 예 3과 동일한 방법으로 세라믹 슬러리를 제조하였다. 제조된 슬러리를 80 ppi 폴리우레탄 스펀지에 코팅하여 24시간 동안 상온 건조시킨 뒤 1200℃에서 열처리하여 최종적으로 담체 형태의 생체의료용 세라믹 재료(형질전환 돼지 유래 뼈 분말/이종골/TCP 입자 복합 다공성 세라믹 담체)를 제조하였다

실시 예 7

형질전환 돼지 유래 뼈 분말을 포함하는 골 이식용 세라믹 입자/PLGA 고분자 복합 그래뉼을 다음과 같이 제조하였다.

형질전환 돼지 유래 뼈 분말은 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하여 최종 입자크기가 평균 5 ㎛가 되게 하였다. PLGA(모노머 함량비 = 75:25) 고분자 1 g을 디클롤로메탄 5 mL에 녹이고 여기에 상기 형질전환 돼지 유래 뼈 분말 500 mg을 추가하여 교반기로 균일하게 분산시켰다. 이어서 실시예 5와 동일한 과정으로 제조된 슬러리를 액체질소에 침지하여 고체화시킨 다음 동결건조 하여 형질전환 돼지 유래 뼈 세라믹 입자를 함유한 다공성 그래뉼 형태의 생체의료용 세라믹재료(다공성 세라믹 입자/PLGA 복합 그래뉼)을 제조하였다.

실시 예 8

형질전환 돼지 유래 뼈 세라믹 입자/PGA 고분자 복합 그래뉼을 다음과 같이 제조하였다.

형질전환 돼지 유래 뼈 세라믹 입자는 실시예 2와 동일한 방법으로 제조하여 유기물이 함유된 형질전환 돼지 유래 뼈 세라믹 입자(크기 100 ㎛)를 제조하였다. 폴리글리콜산(PGA) 고분자 1 g을 아세톤 5 mL에 녹이고 여기에 상기 형질전환 돼지 유래 뼈 세라믹 입자 100 mg을 추가하여 교반기로 균일하게 분산시켰다. 이어서 실시예 5와 동일한 과정으로 제조된 슬러리를 액체질소에 침지하여 고체화시킨 다음 동결건조 하여 유기물이 함유된 형질전환 돼지 유래 뼈 세라믹 입자를 함유한 다공성 그래뉼 형태의 생체의료용 세라믹재료(다공성 세라믹 입자/PGA 복합 그래뉼)을 제조하였다.

실시 예 9

형질전환 돼지 유래 뼈 세라믹 입자/PLA 복합 필라멘트 제조

형질전환 돼지 유래 뼈 세라믹 입자는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하여 최종 입자크기가 평균 1 ㎛가 되게 하였다. 이어서 PLA 고분자를 섬유방사기의 압출기에 넣고 250℃로 열을 가해 용융하였다. 그 다음 제조된 형질전환 돼지 유래 뼈 세라믹 입자를 추가하여 균일하게 혼합한 다음 압출기에 장착되어 있는 1.0 φ의 압출노즐로 방사하여 최종적으로 필라멘트 형태의 생체의료용 세라믹재료(형질전환 돼지 유래 뼈 세라믹 입자를 함유하는 PLA 복합 필라멘트)를 제조하였다.

실시 예 10

형질전환 돼지 유래 뼈 분말/이종골/HA/TCP 입자를 포함하는 골 이식용 세라믹 입자와 PLGA 복합 담체 제조

형질전환 돼지 유래 뼈 분말은 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다. 그리고 PLGA (모노머 비율 = 50:50) 2 g을 디클로로메탄에 완전히 녹였다. 이어서 1 g의 형질전환 돼지 유래 뼈 분말/이종골/HA/TCP 입자를 30:30:20:20 wt%로 혼합한 골 이식용 세라믹 입자 500 mg을 PLGA 용액에 추가한 다음 교반기를 이용하여 상온에서 12시간 동안 균일하게 분산시켰다. 제조된 세라믹/PLGA 혼합 용액을 직경 1 cm, 높이 1 cm의 테프론 몰드에 부어 액체질소에 침지하여 동결하였다. 이어서 동결건조기에 넣어 24시간 동안 용매를 완전히 증발시켜 최종적으로 담체형태의 생체의료용 세라믹재료(형질전환 돼지 유래 뼈 분말/이종골/HA/TCP입자를 포함하는 골 이식용 세라믹 입자를 함유한 PLGA 다공성 담체)를 제조하였다.

실험예 1

실시예1에서 제조된 형질전환 돼지 유래 뼈 분말(유기물 제거됨)을 포함하는 골 이식용 세라믹 입자의 형태학적 특성은 SEM으로 관찰하고, 칼슘/인의 비율은 EDS로 관찰하여 그 결과를 도 1과 도 2에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 제조된 골 이식용 세라믹 입자의 크기는 20-300 ㎛의 범위로 관찰됨으로서 다양한 크기의 입자 크기로 제조될 수 있음을 확인하였고, EDS 분석 결과 칼슘/인의 비율이 1.71로 인체 뼈의 칼슘/인 비율과 거의 유사한 함량비가 나타남을 확인하였다. 그리고 칼슘 조절자로 뼈 건강에의 핵심 미네랄인 마그네슘 및 소량의 염(Na)이 존재하는 것을 확인하였다. 또한 그 어떠한 이물질(중금속 등)에 대한 특성피크가 관찰되지 않음으로써 인체적용에 적합한 세라믹임을 확인할 수 있었다.

실험예 2

실시예2에서 제조된 형질전환 돼지 유래 뼈 분말(유기물 함유)을 포함하는 골 이식용 세라믹 입자의 형태학적 특성은 SEM으로 관찰고, 칼슘/인의 비율은 EDS로 관찰하여 그 결과를 도 3과 도 4에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 제조된 세라믹 입자의 크기는 100-800 ㎛의 범위로 관찰됨으로서 다양한 크기의 입자 크기로 제조될 수 있음을 확인하였고, EDS 분석 결과 칼슘/인의 비율이 1.51로 인체 뼈의 칼슘/인 비율과 거의 유사한 함량비가 나타남을 확인하였다. 그리고 칼슘 조절자로 뼈 건강에의 핵심 미네랄인 마그네슘 및 소량의 염(Na)과 유기물의 존재에 의한 산소 및 수소 피크가 크게 나타나는 것을 확인하였다. 또한 그 어떠한 이물질(중금속 등)에 대한 특성피크가 관찰되지 않음으로써 인체적용에 적합한 유기물 함유 형질전환 돼지 유래 뼈 분말을 포함하는 골 이식용 세라믹입자 임을 확인할 수 있었다.

실험예 3

형질전환 돼지(transgenic pigs) 유래 생 뼈(live bone)에서 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)의 급성면역거부(acute immune rejection) 억제 효과에 대해 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하고 그 결과를 도5 내지 도 8에 도시하였다.

돼지 뼈에 의한 사람 면역세포의 활성화를 측정하기 위하여 건강한 지원자로부터 제공받은 실온 상태의 혈액에서 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 분리하여 RT-PCR을 실시하고 ELISA를 통해 사이토카인 농도를 측정하였다. 먼저 혈액 3 ml를 동량의 Histopaque (Sigma, St. Louis, MO, USA)가 들어 있는 15 ml 튜브에 일정한 속도로 천천히 넣은 다음 원심분리(400 xg, 30 min)하여 세포펠렛을 RPMI 배지(혈액공여자 혈장 10%, penicillin/streptomycine)에 현탁한 후 세포수를 측정하고 5x10⁶/ml 농도로 실험에 사용하였다. 실험에 사용할 돼지 뼈는 일반돼지(G3 : 일반돼지)와 각각의 다른 형질전환 돼지 뼈(HH: HA-HO1 형질전환돼지, Tα: α-gal knockout 형질전환돼지)를 채취하여 실시예2와 동일한 방법을 사용하여 분쇄한 뒤 RPMI에 현탁한 후 40 um 크기의 cell strainer를 통과시켜 40 um 크기보다 큰 뼈입자를 제거한 뒤 농도는 bradford assay로 단백질 농도를 측정하였으며 사람 PBMC가 들어 있는 round bottom 96 well plate 또는 24 well plate에 단백질 농도 기준으로 100 ug/ml 씩 첨부하였다. 세포는 24시간 (RNA용) 또는 48시간 (ELISA용) 배양하여 활성화 시킨 후 수집하여 RNA를 추출하고, 추출한 RNA로 Primescript 1st strand cDNA synthesis kit (TaKaRa Bio, Otsu, Japan)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 1:5로 희석하여 real time PCR을 수행하였으며 GAPDH를 항존유전자(house keeping gene)로 사용하여 결과를 정규화하고 delta CT로 계산하였으며 sandwich ELISA kit (eBioscience, San Diego, CA)를 사용하여 사이토카인 농도를 측정하였다.

도 5와 도 6는 ELISA를 통해 측정한 TNF-α와 IL-1β를 나타낸 것이다(HH: HA-HO1 형질전환돼지, Tα: α-gal knockout 형질전환돼지, Control: 음성대조군, PHA: 양성대조군).

도 5 및 도 6에 도시된 바와 같이 일반돼지 뼈에 반응하여 염증성 사이토카인 TNF-α와 IL-1β의 생성이 증가하였으며 형질전환돼지 HH와 Ta의 경우에는 일반돼지 뼈에 대한 반응보다 TNF-α와 IL-1β의 생성이 현저히 낮았으며 ELISA의 측정한계 이하로 그 값이 측정되지 않았다.

도 7 및 도 8은 각각의 사이토카인의 mRNA를 real time PCR로 측정한 결과이며 ELSIA와 유사한 경향을 보였다.

이러한 실험결과를 통해 일반 돼지 뼈와 비교하여 형질전환 돼지 뼈가 인체에 대한 면역반응이 감소되어 본 발명의 실시예 2와 같이 형질전환 돼지 뼈에 함유된 유기물이 제거되지 않은 상태에서도 우수한 생체적합성을 보이는 것을 알 수 있다. 그 결과, 구체적 실험예로 제시하지는 않았으나 본 발명의 다른 실시예와 같이 형질전환 돼지 유래 뼈 분말에 함유된 유기물이 제거된 골 이식용 세라믹 입자를 이용하게 되면 보다 면역반응이 감소되어 거의 면역반응이 일어나지 않을 것이 예측된다.

따라서, 형질전환 돼지 뼈 유래 뼈 분말을 사용하는 본 발명에 의하면 기존의 인공합성 세라믹 또는 인간 및 동물의 뼈, 산호, 어패류 등으로부터 채취된 세라믹보다 조직재생 및 치유에 안전하게 사용할 수 있고 기존 세라믹 입자와 혼합하여 사용할 수 있어 충분한 공급이 가능한 골 이식용 세라믹입자, 및 상기 입자를 포함하는 생체의료용 세라믹재료를 제공할 수 있을 것이다.

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims

인간에 대한 초급성, 급성혈관성 및 세포매개성 면역거부 현상이 제거되도록 재조합 DNA 기술과 생식세포공학적 방법에 의해 형질 전환된 형질전환 돼지 유래 뼈의 분말을 포함하는 골 이식용 세라믹 입자.
제 1 항에 있어서,
상기 뼈의 분말은 상기 형질 전환 돼지 유래 뼈에 함유된 유기물을 포함하는 뼈의 분말 및 상기 형질 전환 돼지 유래 뼈에 함유된 유기물이 제거된 뼈의 분말 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자.
제 1 항에 있어서,
상기 뼈의 분말은 직경이 100 nm 내지 3 cm 범위인 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자.
제 1 항에 있어서,
상기 뼈의 분말은 탈미네랄화공정, 항생제처리, 항균제 처리 및 방사선조사 중 하나 이상이 수행된 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자.
제 1 항에 있어서,
상기 골 이식용 세라믹 입자는 공지된 세라믹분말을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 골 이식용 세라믹 입자를 제조하는 방법에 있어서,
인간에 대한 초급성, 급성혈관성 및 세포매개성 면역거부 현상이 제거되도록 재조합 DNA 기술과 생식세포공학적 방법으로 형질 전환된 형질전환 돼지로부터 뼈를 추출하는 단계; 및
상기 추출된 뼈를 절단한 후 분쇄하여 뼈 분말을 제조하는 단계를 포함하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법.
제 6 항에 있어서,
상기 뼈 분말에 함유된 유기물을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 뼈 분말에 함유된 유기물을 제거하는 단계는 화학적처리단계 또는 열처리단계 중 어느 하나를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법.
제 8 항에 있어서,
상기 화학적처리단계는 상기 뼈 분말에 대해 수행되는 탈지공정, 탈단백공정 및 수열처리공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법.
제 9 항에 있어서,
상기 탈지공정은 상기 뼈 분말 또는 상기 탈단백공정을 거친 뼈 분말을 클로로포름, 아세톤, 에탄올 또는 메탄올로 포함된 그룹에서 선택된 2개 이상을 0.1 내지 1 (v/v)의 혼합 비율로 만든 용액에 침지시켜 처리하는 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법.
제 9 항에 있어서,
상기 탈단백공정은 상기 뼈 분말 또는 상기 탈지공정을 거친 뼈 분말을 1 내지 10% 농도를 갖는 차아염소산나트륨 용액에 침지시켜 처리하는 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법.
제 9 항에 있어서,
상기 수열처리공정은 상기 탈지공정 및 상기 탈단백공정을 거친 뼈 분말을 100℃ 내지 200℃에서 1 내지 3시간 동안 수열 처리하여 수행되는 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법.
제 8 항에 있어서,
상기 열처리단계는 상기 뼈 분말을 600℃ 내지 1300℃에서 1 내지 10시간 동안 처리하여 수행되는 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법.
제 8 항에 있어서,
상기 뼈 분말에 함유된 유기물을 제거하는 단계는 상기 화학적처리단계 또는 열처리단계를 수행하기 전에 수행되는 전처리단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법.
제 14 항에 있어서,
상기 전처리단계는 상기 뼈 분말을 3 내지 80% 농도를 갖는 화학약품에 침지시켜 1 내지 72시간 동안 4℃ 내지 200℃에서 처리하는 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법.
제 15 항에 있어서,
상기 화학약품은 과산화수소 수용액, 우레아 하이드로겐 퍼옥사이드, 소듐 퍼카보네이트 및 유, 무기에 과산화수소가 결합되어 있는 비등성 화합물 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법.
제 6 항에 있어서,
상기 뼈 분말을 탈미네랄화하는 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법.
제 17 항에 있어서,
상기 탈미네랄화공정은 5 내지 50부피% 농도의 질산, 황산, 염산, 인산 및 이들의 혼합물 중 어느 하나를 사용하여 1 내지 24시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법.
제 6 항에 있어서,
상기 뼈 분말을 10 내지 100 부피% 농도의 물, 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이들의 혼합 용액 중 어느 하나를 사용하여 10분 내지 3시간 범위로 수세하는 수세처리단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법.
제 6 항에 있어서,
상기 뼈 분말에 대해 항생제처리단계, 항균제 처리단계 및 방사선조사단계 중 하나 이상을 더 수행하는 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법.
제 20 항에 있어서,
상기 항생제처리단계 및 항균제 처리단계는 상기 뼈 분말을 3 내지 30 부피%의 항생제 및 항균제로 10분 내지 1시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법.
제 6 항에 있어서,
상기 뼈 분말과 공지된 세라믹 입자를 혼합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골 이식용 세라믹 입자 제조방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 골 이식용 세라믹 입자, 제 6 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 골 이식용 세라믹 입자, 또는 형질전환 돼지 유래 뼈를 포함하는 생체의료용 세라믹재료.
제 23 항에 있어서,
상기 골 이식용 세라믹 입자는 고분자물질과 복합되어 포함되는 것을 특징으로 하는 생체의료용 세라믹재료.
제 24 항에 있어서,
상기 고분자물질은 폴리다이옥사논, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리카프락톤, 락트산-글리콜산 공중합체, 글리콜산-트라이메틸카보네이트, 글리콜산-ε-카프로락톤, 폴리글리코네이트, 폴리글락틴, 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 이들의 혼합물, 및 이들의 공중합체 ; 콜라젠, 젤라틴, 키틴/키토산, 알지네이트, 알부민, 히알루론산, 헤파린, 피브리노겐, 셀롤로오스, 덱스트란, 펙틴, 폴리라이신, 폴리에틸렌이민, 덱사메타손, 콘드로이친 설페이트, 라이소자임, DNA, RNA, RGD 등의 단백질 유도체; 지질, 성장인자, 성장 호르몬, 펩타이드 의약품, 단백질 의약품, 소염진통제, 항암제, 항바이러스제, 성호르몬, 항생제, 항균제 및 이들의 화합물 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 생체의료용 세라믹재료.
제 23 항에 있어서,
상기 생체의료용 세라믹재료는 블록, 필름, 필라멘트, 섬유, 멤브레인, 메쉬, 직포/부직포, 니트, 알갱이, 입자, 플레이트, 볼트/너트, 못, 또는 이들의 복합체의 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 생체의료용 세라믹재료.
제 23 항에 있어서,
상기 생체의료용 세라믹재료는 0.1 nm 내지 5 mm의 기공크기를 갖는 5 내지 98%의 다공도를 갖는 것을 특징으로 하는 생체의료용 세라믹재료.
제 23 항에 있어서,
상기 생체의료용 세라믹재료는 인공뼈, 인공관절, 뼈시멘트, 턱뼈, 안면부위의 소형뼈, 심장 밸브, 혈관, 임플란트, 지대주, 충진재, 도재, 브라켓, 코어, 포스트를 포함하는 경조직 재생을 위한 지지체, 조인트, 뼈고정 디바이스, 척추 고정 디바이스 중 어느 하나 이상으로 성형되는 것을 특징으로 하는 생체의료용 세라믹재료.
제 23 항에 있어서,
상기 형질전환 돼지 유래 뼈는 환자 인체에 필요한 형태로 가공하기 위해 추출된 뼈를 깎거나 추출된 뼈에 고분자물질 또는 골 이식용 세라믹 입자를 부착하는 것을 특징으로 하는 생체의료용 세라믹재료.