KR101053118B1 - 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 실크 방사원액을 준비하는 단계(단계 1); 상기 단계 1에서 준비된 실크 방사원액을 전기방사하는 단계(단계 2); 상기 단계 2에서 방사된 실크 나노섬유를 분산시키는 단계(단계 3); 상기 단계 3에서 분산된 실크 나노섬유를 소정의 용기에 담아 동결 건조하여 3차원적으로 분산된 스펀지 형태의 실크 나노섬유를 제조하는 단계(단계 4); 상기 단계 4에서 제조된 3차원적으로 분산된 스펀지 형태의 실크 나노섬유를 5배 내지 15배 농도의 인체유사 용액(simulated body fluid, SBF)에 침지하여 하이드록시아파타이트로 복합화 코팅하는 단계(단계 5); 및 상기 단계 5에서 하이드록시아파타이트로 복합화 코팅된 실크 나노섬유에 공극을 형성하는 단계(단계 6)를 포함하여 이루어지는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 5배 내지 15배 농도의 인체유사 용액을 사용함으로써 상온과 상압 조건에서 실크 단백질의 손상 없이 짧은 시간에 플라즈마 처리나 표면처리 같은 추가적인 공정을 수행하지 않고 하이드록시아파타이트를 실크 나노섬유 지지체에 효율적으로 코팅할 수 있으며, 하이드록시아파타이트에 비하여 결정화도가 낮아 천연의 뼈와 비슷한 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체를 제조할 수 있다.

Description

골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법{Preparation method of silk/hydroxyapatite hybrid nanofiber scaffold for bone regeneration}

본 발명은 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법에 관한 것이다.

골 이식술은 수혈 다음으로 많이 시행되고 있으며 정형외과 영역에서 임상적으로 흔히 볼 수 있는 골 결손을 치료하기 위해서 여러 영역에서 시행되고 있다. 보고에 의하면 미국에서 연간 50 만례 이상의 골 이식이 행해지고 있으며 전 세계적으로는 연간 220 만례 정도가 시행되고 있다고 한다. 골 이식재는 병적 혹은 생리적 원인에 의해 골이 결손된 부위에서 골 성장을 자극하는 역할을 한다.

골 이식재의 작용은 기전에 따라 골전도(osteoconduction), 골유도(osteoinduction), 골발생(osteogenesis)으로 분류할 수 있다. 골전도란 주위 골조직으로부터 골아세포가 이식골 부위로 이주, 무기질 침착에 의해 골이 형성되는 것으로 반드시 주변에 골조직이나 분화된 간엽세포가 있어야만 일어난다. 만약 골전도 물질이 피하조직 같은 다른 부위에 이식된다면 골성장을 개시하지 못한다. 골조직 혹은 연조직에 이식되었을 때 골전도 물질은 흡수되어 잠행성 치환과정(creeping substitution)과 유사한 과정을 통해 골조직으로 대체된다. 골유도는 골이식재가 미분화간엽세포를 불러오고 골전구세포로 분화되는데 영향을 미쳐서 새로운 골조직을 형성하는 과정으로 보통 골형성유도단백질(BMP)이 관여하는 것으로 알려지고 있다. 피하조직과 같은 다른 조직에 이식되었을 때에도 골형성이 가능하다. 골유도성 이식재는 또한 골개조(remodeling) 과정에도 큰 영향을 미친다. 골발생이란 이식재 내에 살아있는 세포에 의한 골조직 생성을 의미하며 자가골이 유일한 골형성재료이다.

골 이식술에 사용되는 재료로는 자가골, 동종골, 이종골 등이 있으며, 최근에는 다양한 인공 골 대체물들이 연구, 개발되어 사용되고 있다. 골 이식재료들은 이상적으로 골형성 유도, 숙주와의 생체 적합성, 채취 및 조작의 용이성, 비용의 절감 등의 요구 조건을 충족시킬 수 있어야 하지만, 현재 사용되고 있는 골 이식재료들은 각각 어느 정도의 제한성을 지니고 있다.

자가골 이식은 골 유합을 위한 골생성, 골유도 및 골전도의 세 가지 특징을 모두 가지고 있는 가장 우수한 재질이며 다른 모든 골 이식 제재보다 우수한 안정성과 이식률을 보이고 있다. 하지만 이식골을 채취하는 데 관련된 공여부에 또 다른 결손과 감염 등의 합병증이 생길 수 있고 부가적인 수술시간을 요하며, 종종 충 분한 양의 골을 얻지 못할 수 있다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하고자 이를 대체할 골 이식재를 찾기 위한 연구가 광범위하게 이루어져 왔다.

현재, 자가골을 대신하여 가장 흔히 사용되는 동종골은 숙주와 같은 종에서 얻어지는 조직이며 동결, 동결건조 및 탈회동결건조 등으로 입자,젤, 퍼티 등의 여러 형태로 제공된다. 동종골은 상대적으로 많은 양을 얻을 수 있고 골격의 특정 부분을 이용하거나 가공 처리함으로써 모양이나 골밀도 등을 조절할 수 있는 장점이 있다. 이식재로서의 동종골은 골전도성은 뛰어나나 골세포가 생존하지 않아 골생성력은 없으며 골유도성도 극히 제한적이다. 또한, 공급이 제한적이고 윤리적인 문제 등의 제한이 있으며 오염 물질, 독소 등의 전파 또는 감염 등의 위험성이 있는 단점이 있다. 또한, 동종골은 공여자에 대한 철저한 조사와 각종 검사에도 불구하고 바이러스에 의한 감염성 질환의 전염 가능성이 존재하며, 이러한 위험성을 줄이기 위해 동종골에 여러가지 가공처리를 하면 본래의 생물학적, 역학적 성질을 변화시킬 수 있고 이로 인하여 역학적 강도를 약화시키거나 골 전도성과 골 유도성에 악영향을 끼칠 수 있는 문제점이 있다.

이종골 이식은 소나 돼지 등의 동물뼈를 가공하여 인체에 이식하는 것으로 제한적으로 사용되고 있으나 면역 반응과 감염성 질환의 전파 등의 문제가 있어 점차로 사용이 감소되는 추세이다.

이러한 자가골, 동종골, 이종골에 관련된 문제 때문에 최근에는 골이식을 위한 생체 적합성 및 안전성을 부여해 줄 인공 골 대체물에 대한 관심이 증가하여, 많은 연구가 활발히 이루어지고 있다.

인공 골 대체물은 다음과 같은 요건의 충족이 필수적이다. 첫째, 감염을 일으키지 않으며 항원반응이 나타나지 않거나 최소화되어야 하고, 둘째, 시술시 부스러지지 않고 다루기 쉬워야 하며, 셋째, 생체 내 우수한 흡습성을 가져야 하며, 넷째, 수술 후 주변 조직의 압력을 견디기 위해 충분한 기계적 강도를 가져야 하며, 다섯째, 지지체 내에 골조직이 충분히 형성되고 성숙될 때까지 일정한 부피를 유지하여야 하며, 여섯째, 기존 조직과 잘 부착하기 위해 적절한 표면 거칠기를 지녀야 하며, 일곱째, 세포들의 접착과 성장 및 분화를 위해 영양분이나 배설물이 잘 확산될 수 있는 다공성을 띠어야 하며, 여덟째, 인공 골 대체물의 분해에 의한 부가적인 생성물이 생체적합성을 가져야한다.

현재 인공 골재료로 가장 각광을 받고 있는 것은 인산칼슘계 화합물이다. 이 중 가장 보편적으로 사용되고 있는 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)는 인체의 뼈나 치아의 주성분과 구조가 동일하여 의료분야에서 분말형태, 치밀체 또는 금속에 코팅하여 사용되고 있으며, 생체적합성과 생체친화성이 우수하여 주위 골의 골전도를 일으키므로 이를 인공 골 재료로 개발하여 실험 및 임상적으로 적용하려는 연구들이 활발히 진행되고 있다. 그러나, 하이드록시아파타이트 분말 제재의 경우, 강도가 낮아서 그대로를 사용하기에 어려우므로, 이를 해결하기 위해 유기 물질과의 하이브리드 재료에 대한 연구가 이루어지고 있다.

하이드록시아파타이트와 하이브리드화 하려는 유기물질로는 폴리글리콜산(PGA), 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리락틱산(PLA)과 같은 생분해성 합성고분자, 뼈의 유기성분인 콜라겐 등이 이용되고 있다. 그러나 폴리글리콜산, 폴리락틱산-글리콜산 공중합체, 폴리락틱산과 같은 생분해성 합성고분자는 구조 안정성 및 인장강도는 우수하나, 생분해 기간이 2년 이상으로 길고 분해 산물이 산성 물질이기 때문에 이에 의해 발생하는 염증반응과 같은 문제점이 있다. 또한 콜라겐은 동물로부터 추출해야 하기 때문에 제작 과정과 보관이 까다롭고 대량 생산에 적합하지 않아 제조 단가가 비싸므로 임상적으로 활용하기에는 제한이 많고, 체내에서의 용해 속도가 너무 빠르고, 면역 반응 및 감염성 질환을 유발시킬 수 있으며, 생체 내에서 인장력이 취약하다는 문제점이 있다.

한편, 하이드록시아파타이트 코팅 방법으로는 플라즈마 용사법이 가장 많이 사용되었는데, 이것은 하이드록시아파타이트 분말을 2만 내지 3만도의 고온 플라즈마 영역에서 용융시킨 후 이를 금속 타겟에 융착시키는 방법이다. 플라즈마 용사법으로 코팅한 코팅층은 부착 강도가 화학기상증착법, 스퍼터링법 등으로 코팅한 코팅층에 비하여 높으나 여전히 코팅층의 파괴가 금속 표면과 코팅층 표면에서 일어나는 문제점이 있다. 최근에는 금속 이식체를 칼슘과 인산 이온이 들어있는 용액에 침적하여 금속 표면에 하이드록시아파타이트를 석출시키거나, 표면을 개질하여 인체유사 용액(Simulated Body Fluid, SBF)에 침적시켜 표면에 하이드록시아파타이트 층을 생성시키는 방법과 아파타이트 미세 입자를 전기영동을 이용하여 코팅하는 방 법들이 개발되고 있으나, 인체유사 용액을 이용하여 하이드록시아파타이트로 코팅하는 경우에는 침적시간이 오래 걸린다는 문제점이 있다. 섬유 등에 하이드록시아파타이트를 코팅한 예는 있으나 실크 나노 섬유에 적용한 예는 아직까지 보고된 바가 없으며, 특히 나노 섬유 표면을 균일하게 코팅한 경우는 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 기존의 인공 골 대체물을 대신할 수 있는 골 이식재를 개발하기 위해 연구하던 중, 5배 내지 15배 농도의 인체유사 용액을 사용함으로써 상온과 상압 조건에서 실크 단백질의 손상 없이 짧은 시간에 플라즈마 처리나 표면처리 같은 추가적인 공정을 수행하지 않고 하이드록시아파타이트를 실크 나노섬유 지지체에 효율적으로 코팅할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 실크 방사원액을 준비하는 단계(단계 1); 상기 단계 1에서 준비된 실크 방사원액을 전기방사하는 단계(단계 2); 상기 단계 2에서 방사된 실크 나노섬유를 분산시키는 단계(단계 3); 상기 단계 3에서 분산된 실크 나노섬유를 소정의 용기에 담아 동결 건조하여 3차원적으로 분산된 스펀지 형태의 실크 나노섬유를 제조하는 단계(단계 4); 상기 단계 4에서 제조된 3차원적으로 분산된 스펀지 형태의 실크 나노섬유를 5배 내지 15배의 농도의 인체유사 용액(simulated body fluid, SBF)에 침지하여 하이드록시아파타이트로 복합화 코팅하는 단계(단계 5); 및 상기 단계 5에서 하이드록시아파타이트로 복합화 코팅된 실크 나노섬유에 공극을 형성하는 단계(단계 6)를 포함하는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법은 5배 내지 15배 농도의 인체유사 용액을 사용함으로써 상온과 상압 조건에서 실크 단백질의 손상 없이 짧은 시간에 플라즈마 처리나 표면처리 같은 추가적인 공정을 수행하지 않고 하이드록시아파타이트를 실크 나노섬유 지지체에 효율적으로 코팅할 수 있으며, 하이드록시아파타이트에 비하여 결정화도가 낮아 천연의 뼈와 비슷한 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체를 제조할 수 있다.

본 발명은 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체는

실크 방사원액을 준비하는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 준비된 실크 방사원액을 전기방사하는 단계(단계 2);

상기 단계 2에서 방사된 실크 나노섬유를 분산시키는 단계(단계 3);

상기 단계 3에서 분산된 실크 나노섬유를 소정의 용기에 담아 동결 건조하여 3차원적으로 분산된 스펀지 형태의 실크 나노섬유를 제조하는 단계(단계 4);

상기 단계 4에서 제조된 3차원적으로 분산된 스펀지 형태의 실크 나노섬유를 5배 내지 15배의 농도의 인체유사 용액(simulated body fluid, SBF)에 침지하여 하이드록시아파타이트로 복합화 코팅하는 단계(단계 5); 및

상기 단계 5에서 하이드록시아파타이트로 복합화 코팅된 실크 나노섬유에 공극을 형성하는 단계(단계 6)를 포함하여 이루어지는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 상기 제조방법을 단계별로 더욱 구체적으로 설명한다.

먼저, 본 발명에 따른 상기 단계 1은 실크 방사원액을 준비하는 단계이다.

상기 실크 방사원액은 실크 섬유에서 세리신을 제거하는 단계(단계 a); 세리신이 제거된 실크 섬유를 수세, 건조 및 투석하여 실크 피브로인 수용액을 제조하는 단계(단계 b); 상기 실크 피브로인 수용액을 동결 건조하여 실크 피브로인 스펀지를 제조하는 단계(단계 c); 및 상기 실크 피브로인 스펀지를 소정의 용매에 용해한 후 여과하는 단계(단계 d)를 통해 준비할 수 있다.

상기 실크 섬유는 두 가닥의 피브로인이 세리신 외막에 싸여 있는 구조를 갖고 있으며, 상기 피브로인은 생체친화성이 우수하여 주변의 어떤 조직에도 영향을 미치지 않기 때문에 분말, 겔, 수용액 등 여러 형태로 제조되어 식품, 의약품 등에 다양하게 사용될 수 있다. 이와 같은 실크 섬유를 이용하여 방사원액을 준비하는 경우에는 실크 섬유에서 세리신을 제거하는 것이 생체적합성을 최대화하기 위해 바람직하다. 실크 나노섬유를 올레인산나트륨, 탄산수소나트륨 용액에 침지한 후 가열하는 과정을 수행하여 세리신을 제거할 수 있다.

상기 세리신이 제거된 실크 섬유는 증류수를 이용하여 반복하여 수세하고 건 조하여, 염화칼슘/물/에탄올의 혼합용액에 용해한 후, 투석막에 넣어 증류수로 투석하여 실크 피브로인 수용액을 제조할 수 있다. 상기 투석막은 MWCO가 12 내지 14 kDa인 투석막을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 실크 피브로인 수용액을 동결 건조하여 실크 피브로인 스펀지를 제조한 후, 개미산에 용해한 후 여과하는 과정을 수행하여 실크 방사원액을 제조할 수 있다.

상기 실크 방사원액은 10 내지 18%의 농도의 용액을 준비하는 것이 전기방사 공정을 원활히 수행하고 균일한 크기 및 형태의 나노섬유를 얻기 위해 바람직하다. 10 내지 18%의 농도 범위 내에서 농도가 증가할 경우 섬유의 굵기가 증가한다. 상기 방사원액의 농도가 상기 범위 미만인 경우 방사원액의 점도가 너무 낮아 섬유가 형성되지 않고, 상기 범위를 초과하는 경우 방사원액의 점도가 지나치게 높아 전기력에 의한 섬유형성이 어려워 안정적으로 전기방사를 진행할 수 없는 문제점이 발생한다.

다음으로, 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 준비된 실크 방사원액을 전기방사하는 단계이다.

상기 전기 방사는 소정의 전압을 인가하면서 소정의 방사장치를 이용하여 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 전기방사 장치는 방사부, 직류전원 공급부 및 분산부를 포함하여 이루어진다. 상기 방사부는 방사원액을 수용하고 수용된 방사원액을 나노섬유로 방사하는 역할을 하는 것이다. 상기 방사부에서 방사원액을 방사할 경 우 방사속도는 일정하게 유지하는 것이 바람직하며, 따라서, 방사속도를 일정하기 유지하는 데 적합한 주사기 펌프를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 직류전원 공급부는 방사시 전압을 인가하는 역할을 하는 것으로서, 상기 방사부에 연결되어 있다. 상기 분산부는 방사된 섬유가 분산되어 응고되도록 하는 역할을 하며,응고액이 채워진 응고욕으로 이루어진다. 상기 응고욕은 금속용기로 이루어지며, 소정의 전선에 의해 접지되어 형성된다.

상기 전기방사시 인가되는 전압은 10 내지 15 kV의 범위 내로 설정하는 것이 안정적인 방사공정을 수행할 수 있어 바람직하다. 10 내지 15 kV의 전압 범위 내에서 전압이 커질 경우 방사속도가 증가된다.

다음으로, 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 방사된 실크 나노섬유를 분산시키는 단계로, 소정의 응고액으로 채워진 응고욕에 상기 단계 2에서 방사된 섬유를 분산시켜 이루어질 수 있다. 상기 응고액으로는 메탄올이 사용될 수 있는데, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

다음으로, 상기 단계 4는 상기 단계 3에서 분산된 실크 나노섬유를 소정의 용기에 담아 동결 건조하여 3차원적으로 분산된 스펀지 형태의 실크 나노섬유를 제조하는 단계이다.

상기 단계 3에서 응고욕에 분산된 섬유는 나노 크기로 젤과 유사한 상태를 나타내게 되는데 동결 건조를 수행하기 전에 상기 분산된 섬유에 존재하는 응고액 을 제거하는 과정을 수행하는 것이 바람직하다. 상기 응고액은 상기 단계 3에서 분산된 섬유를 증류수에 수세함으로써 제거할 수 있다. 동결 건조는 응고액을 제거한 섬유를 소정의 용기에 담은 상태에서 수행함으로써, 용기의 형태에 따라 다양하게 3차원적으로 분산된 스펀지 형태의 나노섬유를 만들 수 있다.

다음으로, 상기 단계 5는 상기 단계 4에서 제조된 3차원적으로 분산된 스펀지 형태의 실크 나노섬유를 5배 내지 15배의 농도의 인체유사 용액(simulated body fluid, SBF)에 침지하여 하이드록시아파타이트로 복합화 코팅하는 단계이다. Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ 구조를 갖는 하이드록시아파타이트의 칼슘/인(Ca/P) 몰비는 10/6, 즉 1.67로서 인체뼈와 유사하다. 인체뼈는 순수한 하이드록시아파타이트라기보다는 상기 구조에서 PO₄기 자리와 OH기 자리가 CO₃기로 일부 치환된 구조이다.

상기 인체유사 용액은 인간 혈장의 이온 조성과 유사하기 때문에 이를 이용하여 하이드록시아파타이트가 형성된 다공성 생분해고분자 지지체를 제조할 경우 좀 더 인체에 가까운 환경조건을 제공하여 다공성 생분해고분자 지지체에 하이드록시아파타이트의 형성을 촉진시킬 수 있다. 이때, 5배 내지 15배의 농도의 인체유사 용액은 1ℓ의 증류수에 Ca²⁺ 2.5 mM, H₂PO₄ ^2- 1.0 mM을 포함하고, Na⁺, K⁺ , Mg²⁺, Cl^-, HCO^3-, SO₄ ^2-의 화학종을 함유하는 인체유사 용액을 기준으로 하고(1×SBF), 이 기준용액에 대해 Ca^{2 +}와 H₂PO₄ ^{2 -}의 농도를 5배 내지 15배로 증가시킨 것을 의미한다. 상기 인체유사 용액의 농도가 5배 미만인 경우에는 시간이 오래 걸리고 하이드록시아파타이트가 실크 나노섬유의 표면에 잘 코팅되지 않는 문제점이 발생할 수 있으며, 상기 인체유사 용액의 농도가 15배 초과인 경우에는 실크 나노섬유의 표면에 하이드록시아파타이트가 생성되기 전에 용액 내에서 염이 침전되어 하이드록시아파타이트 코팅이 이루어지지 않을 수 있으며 고농도의 경우 염 용액에 의해 섬유 구조 손상의 가능성이 있다.

상기 단계 4에서 제조된 3차원적으로 분산된 스펀지 형태의 실크 나노섬유를 37±0.5 ℃의 온도 및 7.2 내지 7.4의 pH 범위인 인체유사 용액 용액에 30분 내지 90분 동안 침지함으로써 하이드록시아파타이트로 코팅할 수 있다. 반응이 종결된 후, 실크 나노섬유에 코팅되지 않고 잔존하는 하이드록시아파타이트를 증류수로 수세하는 과정을 추가로 수행할 수 있다. 상기 수세가 제대로 이루어지지 않을 경우에는 불필요한 염이 잔류하는 문제가 될 수 있으므로, 수세는 3번 이상 수행하는 것이 바람직하다.

다음으로, 상기 단계 6은 상기 단계 5에서 하이드록시아파타이트로 복합화 코팅된 실크 나노섬유에 공극을 형성하는 단계이다.

상기 공극은 하이드록시아파타이트로 복합화 코팅된 실크 나노섬유를 분산매에 분산하는 단계(단계 a); 상기 혼합용액에 공극 형성용 입자를 첨가하는 단계(단 계 b); 상기 단계 b에서 얻은 공극 형성용 입자를 포함하는 혼합물을 이용하여 공극 형성용 입자를 포함하는 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 폼(foam)을 준비하는 단계(단계 c); 및 상기 나노섬유 폼의 공극 형성용 입자를 제거함으로써 공극이 형성된 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체를 형성하는 단계(단계 d)를 통해 형성할 수 있다.

상기 단계 a는 하이드록시아파타이트로 복합화 코팅된 실크 나노섬유를 분산매에 분산시키는 단계이다. 상기 분산매는 공극 형성용 입자를 녹이지 않으면서 실크와 실크 표면의 하이드록시아파타이트를 화학적 및 물리적으로 변하게 하지 않는 한도 내에서는 그 종류는 특별히 한정되지 않으나, 다이옥산, 사염화탄소, 트리클로로에탄, 벤젠, 이소프로판올, 시클로헥산, 또는 이들의 혼합 용액인 것이 바람직하며, 다이옥산인 것이 가장 바람직하다. 상기 다이옥산은 10 ℃ 이하에서 동결되고 실온에서 진공조건 10 mTorr에서 승화가 일어나기 때문에 동결 건조에 적합한 유기용매이다. 또한, 실크 피브로인 및 공극 형성용 입자를 용해시키지 않아, 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 형태를 유지하면서 성형하고 동결 건조하기에 매우 적합하다.

상기 단계 b는 상기 혼합용액에 공극 형성용 입자를 첨가하는 단계로서, 상기 공극 형성용 입자는 상기 분산매에 불용이며, 후술되는 단계에 의해 제거되므로 그 종류는 특별히 한정되지 않으나, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 수크로스, 염화알루미늄 등인 것이 바람직하며, 염화나트륨인 것이 가장 바람직하다. 상기 공극 형성용 입자의 입경은 100 내지 200 ㎛인 것이 바람직하며, 하이드록시아파타이 트로 복합화 코팅된 실크 나노섬유 2 ㎎당 0.01 내지 0.02 g의 공극 형성용 입자를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 단계 c는 상기 단계 b에서 얻은 공극 형성용 입자를 포함하는 혼합물을 이용하여 공극 형성용 입자를 포함하는 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 폼(foam)을 준비하는 단계이다. 상기 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 폼은 상기 공극 형성용 입자를 포함하는 혼합물을 동결 건조함으로써 준비될 수 있다.

상기 단계 d는 상기 나노섬유 폼의 공극 형성용 입자를 제거함으로써 공극이 형성된 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체를 형성하는 단계이다. 상기 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체는 상기 단계 c의 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 폼을 증기를 이용하여 증기 가교결합(vapor cross-linking)시킨 후, 상기 공극 형성용 입자를 가용시키는 용매에 침지시키고, 상기 침지된 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 폼을 동결 건조하는 과정을 수행함으로써 형성할 수 있다. 상기 증기 가교결합을 이용하면 수용액에 가교하고자 하는 물질을 젖게 하지 않아도 되기 때문에 수분에 취약한 재료를 가교처리 할 수 있다는 장점이 있다. 여기서, 상기 증기는 가교하고자 하는 나노섬유 폼에 따라 달라질 수 있으므로 특별히 한정되지 않으나, 글루타알데히드, 카보디이미드, 디페닐포스포릴아자이드, 에틸디메틸아미노프로필카보디이미드, 토일렌디이소시아네이트, 헥사메틸렌디이소시아네이트 등을 사용하는 것이 바람직하다. 이어, 증기 가교결합된 나노섬유 폼을 상기 공극 형성용 입자가 가용하는 용액에 침지시킬 수 있다. 이 때, 상기 증기 가교결합시 사용된 증기의 잔류 독성이 제거되는 것이 바람직하다. 이어, 상기 침지된 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 폼을 소정의 용매를 사용하여 수세한 후, 동결 건조함으로써 본 발명에 따른 나노섬유 지지체를 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법에 의하면 상온과 상압 조건에서 실크 단백질의 손상 없이 짧은 시간에 플라즈마 처리나 표면처리 같은 추가적인 공정을 수행하지 않고 실크 나노섬유를 하이드록시아파타이트로 코팅할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 실크 / 하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조 1

단계 1 : 실크 방사원액의 제조

건조된 가잠 고치를 0.3%의 비누와 0.2%의 탄산수소나트륨 용액에 욕비 1 : 25로 침지하여 100 ℃에서 1시간 동안 처리하여 세리신 단백질을 제거하였다. 세리신이 제거된 고치를 증류수로 반복 수세하고 건조한 후, 염화칼슘/물/에탄올이 1:8:2의 몰비로 혼합된 용액에 1:25의 욕비로 85 ℃에서 3분 동안 용해하였다. 용 해한 용액을 투석막을 이용하여 3일 동안 투석하여 실크 피브로인 수용액을 제조하였다. 상기 실크 피브로인 수용액을 동결 건조하여 실크 피브로인 스펀지를 제조하였고, 이를 98%의 개미산에 12%의 농도로 용해하고 불용분은 여과하여 실크 방사원액을 제조하였다.

단계 2 : 실크 방사원액의 전기방사

상기 단계 1에서 준비된 방사원액을 전술한 전기방사 장치를 이용하여 전기방사 공정을 수행하였다. 상기 전기방사 장치와 관련해서 보다 구체적으로 설명하면, 상기 방사부로는 22 G의 주사 바늘을 포함하는 실린지 펌프를 이용하였고, 상기 방사부와 응고욕의 거리는 약 15 ㎝로 설정하였으며, 10 kV의 인가전압으로 전기 방사를 수행하였다.

단계 3 : 방사된 실크 나노섬유의 분산

상기 단계 2에서 제조된 나노섬유의 응고욕으로는 메탄올을 사용하였다. 전기방사 공정을 수행한 후, 응고욕에 분산된 나노섬유를 투석막에 담아 증류수로 2일 동안 투석하여 응고욕으로 사용된 메탄올을 제거하였다.

단계 4 : 동결건조

상기 단계 3에서 메탄올이 제거된 실크 피브로인 나노섬유를 적절한 용기에 담아 동결 건조하여 스펀지 형태의 실크 나노섬유를 수득하였다.

단계 5 : 하이드록시아파타이트로 복합화 코팅된 실크 나노섬유의 제조

1ℓ의 증류수에 NaCl 58.430 g, KCl 0.373 g, CaCl₂ 3.675 g, MgCl₂ 1.016 g, NaH₂PO₄ 1.420 g, NaHCO₃ 0.840 g을 순서대로 용해시켜 10배 농도의 인체유사 용액(10×SBF 용액)을 제조하였다. 여기에 상기 단계 4에서 얻은 실크 나노섬유 10 ㎎당 10배 농도의 인체유사 용액 50 ㎖의 비율로 실크 나노섬유를 침지하여 37 ℃에서 30분 동안 침지하여 하이드록시아파타이트로 코팅하였다. 반응이 끝난 후, 실크 나노섬유를 증류수로 3번 수세한 후 동결 건조하여 하이드록시아파타이트로 복합화 코팅된 스펀지 형태의 실크 나노섬유를 수득하였다.

단계 6 : 공극이 형성된 실크 / 하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조

상기 단계 5에서 얻은 하이드록시아파타이트로 복합화 코팅된 실크 나노섬유를 다이옥산에 침지하여 충분히 분산되도록 12시간 동안 방치하였다. 이후, 평균 입경이 100 내지 200 ㎛인 염화나트륨을 첨가하여 상기 하이드록시아파타이트로 복합화 코팅된 실크 나노섬유와 잘 섞이도록 분산시켜, 지름 6 ㎜의 내경을 지니는 유리관에 채워 넣은 후, 동결 건조하여 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 폼을 준비하였다. 상기 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 폼을 글루타알데히드 증기로 포화되어 있는 데시케이터에 넣어서 실크 피브로인 분자쇄 간에 가교 결합이 일어나도록 24시간 동안 처리하였다. 가교처리 후, 0.1 M 글라이신 수용액에 침지하여 24시간 동안 6시간 간격으로 교환하면서 교반하였다. 상기 교반시, 염화나트륨 입자들이 녹으면서 지지체에 목적으로 하는 공극이 형성되었다. 이후, 다시 PBS(phosphate buffer saline)를 이용하여 3회 수세하고 침지하여 24시간 동안 교반한 후, 동결 건조의 과정을 통하여 다공성 구조를 지닌 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체를 수득하였다.

< 실시예 2> 실크 / 하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조 2

상기 실시예 1의 단계 5에 있어서 10배 농도의 인체유사 용액에 침지시켜 60분 동안 반응하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 다공성 구조를 지닌 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체를 수득하였다.

<실시예 3> 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조 3

상기 실시예 1의 단계 5에 있어서 10배 농도의 인체유사 용액에 침지시켜 90분 동안 반응하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 다공성 구조를 지닌 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체를 수득하였다.

< 실시예 4> 실크 / 하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조 4

상기 실시예 1의 단계 5에 있어서 10배 농도의 인체유사 용액에 침지시켜 120분 동안 반응하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 다공성 구조를 지닌 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체를 수득하였다.

<실시예 5> 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조 5

상기 실시예 1의 단계 5에 있어서 5배 농도의 인체유사 용액에 침지시켜 60분 동안 반응하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 다공성 구조를 지닌 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체를 수득하였다.

< 실시예 6> 실크 / 하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조 6

상기 실시예 1의 단계 5에 있어서 15배 농도의 인체유사 용액에 침지시켜 60분 동안 반응하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 다공성 구조를 지닌 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체를 수득하였다.

< 실시예 7> 실크 / 하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조 7

상기 실시예 1의 단계 5에 있어서 20배 농도의 인체유사 용액에 침지시켜 60분 동안 반응하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 다공성 구조를 지닌 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체를 수득하였다.

< 비교예 1> 1.5배 농도의 인체유사 용액을 이용한 실크 / 하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조

상기 실시예 1의 단계 5에 있어서 10배 농도의 인체유사 용액 대신에 1.5배 농도의 인체유사 용액을 사용하여 1주일 동안 반응하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 다공성 구조를 지닌 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체를 수득하였다.

< 비교예 2> 실크 나노섬유 지지체의 제조

상기 실시예 1의 단계 5를 수행하지 않는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실크 나노섬유 지지체를 수득하였다.

< 실험예 1> 인체 유사 용액의 농도에 따른 하이드록시아파타이트 코팅 두께 변화 측정

본 발명에 따른 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 인체유사 용액의 농도에 따른 하이드록시아파타이트 코팅 두께 변화를 알아보기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.

상기 비교예 1의 주사전사 현미경 이미지를 도 1의 (a)에 나타내었으며, 상기 실시예 5의 주사전사 현미경 이미지를 도 1의 (b)에 나타내었으며, 상기 실시예 2의 주사전사 현미경 이미지를 도 1의 (c)에 나타내었으며, 상기 실시예 6의 주사전사 현미경 이미지를 도 1의 (d)에 나타내었으며, 상기 실시예 7의 주사전사 현미경 이미지를 도 1의 (e)에 나타내었다. 또한, 상기 비교예 2 및 실시예 2의 X선 분말 회절분석(X-ray Diffraction, XRD) 스펙트럼을 도 2에 나타내었다.

도 1의 (a)에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 비교예 1의 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체는 하이드록시아파타이트가 알갱이 형태로 실크 나노섬유 표면에 생기는 것을 알 수 있다. 또한, 도 1의 (b), (c) 및 (d)에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체는 인체유사 용액의 농도가 높아질수록 많은 양의 하이드록시아파타이트 코팅이 이루어지는 것을 알 수 있다. 그러나, 도 1의 (e)에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 7의 경우에는 실크 나노섬유 표면에 하이드록시아파타이트가 생성되기 전에 용액 내에서 염이 침전되어 하이드록시아파타이트 코팅이 이루어지지 않은 것을 알 수 있다.

도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 2의 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체는 하이드록시아파타이트 무기 결정 구조를 나타내는((002) 및 (211)) 결정 격자 면에 해당하는 회절 피크가 각각 26°및 32°에서 나타나는 것을 알 수 있다.

이를 통해 본 발명에 따른 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법은 5배 내지 15배 농도의 인체유사 용액을 사용함으로써 상온과 상압 조건에서 실크 단백질의 손상 없이 짧은 시간에 플라즈마 처리나 표면처리 같은 추가적인 공정 없이 하이드록시아파타이트를 실크 나노섬유 지지체에 효율적으로 코팅할 수 있음을 알 수 있다.

< 실험예 2> 인체 유사 용액 침지 시간에 따른 하이드록시아파타이트 코팅 두께 변화 측정

본 발명에 따른 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 인체유사 용액에의 침지 시간에 따른 하이드록시아파타이트 코팅 두께 변화를 알아보기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.

상기 실시예 1 내지 4의 질량 변화와 평균 섬유 직경을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 1 및 도 3에 나타내었다.

구분	질량 변화(%)	평균 섬유 두께(㎚)
실시예 1	124.6±15.66	428.7±54.40
실시예 2	130.9±21.59	538.7±81.73
실시예 3	150.7±20.32	1207.47±140.29
실시예 4	176.4±25.48	측정할 수 없음

상기 표 1을 참조하면, 실시예 1 내지 4의 경우에는 인체 유사 용액에의 침지 시간이 증가할수록 질량 및 평균 섬유 두께가 증가하는 것을 알 수 있다. 특히 실시예 4의 경우에는 섬유 두께가 너무 두꺼워져 섬유의 굵기를 측정할 수 없는 것을 알 수 있다.

도 3의 (a)에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1의 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체는 하이드록시아파타이트 코팅이 실크 나노섬유 전체를 고르게 덮고 있지 않고 부분적으로 알갱이처럼 섬유 표면에 생겨난 것을 알 수 있다. 도 3의 (b)에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 2의 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체는 하이드록시아파타이트 코팅이 실크 나노섬유 전체를 거의 다 덮고 있음을 알 수 있다. 도 3의 (c)에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 3의 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체는 하이드록시아파타이트 코팅이 실크 나노섬유 표면을 완전히 덮고 있을 뿐만 아니라 섬유의 형태가 유지되고 있는 것을 알 수 있다. 도 3의 (d)에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 4의 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체는 하이드록시아파타이트 코팅이 두꺼워져 실크 나노섬유의 형태를 잃고 거의 평면적으로 변한 것을 알 수 있다.

또한, 상기 실시예 1 내지 4 및 비교예 2의 FT-IR 스펙트럼을 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법은 인체유사 용액에의 침지 시간이 증가할수록 하이드록시아파타이트의 P-O 결합을 나타내는 피크가 커지는 것을 알 수 있다.

이를 통해 본 발명에 따른 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법은 인체유사 용액에의 침지 시간을 조절하여 하이드록시아파타이트 코팅의 두께를 조절할 수 있음을 알 수 있다.

< 실험예 3> 인체유사 용액 침지를 통하여 생성된 하이드록시아파타이트 코팅의 원소 분석

본 발명에 따른 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 인체유사 용액 침지를 통하여 생성된 하이드록시아파타이트 코팅의 원소 함량을 알아보기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.

상기 실시예 2의 원소 분석(Energy Dispersive Spectroscopy, EDS) 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 2의 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체는 하이드록시아파타이트의 Ca 이온과 P 이온의 비율이 1.61 임을 알 수 있다. 하이드록시아파타이트 (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)는 Ca 이온과 P 이온의 비율은 1.67이 일반적이나 상기 실시예 2의 인체유사 용액 침지의 경우 제조한 하이드록시아파타이트는 Ca 이온이 약간 적게 첨가되어 1.67 보다 적은 Ca 과 P의 비를 가지고 있는 것이 보통이다.

그러므로 본 발명에 따른 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법은 5배 내지 15배 농도의 인체유사 용액을 사용함으로써 상온과 상압 조건에서 실크 단백질의 손상 없이 짧은 시간에 플라즈마 처리나 표면처리 같은 추가적인 공정을 수행하지 않고 하이드록시아파타이트를 실크 나노섬유 지지체에 효율적으로 코팅할 수 있으며, 하이드록시아파타이트에 비하여 결정화도가 낮아 천연의 뼈와 비슷한 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체를 제조할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 인체유사 용액의 농도 변화에 대한 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 주사 전자 현미경 이미지이고((a)비교예 1, (b)실시예 5, (c)실시예 2, (d)실시예 6, (e)실시예 7);

도 2는 본 발명에 따른 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 X선 분말 회절분석(X-ray Diffraction, XRD) 스펙트럼을 나타낸 그래프이고;

도 3은 본 발명에 따른 인체유사 용액의 농도에의 침지 시간에 따른 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 주사 전자 현미경 이미지이고((a)실시예 1, (b)실시예 2, (c)실시예 3, (d)실시예 4);

도 4는 본 발명에 따른 인체유사 용액의 농도에의 침지 시간에 따른 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 FT-IR 스펙트럼 측정결과이고; 및

도 5는 본 발명에 따른 인체유사 용액에 의하여 생성된 하이드록시아파타이트의 원소 함량을 분석한 EDS 스펙트럼 측정결과이다.

Claims (16)

1. 실크 방사원액을 준비하는 단계(단계 1);

   상기 단계 1에서 준비된 실크 방사원액을 전기방사하는 단계(단계 2);

   상기 단계 2에서 방사된 실크 나노섬유를 분산시키는 단계(단계 3);

   상기 단계 3에서 분산된 실크 나노섬유를 소정의 용기에 담아 동결 건조하여 3차원적으로 분산된 스펀지 형태의 실크 나노섬유를 제조하는 단계(단계 4);

   상기 단계 4에서 제조된 3차원적으로 분산된 스펀지 형태의 실크 나노섬유를 5배 내지 15배의 농도의 인체유사 용액(simulated body fluid, SBF)에 침지하여 하이드록시아파타이트로 복합화 코팅하는 단계(단계 5); 및

   상기 단계 5에서 하이드록시아파타이트로 복합화 코팅된 실크 나노섬유에 공극을 형성하는 단계(단계 6)를 포함하여 이루어지는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법:

   (상기 단계 5에서 5배 내지 15배의 농도의 인체유사 용액은 1ℓ의 증류수에 Ca²⁺ 2.5 mM, H₂PO₄ ^2- 1.0 mM을 포함하고, Na⁺, K⁺ , Mg²⁺, Cl^-, HCO^3-, SO₄ ^2-의 화학종을 함유하는 인체유사 용액을 기준으로 하고(1×SBF), 이 기준용액에 대해 Ca²⁺와 H₂PO₄ ^2-의 농도를 5배 내지 15배로 증가시킨 것을 의미한다).
2. 제1항에 있어서, 상기 단계 1의 실크 방사원액은

   실크 섬유에서 세리신을 제거하는 단계(단계 a);

   세리신이 제거된 실크 섬유를 수세, 건조 및 투석하여 실크 피브로인 수용액을 제조하는 단계(단계 b);

   상기 실크 피브로인 수용액을 동결 건조하여 실크 피브로인 스펀지를 제조하는 단계(단계 c); 및

   상기 실크 피브로인 스펀지를 소정의 용매에 용해한 후 여과하는 단계(단계 d)를 포함하여 준비되는 것을 특징으로 하는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 실크 방사원액은 10 내지 18%의 농도로 준비되는 것을 특징으로 하는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 단계 2의 전기방사는 전압을 10 내지 15 kV의 전압범위로 인가하는 것을 특징으로 하는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 단계 3의 분산은 소정의 응고액으로 채워진 응고욕에 상기 단계 2에서 방사된 실크 나노섬유를 분산시키는 것을 특징으로 하는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 단계 5의 3차원적으로 분산된 스펀지 형태의 실크 나노섬유를 37±0.5 ℃의 온도 및 7.2 내지 7.4의 pH 범위인 인체유사 용액에 30분 내지 90분 동안 침지하는 것을 특징으로 하는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법..
7. 제1항에 있어서, 상기 단계 6의 공극은

   하이드록시아파타이트로 복합화 코팅된 실크 나노섬유를 분산매에 분산하는 단계(단계 a);

   상기 혼합 용액에 공극 형성용 입자를 첨가하는 단계(단계 b);

   상기 단계 b에서 얻은 공극 형성용 입자를 포함하는 혼합물을 이용하여 공극 형성용 입자를 포함하는 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 폼(foam)을 준비하는 단계(단계 c); 및

   상기 나노섬유 폼의 공극 형성용 입자를 제거함으로써 공극이 형성된 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체를 형성하는 단계(단계 d)를 포함하여 형성되는 것을 특징으로 하는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 단계 a의 분산매는 다이옥산, 사염화탄소, 트리클로로에탄, 벤젠, 이소프로판올, 시클로헥산, 또는 이들의 혼합 용액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 특징으로 하는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 단계 b의 공극 형성용 입자는 염화나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 수크로스 및 염화알루미늄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법.
10. 제7항에 있어서, 상기 단계 b의 공극 형성용 입자의 입경은 100 내지 200 ㎛인 것을 특징으로 하는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지 체의 제조방법.
11. 제7항에 있어서, 상기 하이드록시아파타이트로 코팅된 실크 나노섬유 2 ㎎당 0.01 내지 0.02 g의 공극 형성용 입자를 사용하는 것을 특징으로 하는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법.
12. 제7항에 있어서, 상기 단계 c의 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 폼은 상기 단계 b에서 얻은 공극 형성용 입자를 포함하는 혼합물을 동결 건조하여 준비되는 것을 특징으로 하는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법.
13. 제7항에 있어서, 상기 단계 d의 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체는 상기 단계 c의 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 폼을 증기를 이용하여 증기 가교 결합(vapor cross-linking)시킨 후, 상기 공극 형성용 입자를 가용시키는 용매에 침지시키고, 상기 침지된 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 폼을 동결 건조하여 형성되는 것을 특징으로 하는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 증기는 글루타알데히드, 카보디이미드, 디페닐포스포릴아자이드, 에틸디메틸아미노프로필카보디이미드, 토일렌디이소시아네이트 및 헥사메틸렌디이소시아네이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법.
15. 제1항에 있어서, 상온과 상압 조건에서 실크 단백질의 손상 없이 짧은 시간에 실크 나노섬유를 하이드록시아파타이트로 코팅하는 것을 특징으로 하는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법.
16. 제1항에 있어서, 플라즈마 처리나 표면처리 같은 추가적인 공정을 수행하지 않고 실크 나노섬유를 하이드록시아파타이트로 코팅하는 것을 특징으로 하는 골 재생용 실크/하이드록시아파타이트 복합 나노섬유 지지체의 제조방법.

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