KR100713619B1 - 유도 골재생을 위한 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의제조방법 - Google Patents

유도 골재생을 위한 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의제조방법 Download PDF

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Abstract

GTR(Guided Tissue Regeneration) 또는 GBR(Guided Bone Regeneration)에서 조직 또는 뼈의 손상된 영역을 섬유상 결합조직의 침입으로부터 방지하는 방어막(barrier)으로서 사용될 수 있는 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의 제조방법이 개시된다. 이러한 복합체 멤브레인은 염기 수용액에서 잘 조절된 콜라겐과 아파타이트의 공침전 그리고 후속하는 여과지 상에의 캐스팅에 의한 여과, 동결건조 및 가교화에 의하여 얻을 수 있다. 본 발명의 방법에 의하여 콜라겐의 자기조립에 의한 뭉침이 없이, 콜라겐 섬유 방향으로 아파타이트, 특히 수산화아파타이트 결정이 균일하게 코팅된 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인이 형성된다. 이러한 복합체 멤브레인은 우수한 기계적 물성을 가질 뿐만 아니라 우수한 생체적합성과 세포친화성, 적합한 생분해성 그리고 우수한 형상 안정성을 가지고 있어 GTR을 위한 방어막으로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 방법은 골아세포의 부착 및 분화를 가능하게 하는 미세구조를 가지고 있을 뿐만 아니라 멤브레인을 형성하는 과정에서 두께 조절에 의하여 그 물성을 조절할 수 있으므로 요구되는 용도에 적합한 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인을 제공할 수 있다.
GTR, GBR, 콜라겐, 아파타이트, 복합체, 멤브레인, 공침전

Description

유도 골재생을 위한 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING COLLAGEN/APATITE COMPOSITE MEMBRANE FOR GUIDED BONE REGENERATION}
도 1은 본 발명의 방법에 관한 개략적 설명도(A)와 가교화 전의 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인을 보여주는 사진들(B)이다.
도 2는 본 발명의 실시예들에 의하여 제조된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인들을 분석한 그래프로서, (A)는 열비중계 분석(Thermogravimetric Analysis; TGA) 그래프이고, (B)는 FT-IR 분광계의 그래프이다. 각 그래프에서, (a)는 가교화한 순수한 콜라겐 멤브레인, (b)는 가교화한 20 중량%(명목상 성분비)의 하이드록시아파타이트가 코팅된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인, 그리고 (c)는 가교화한 40 중량%(명목상 성분비)의 하이드록시아파타이트가 코팅된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인에 대한 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예들에 의하여 제조된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인들의 조직형태를 보여주는 현미경 이미지들로서, (A)는 가교화된 순수한 콜라겐 멤브레인의 표면의 SEM 이미지이고, 가교화된 40중량%(명목상 성분비)의 하이드록시아파타이트가 코팅된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인의 SEM 이미지로서, (B)는 표면, (C)는 단면, 그리고 (D)는 노출된 미세섬유들에 대한 것 이고, 그리고 (E)는 TEM 이미지 및 SAD 패턴을 보여준다.
도 4는 본 발명의 실시예들에 의하여 제조된 가교화된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인들에 관하여 두께에 대하여 밀도 분포를 보여주는 그래프이다. 여기에서 모든 샘플들은 동일한 수단과 방식으로 여과함으로써 동일한 면적을 가지는 것들이다.
도 5는 본 발명의 실시예들에 의하여 제조된 가교화된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인들의 기계적 물성들을 나타낸 그래프로서, (A)는 응력-변형 곡선을, 그리고 (B)는 인장강도와 탄성계수를 보여준다(n>6, *p<0.01).
도 6은 본 발명의 실시예들에 의하여 제조된 가교화된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인들의 형상 안정성을 보여주는 것들로서, 본 발명에 따른 멤브레인들을 물속에 24시간 동안 담근 후 (A)는 물속에서의 부풀기 정도를 보여주는 사진이고, (B)는 부피의 변화를 보여주는 그래프이다(*p<0.05).
도 7은 본 발명의 실시예들에 의하여 제조된 가교화된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인들의 생분해 안정성을 보여주는 것들로서, (A)는 본 발명에 따른 멤브레인들을 콜라게나제 150U/ml의 용액으로 24시간 동안 처리한 후의 상태를 보여주는 사진들이고, (B)는 콜라겐 생분해 정도를 보여주는 그래프이다. (B)에서 모든 멤브레인들은 EDC/NHS에 의하여 가교되되었고 37℃에서 24시간 동안 150U/ml 콜라게나제에서 배양되었다. 값들은 평균 ± 표준편차 (*p<0.05, **p<0.01) 이다.
도 8은 콜라게나제에 의한 콜라겐의 분해 메카니즘을 보여주는 개략적 다이 아그램이다.
도 9는 본 발명의 실시예들에 의하여 제조된 가교화된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인들의 세포특성들을 보여주는 것들로서, MT3T3 골아세포를 멤브레인들 상에 배양한지 3일 후 (A)는 세포성장특성들을 보여주는 그래프이고, (B)는 SEM 이미지들을 보여주는 사진이다. (B)에서 (a)와 (b)는 순수 콜라겐 멤브레인에 대한 것들이고, (c)와 (d)는 80 중량%(명목상 성분비)를 가지는 멤브레인에 대한 것들이다. 세포량은 별로 다르지 않았다. 과립들이 복합체 멤브레인 상에 그리고 복합체 멤브레인 상의 세포 주위에 형성되었다.
본 발명은 유도 골 또는 조직 재생에 유용하게 적용할 수 있는 생체모방적 방법에 의한 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의 제조방법 및 그 방법에 의하여 제조된 콜라겐/아파파이트 복합체 멤브레인에 관한 것이다.
최근 조직공학은 그 간의 발전을 토대로 의료 및 공학 분야에서 손상된 조직의 재생을 위한 최선의 대안으로 자리잡아가고 있다. 가장 발전된 분야 중 하나는 유도 골 재생(Guided Bone Regeneration; GBR) 또는 유도 조직 재생(Guided Tissue Regeneration; GTR)이다. 이것은 조직 또는 뼈의 손상된 부위에 섬유상 결합조직이 침입하는 것을 방지하는 방어막(barrier)으로서 멤브레인 형태로 사용한다.
많은 연구자들이 이러한 용도의 멤브레인으로서 가장 적합한 재료를 만들기 위하여 노력하여 왔으나, 지금까지 시도된 모든 재료들은 각각 장점과 단점을 가지고 있다. 예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌(polytertrafluoroethylene; PTFE) 멤브레인이 GTR을 위한 이러한 방어막의 용도로 사용되어 왔으나, PTFE는 생체흡수성이 없기 때문에 그 멤브레인을 제거하여야 하는 2차 수술이 필요하다는 치명적 단점을 가지고 있고 또한 적용가능한 손상조직의 크기가 제한된다는 단점을 가지고 있다.
이러한 단점을 극복하기 위하여, 콜라겐 및 합성 생분해성 고분자와 같은 생체흡수성 멤브레인이 많은 연구자들에 의하여 제안되고 연구되어 왔다. 콜라겐은 인간 및 동물의 피부, 결합조직, 뼈 및 치아에서 발견되는 안정한 자연산 단백질로서, 우수한 생체적합성과 생체흡수성을 가지지만, 기계적 물성이 좋지 못하다. 게다가, 순수한 콜라겐의 용해도는 일반적으로 너무 높다. 반면에 폴리락티드-기반 고분자들은 충분한 기계적 물성을 가지지만 세포친화도 및 용해속도가 너무 낮다 [Y. Aman, M. Ota, K. Sekiguchi, Y. Shibukawa, and S. Yamada, Evaluation of a poly-l-lactic acid membrane and membrane fixing pin for guided tissue regeneration on bone defects in dogs, Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2004; 97: 155-163; M. Asboe, E. M. Pinholt and E. Hjorting-Hansen, Healing of experimentally created defects: a review, British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery 1995; 33: 312-318; Y. Park, Y. Ku, C. Chung and S. Lee, Controlled release of platelet-derived growth factor from porous poly(L-lactide) membranes for guided tissue regeneration, Journal of Controlled Release 1998; 51: 201-211; M. Kikuchi, Y. Koyama, T. Yamada, Y. Imamura, T. Okada, N. Shirahama, K. Akita, K. Takakuda and J. Tanaka, Development of guided bone regeneration membrane composed of β-ticalcium phosphate and poly (L-lactide-co-glycolide-co-ε-caprolactone) composites, Biomaterials 2004; 25: 5979-5986].
이러한 문제점들을 고려하며, 몇몇 연구자들은 골유도성 인산칼슘 세라믹스와 생분해성 합성 고분자의 복합체를 제조하였다. 예를 들어, 하이드록시아파타이트/폴리(ε-카프로락톤) 복합체 [D. Choi, K. G. Marra and P. N. Kumta, Chemical synthesis of hydroxyapatite / poly (ε-caprolactone) composites, Materials Research Bulletin 2004; 39: 417-432], 생분해성 폴리액티브/하이드록시아파타이트 멤브레인 [J. A. Jansen, J. E. de Ruijter, P. T. M. Janssen and Y. G. C. J. Paquay, Histological evaluation of biodegradable polyactive /hydroxyapatite membrane, Biomaterials 1995; 16: 819-827], β-티칼슘 포스페이트와 폴리(L-락티드-코-글리콜리드-코-ε-카프로락톤) 복합체 [M. Kikuchi, Y. Koyama, T. Yamada, Y. Imamura, T. Okada, N. Shirahama, K. Akita, K. Takakuda and J. Tanaka, Development of guided bone regeneration membrane composed of β-ticalcium phosphate and poly (L-lactide-co-glycolide-co-ε-caprolactone) composites, Biomaterials 2004; 25: 5979-5986]의 물성이 조사되었다. GBR을 위한 적용가능성은 높아졌음에도 불구하고, 그것들은 고분자 메트릭스에 결합되는 세라 믹스 입자의 크기 및 양에 따라 그 입자들들이 균일하지 못한 문제가 있었다. 게다가, 세라믹 입자들은 때때로 결함인자로 작용하기도 하고 복합체 멤브레인의 기계적 물성을 열화시키기도 한다.
GTR을 위한 복합체 멤브레인에 관한 다른 접근은 콜라겐 멤브레인 기재에 하이드록시아파타이트가 형성되도록 하는 것이다. 멤브레인의 형성 능력을 향상시키기 위하여, 많은 콜라겐 변형 방법들이 제안되었다 [S. Rhee and J. Tanaka, Effect of citric acid on the nucleation of hydroxyapatite in a simulated body fluid, Biomaterials 1999; 20: 2155-2160; D. Lickorish, J. A. M. Ramshaw, J. A. Werkmeister, V. Glattauer and C. R. Howlett, Collagen-hydroxyapatite composite prepared by biomimetic process, J Biomed Mater Res 68A 2004; 19-27; A. Tampieri, G. Celotti, E. Landi, M. Sandri, N. Roveri and G. Falini, Biologically inspired synthesis of bone-like composite: Self-assembled collagen fibers/hydroxyapatite nanocrystals, J Biomed Mater Res 67A 2003; 618-625]. 보다 최근에, 콜라겐/하이드록시아파타이트 복합체가 생체모방적 방법에 의하여 제조되었다. 이 방법에서는, 아파타이트 결정이 콜라겐 섬유 방향으로 침전되어 배열된다. 이 방법의 장점은 나노크기의 균일한 복합체 구조를 형성할 수 있다는 것이다. 그러나 이 방법은 자기-조립된(self-assembled) 섬유들이 뭉쳐져서 불규칙한 입자들을 형성하기 때문에 심각한 문제를 야기한다 [M. Kikuchi, S. Itoh, S. Ichinose, K. Shinomiya and J. Tanaka, Self-organization mechanism in a bone-like hydroxyapatite/collagen nanocomposite synthezed in vitro and its biological reaction in vivo, Biomaterials 2001: 22: 1705-1711; S. Itoh, M. Kikuchi, Y. Koyama, K. Takakuda, K. Shinomiya and J. Tanaka, Development of an artificial vertebral body using a novel biomaterial, hydroyapatite/collagen composite, Biomaterials 2002; 23: 3919-3926].
미국특허 제6,300,315호 및 제6,417,166호는 콜라겐 겔 슬러리에 염화칼슘 용액과 인산암모늄 용액을 동시에 첨가하고 그 침전물을 여과지 상에 캐스팅하여 무기물이 복합된 콜라겐 멤브레인 시트를 얻는 방법을 개시하였다. 이 방법은 콜라겐 상에 아파타이트 침전을 형성하기 위하여 사용되는 초기 콜라겐으로 콜라겐 슬러리를 사용하여 콜라겐 멤브레인을 얻는 것을 특징으로 한다. 그런데, 콜라겐 슬러리를 사용하여 그것상에 아파타이트 침전을 형성하는 방법은 이 특허의 발명자의 이전 미국특허 제5,320,844호(위 특허출원전에 등록되어 공표됨)에 의하여 이미 개시된 것이지만 이 이전 특허는 그렇게 제조된 복합체를 경조직 대체용으로 제안하였을 뿐이며, GTR을 위한 멤브레인 및 그 제조방법을 제안하지는 않았다. 한편, 이 발명자는 콜라겐 멤브레인에 관한 위 특허들에서 무기물로 복합화된 콜라겐은 지금까지(그 특허들의 출원시까지) 스폰지 구조를 형성하기 위하여 동결건조에 의하여 준비하여 왔거나 대안적으로 고체 블록 또는 그래뉼 형태로 제조되지만, 이러한 형태의 콜라겐은 GTR을 위한 멤브레인 방어막으로 사용될 수 없고 또한 GTR 적용에 적합한 콜라겐 멤브레인이 제시되지 않았다고 기술하였다.
한편, 인공골 재료로 손상된 골을 대체하려는 연구도 상당히 진행되어 왔는데, 대한민국 특허공개 제2005-0083797호(2005년 8월 26일 공개; 2004년 5월 21일 에 국제공개된 국제공개번호 WO 2004/041320의 국내단계에 있는 특허출원에 대한 한국의 특허공개임)는 인공골 재료로서 아파타이트/콜라겐 가교 다공체 및 그것의 제조방법을 개시하고 있다. 이 특허는 콜라겐의 인산수용액과 수산화칼슘 현탁액을 혼합하여 질량기준으로 8/2의 아파타이트/콜라겐 복합체를 얻은 후 이것을 페이스트 형상의 분산물로 만들고 겔화시켜 젤리 형상의 성형체를 얻은 다음에 동결건조하고 가교화하여 최종적으로 인공골 재료를 얻었다. 이 특허는 GTR을 위한 멤브레인에 대해서는 전혀 언급이 없으며, 단지 아파타이트 주재에 콜라겐을 복합화한 골대체 재료를 제안하고 있을 뿐이다.
본 발명의 목적은 GTR(Guided Tissue Regeneration) 또는 GBR(Guided Bone Regeneration)에서 조직 또는 뼈의 손상된 영역을 섬유상 결합조직의 침입으로부터 방지하는 방어막(barrier)으로서 사용될 수 있는 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 그러한 방법에 의하여 제조되는 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인을 제공하는 것이다.
본 발명은 생체모방적 방법에 의하여 콜라겐 상에 아파타이트가 균일하게 침전된 콜라겐/아파타이트 복합체로 이루어지는 멤브레인의 제조방법 및 그 방법에 의하여 제조되는 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 용해성 칼슘 이온을 함유하는 수용액(칼슘염 용액)을 준비하는 단계, 용해성 인산염(phosphate) 이온을 함유하는 수용액(인산염 용액)에 콜라겐을 용해한 인산염/콜라겐 용액을 준비하는 단계, pH가 7 이상으로 설정된 완충용액을 준비하는 단계, 상기 칼슘염 용액과 상기 인산염/콜라겐 용액을 상기 완충용액에 첨가하고 교반하여 상기 칼슘염 용액과 상기 인산염 용액으로부터 형성되는 아파타이트와 콜라겐이 복합화된 콜라겐/아파타이트 복합체 침전물을 형성하는 단계, 및 상기 콜라겐/아파타이트 복합체 침전물을 세척 및 여과지 상에서 여과한 후 동결건조하여 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인을 형성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 상기 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의 콜라겐을 가교화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 콜라겐의 가교화는 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필)카보디이미드 [1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide; EDC]와 N-하이드록시숙신이미드 [N-hydroxysuccinimide; NHS]가 알콜에 용해된 EDC-NHS 용액에 상기 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인을 담금으로써 수행될 수 있다. 상기 EDC-NHS 용액의 용매로 사용되는 알콜은 에탄올인 것이 바람직하다. 상기 가교화 후에 가교화된 멤브레인을 회수하고 순수한 물로 세척한 후 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 그리고 습기가 있는 분위기에서 상기 멤브레인의 표면에 압력을 고르게 가한 상태에서 건조시킴으로써 멤브레인의 두께를 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 콜라겐/아파타이트 복합체 침전 형성 반응이 완전히 진행되고 손실이 없는 상태의 명목상 콜라겐과 아파파이트의 조성비가 중량비로 바람직하게, 9:1 ~ 5:5, 더욱 바람직하게는, 8:2 ~ 6:4의 범위가 되도록 상기 칼슘염 용액 및 상기 인산염/콜라겐 용액을 준비한다. 상기 칼슘염 용액으로는 Ca(OH)2가 물에 용해된 Ca(OH)2 용액을 사용할 수 있다. 상기 인산염/콜라겐 용액으로는 H3PO4 수용액에 콜라겐을 용해시킨 것을 사용할 수 있다. 상기 콜라겐/아파타이트 복합체 침전물의 형성단계는 pH가 7 이상으로, 바람직하게는 pH 9로 유지된 상태에서 수행된다. 상기 완충용액은 pH 9로 설정된 트리스-HCl 완충용액이고, 상기 콜라겐/아파타이트 복합체 침전물의 형성단계는 pH가 9로 유지된 상태에서 수행되는 것이 바람직하다. 상기 콜라겐/아파타이트 복합체 침전물의 세척 및 여과는 고체-액체 분리수단에 의한 침전물의 분리, 세척 및 여과지 상에서의 여과에 의하여 수행되거나 또는 여과지 상에서의 여과 및 여과지 상에서의 세척에 의하여 수행될 수 있다. 상기 콜라겐/아파타이트 복합체 중의 아파타이트는 바람직하게, 수산화아파타이트이다.
본 발명의 방법에 의하여 콜라겐의 자기조립에 의한 뭉침이 없이, 콜라겐 섬유 방향으로 아파타이트, 특히 수산화아파타이트 결정이 균일하게 코팅된 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인이 형성된다. 이러한 복합체 멤브레인은 우수한 기계적 물성을 가질 뿐만 아니라 우수한 생체적합성과 세포친화성, 적합한 생분해성 그리고 우수한 형상 안정성을 가지고 있어 GTR을 위한 방어막으로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 방법은 골아세포의 부착 및 분화를 가능하게 하는 미세구조를 가지고 있을 뿐만 아니라 멤브레인을 형성하는 과정에서 두께 조절에 의하여 그 물성을 조절할 수 있으므로 요구되는 용도에 적합한 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인을 제공할 수 있다.
본 발명은 생체모방적 방법에 의하여 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인을 제조하는 방법에 관한 것이다. 도 1은 본 발명의 방법에 관한 개략적 설명도(A)와 가교화 전의 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인을 보여주는 사진들(B)이다.
본 발명의 방법에 의하여 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인을 제조하기 위하여, 용해성 칼슘 이온을 함유하는 수용액(칼슘염 용액)을 준비한다. 칼슘염 용액에 함유되는 칼슘 화합물로는 물에 용해성이 있고 아파타이트의 침전을 방해하지 않는다면 특별히 제한되지 않으며, 본 발명의 실시예에서는 바람직하게, 수산화칼슘[Ca(OH)2]를 사용하였다. 이러한 칼슘 화합물은 요구되는 양으로 용해도의 한도 내의 농도로 물에 용해된다. 칼슘 화합물의 요구량은 최종 멤브레인에서의 콜라겐과 침전으로 생성되는 아파타이트의 성분비에 따라 결정된다.
또한 용해성 인산염 이온을 함유하는 수용액(인산염 용액)에 콜라겐이 용해된 인산염/콜라겐 용액을 준비한다. 인산 또는 인산염의 용해 및 콜라겐의 용해 순서는 특별히 제한되지 않는다. 콜라겐 및 인산염의 양은 최종 멤브레인에서 콜라겐과 침전으로 생성되는 아파타이트의 성분비에 따라 결정된다. 인산염 용액에 사용되는 인산염 화합물로는 물에 용해성이 있고 아파타이트의 침전을 방해하지 않는다면 특별히 제한되지 않으며, 본 발명의 실시예에서는 바람직하게, 인산[H3PO4]를 사용하였으며, 물에 대한 용해도의 한도 내의 농도로 물에 용해된다. 본 발명에서 사 용되는 콜라겐으로는 특별히 한정되지 않으나, 타입 I 콜라겐이 바람직하다. 콜라겐의 농도는 용해도의 한도 내에서 적절하게 정해질 수 있다.
한편, 이러한 반응물들과는 별도로 pH가 7 이상으로 설정된 완충용액을 준비한다. 완충용액은 콜라겐과 아파타이트의 침전 및 아파타이트의 형성을 방해하지 않는다면 특별히 제한되지는 않으나, 본 발명의 실시예에서 바람직하게 트리스-HCl 완충용액을 사용하였다. 완충용액의 pH는 더욱 바람직하게 pH 9 정도로 설정되는 것이 바람직하다. 아파타이트의 침전을 pH 9 정도에서 유도할 경우 하이드록시아파타이트가 형성될 수 있다.
이렇게 준비된 완충용액에 칼슘염 용액과 인산염/콜라겐 용액을 동시에 또는 순차적으로 첨가한다. 그리고 격렬하게 교반하여 아파타이트와 콜라겐의 공침전을 유도한다. 이러한 공침반응 동안에 반응용액의 pH는 7 이상, 바람직하게는 9 정도에서 일정하게 유지되는 것이 바람직하다. 반응용액의 pH 조절 및 유지는 완충용액의 사용과 HCl과 같은 산 그리고 NH4OH와 같은 염기에 의하여 달성될 수 있다. 이러한 공침전 방법에 의하여 형성되는 콜라겐/아파타이트 복합체는 아파타이트, 특히 하이드록시아파타이트의 C축이 콜라겐 섬유 방향을 따라 배향되는 형태로 하이드록시아파타이트가 콜라겐 섬유 상에 매우 균일하게 코팅된 구조를 가진다. 이러한 공침을 유도함에 있어서 중요하게 고려되어야 할 것은 균일한 침전과 콜라겐의 자기조립에 의한 뭉쳐짐의 방지이다. 이러한 것들은 콜라겐/아파타이트 복합체에서 콜라겐의 성분비가 높을 경우, 특히 중요한 사안이 된다. 본 발명의 복합체 멤브레인 에서 콜라겐/아파타이트의 명목상 성분비는 중량비로 9/1 ~ 5/5, 바람직하게는 8/2 ~ 6/4 이다. 본 명세서에서 콜라겐/아파타이트의 명목상 성분비는 최종 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인에서의 실제 성분비를 의미하는 것이 아니라 콜라겐 및 아파타이트 생성을 위한 반응물들의 공침전 반응이 완전히 진행되고 손실이 없는 이상적인 조건에서의 콜라겐/아파타이트의 성분비를 의미한다.
복합체 멤브레인에서 요구되는 콜라겐의 성분비가 높을 경우, 반응용액에서의 콜라겐의 농도가 높아져서 콜라겐의 자기조립에 의한 뭉쳐짐의 발생 가능성이 높아진다. 이를 방지하기 위하여 콜라겐 슬러리를 사용할 수 있으나 이 경우에는 콜라겐 상에서의 아파타이트의 균일한 침전에는 한계가 있다. 즉, 콜라겐 슬러리의 균일성에 대한 한계로 인하여 아파타이트 침전의 균일성을 완전하게 달성하기 어려울 뿐만 아니라 콜라겐 슬러리의 노출되지 않은 부분에는 아파타이트 침전이 형성될 수 없어 콜라겐 섬유 상에 균일한 아파타이트 침전을 가지는 미세한 구조의 복합체 멤브레인을 얻기 어렵게 된다. 그러한 이유로 본 발명에서는 콜라겐을 물에 용해시키는 것이 바람직하다.
한편, 제한된 용해도를 가지는 칼슘염의 현탁액에 의하여 콜라겐과 아파타이트의 공침을 유도할 경우 침전되는 아파타이트의 조성의 불균일성과 더불어 콜라겐 상에서의 아파타이트 침전의 분포의 불균일성이 발생할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 제한된 용해도를 가지는 칼슘염, 특히 수산화칼슘은 현탁액으로가 아니라 용액으로 사용된다.
본 발명에서 사용되는 공침반응 시스템은 콜라겐이 형성될 아파타이트, 특히 하이드록시아파타이트보다 과량, 바람직하게 콜라겐/아파타이트 성분비가 9/1 ~ 5/5, 더욱 바람직하게는 8/2 ~ 6/4로서, 소량의 아파타이트가 콜라겐과 만날 확률이 낮아 나노크기의 아파타이트 미세입자가 콜라겐 상에 특별한 배향으로 균일하게 침적할 수 있고, 용액 중에서 콜라겐의 자기조립에 의한 뭉쳐짐을 방지할 수 있는 것이다. 이러한 시스템은 칼슘염 용액, 콜라겐 용액, 완충용액, pH 조절 및 유지 등의 조합에 의하여 이루어지고, 또한 격렬한 교반, 낮은 농도 그리고 통상 12시간 이상, 바람직하게는 24시간 정도 또는 그 이상의 긴 교반 숙성시간에 의하여 그러한 시스템이 강화될 수 있다. 반응온도는 대략 40℃ 정도, 보다 정확하게는 37℃인 것이 바람직하다.
다음으로, 본 발명의 생체모방적 공침반응 시스템에 의하여 형성되는 콜라겐/아파타이트 복합체 침전물은 세척, 여과 및 동결건조에 의하여 가교화되지 않은 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인으로 형성된다. 이 때, 여과는 시트상의 멤브레인을 형성하기 위하여 여과지 상에 복합체 침전물이 캐스팅되도록 수행된다. 세척단계는 복합체 침전물을 여과지 상에 캐스팅하는 여과 후에 순수한 물로 세척하는 것에 의하여 수행될 수도 있고, 먼저 고체-액체 분리수단, 예를 들어, 원심분리 또는 여과에 의하여 침전물을 분리한 후 이를 다시 물에 현탁 또는 슬러리로 분산시켜서 세척한 후 여과지 상에서 여과함으로써 수행될 수도 있다. 동결건조는 통상적으로 알려진 방법에 의하여 수행할 수 있다. 동결속도가 크면 생성되는 다공질체의 기공직경이 작아지는 경향이 있는 바와 같이, 동결속도에 의하여 생성되는 다공질체의 기공직경 및 기공형상을 제어할 수 있다는 것은 일반적으로 알려진 사실이다. 따라서, 동결속도를 조절함으로써 용도에 적합한 기공크기를 가지는 복합체 멤브레인을 제조할 수 있다.
제조된 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인은 기계적 물성의 향상뿐만 아니라 형상 안정성 향상을 위하여, 즉 생체 내에서 사용될 때 물속에서의 부풀어짐에 대한 저항성으로 안정한 형상유지 능력을 갖도록 하기 위하여 가교화되는 것이 바람직하다. 복합체 멤브레인의 콜라겐의 가교화는 물리적 방법 또는 화학적 방법에 의하여 수행될 수 있으며, 간단하게는 가교제 용액에 동결건조한 복합체 멤브레인을 담금으로써 수행될 수 있다. 가교제는 알데히드계 가교제, 이소시아네이트계 가교제, 카보디이미드계 가교제 등 여러가지를 포함할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필)카보디이미드 [1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide; EDC]와 N-하이드록시숙신이미드 [N-hydroxysuccinimide; NHS]가 에탄올에 용해된 EDC-NHS 용액을 사용하였다. 에탄올과 같은 알콜을 가교제 용액의 용매로 사용함으로써 가교화반응 중 복합체 멤브레인의 용해 또는 손실을 방지할 수 있다. 가교화 후에는 잔여 가교제를 세척하여 제거하고 동결건조한다.
한편, 상기와 같이 제조된 본 발명의 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인은 공침전과정에서 얻은 콜라겐/아파타이트 복합체 침전물을 동일 면적의 여과지에 캐스팅하여 형성된 시트상의 멤브레인으로서, 침전 및 여과에 의하여 두께를 균일하게 하더라도 그 균일성에는 한계가 있다. 따라서, 예를 들어, 40℃의 습기가 있는 분위기에서 복합체 멤브레인의 표면 상에 압력을 고르게 가한 상태에서 또는 가한 후 건조시킴으로써 두께가 균일한 그리고 원하는 두께의 복합체 멤브레인을 얻을 수 있다. 이 때, 복합체 멤브레인의 밀도 및 공극성 또는 다공성의 정도는 두께의 조절에 의하여 조절될 수 있기 때문에 복합체 멤브레인의 요구되는 용도에 따라 적당한 두께로 조절하여 적용할 수 있다.
이하에서는 본 발명을 실시예들에 의하여 구체적으로 예시한다. 이러한 실시예들에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것이 아님은 당업자들에게는 자명할 것이다.
실시예
1. 가교화된 콜라겐/하이드록시아파타이트 복합체 멤브레인의 제조
(1) 콜라겐/하이드록시아파타이트 복합체 멤브레인의 제조
출발물질로서, Ca(OH)2 (99.995 %, Aldrich, USA), H3PO4 (99.999 %, 85wt% aqueous solution, Aldrich, USA), 및 타입 I 콜라겐 (MW 300,000, RegenMed Inc., Korea)을 사용하였다. 침전방법은 공침전에 의한 생체모방적 방법을 변형하여 사용되었다[M. Kikuchi, S. Itoh, S. Ichinose, K. Shinomiya and J. Tanaka, Self-organization mechanism in a bone-like hydroxyapatite/collagen nanocomposite synthezed in vitro and its biological reaction in vivo, Biomaterials 2001: 22: 1705-1711; BY Yoon, HW Kim, SH Lee, CJ Bae, YH Koh, YM Kong and HE Kim, Stability and cellular responses to fluorapatite-collagen composites, Biomaterials 2005; 26: 2957-2963]. Ca(OH)2를 용해도의 범위에서 차가운 증류수에 완전히 용해시켰고, 이와 별도로, 59.7 mM의 H3PO4 용액을 증류수로 희석하고 콜라겐을 여기에 용해시켰다. 반응 전에, pH 9의 트리스-HCl 완충용액을 수조(water bath)에 37℃의 온도를 유지하면서 준비하였다. Ca(OH)2 및 H3PO4/콜라겐 용액을 완충용액이 담긴 반응용기에 동시에 첨가하였다. 반응 동안에, HCl 및 NH4OH를 사용하여 조심스럽게 pH를 9로 유지하였다. Ca, P 그리고 콜라겐의 양은 80/20 및 60/40(wt/wt)의 최종 콜라겐/하이드록시아파타이트(hydroxyapatite; HA) 성분비를 생성하도록 설정되었다. 혼합물을 37℃의 수조에서 24시간 동안 급속하게 교반하였다. 계속하여 생성된 침전물을 여과하고 부피가 50 ml로 될 때까지 반복하여 세척한 다음에 진공 하에서 -60℃에서 동결건조하였다.
비교를 위하여, 순수한 콜라겐 멤브레인을 동일한 여과 방법에 의하여 만들었다. 콜라겐을50 mM 아세트산 용액에 용해하였다. pH 9로 유지된 트리스-HCl 완충용액에 콜라겐 용액을 혼합한 후에, 그 용액을 24 시간 동안에 37℃에서 숙성시켰다. 침전된 콜라겐 섬유들을 여과하고 반복하여 세척한 다음에 진공 하에서 -60℃에서 동결건조하였다.
(2)가교화
콜라겐 멤브레인들의 화학적 가교화를 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필)카보디이미드 [1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide; EDC]와 N-하이드록시숙신이미드[N-hydroxysuccinimide; NHS]를 사용하여 수행하였다[L.H.H. Olde Damink, P.J. Dijkstra, M.J.A.l van Luyn, P.B. van Wachem, P. Nieeuwenhuis and J. Feijen, Cross-linking of dermal sheep collagen using a water-soluble carbodiimide, Biomaterials 1996; 17: 765-773]. 가교화되지 않은 멤브레인들을 실온에서 100 mM EDC - 100 mM NHS가 95% 에탄올 용매에 용해된 용액에 24 시간 동안 담갔다. EDC와 NHS의 용매로서, 에탄올은 그 공정 동안에 멤브레인의 용해 또는 손실을 방지하였다[M. Chang and J. Tanaka, FT-IR study for hydroxyapatite/collagen nanocomposite cross-linked by glutaraldehyde, Biomaterials 2002; 23: 4811-4818 ]. 가교화된 멤브레인들을 조심스럽게 회수하고 5 분 동안 5 차례 충분한 증류수로 세척하여 잔여 EDC와 NHS를 제거하였다. 세척 후, 멤브레인들을 다시 진공 하에서 -60℃에서 동결건조하였다.
2. 가교화된 콜라겐/하이드록시아파타이트 복합체 멤브레인의 물성확인
(1) 화학적 조성 및 미세구조의 확인
열비중계 분석(thermogravimetric analysis; TGA)를 수행하여 복합체 상의 하이드록시아파타이트의 양을 결정하였다. 각 멤브레인 20 mg을 열비중계 분석기(TGA-1000, Rheometric Scientific, UK)를 사용하여 시험하였고 공기에 의한 가열속도를 분당 10℃로 하여 30℃에서 900℃까지 측정값들을 기록하였다. 그 잔여물들 은 무기성분들, 주로 하이드록시아파타이트로 인식되었다. 복합체의 상을 1°/분의 속도로 25-35°(2θ) 내의 CuKα 방사에 의한 X-선 회절(XRD, M18XHF-SRA, MAC Science, Yokohama, Japan) 패턴에 의하여 분석하였다. 복합체의 화학적 분석을 푸리에르 변환 적외선 (FT-IR) 분광기 (Nicolet Magma 550 series II, Midac, USA)에 의하여 평균 64 스캔을 하는 1 cm-1 해상도로 4000에서 400 cm-1의 범위에 걸쳐서 수행하였다. 그 분석들로부터 멤브레인의 가교화를 확인하였다[M. Chang and J. Tanaka, FT-IR study for hydroxyapatite/collagen nanocomposite cross-linked by glutaraldehyde, Biomaterials 2002; 23: 4811-4818 ]. 복합체들의 미세구조 및 나노-구조를 필드-에미션 주사 전자현미경(FE-SEM, JSM-6330F, JEOL, Tokyo, Japan) 그리고 투과전자현미경 (TEM, CM-20, Philips Electron Optics, Netherlands)에 의하여 관찰하였다.
(2) 기계적 물성
각 형태의 시편들의 밀도를 측정하여 이론적 밀도와 비교하였다. 200에서 1000 ㎛의 넓은 두께 범위를 가지는 멤브레인들을 5 x 5 mm의 치수를 가지는 정사각형으로 잘라서 무게를 측정하였다. 인장강도와 탄성계수를 유니버설 테스팅 장비(Model 5565, Instron Corp., Danvers, MA)를 사용하여 평가하였다. 멤브레인들을 습기 조건 하에서 가열가압하여 500 ㎛의 균일한 두께를 가지도록 하고 진공하에서 -60℃에서 동결건조하였다. 건조된 시편들의 정확한 두께를 공촛점 레이저 주사 현 미경(CLSM, OLS1200, Olympus)을 사용하여 측정하였다. 그런 다음에 멤브레인들을 25 mm의 길이와 5 mm의 안쪽 너비를 가지는 아령 모양으로 절단하였다. 인장력은 1 mm/분의 인장속도로 적용되었다. 6개 보다 많은 시편들을 각 조건에 대하여 시험하였다.
(3) 부풀기(swelling) 정도
멤브레인들의 부풀기 정도는 담그기 전과 후의 부피 변화에 의하여 시험하였다. 가교된 순수 콜라겐 멤브레인과 콜라겐/HA 멤브레인의 부피를 측정한 다음에 각각 별도로 실온에서 24시간 동안에 증류수에 담갔다. 물에서 제거한 후에, 멤브레인들을 그것으로부터 떨어지는 물이 관찰되지 않을 때까지 1 분 동안 습한 조직 상에 놓았다. 부풀은 멤브레인들의 부피를 측정하고 부피변화의 정도를 다음 공식에 의하여 계산하였다. 부피변화(%) = [(Vs -Vd)/Vd] x 100; 여기에서 Vd는 건조 멤브레인의 부피이고, Vs는 부풀은 멤브레인의 부피이다.
(4) 시험관내 세포 검사
MC3T3-E1 골아세포들(presteoblasts) (ATCC, CRL-2593)를 37℃에서 5% CO2의 습한 분위기에서 10% 가열-불활성화된 치명적 소 혈청(FBS; GIBCO, USA)과 1% 항생제/항진균독(antimycotic) (GIBCO, USA)으로 보충된 α-변형된 최소 필수배지(α-MEM; Join Bio Innovation (JBI), Korea)로 구성된 정규 배양배지에서 배양하였다. 실험 전에, MC3T3 세포들은 트립신으로 처리되어 1 x 106 세포들/cm2의 밀도로 표본들 상에 놓여져서 골생성 배지(위에서 언급한 정규 배양배지에 10 mM β-글리세롤 포스페이트와 50 ㎍/ml L-아스코빅 산(Sigma, USA)을 더한 것)로 배양되었다. 그런 후 1일째 및 3일째에 그것들을 수확하여 세포 조직형태를 조사하였다. 세포 조직형태는 글루타르알데히드(2.5%)로 고정, 등급화된 에탄올들(75, 90, 95 그리고 100%)로 탈수, 임계점 건조 및 금 코팅 후에 SEM으로 관찰하였다.
(5) 시험관내 콜라게나제 분해
가교화된 순수한 콜라겐 멤브레인과 복합체 멤브레인들의 생물학적 안정성을 시험관내 콜라게나제 생분해 시험에 의하여 평가하였다[L. Ma, C. Gao, Z. Mao, J. Zhou and J. Shen, Enhanced biological stability of collagen porous scaffolds by using amino acids as novel cross-linking bridges, Biomaterials 2004; 25: 2997-3004]. 각 종류의 멤브레인들을 24 시간 동안 37℃에서 주어진 농도들의 타입 I 콜라게나제(273U/mg, Sigma)를 포함하는 인산염 완충 식염용액 (PBS, pH 7.4)에서 배양하였다. 분해는 시험물을 얼음조에 넣음에 의하여 즉각적으로 중지되었다. 10분 동안 1500 rpm으로 원심분리한 다음에, 맑은 상등액을 24 시간 동안 110℃에서 6M HCl로 가수분해시켰다. 멤브레인들에 있는 콜라겐 분자들로부터 방출된 하이드록시프롤린의 양을 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다[W. D. Coasts, Jr, D. T. Cheung, B. Han, J. W Currier and D. P. Faxon, Ballon angioplsty significantly increases collagen content but does not alter collagen subtype I/III ratios in the atherosclerotic rabbit lliac model, J Mol Cell Cardiol 1996; 28: 441-446]. 생분해 정도는 동일한 조성과 중량을 가지는 완전히 분해된 것에 대한 멤브레인들로부터 방출된 하이드록시프롤린의 백분율로서 정의된다. 또한 용액에서 분해되는 콜라겐의 양을 측정하여 분해과정에서의 하이드록시아파타이트의 효과를 판정하였다.
(6) 통계적 분석
데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로서 표현된다. 통계적 분석을 두-집단 학생의 t-시험(two-population Student's t-test)를 사용하여 수행하였다. 임계적 수준은 p<0.05로 설정되었다.
3. 결과 및 논의
(1) 멤브레인들의 조성 확인
도 2는 본 발명의 실시예들에 의하여 제조된 콜라겐/하이드록시아파타이트 복합체 멤브레인들의 화학적 조성을 분석한 그래프로서, (A)는 열비중계 분석 그래프이고, (B)는 FT-IR 분광계의 그래프이다. 각 그래프에서, (a)는 가교화한 순수한 콜라겐 멤브레인, (b)는 가교화한 20 중량%(명목상 성분비)의 하이드록시아파타이트가 코팅된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인, 그리고 (c)는 가교화한 40 중량%(명목상 성분비)의 하이드록시아파타이트가 코팅된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인에 대한 것이다.
콜라겐/하이드록시아파타이트 (Col/HA) 멤브레인들의 HA 양을 도 2에서 보는 바와 같은 TGA 분석들에 의하여 확인하였다. 복합체 멤브레인을 제조하기 위한 공침전 반응에서 반응물들은 생성물 Col/HA 복합체 멤브레인의 조성비가 명목상 80/20 및 60/40 (중량비)로 되도록 사용하였으나 실제로는 82/18 및 65/35가 되었음을 확인하였다. 명목상 조성과 실제 조성 간의 이러한 차이는 하이드록시아파타이트의 생성/침전 반응의 불완전성에 기인하는 것이다. 콜라겐 분해 거동의 관점에서, 순수한 콜라겐과 Col/HA 복합체의 TG 곡선들 간에는 별 차이는 없었다: 5~10%의 첫번째 중량 손실은 시편들 중의 물로 50~100℃에서 일어났고, 두번째 중량 손실은 240~250℃에서 일어났다.
TGA의 결과로부터 계산한 최종 복합체 멤브레인의 조성으로부터 HA의 생성/침전 반응의 수율을 계산할 수 있었다. Col/HA의 명목상 조성비가 80/20인 복합체 멤브레인의 실제 조성비는 상당한 편차를 보였는데, 이것은 콜라겐 섬유의 자기조립에 의한 응집으로부터 야기되었을 것으로 추정되었다. 이 조성의 복합체 멤브레인에서 콜라겐의 나노섬유를 SEM에 의하여 찾기는 어려웠다. 따라서, 본 발명에 있어서, Col/HA의 조성은 80/20 이하인 것이 바람직할 것이다.
도 2(B)에서 보는 바와 같이, 콜라겐에 대한 전형적인 IR 밴드들이 관찰되었다. 그러한 밴드들은 다음과 같다. 3310 cm-1에서의 N-H 스트레칭(아미드 A 밴드), 3063 cm-1에서 C-H 스트레칭(아미드 B 밴드), 1600-1700 cm-1에서의 C=O 스트레칭(아 미드 I 밴드), 1500-1550 cm-1에서의 N-H 변형(아미드 II 밴드), 1200-1300 cm-1에서의 N-H 변형(아미드 III 밴드). C-H 스트레칭으로부터 발생하는 아미드 B 밴드의 특별한 특징은 가교화에 의하여 상당히 영향을 받는다는 것이 보고되었다. 이러한 사실로부터 본 발명의 복합체 멤브레인들은 가교화되어 있음을 확인할 수 있었다. HA와 관련된 밴드들은 OH 스트레칭 (3569 cm-1)과 인산염 밴드들을 포함한다. 도 2(B)는 또한 인산염 밴드들, 즉, 비대칭 HA에 대한 PO43 - ν3 모드(1030~1033 cm-1 및 1097~1110 cm-1) 그리고 PO43 -ν4 모드들(601~607 및 563~569 cm-1 사이)을 보여준다. 이러한 밴드들의 강도는 복합체 멤브레인들의 HA 양에 비례하였다. 이러한 사실로부터 본 발명의 실시예들에 따른 복합체 멤브레인들은 콜라겐에 HA가 복합되어 있음을 알 수 있었다.
(2) 복합체 멤브레인들의 조직형태
도 3은 본 발명의 실시예들에 의하여 제조된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인들의 조직형태를 보여주는 현미경 이미지들로서, (A)는 가교화된 순수한 콜라겐 멤브레인의 표면의 SEM 이미지이고, 가교화된 40중량%(명목상 성분비)의 하이드록시아파타이트가 코팅된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인의 SEM 이미지로서, (B)는 표면, (C)는 단면, 그리고 (D)는 노출된 미세섬유들에 대한 것이고, 그리고 (E)는 TEM 이미지 및 SAD 패턴을 보여준다.
도 3의 (A)와 (B)에서 보는 바와 같이, 순수한 콜라겐 멤브레인과 60/40 콜라겐/하이드록시아파타이트 복합체 멤브레인의 표면은 거의 유사하지만, 복합체 멤브레인의 표면이 조금 더 거칠고 작은 구멍들을 가지고 있다. 한편, 80/20 콜라겐/하이드록시아파타이트 복합체 멤브레인의 표면에는 작은 양의 HA 나노결정들이 형성되어 있지만(도면에 나타내지 않음), 60/40 콜라겐/하이드록시아파타이트 복합체 멤브레인의 표면을 HA 나노결정들이 거의 덮고 있다. 도 3(C)에서 보는 바와 같이, 복합체 멤브레인의 단면은 층상구조로서 중간에 다공성의 층들을 가지고 있다. 이러한 구조는 하이드록시아파타이트의 양에 무관하게 나타나고 있으며, 이러한 단면은 여과방법에 의하여 제조된 복합체 멤브레인에서 공통적으로 나타난다. 도 3(D)는 2000배로 확대한 복합체 멤브레인의 한 부분의 모습을 보여주고 있는데, 콜라겐 섬유들이 부분적으로 돌출되어 있고 그 표면을 하이드록시아파타이트가 덮고 있다. 도 3(E)에서, 하이드록시아파타이트가 침상으로 수백 나노크기를 가지고 분포하고 있으며, SAD 이미지를 통하여 하이드록시아파타이트가 002 방향으로 배열되어 있음을 알 수 있다. 하이드록시아파타이트의 c축이 콜라겐 섬유들의 방향과 일치하고 있음을 확인하였다.
본 발명의 실시예들에 따른 복합체 멤브레인들은 약간의 구멍을 가지지만 전체적으로 치밀한 표면과 다공성 층들을 포함하는 다공성 단면구조를 가지고 있는데, 이러한 이중적 구조는 치밀한 표면층에 의하여 결합섬유가 손상부위로 침입하는 것을 방지하고 다공성 단면구조에 의하여 골아세포의 분화가 유도되고 멤브레인의 공극들이 멤브레인과 결합되는 뼈로 채워지게 해준다.
(3) 기계적 물성
도 4는 본 발명의 실시예들에 의하여 제조된 가교화된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인들에 관하여 두께에 대하여 밀도 분포를 보여주는 그래프이다. 여기에서 모든 샘플들은 동일한 수단과 방식으로 여과함으로써 동일한 면적을 가지는 것들이다. 도 5는 본 발명의 실시예들에 의하여 제조된 가교화된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인들의 기계적 물성들을 나타낸 그래프로서, (A)는 응력-변형 곡선을, 그리고 (B)는 인장강도와 탄성계수를 보여준다(n>6, *p<0.01).
도 4에서 실선 및 점선은 이론적 밀도들을 나타내는데, 이론적 밀도들은 콜라겐의 양이 모든 멤브레인들에서 동일하다고 가정하여 산출하였고, HA 양들은 TGA의 결과로부터 얻었다. 도 4로부터 멤브레인들은 두께가 얇을수록 치밀해진다. 이것은 여과방식에 의하여 동일한 면적을 가지도록 멤브레인들을 형성하였기 때문에 나타나는 당연한 결과이다. 반응물 및 침전물의 양은 미리 결정된다. 이로부터 본 발명의 멤브레인들은 여과과정 및 후속 압축과정에 의하여 그 두께를 조절함으로써 적합한 밀도를 가질 수 있다. 실제 밀도와 이론적 밀도의 차이에 의하여 HA의 생성 및 침전 반응의 수율을 알 수 있다. 밀도는 멤브레인의 기공 함유율과 물성에 큰 영향을 주기 때문에, 두께를 조절함으로써 용도에 적합한 멤브레인들을 만들 수 있게 된다.
도 5의 결과들은 다공성을 갖는다고 여겨지는 500~600㎛ 두께 범위의 멤브레인들을 아령 모양의 시편으로 만들어 수행한 시험의 결과들이다. 도 5에서 보는 바 와 같이, 하이드록시아파타이트의 양이 많아질수록 멤브레인은 취성이 강해지고 인장강도도 커진다. 탄성계수 역시 하이드록시아파타이트가 많을수록 증가한다. GBR 멤브레인으로 사용하기 위해서는 멤브레인의 탄성계수가 적당히 커야 함몰되는 정도가 작다. 그런 점에서 하이드록시아파타이트의 복합화는 긍정적인 영향을 미칠 것이다. 도 5는 순수한 콜라겐 멤브레인에 비하여 본 발명의 복합체 멤브레인들이 기계적 물성 측면에서 월등히 우수한 특성을 가짐을 보여준다.
(4) 형태 안정성
도 6은 본 발명의 실시예들에 의하여 제조된 가교화된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인들의 형상 안정성을 보여주는 것들로서, 본 발명에 따른 멤브레인들을 물속에 24시간 동안 담근 후 (A)는 물속에서의 부풀기 정도를 보여주는 사진이고, (B)는 부피의 변화를 보여주는 그래프이다(*p<0.05).
인체 내의 주요한 환경은 물로 구성되기 때문에 물 속에서의 복합체 멤브레인의 거동 역시 중요한 요소이다. 그 일례가 부피의 변화인데, 자연산 고분자들은 보통 물 속에서 부풀어오르기 때문에 부피변화가 크다고 보고되어 왔다. 그러나 GTR을 위한 멤브레인으로 사용하기 위해서는 부피변화가 작을수록 좋다. 부피변화가 크면 형태가 파괴되기 쉽기 때문이다. 이런 측면에서 하이드록시아파타이트는 복합체 멤브레인의 형태 안정성에 긍정적인 영향을 준다. 도 6에서 보는 바와 같이, 하이드록시아파타이트가 많이 함유될수록 부피변화가 적다는 것을 알 수 있다. 순수한 콜라겐 멤브레인의 경우 부피변화가 2배 이상이 되지만, 60/40 콜라겐/하이 드록시아파타이트 복합체 멤브레인의 경우 그 부피변화의 정도가 순수한 콜라겐 멤브레인의 경우에 비하여 상당히 완화됨을 알 수 있다.
콜라겐 멤브레인들의 부풀기 특성은 가교화 정도에 의하여 영향을 받는다. 그러나 도 6은 가교화 정도가 동일하다고 인정할 수 있는 멤브레인들의 결과를 보여주는 바, 이로부터 그 부풀기 특성은 가교화 정도 이외에도 다른 요인에 의하여 영향을 받는다고 생각할 수 있다. 일반적으로 인장강도 및 뻣뻣한 정도(Stiffness)와 같은 기계적 특성은 멤브레인의 공간 유지 능력(space-maintaining capacity) 또는 형태 안정성(form stability)에 영향을 미친다. 80중량%의 HA를 가지는 콜라겐/하이드록시아파타이트 복합체는 콜라겐의 강화력 때문에 치밀한 순수 HA에 비하여 압축강도가 향상되었다고 한다. 한편, 본 발명의 복합체 멤브레인은 순수한 콜라겐 멤브레인에 비하여 기계적 물성들이 향상되었는데, 이로부터 콜라겐 섬유 상에 결합되는 HA 나노결정들은 콜라겐 멤브레인을 강화시킨다고 추정할 수 있다. 그러나 경우에 따라 복합된 무기물 입자들은 멤브레인의 결함 부위에서 균열의 원인이 되어 인장강도를 떨어뜨리고 탄성계수를 증가시킬 수 있다. 따라서, 기계적 물성과 형태 안정성의 일반적 관계를 구체적인 경우에 대하여 적용하기는 어렵다. 반면에, 본 발명은 복합체 멤브레인의 기계적 물성 및 형태 안정성을 동시에 달성하고 있다고 할 수 있다.
(5) 생물학적 안정성 (생분해성)
도 7은 본 발명의 실시예들에 의하여 제조된 가교화된 콜라겐/수산화아파타 이트 복합체 멤브레인들의 생분해 안정성을 보여주는 것들로서, (A)는 본 발명에 따른 멤브레인들을 콜라게나제 150U/ml의 용액으로 24시간 동안 처리한 후의 상태를 보여주는 사진들이고, (B)는 콜라겐 생분해 정도를 보여주는 그래프이다. (B)에서 모든 멤브레인들은 EDC/NHS에 의하여 가교되되었고 37℃에서 24시간 동안 150U/ml 콜라게나제에서 배양되었다. 값들은 평균 ± 표준편차 (*p<0.05, **p<0.01) 이다.
인체 내에서는 콜라게나제(콜라겐 분해효소)에 의하여 콜라겐의 분해가 일어난다. 빠른 콜라겐 분해를 방지하기 위하여 콜라겐의 가교반응을 통하여 콜라겐의 생물학적 안정성을 증가시키기 위한 노력들이 이루어져 왔다. 생체흡수성 멤브레인들이 GTR 또는 GBR 과정에 사용되기 위해서는 이러한 분해속도가 중요한 요소가 된다. 이러한 분해속도는 손상을 입은 뼈의 재생을 위한 치료기간을 고려하여 조절되어야 하는데, 많은 생체흡수성 멤브레인들 및 몇몇 상업적 콜라겐 멤브레인들은 너무 빠른 분해속도 또는 염증반응으로 인하여 골생성에 실패하였다.
본 발명의 실시예에서는 가교화 및 콜라겐을 하이드록시아파타이트로 복합화시킴으로써 콜라게나제 저항성을 향상시켰다. 본 실시예에서 사용된 멤브레인들은 모두 같은 정도의 가교반응을 거쳤다. 도 7에서 보는 바와 같이, 순수한 콜라겐 멤브레인은 24시간 동안의 콜라게나제에 의한 분해반응 후에 모두 분해되었다. 20 중량%의 하이드록시아파타이트를 함유하는 콜라겐/하이드록시아파타이트 복합체 멤브레인은 형태를 유지하지 못하고 일부만이 침전 상태로 존재하였다. 반면에 40 중량%의 하이드록시아파타이트를 함유하는 콜라겐/하이드록시아파타이트 복합체 멤브레 인은 멤브레인의 형태를 유지하였는데, 대략 50% 정도의 콜라겐이 분해되지 않고 남아 있었다.
한편, 도 8은 콜라게나제에 의한 콜라겐의 분해 메카니즘을 보여주는 개략적 다이아그램이다. 콜라게나제는 분해과정 동안에 콜라겐 섬유와 강하게 결합하여 상호작용을 하는데, 이론적으로 콜라겐 섬유에 있는 콜라겐 분자들 중 대략 10% 정도가 효소와의 결합을 위하여 노출되어 있다. 그러나, 본 실시예의 복합체 멤브레인에서는 콜라겐 섬유 상의 하이드록시아파타이트가 효소가 콜라겐과 결합하는 것을 방해하기 때문에 콜라게나제에 대한 생분해 저항성을 향상시킨다. 이러한 생분해 저항성은 콜라겐 섬유 상에 균일한 침적에 의하여 더욱 높게 달성될 수 있다.
(6) 생체적합성 (세포활성)
도 9는 본 발명의 실시예들에 의하여 제조된 가교화된 콜라겐/수산화아파타이트 복합체 멤브레인들의 세포특성들을 보여주는 것들로서, MT3T3 골아세포를 멤브레인들 상에 배양한지 3일 후 (A)는 세포성장특성들을 보여주는 그래프이고, (B)는 SEM 이미지들을 보여주는 사진이다. (B)에서 (a)와 (b)는 순수 콜라겐 멤브레인에 대한 것들이고, (c)와 (d)는 80 중량%(명목상 성분비)를 가지는 멤브레인에 대한 것들이다. 세포량은 별로 다르지 않았다. 과립들이 복합체 멤브레인 상에 그리고 복합체 멤브레인 상의 세포 주위에 형성되었다.
도 9에서 보는 바와 같이, 멤브레인 위에 뿌린 골아세포들은 잘 성장하였다. 순수한 콜라겐 멤브레인과 복합체 멤브레인 모두에서 골아세포들은 잘 성장하였기 때문에 어느 쪽이 세포특성이 더 좋다고 말하기는 어려웠다. 그러나 3일째의 복합체 멤브레인에서, 순수한 콜라겐 멤브레인에서는 관찰되지 않는 무기질 과립들이 관찰되었다. 최근의 보고[S. Bar, G. Torun Kose, V. Hasirci Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study, Biomaterials 2005; 26: 1977-1986; K. Fujihara, M. Kotaki and S. Ramakrishna, Guided bone regeneration membrane made of polycaprolactone/calcium carbonate composite nano-fibers, Biomaterials 2005: 26; 4139-4147]에 의하면, 콜라겐 복합체에서의 인산칼슘은 원래의(native) 콜라겐과 비교하여 ALP 활성의 상당한 증가를 보이는 것으로 볼 때, 골아세포의 성장을 방해하지만 뼈 세포의 분화를 유도한다고 한다. 또한 폴리카프로락톤과 탄산칼슘의 복합 멤브레인에서 세포성장 1일 후에 무기질화의 표시로서 인식될 수 있는 진주층(nacre)이 Ca-풍부한 고분자 멤브레인의 세포 표면에서 관찰되었다. 이러한 무기질화는 세포의 분화와 관련이 있는 것으로 여겨졌다.
이러한 측면에서 보면, 본 발명의 실시예에 따른 복합체 멤브레인의 표면에 생성된 무기질 과립은 본 발명의 복합체 멤브레인이 골아세포의 분화에 유리하게 작용하고 뼈 손상을 성공적으로 회복시킬 것임을 기대할 수 있게 해준다.
본 발명에 따라 제조되는 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인은 기계적 물성, 생체적합성 및 적합한 생분해성을 갖추고 있어 GTR 및 GBR 과정에서 손상부위에 외부로부터 결합섬유가 침입하는 것을 방지하는 방어막 역할을 충분히 할 수 있 을 뿐만 아니라 손상부위에서 골아세포의 분화를 도울 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 복합체 멤브레인은 GTR 및 GBR을 위하여 사용될 수 있다.

Claims (14)

  1. Ca(OH)2 수용액을 준비하는 단계,
    용해성 인산염(phosphate) 이온을 함유하는 수용액(인산염 용액)에 콜라겐을 용해한 인산염/콜라겐 수용액을 준비하는 단계,
    pH가 7 이상으로 설정된 완충용액을 준비하는 단계,
    상기 Ca(OH)2 수용액과 상기 인산염/콜라겐 수용액을 상기 완충용액에 첨가하고 교반하여 상기 Ca(OH)2 수용액과 상기 인산염 수용액으로부터 형성되는 아파타이트와 콜라겐이 복합화된 콜라겐/아파타이트 복합체 침전물을 형성하는 단계, 및
    상기 콜라겐/아파타이트 복합체 침전물을 세척 및 여과지 상에서 여과한 후 동결건조하여 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인을 형성하는 단계를 포함하며,
    상기에서, 상기 콜라겐/아파타이트 복합체 침전 형성 반응이 완전히 진행되고 손실이 없는 상태의 명목상 콜라겐과 아파파이트의 조성비가 중량비로 8:2 ~ 6:4의 범위가 되도록 상기 Ca(OH)2 수용액 및 상기 인산염/콜라겐 수용액을 준비하는 것을 특징으로 하는 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의 콜라겐을 가교화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 콜라겐의 가교화는 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필)카보디이미드 [1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide; EDC]와 N-하이드록시숙신이미드 [N-hydroxysuccinimide; NHS]가 알콜에 용해된 EDC-NHS 용액에 상기 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인을 담금으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 EDC-NHS 용액의 용매로 사용되는 알콜은 에탄올인 것을 특징으로 하는 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의 제조방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 가교화 후에 가교화된 멤브레인을 회수하고 순수한 물로 세척한 후 동결건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    습기가 있는 분위기에서 상기 멤브레인의 표면에 압력을 고르게 가한 상태에서 건조시킴으로써 멤브레인의 두께를 조절하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의 제조방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 인산염/콜라겐 용액은 H3PO4 수용액에 콜라겐을 용해시킨 것임을 특징으로 하는 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 콜라겐/아파타이트 복합체 침전물의 형성단계는 pH가 7 이상으로 유지된 상태에서 수행되는 것임을 특징으로 하는 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 완충용액은 pH 9로 설정된 트리스-HCl 완충용액이고, 상기 콜라겐/아파 타이트 복합체 침전물의 형성단계는 pH가 9로 유지된 상태에서 수행되는 것임을 특징으로 하는 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 콜라겐/아파타이트 복합체 침전물의 세척 및 여과는 고체-액체 분리수단에 의한 침전물의 분리, 세척 및 여과지 상에서의 여과에 의하여 수행되거나 또는 여과지 상에서의 여과 및 여과지 상에서의 세척에 의하여 수행되는 것임을 특징으로 하는 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의 제조방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 콜라겐/아파타이트 복합체 중의 아파타이트는 수산화아파타이트 인 것을 특징으로 하는 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의 제조방법.
  14. 삭제
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