이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 연골 재생을 위한 다공성 연골-골 복합 지지체 및 이의 제조 방법 에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체적합성의 고분자로 형성된 연골 재생층과 생체 활성 세라믹으로 형성된 골 재생층을 포함하여 이루어지는 다층 구조의 다공성 연골-골 복합 지지체 및 이의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 복합지지체의 제조 방법의 경우 상기 연골 재생층과 골 재생층을 동결 건조 방법을 이용하여 연결하는 것을 특징으로 한다.
(1) 다공성 연골
재생층
본 발명의 연골 재생층은 생체적합성의 고분자로 형성되어 있으며, 상기 고분자로는 천연 고분자 또는 합성 고분자를 사용할 수 있다.
상기 천연 고분자로는 히알루론산, 콜라겐, 알지네이트, 겔라틴, 셀룰로오스 메틸 셀룰로오스, 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 천연 고분자인 히알루론산과 콜라겐으로 구성되어지는 천연 고분자를 사용할 수 있다.
상기 합성 고분자로는 폴리락타이드, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리 다이옥사논 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 폴리락타이드, 폴리카프로락톤을 사용할 수 있다.
상기 천연 고분자 중에서 히알루론산을 사용하는 경우에는 중량 평균 분자량이 100,000 ~ 5,000,000 정도가 바람직하나, 분자량에 상관없이 사용할 수 있다. 히알루론산은 생체적합성 고분자 혼합 용액, 예를 들어 히알루론산/콜라겐 혼합된 용액의 70 ~ 95중량%로 포함되는 것이 바람직하며, 만일 70% 미만이면 제조된 지지체의 물리적 강도가 약해지며, 95%를 초과하면 혼합용액을 다루기에 부적합하다.
상기 히알루론산은 천연 고분자로서 연골의 구성성분의 하나로 생체 적합성을 갖으며, 조직 생성 시 세포의 이동에 유리하고, 생체 내 효소에 의해 완전 분해된다.
또한, 상기 천연 고분자 중에서 콜라겐을 사용하는 경우에는 아텔로 콜라겐으로서 고분자인 아텔로 콜라겐으로는 중량 평균 분자량이 1,000 ~ 20,000 정도인 것을 사용하는 것이 바람직하나, 분자량에 상관없이 사용할 수 있다. 상기 아텔로 콜라겐은 생체적합성 고분자 혼합 용액, 예를 들어 히알루론산/콜라겐 혼합된 용액의 5 ~ 30중량%로 포함되는 것이 바람직하며, 만일 그 함량이 5중량% 미만이면 지지체의 물리적 강도가 약해지며, 30중량%를 초과하면 혼합 용액을 다루기 어렵다.
또한, 상기 아텔로 콜라겐은 콜라겐의 면역 반응을 일으키는 텔로 부분을 제거하여 체내 면역반응을 일으키는 요소를 제거하였으며, 조직 생성시 세포의 부착에 유리하고, 지지체 제조 시 물리적 골격을 유지하게 된다.
이하, 본 발명에 따른 연골 재생층의 제조방법을 설명한다.
일 예로서, 콜라겐/히알루론산 혼합용액의 제조방법을 설명한다. 우선 증류수에 염산, 황산 등의 산을 첨가하여 pH 3.0 ~ 4.0으로 하고, 여기에 콜라겐을 증류수,콜라겐,히알루론산,및 가교제가 혼합된 용액 (이하, '최종 용액'이라 함)에 대하여 0.1 ~ 1.0중량%, 더 바람직하게는 0.5중량%가 되도록 첨가하여 콜라겐 용액을 제조한다. 각각의 용액을 따로 제조하여 혼합하는 번거로움을 피하기 위하여, 상기 용액에 직접 히알루론산을 최종 용액에 대하여 1 ~ 2중량%가 되도록 혼합하고, 균질기를 이용하여 히알루론산/콜라겐 혼합용액을 제조한 후, 상기 혼합용액에 가교제를 최종 용액에 대하여 0.1 ~ 1중량%가 되도록 혼합하고 일정한 형태의 몰드에 혼합용액을 주입한다.
상기 용액이 담긴 몰드를 25 내지 40℃에서 10분 ~ 1시간 동안 예비 가교한 후, 상기 가교된 용액을 플라스틱재질의 몰드에 부어 -30℃ 내지 -40℃에서 동결 건조기에서 동결 건조한다.
상기 가교시키는 온도가 25℃ 미만이면 가교 반응이 진행되는 속도가 느리며, 40℃를 초과하게 되면 가교가 약하여 지지체가 쉽게 물에 풀어지게 된다.
또한, 상기 동결 건조 온도가 -30℃ 미만이면 지지체의 다공형성 및 지지체 표면이 갈라지게 되며, -40℃를 초과하게 되면 가교가 약하여 지지체가 쉽게 물에 풀어지게 된다.
상기 가교제는 히알루론산과 콜라겐의 관능기를 가교시키기 위하여 사용되는데, 구체적으로는 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether:EGDGE), 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether:BDDE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 및 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
상기 가교제의 양이 0.1중량% 미만일 경우 가교가 약하여 지지체가 쉽게 물에 풀어지게 되며, 1중량%를 초과하는 경우에는 가교제의 양이 과포화되어 더 이상 가교가 진행되지 않아 미반응 가교제가 많으며, 비용면에서도 비경제적이다.
이렇게 얻어진 본 발명의 연골 재생층(다공성 지지체)의 공극의 크기는 50 ~ 300μm, 더 바람직하게는 100 ~ 200μm가 바람직하다.
(2) 다공성 골
재생층
본 발명의 골 재생층은 골 전도성이 있다고 알려진 생체 활성 세라믹으로 형성된 골 재생층으로서, 상기 골 재생층은 핸들링하기에 적합한 기계적 강도를 가진다.
이하, 본 발명의 골 재생층 및 이의 제조방법을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 골 재생층을 제조하기 위하여, 우레탄 발포법을 이용하여 다 공성의 세라믹 지지체를 제조하였다.
ⅰ)(A)이소시아네이트, 세라믹 혼합분말 및 분산제를 첨가하여 혼합한 이소시아네이트 혼합용액과 (B)폴리올, 세라믹 혼합분말, 가교제, 분산제 등을 첨가하여 혼합한 폴리올 혼합용액을 제조하는 단계, ⅱ) 상기 (A)용액과 (B)용액을 몰드에 주입한 후에 발포시키는 단계, ⅲ) 상기 발포 단계를 거친 후, 우레탄 유기물을 제거한 다음 남은 무기물을 결정화시키는 단계, 및 ⅳ) 상기 결정화 단계를 거친 후, 고온에서 소결하는 단계를 포함하는 제조방법을 사용할 수 있다.
좀 더 구체적으로 살펴보면, 본 발명은 우레탄 발포법을 응용한 골 대체용 지지체를 제조하는 방법으로써, 우레탄 발포액인 (A)이소시아네이트 혼합용액과 (B)폴리올 혼합용액 각각에 어트리션 밀(attrition mill)을 이용하여 분쇄된 세라믹을 단독 혹은 혼합하여 첨가시킨다. 이때, 반응액(혼합 용액)에 첨가하는 세라믹을 포함한 무기물 또는 금속분말의 함유량이 적은 경우 차후 우레탄 폼 소결시 큰 수축율로 인하여 파손이나 생산성의 문제가 야기되며, 너무 많은 경우 반응액의 높은 점도로 인하여 균일한 분산이 어렵고, 높은 발열과 불안정한 반응성으로 요구하는 우레탄 발포체를 얻기 어렵다. 분말을 포함한 혼합용액 (A)용액과 (B)용액의 반응성과 분산성을 위하여 분산제를 첨가시킨다.
상기 (A)이소시아네이트 혼합용액의 구성은 이소시아네이트계 화합물 40 ~ 70 중량%, 세라믹 혼합분말 20 ~ 40 중량% 및 분산제 10 ~ 20 중량%인 것이 바람직하다.
상기 이소시아네이트계 화합물로는 이소포론디이소시아네이트, 2,4-톨루엔디이소시아네이트 및 그 이성질체, 디메틸메탄디이소시아네이트, 헥사메틸렌디이소시아네이트, 라이신디이소시아네이트, 트리메틸헥사메틸렌디이소시아네이트, 2,2-bis-4‘-프로판이소시아네이트, 6-이소프로필-1,3-페닐디이소시아네이트, bis(2-이소시아네이트에틸)-퓨마레이트, 3,3’-디메틸-4,4‘-디페닐메탄디이소시아네이트, 1,6-헥산디이소시아네이트, 4,4’-바이페닐렌디이소시아네이트, 3,3‘-디메틸페닐렌디이소시아네이트, p-페닐렌디이소시아네이트, m-페닐렌디이소시아네이트, 1,5-나프탈렌디이소시아네이트, 1,4-자일렌디이소시아네이트, 1,3-자일렌디이소시아네이트, 중합(polymeric) 디페닐메탄디이소시아네이트 등을 단독 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 이소시아네이트계 화합물의 함량은 40 ~ 70 중량%, 더 바람직하게는 50 ~ 60 중량%일 수 있다. 상기 이소시아네이트계 화합물의 함량이 너무 많으면 지지체의 구성이 어렵고, 너무 적게 되면 발포가 어렵게 되어 좋지 않다.
상기 세라믹 혼합분말로는 세라믹을 포함한 무기물 α-, β-삼인산칼슘(β-TCP, β-tri-calcium phosphate), 합성/천연 수산화아파타이트(HA), 칼슘메타포스페이트(CMP, Calcium metaphosphate), 금속(알루미나) 분말 등 중에서 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 세라믹 혼합분말의 함량은 20 ~ 40 중량%, 더 바람직하게는 25 ~ 35 중량%일 수 있다. 상기 세라믹 혼합분말의 함량이 너무 많으면 발포가 어렵고, 너무 적으면 지지체의 물리적인 강도가 낮아지게 된다.
상기 분산제로는 에탄올, 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드, 테트라히드로퓨란 등 중에서 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 상기 분산제는 분산 상태의 균일성을 부여하기 위하여 사용된다.
상기 분산제의 함량은 10 ~ 20 중량%, 더 바람직하게는 12 ~ 15 중량%일 수 있다. 상기 분산제의 함량이 너무 많으면 발포가 어렵고, 너무 적으면 세라믹 분말을 혼합하기에 어려움이 있다.
상기 (B) 폴리올 혼합용액은 폴리올 30 ~ 69 중량%, 세라믹 혼합분말 20 ~ 40 중량%, 가교제 10 ~ 20 중량%, 분산제 1 ~ 10 중량%, 발포제 0 ~ 10 중량%, 및 계면활성제 0 ~ 5중량%를 포함하여 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 폴리올로는 에틸렌옥사이드/프로필렌 옥사이드 랜덤 공중합체, 블록 공중합체의 폴리올과 폴리프로필렌계, 폴리에틸렌계, 프로필렌옥사이드계 폴리올 등을 단독 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 폴리올은 (A)용액의 이소시아네이트와 반응한다. 상기 폴리올의 함량은 30 ~ 69중량%, 더 바람직하게는 35 ~ 45 중량%일 수 있다. 상기 폴리올의 함량이 너무 많거나 적으면 지지체의 구성이 어렵게 되는 문제가 있다.
상기 세라믹 혼합분말로는 세라믹을 포함한 무기물 α-, β-삼인산칼슘(β-TCP, β-tri-calcium phosphate), 합성/천연 수산화아파타이트(HA), 칼슘메타포스페이트(CMP, Calcium metaphosphate)나 금속(알루미나) 분말 등 중에서 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 세라믹 혼합 분말의 함량은 20 ~ 40 중량%, 더 바 람직하게는 25 ~ 35 중량%일 수 있다. 상기 세라믹 혼합 분말의 함량이 너무 많으면 발포가 어렵고, 너무 적으면 지지체의 물리적 강도가 약해진다.
상기 가교제로는 글리세롤, 소비톨, 솔보스, 1,3-부탄디올, 1,4-부탄디올, 1,5-펜탄디올, 1,6-헥산디올, 네오펜틸글리콜, 프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜, 트리메탄올에탄, 트리메틸올프로판, 펜타에리트리톨, 트리에탄올아민, NP-300, NP-400, KR-6350 등을 단독 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 가교제의 함량은 10 ~ 20 중량%, 더 바람직하게는 12 ~ 15 중량%일 수 있다. 상기 가교제의 함량이 너무 많으면 발포체를 형성하기 어렵고, 너무 적으면 가교가 진행되지 않아 발포체가 형성되지 않는다.
상기 분산제로는 에탄올, 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드, 테트라히드로퓨란 등 중에서 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 상기 분산제는 분산 상태의 균일성을 부여하기 위하여 사용된다. 상기 분산제의 함량은 1 ~ 10 중량%, 더 바람직하게는 5 ~ 8 중량%일 수 있다. 상기 분산제의 함량이 너무 많으면 발포체를 형성하기 어렵고, 너무 적으면 균질한 분말혼합이 용이하지 않다.
상기 발포제로는 H2O, 에탄올, 클로로플로로메탄(chlorofluoromethane) 등을 사용할 수 있으며, 상기 발포제의 함량은 0 ~ 10 중량%, 더 바람직하게는 2 ~ 5 중량%일 수 있다. 상기 발포제의 함량이 너무 많으면 반응이 빨라 발포체를 형성하기 어렵고, 너무 적으면 발포체의 기공을 조절하기 어렵다.
상기 계면 활성제로는 L-62, L-64, P-84, P-85, P-105, F-68, F-87, F-88, F-108, F-127(Basf 사), twin20, twin80, L-508, L-5305, L-5302, L-3150, DC-5098, DC-5258, DC-5169, DC-5043 등을 단독 혹은 혼합하여 사용할 수 있으며, 상기 계면활성제의 함량은 0 ~ 5중량%인 것이 바람직하다. 상기 계면활성제의 함량이 너무 많거나 적으면 발포체의 기공이 잘 형성되지 않는 문제가 있다.
상기 이외에도 소포제, 정포제 등의 첨가물을 첨가하여 사용할 수 있는데, 본 발명에서 사용되는 상기 소포제, 정포제 등은 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에서는 물리적 강도, 기공률 및 기공크기를 제어하기 위하여, (A)이소시아네이트 혼합용액의 상대 비율을 높여 기공율을 높게 하거나, 또는 (B)폴리올 혼합용액의 상대 비율을 높여 다공체의 기공 사이즈를 크게 할 수 있다. 상기 (A)이소시아네이트 혼합용액과 (B)폴리올 혼합용액의 몰드 주입 비율은 2:1 ~ 1:2로 하는 것이 바람직하다.
또한, 몰드에 넣는 (A)이소시아네이트 혼합용액과 (B)폴리올 혼합용액의 주입량을 통해서도 물성을 제어할 수 있는데, 이 때 (A)용액과 (B)용액의 주입량이 너무 많으면 기공 사이즈가 작아지고, 주입량이 너무 적으면 기공이 균일하지 않게 되는 문제가 발생하는 바, 몰드에 대한 (A)용액과 (B)용액의 주입량은 몰드 부피의50 ~ 70%, 더 바람직하게는 50 ~ 55%정도가 바람직하다.
다음으로, 본 발명의 발포 단계에서는 상기 (A)용액과 (B)용액이 주입된 몰드를 발포함으로써, 밀도 0.5 내지0.8g/cm3를 갖는 무기물을 포함한 우레탄 폼을 얻 을 수 있다. 상기에서 밀도가 0.5g/cm3 미만이면 최종 소결 후 생성되는 세라믹 다공체의 압축강도가 약해지는 문제가 있고, 0.8g/cm3를 초과하면 발포체의 기공이 작게 형성되며 기공이 서로 연결되지 않고 막히는 문제가 있다. 이 단계에서 상기 (A)용액과 (B)용액을 몰드에 넣는 양을 조절하여 우레탄 발포체의 밀도를 조절함으로써 우레탄 폼의 기공 크기, 기공률 및 강도 등을 조절할 수 있다.
이렇게 하여 얻어진 상기 우레탄 폼은 골대체용 지지체의 미세기공을 포함하는 다공체의 골격을 만들어 주는 역할을 하게 된다.
본 발명에서 발포 후 우레탄 유기물을 없애고 남은 무기물을 결정화시키는 단계에서는, 상기 얻어진 우레탄 폼을 승온 속도 0.01 ~ 5℃/min로 200 ~ 850℃ 구간에서 5시간 정도 유지하여 우레탄 유기물을 제거하고 남은 무기물을 결정화시킴으로써, 무기물 또는 금속으로만 이루어지고 균열이 없이 일정한 다공성 지지체를 형성한다.
이어서, 고온에서 소결하는 단계에서는 온도 910 ~ 1,350℃의 범위에서 소결하며, 이는 치밀한 지지체를 형성하기 위함이다. 상기 소결 온도가 910℃ 미만인 경우에는 세라믹 지지체 골격 형성이 약하여 쉽게 부서지는 문제가 있고, 1,350℃ 이상인 경우에는 세라믹 지지체가 용해되어(melt) 지지체 형성이 되지 않는다. 즉, 우레탄 유기물을 다 태우고 남은 무기물이나 금속만으로 이루어진 다공체는 910 ~ 1,350℃에서 소결 과정을 거침으로써 보다 더 치밀하게 되어 요구하는 강도를 얻게 되며, 구조적으로 10 ~ 200㎛의 미세기공과 200 ~ 1000㎛의 거대기공이 연결되어 있는 다공성 세라믹 지지체를 얻을 수 있다.
상기 얻어진 골 재생층의 공극의 크기는 100 ~ 700㎛, 더 바람직하게는 100 ~ 500㎛의 크기가 바람직하다.
(C) 다공성 연골-골 복합 지지체의 제조
상기 제조되어진 연골 재생층과 골 재생층을 연결하여 다공성 연골-골 복합 지지체를 제조하기 위하여, 연골 재생층을 제조하기 위한 과정에서 제조된 가교제가 포함된 히알루론산/콜라겐 용액을 다공성의 세라믹 지지체(골 재생층)에 접착제처럼 바른 후, 그 위에 미리 제조되어진 히알루론산/콜라겐 지지체(연골 재생층)를 붙이고 -35℃ 내지 -40℃에서 동결 건조를 한다.
상기 연골 재생층과 골 재생층을 연결함에 있어서, 연골 재생층의 주 원료로 형성된 용액을 연골 재생층과 골재생층에 침지한 후, 동결 건조 방법으로 연결하는 방법을 사용할 수 있다.
또한, 상기 연골 재생층과 골 재생층을 피브린글루를 포함하는 생체 접착제로 연결할 수 있다.
본 발명을 하기의 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 단지 예시적인 것일 뿐, 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다.
[실시예]
<실시예 1>
1) 다공성 연골
재생층
(히알루론산/콜라겐 지지체) 제조
히알루론산/아텔로 콜라겐 지지체를 제조하기 앞서, 먼저 증류수에 1 N HCl로 pH를 3.5로 맞추고, 여기에 콜라겐을 최종 용액의 0.5중량%가 되도록 첨가한 후, 이 용액에 히알루론산을 최종 용액의 1.5중량%가 되도록 첨가하고 균일하게 용해시키기 위해 균질 혼합기를 이용하여 예비 균일 혼합을 하고, 다시 강제교반기(mechanical stirrer)로 일정시간 혼합을 하였다.
상기 용액에 가교제로 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르(ethylene glycol diglycidyl ether:EGDGE)를 최종 용액의 0.5%가 되도록 상기 혼합용액에 균일하게 혼합하여 일정 형태의 몰드에 넣고 30℃의 온도에서 30분간 유지하여 반응시킨 후 -40℃로 냉각시켜 동결 건조하였다.
상기 동결 건조된 히알루론산/아텔로 콜라겐 지지체에서 다시 콜라겐의 부분 가교를 위해 UV로 30분간 조사한 후, 1일간 증류수를 교환하며 상기 가교된 지지체를 수 회 수세하여 가교에 참여하지 않은 미가교제를 제거한 후, 다시 동결 건조하여 다공크기가 일정하고 높은 다공 연결성을 가지는 지지체를 제조하였다.
2) 다공성 골
재생층
(세라믹 지지체) 제조
① A용액(이소시아네이트 혼합용액) 제조
중합(polymeric) 디페닐메탄디이소시아네이트 58g에 대해 합성/천연 수산화 아파타이트(HA), β-TCP의 2개의 세라믹 분말을 6:4의 비율로 혼합한 혼합분말 30g를 넣고, DMF(디메틸포름아미드) 12g을 첨가하여 호머믹서(homomixer) 또는 고속 교반기를 이용하여 분산시켜 제조하였다. 상기 제조된 분말은 공기 중의 수분 흡수가 용이하기 때문에 실내 습도를 고려하여 신속히 중합(polymeric) 디페닐메탄디이소시아네이트에 첨가하여 제조하였으며, 상기 반응액의 점도는 브룩필드(brook field) 점도계를 이용하여 측정하였고 NCO%를 측정하였다. 한편, 보다 많은 세라믹 분말을 첨가하기 위해 DMF를 전체 디페닐메탄디이소시아네이트에 대해 10g를 추가로 첨가하여 점도를 조절하였다. 마찬가지로 점도 및 NCO%를 측정하여 안정성을 갖는 반응액(이하 A용액)을 제조하였다.
② B용액(
폴리올
혼합용액) 제조
디메틸포름아미드(DMF) 9g에 합성/천연 수산화아파타이트(HA), β-TCP의 2개의 세라믹 분말을 6:4의 비율로 혼합한 혼합분말 30g을 넣고, 우선 충분히 분산시킨 후에 글리세롤을 15g로 첨가하여 고속 교반하여 분말의 분산을 실시하였다. 그 후, 폴리올(에틸렌옥사이드/프로필렌옥사이드 랜덤 공중합체 폴리올:프로필렌옥사이드 폴리올=95g:5g인 혼합물) 46g을 혼합한 후, 분말과 반응액과의 응집현상을 육안을 통해 관찰한 후 응집현상이 없는 폴리올 혼합용액을 제조하였다.
③ 발포, 결정화 및 소결단계
상기에서 제조한 A용액, B용액을 1:1의 비율로 정량한 후, 고속 교반하여 몰 드 발포를 통해 밀도 0.55g/cm3을 갖는 무기물을 포함한 우레탄 폼을 얻었다. 그리고, 상기 형성된 우레탄 폼을 800℃에서 소결하여 세라믹 분말을 결정화한 후, 이를 적정 크기로 컷팅하여 다시 전기로에서 1,250℃의 온도로 소결을 실시하여 다공성의 세라믹 지지체를 얻을 수 있었다.
3) 다공성 연골-골 복합 지지체 제조
상기 제조되어진 연골 재생층을 직경 6mm, 높이 1mm의 디스크 타입으로 제조하고, 골 재생층은 직경 6mm, 높이 5mm의 원기둥 형태로 미리 준비한다.
연골 재생층을 제조하는 과정에서 제조된, 가교제가 포함된 히알루론산/콜라겐 용액을 일반적인 주사기에 넣어 상기 준비된 다공성의 세라믹 지지체에 접착제처럼 바른 다음, 그 위에 연골 재생층을 붙이고 -40℃에서 동결 건조를 한다.
4) 다공성 연골-골 복합 지지체의
SEM
분석 및
다공도
분석
상기 제조된 연골-골 복합 지지체의 미세 표면 분석을 하기 위해 백금 코팅을 한 후 전자 주사 현미경에 위치시키고 연골 재생층과 골 재생층, 연골-골 재생층의 중간 영역을 확인하였다.
연골 재생층은 다공이 전반적으로 균일하게 기공이 분포되어 있고 다공 크기는 약 100㎛(도 1 참조) 내외인 것을 확인하였으며, 골 재생층도 마찬가지로 균일한 다공 분포를 나타내며 구조적으로 10 ~ 200㎛의 미세기공들과 200 ~ 1000㎛의 거대기공들이 서로 연결되어 있는 구조인 것을 확인하였다.
연골 재생층과 골 재생층이 연결되어 있는 부분을 확인한 결과 연골 재생층과 골 재생층이 서로 잘 연결되어 있는 것을 확인하였다(도 2 참조).
또한, 연골-골 복합 지지체는 82%의 기공율을 가지므로 이식 후 체액 및 세포의 유동을 원활하게 하여 혈관생성 및 신생골 생성에 용이하게 작용될 수 있다.
5) 다공성 연골-골 복합 지지체의 기계적 성질 확인
상기 제조된 연골 지지체와 골 지지체, 연골-골 복합 지지체는 인스트론(Instron) 인장기기에 설치하여 인장시험을 시행하였다. 측정방법은 디스크 형태의 지지체를 그립(grip)사이에 위치시키고 고정시킨 후, 1mm/min 의 cross-head speed로 압축시험을 시행하였으며, 최대응력(maximum stress)값을 구하였다.
기계적 인장강도를 확인한 결과, 하기 도 3에서와 같이 천연 고분자의 물리적 특성의 경우 연골 재생 지지체(연골 재생층)가 세라믹 골 재생 지지체(골 재생층)에 비하여 보다 낮은 압축강도를 가진다는 것을 확인하였고, 연골-골 복합 지지체는 세라믹 골 재생 지지체(골 재생층)와 유사한 특성을 나타내었다.
6) 다공성 연골-골 복합 지지체의 예비 세포 배양 실험
본 실험에서 연골-골 복합 지지체의 세포 부착 및 성장 거동을 고찰하기 위해 조직세포 배양 실험을 하였다.
연골세포(immortalized human costal chondrocyte cell line C-28/12, Beth israel Deaconess Medical Center, USA)를 이용하여 각 지지체 내에서의 세포 점착 및 증식거동을 조사하였다. 먼저 37℃, 5% CO2 분위기를 유지하고 있는 세포 배양기 내에서 175cm2 의 조직배양 플라스크(tissue culture flask)에 배양된 세포들을 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)로 분리하여 세포의 수를 산출하였다. 배양액은 10% FBS(fetal bovine serum), 페니실린, 젠타마이신이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 연골세포에 사용하였다.
상기 제조된 디스크 형태의 지지체에 연골세포를 분주하고 37℃, 5% CO2 분위기의 세포배양기 내에서 일정기간 배양하였다. 세포 배양액은 2일 간격으로 신선한 배양액으로 교체하여 주었으며, 3주간 배양 후 지지체내 점착 및 증식되어지는 세포들을 H&E 염색, safranin-O 염색을 통해 분석되었다.
지지체 내에서 성장하는 세포의 분포를 확인하는 방법으로 H&E 염색을 하기 위해 배양중이던 지지체를 10% 포르말린 용액에 고정 후 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고 절편기를 이용하여 얇은 박편을 제조 후 현미경을 이용하여 확인하였다.
또한, 연골세포의 기질 형성 정도를 확인하기 위해 마찬가지로 지지체를 10% 포르말린 용액에 고정 후 safranin-O 염색을 실시하고 절편기를 이용하여 얇은 박편을 제조 후 현미경을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 지지체에 배양되는 연골세포는 고루 분포되어 잘 성장하는 것을 확인하였으며(도 4), 연골세포의 기질 형성도 양호하게 나타난 것을 확인하였다.(도 5)
[비교예]
상기에서 실시예 1에서 제조된 지지체의 연골 재생능 평가를 위해 동물 이식실험을 진행하였다. 대조군으로는 연골 조직 재생을 위해 임상적으로 사용하는 방법인 자가 세포 이식 방법을 사용하였다.
75kg 정도의 돼지(pig)를 이소프렌으로 흡입 마취시킨 다음, 뒷다리 관절 부분을 절개한 후에 연골 세포를 채취하여 연골 세포를 3주간 배양한 후 같은 방법으로 돼지(pig)를 마취시키고 직경 6mm의 크기로 연골 부위에 2부분의 직접적인 손상을 만들어 한쪽 손상 부위에는 배양한 세포를 주입하고 골막을 이용하여 덮고, 다른 손상부위에는 상기에서 실시예 1에서 제조한 지지체를 이식하고 절개한 조직을 덮고 봉합하였다. 조직 관찰은 6개월 후에 H & E염색을 통해 연골조직의 재생 유무를 확인하였다.
조직 관찰의 확인 결과, 상기 자가 세포를 이식한 경우에는 연골 조직이 재생이 되었으나 표면이 매끄럽지 않았던 반면, 상기 연골-골 복합 지지체를 이식한 경우에는 기존의 연골 조직과 상호 잘 연결이 되었을 뿐만 아니라 표면도 매끄럽게 연결이 되었다는 것을 알 수 있었다(도 6).
상기에서 본 발명을 기재된 구체 예를 중심으로 상세히 설명하였지만, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.