KR101366451B1 - 히알루론산/젤라틴/bcp 하이드로젤이 로딩된 bcp지지체의 제조방법 - Google Patents

히알루론산/젤라틴/bcp 하이드로젤이 로딩된 bcp지지체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

히알루론산/젤라틴/BCP 하이드로젤이 로딩된 BCP 지지체의 제조방법이 개시되어 있다. 본 발명은, 혈소판농축혈장(PRP)를 준비하는 단계; 증류수에 히알루론산을 용해시켜 0.5%(w/v)의 히알루론산용액을 만들고, 증류수에 젤라틴을 용해시켜 10%(w/v)의 젤라틴용액을 만드는 단계; 상기 제조된 히알루론산용액과 젤라틴용액을 15 : 85의 부피비율로 혼합한 후, 10%(w/v)의 BCP 파우더를 첨가하여 교반시켜 슬러리화하여 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤 용액(HGB10)을 제조하는 단계; 상기 준비된 혈소판농축혈장(PRP)을 상기 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤 용액에 첨가하는 단계; 상기 제조된 혈소판농축혈장(PRP)가 첨가된 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤을 스폰지 공정법으로 제조된 BCP 지지체에 로딩하는 단계(HGB10/PRP); 및 다공성의 구조를 형성하기 위하여 HGB10/PRP지지체를 동결건조시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

히알루론산/젤라틴/BCP 하이드로젤이 로딩된 BCP지지체의 제조방법{Method of BCP scaffold which hyaluronic acid/gelatin-10% BCP hydrogel is loaded for bone regeneration}
본 발명은 히알루론산/젤라틴/BCP 하이드로젤이 로딩된 BCP 지지체의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 히알루론산(Hyaluronic acid, H)과 젤라틴(Gelatin, G)과 10%의 비페이직 칼슘 포스페이트(Biphasic Calcium Phosphate, BCP) 파우더를 사용하여 하이드로젤을 제조한 후, 쥐의 혈액으로부터 혈소판농축혈장(Platelet-rich plasma, PRP)을 추출하여 이 하이드로젤에 첨가하여 스폰지 공정법으로 제조된 BCP 지지체에 로딩하여 골재생력을 증진시킬 수 있도록 한 히알루론산/젤라틴/BCP 하이드로젤이 로딩된 BCP 지지체의 제조방법에 관한 것이다.
재료공학 및 조직공학이 발전되면서 손상된 골을 회복시키기 위한 개발연구가 활발하게 진행되고 있다. 현재까지 골결손부 회복에는 자가골 이식이 효과적인 것으로 알려져 있지만, 자가골 채취에 따른 문제점으로 인하여 다양한 골지지체들이 개발되고 있다.
본 발명에서는 이상적인 골 지지체를 제조하기 위하여 생분해 속도 조절이 용이하고 효과적인 골전도성을 가지는 BCP 파우더를 사용하여 스폰지 공정법을 통해 BCP 지지체를 제조하였다. 그리고 제조 된 BCP 지지체의 약한 기계적 강도를 보강하기 위하여 생체 친화적이고 생분해성 고분자로 널리 알려져 있는 히알루론산과 젤라틴에 BCP 입자를 함유한 하이드로젤을 개발하였으며, 지지체의 골 형성 속도와 골 형성량을 증가시키기 위하여 자가혈액에서 골유도성 성장인자들이 함유되어 있는 혈소판농축혈장(PRP)을 추출하여 제조된 하이드로젤에 첨가한 후, BCP 지지체에 로딩하였다.
본 발명의 목적은 자가골 채취와 동종골 및 이종골 이식에서 발생되는 문제점을 해결함과 동시에 혈소판농축혈장(PRP)을 자가 이식하여 골재생력을 증진시킬 수 있도록 한 히알루론산/젤라틴/BCP 하이드로젤이 로딩된 BCP 지지체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 전조골세포의 부착 및 증식과 신생골 형성을 향상시킬 수 있도록 한 히알루론산/젤라틴/BCP 하이드로젤이 로딩된 BCP 지지체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산/젤라틴/BCP 하이드로젤이 로딩된 BCP 지지체의 제조방법은,
증류수에 히알루론산을 용해시켜 0.5%(w/v)의 히알루론산용액을 만들고, 증류수에 젤라틴을 용해시켜 10%(w/v)의 젤라틴용액을 만드는 단계; 상기 제조된 히알루론산 용액과 젤라틴 용액을 15 : 85의 부피비율로 혼합한 후, 10%(w/v)의 BCP 파우더를 첨가하여 교반시켜 슬러리화하여 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤 용액(HGB10)을 제조하는 단계; 상기 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤 용액을 스폰지 공정법으로 제조된 BCP 지지체에 로딩하는 단계; 및 다공성의 구조를 형성하기 위하여 HGB10/PRP지지체를 동결건조시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 히알루론산/젤라틴/BCP 하이드로젤이 로딩된 BCP 지지체의 제조방법은,
혈소판농축혈장(PRP)를 준비하는 단계; 증류수에 히알루론산을 용해시켜 0.5%(w/v)의 히알루론산용액을 만들고, 증류수에 젤라틴을 용해시켜 10%(w/v)의 젤라틴용액을 만드는 단계; 상기 제조된 히알루론산 용액과 젤라틴 용액을 15 : 85의 부피비율로 혼합한 후, 10%(w/v)의 BCP 파우더를 첨가하여 교반시켜 슬러리화하여 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤 용액(HGB10)을 제조하는 단계; 상기 준비된 혈소판농축혈장(PRP)을 상기 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤 용액에 첨가하는 단계; 상기 제조된 혈소판농축혈장(PRP)가 첨가된 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤을 스폰지 공정법으로 제조된 BCP 지지체에 로딩하는 단계(HGB10/PRP); 및 다공성의 구조를 형성하기 위하여 HGB10/PRP지지체를 동결건조시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 혈소판농축혈장(PRP)를 준비하는 단계는,
혈액을 채혈하는 단계; 응고를 예방하기 위하여 3.8%(w/v)의 시트르산나트륨(sodium citrate) 용액을 즉시 첨가하는 단계; 상기 채혈된 혈액을 원심분리를 하여 적혈구를 분리하고, 혈소판농축혈장층과 버피코트층만을 다시 원심분리를 하여 분리된 혈소판결핍혈장층인 PPP층과 혈소판농축혈장층인 PRP층을 각각 냉동 보관하는 단계; 및 상기 냉동 보관되었던 PRP를 천천히 해동시킨 후, PRP에 함유되어 있는 성장인자들의 방출을 위하여 4%(w/v)의 염화칼슘(CaCl2) 용액을 넣어 주는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 HGB10/PRP지지체의 동결건조 단계 후에,
상기 동결 건조된 HGB10/PRP 지지체의 생분해 속도를 제어하기 위하여 EDC/NHS(N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropy)carbodiimide hydrochloride/Hydroxy-2,5-dioxopyrolidine-3-sulfonic acid sodium)를 사용하여 4℃에서 6시간씩 2번 반복수행하여 지지체를 가교시킨 후, 증류수를 사용하여 세척하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 다공성 BCP 지지체에 히알루론산/젤라틴/10% BCP 하이드로젤을 로딩하여 기계적 강도와 전조골세포의 부착 및 증식을 향상시킬 수 있으며, 혈소판농축혈장(PRP: Platelet-Poor Plasma)를 첨가하여 신생골 형성을 증진시킬 수 있다.
도 1은 종래의 BCP 지지체와, 본 발명에 따라 제조된히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤이 로딩된 BCP 지지체의(HGB10)구조를 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)과 EDS 분석을 수행한 사진이다.
도 2는 종래의 BCP 지지체와, 본 발명으로 제조된 HGB10 지지체의 압축강도(Compressive strength), 기공율(Porosity) 및 기공크기분포도(Pore size)를 나타낸 그래프이다.
도 3은 쥐(rat)의 심장과 꼬리에서 채혈한 혈액을 원심분리한 후, 혈소판농축혈장(PRP)과 혈소판결핍혈장(Platelet-Poor Plasma, PPP)을 추출하는 과정을 나타낸 사진과 PRP와 PPP안의 PDGF-BB와 TGF-β의 함유량을 정량화하여 Control과 비교한 그래프이다.
도 4는 종래의 BCP 지지체와, 본 발명으로 제조된 HGB10 지지체, 및 혈소판풍부혈장이 첨가된 하이드로젤을 로딩한 BCP 지지체(HGB10/PRP)에서 MC3T3-E1 전조골세포를 1일, 3일, 7일 동안 배양한 후, 세포독성평가를 관찰한 사진이다.
도 5는 종래의 BCP 지지체와, 본 발명으로 제조된 HGB10 지지체, 및 HGB10/PRP에서 MC3T3-E1 전조골세포를 1일, 3일, 7일 동안 배양한 후, 세포의 성장 및 증식거동을 관찰한 사진이다.
도 6은 종래의 BCP 지지체와, 본 발명으로 제조된 HGB10 지지체, 및 HGB10/PRP에서 MC3T3-E1 전조골세포를 1일, 3일, 7일 동안 배양한 후, MTT assay를 수행하여 세포의 증식율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 종래의 BCP 지지체와, 본 발명으로 제조된 HGB10 지지체, 및 HGB10/PRP를 쥐의 두개골의 결손 부위에 2주, 4주, 8주 동안 이식한 후, 이식 부위의 조직을 적출하여 헤마톡실린 & 에오진(Hematoxylin & Eosin) 염색법으로 지지체 내에 형성된 신생골을 저배율로 관찰한 사진이다.
도 8은 도 7의 사진을 고배율로 관찰한 사진이다.
도 9는 종래의 BCP 지지체와, 본 발명으로 제조된 HGB10 지지체, 및 HGB10/PRP를 쥐의 두개골의 결손 부위에 2주, 4주, 8주 동안 이식한 후, 이식 부위의 조직을 적출하여 매슨 & 트라이크롬 (Masson's Trichrome) 염색법으로 지지체 내에 형성된 콜라겐섬유와 신생골을 고배율로 관찰한 사진이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 다양한 실시예에 따른 히알루론산/젤라틴/BCP 하이드로젤이 로딩된 BCP 지지체(HGB10/PRP)의 제조방법에 대하여 상세히 설명한다.
도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 혈소판농축혈장이 첨가된 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤이 로딩된 BCP 지지체(HGB10/PRP)의 제조방법은 다음과 같은 공정을 통해 이루어진다.
1. 혈소판농축혈장(PRP)를 추출하기 위하여 쥐(Rat)의 심장과 꼬리에서 약 10ml의 혈액을 채혈한 후, 응고를 예방하기 위하여 3.8%(w/v)의 시트르산나트륨(sodium citrate) 용액 0.5ml을 즉시 첨가한다.
2. 상기 채혈된 혈액을 3000rpm에서 약 15분간 원심분리를 하여 적혈구를 분리하고, 혈소판농축혈장층과 버피코트층만을 다시 5000rpm에서 10분간 원심분리를 하여 분리된 혈소판결핍혈장층인 PPP층과 혈소판농축혈장층인 PRP층을 각각 -20℃의 온도에서 냉동 보관한다.
3. 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤을 제조하기 위하여, 증류수에 히알루론산을 용해시켜 0.5%(w/v)의 용액을 만들고, 증류수에 젤라틴을 용해시켜 10%(w/v)의 용액을 만든다.
4. 상기 제조된 히알루론산용액과 젤라틴 용액을 15 : 85의 부피비율로 혼합한 후, 10%(w/v)의 BCP 파우더를 첨가하여 교반시켜 슬러리화하여 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤 용액을 제조한다(HGB10).
5. 상기 냉동 보관되었던 PRP를 천천히 해동시킨 후, PRP에 함유되어 있는 성장인자들의 방출을 위하여 4%(w/v)의 염화칼슘(CaCl2) 용액을 넣어 주고, 상기 제조된 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤 용액에 첨가한다.
6. 상기 제조된 PRP가 첨가된 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤을 스폰지 공정법으로 제조된 BCP 지지체에 로딩한다(HGB10/PRP).
7. 다공성의 구조를 형성하기 위하여 HGB10/PRP지지체를 -70℃에서 하루 동안 동결시킨 후, 2∼3일 동안 동결건조를 수행한다.
8. 상기 동결 건조된 HGB10/PRP 지지체의 생분해 속도를 제어하기 위하여 EDC/NHS(N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropy)carbodiimide hydrochloride/Hydroxy-2,5-dioxopyrolidine-3-sulfonic acid sodium)를 사용하여 4℃에서 6시간씩 2번 반복수행하여 지지체를 가교시킨 후, 증류수를 사용하여 세척한다.
상기와 같은 공정을 통해 본 발명에 따른 혈소판농축혈장이 첨가된 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤이 로딩된 BCP 지지체(HGB10/PRP)를 제조할 수 있고, 이렇게 제조된 HGB10/PRP는 전조골세포의 성장 및 증식뿐만 아니라, 신생골 형성을 촉진시킬 수 있다.
이와 같이 BCP 지지체에 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤과 PRP를 첨가하여 지지체를 제조하는 방법을 본 발명에서 개시한 것이다.
이하에서는 본 발명에 따른 다양한 실시예와 비교예를 설명하도록 한다.
<실시예 1>
쥐의 심장과 꼬리에서 채혈된 10ml의 혈액을 원심 분리하여 PRP 층을 추출한 후 -20℃에서 냉동 보관한다. 증류수에 용해된 0.5%(w/v)의 히알루론산용액과 10%(w/v)의 젤라틴을 용액을 15:85의 부피비율로 혼합한 후, 10%(w/v)의 BCP 파우더를 넣어 완전히 슬러리화하여 하이드로젤 용액을 제조한다. 상기 냉동 보관된 PRP를 서서히 해동시켜 염화칼슘 용액으로 활성화시킨 후 제조된 하이드로젤 용액에 첨가한다. 스폰지 공정법을 사용하여, 폴리우레탄(PU) 스폰지에 40ml의 알코올에 10g의 BCP 파우더를 넣고 바인더의 역할로써 1g의 폴리비닐부틸(PVB: polyvinylbutyl)을 첨가하여 균일한 BCP 슬러리를 만들어 PU 스폰지에 코팅한 후, 건조 및 소결 과정을 거쳐 다공성의 BCP 지지체를 제조한다. 이렇게 제조된 BCP 지지체에 PRP가 첨가된 하이드로젤 용액을 로딩하여 동결 및 동결건조를 수행하여 다공성의 지지체를 제조한 후, EDC/NHS 용액으로 지지체를 가교 및 세척한다. 이러한 공정 과정을 거쳐 최종적으로 HGB10/PRP 지지체를 제조한다.
<실시예 2>
증류수에 용해된 0.5%(w/v)의 히알루론산용액과 10%(w/v)의 젤라틴용액을 15:85의 부피비율로 혼합한 후, 10%(w/v)의 BCP 파우더를 넣어 완전히 슬러리화하여 하이드로젤 용액을 제조한다. 스폰지 공정법을 사용하여, PU 스폰지에 40ml의 알코올에 10g의 BCP 파우더를 넣고 바인더의 역할로써 1g의 PVB(polyvinylbutyl)를 첨가하여 균일한 BCP 슬러리를 만들어 PU 스폰지에 코팅한 후, 건조 및 소결 과정을 거쳐 다공성의 BCP 지지체를 제조한다. 이렇게 제조된 BCP 지지체에 하이드로젤 용액을 로딩하여 동결 및 동결건조를 수행하여 다공성의 지지체를 제조한 후, EDC/NHS 용액으로 지지체를 가교 및 세척한다. 이러한 공정 과정을 거쳐 최종적으로 HGB10 지지체를 제조한다.
<비교예>
스폰지 공정법을 사용하여, PU 스폰지에 40ml의 알코올에 10g의 BCP 파우더를 넣고 바인더의 역할로써 1g의 PVB(polyvinylbutyl)를 첨가하여 균일한 BCP 슬러리를 만들어 PU 스폰지에 코팅한 후, 건조 및 소결 과정을 거쳐 다공성의 BCP 지지체를 제조한다. 이러한 공정 과정을 거쳐 최종적으로 BCP 지지체를 제조한다.
이하, 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들과 비교예들 비교하도록 한다. 본 발명의 다양한 실시예에 따라 제조된 HGB10/PRP 지지체 및 HGB10 지지체와, 상기 비교예에 의해 제조된 BCP 지지체들에 대한 물성평가, 세포독성 평가 및 생물학적 안정성 평가를 실시하였고, 그에 대한 결과는 도 1에서 도 9까지 나타내었다.
도 1은 비교예에 의해 제조된 BCP와, 본 발명의 실시예에 의해 제조된 HGB10 지지체를 주사전자현미경과 EDS 분석을 수행한 사진이다.
도 1의 (a)로 나타낸 도식과 같이 BCP 지지체의 상호 연결된 기공구조를 확인할 수 있으며 약 300㎛에서 500㎛의 범위를 가진 기공의 크기가 관찰된다.
도 1의 (b,c)로 나타낸 도식은 BCP 지지체에 하이드로젤이 BCP 기공에 대체적으로 균일하게 로딩된 것을 확인할 수 있으며, 고배율로 관찰하였을 때 하이드로젤 로딩으로 인하여 다양한 크기의 기공이 형성됨을 관찰할 수 있다.
도 1의 (d)로 나타낸 도식은 BCP 지지체와 HGB10 지지체의 각 부분을 EDS로 분석한 결과, BCP의 조성이 잘 배합되었으며 지지체에 균일하게 분포되어 있음을 나타낸다.
도 2의 (a)로 나타낸 도식은 BCP 지지체와 HGB10 지지체의 압축강도와 기공율을 측정한 그래프를 나타낸 것으로, BCP 지지체의 압축 강도는 약 1.4MPa로 측정되었으며, HGB10 지지체는 약 4.6MPa의 압축강도를 나타내었으며 이 값들은 통계적으로 유의한 결과를 나타낸다. 또한, BCP 스케폴드의 기공률은 약 70%를 나타내었고 하이드로젤이 로딩된 BCP 스케폴드의 기공률은 50%로 측정되었다.
도 2의 (b)로 나타낸 도식은 BCP 지지체와 HGB10 지지체의 기공크기분포도를 측정한 그래프를 나타낸 것으로, BCP 지지체에서는 약 100∼500㎛의 기공이 많이 분포하는 것으로 나타났고, HGB10 지지체에서는 약 10∼20㎛와 50∼100㎛의 기공이 주로 분포하는 것으로 나타났다.
도 3의 (a)로 나타낸 도식은 쥐의 심장에서 혈액을 채혈하여 원심분리를 수행하여 PRP층과 PPP층으로 분리하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 3의 (b,c)로 나타낸 도식은 쥐에서 채혈한 혈액 속에 포함되어 있는 성장인자들을 정량화하기 위하여 ELISA 키트를 사용하여 PRP와 PPP에 함유되어 있는 PDGF-BB와 TGF-β의 농도를 450nm 파장으로 측정하여 그래프로 나타낸 결과이다.
PRP에서 PPP와 키트에서 제공된 대조군(control)의 농도보다 많은 양의 PDGF-BB와 TGF-β가 측정되었고, 이 값은 통계적으로 유의한 결과로 나타났다. 이러한 결과를 미루어보아, 본 발명에서 PRP를 성공적으로 추출함이 증명되었으며 추출된 PRP에 고농도의 성장인자들이 포함되어 있음을 증명하였다.
도 4는 종래의 BCP 지지체와, 본 발명으로 제조된 HGB10 지지체 및 HGB10/PRP 지지체 표면에 MC3T3-E1 전조골세포를 1일, 3일, 7일 동안 배양 한 후 공초점현미경으로 Live/dead cell assay를 관찰한 결과이다.
도 4의 (a-1,a-2,a-3)로 나타낸 도식은 BCP 지지체에 1일, 3일, 7일 동안 배양된 세포의 생존력을 관찰한 결과이며, 도 4의 (b-1,b-2,b-3)로 나타낸 도식은 HGB10 지지체에 배양 된 세포의 생존력을 관찰한 결과이고, 도 4의 (c-1,c-2,c-3)로 나타낸 도식은 HGB10/PRP 지지체에 배양된 세포의 생존력을 관찰한 결과이다.
도 4에 나타난 도식과 같이, 붉게 염색된 부분은 죽은 세포(dead cell)를 나타내며 초록색으로 염색된 부분은 살아있는 세포(live cell)를 나타낸다. 모든 지지체에서 배양 시간이 증가할수록 죽은세포가 증가하였으나, BCP 지지체에서 가장 많은 죽은 세포가 관찰되었으며 HGB10/PRP 지지체에서 가장 적은 죽은세포와 가장 많은 살아있는 세포가 관찰되었다.
도 5는 종래의 BCP 지지체와, 본 발명으로 제조된 HGB10 지지체 및 HGB10/PRP 지지체 표면에 MC3T3-E1 전조골세포를 1일, 3일, 7일 동안 배양 한 후 공초점현미경으로 세포의 부착, 성장 및 증식 거동을 관찰한 결과이다.
도 5의 (a-1,a-2,a-3)로 나타낸 도식은 BCP 지지체에 1일, 3일, 7일 동안 배양된 세포의 증식 거동을 관찰한 결과이며, 도 5의 (b-1,b-2,b-3)로 나타낸 도식은 HGB10 지지체에 배양된 세포의 증식 거동을 관찰한 결과이고, 도 5의 (c-1,c-2,c-3)로 나타낸 도식은 HGB10/PRP 지지체에 배양된 세포의 증식 거동을 관찰한 결과이다.
도 5에 나타난 도식과 같이, 붉게 염색된 부분은 세포의 핵을 나타내며 초록색으로 염색된 부분은 세포의 F-actin을 나타낸다. 각 지지체의 기공 주위에 부착된 세포들이 배양 기간이 증가할수록 기공 안으로 침투(immigration)되는 경향을 나타내었으며, 하이드로젤에 많은 세포들이 부착된 모습을 관찰하였다. HGB10/PRP지지체에서 가장 우수한 증식능이 관찰되었으며 이러한 결과를 미루어보아, BCP 지지체에 하이드로젤과 PRP가 로딩되면서 세포친화력을 증진시켰음을 확인하였다.
도 6은 종래의 BCP 지지체와, 본 발명으로 제조된 HGB10 지지체 및 HGB10/PRP 지지체에 MC3T3-E1 전조골세포를 1일, 3일, 7일 동안 배양 한 후 MTT assay를 수행하여 세포의 증식율을 ELISA 리더기로 측정한 그래프를 나타낸 것이다.
도 6에 나타낸 도식과 같이, 배양시간이 길어짐에 따라 모든 지지체에 배양된 세포의 광밀도(optical density) 값이 증가하였고, BCP 지지체에 배양된 세포의 광밀도 값보다 HGB10 지지체와 HGB10/PRP 지지체에서 더 높은 값이 측정되었으며, 이 값은 통계적으로 유의하였다.
도 7은 종래의 BCP 지지체와, 본 발명으로 제조된 HGB10 지지체 및 HGB10/PRP 지지체를 각각 지름이 5mm의 크기로 제어한 후, 쥐의 결손된 두개골 부위에 2주, 4주, 8주 동안 이식하여 헤마톡실린 & 에오진(Hematoxylin & Eosin) 조직염색을 수행하여 저배율로 관찰한 결과를 나타낸다. 면역 반응을 방지하기 위하여 HGB10/PRP 지지체의 경우, 지지체에 첨가하기 위하여 추출한 PRP를 쥐에게 자가이식을 수행하였다.
도 7에 나타낸 도식과 같이, 이식 기간이 길어질수록 각 BCP, HGB10, HGB10/PRP 지지체가 생분해되는 것을 관찰할 수 있으며, 이물반응은 관찰되지 않았다. 각 지지체가 이식된 부위의 가장자리부터 신생골이 형성되어 지는 형태가 관찰되었고, HGB10/PRP 지지체가 이식된 부위에서 진한 분홍색으로 염색된 치밀한 골의 형성이 관찰되었다.
도 8은 종래의 BCP 지지체와, 본 발명으로 제조된 HGB10 지지체 및 HGB10/PRP 지지체를 각각 지름이 5mm의 크기로 제어한 후, 쥐의 결손된 두개골 부위에 2주, 4주, 8주 동안 이식하여 헤마톡실린 & 에오진(Hematoxylin & Eosin) 조직염색을 수행하여 고배율로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 8에 나타낸 도식과 같이, BCP 지지체를 이식한 부위보다 HGB10 지지체와 HGB10/PRP 지지체를 이식한 부위에서 신생골이 더 빠르게 형성되고 있으며 HGB10/PRP 지지체를 이식한 부위에서 이식 8주 후, 천연골과 유사한 매우 치밀한 신생골이 형성되는 모습을 관찰하였다. 이식 기간이 길어짐에 따라, 진한 자주색으로 염색된 하이드로젤이 생분해되는 것이 관찰되었고, 하이드로젤 구조 사이사이에서 신생골이 형성되는 것이 관찰되었다.
도 9는 종래의 BCP 지지체와, 본 발명으로 제조된 HGB10 지지체 및 HGB10/PRP 지지체를 각각 지름이 5mm의 크기로 제어한 후, 쥐의 결손된 두개골 부위에 2주, 4주, 8주 동안 이식하여 매슨 & 트라이크롬 (Masson's Trichrome) 조직염색을 수행하여 고배율로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 9에 나타낸 도식과 같이, 각 지지체가 이식된 부위에서 생성된 콜라겐 섬유와 신생골 형성을 뚜렷하게 관찰할 수 있습니다. BCP 지지체가 이식된 부위에서는 이식 기간이 증가할수록 콜라겐 섬유의 생성이 증가하였으나, 미미한 신생골의 형성이 관찰되었다. BCP 지지체가 이식된 결과와 다르게 HGB10 지지체와 HGB10/PRP 지지체가 2주 동안 이식된 부위에서 더 빠르고 많은 콜라겐 섬유가 형성되었으며 초기 신생골이 형성되는 거동이 관찰되었으며, HGB10/PRP 지지체를 4주 동안 이식하였을 때는 하이드로젤 주위에서 신생골이 치밀하게 형성됨이 관찰되었습니다. 또한, 8주 동안 이식되었을 때 하이드로젤이 거의 생분해된 것을 확인할 수 있으며, 하이드로젤이 분해된 부위에서 점차 넓게 신생골이 형성되는 거동이 관찰되었다.
본 발명의 권리범위는 위에서 설명된 실시 예에 한정되지 않고 청구범위에 기재된 바에 의해 정의되며, 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 청구범위에 기재된 권리범위 내에서 다양한 변형과 개작을 할 수 있다는 것은 자명하다.

Claims (4)

  1. 증류수에 히알루론산을 용해시켜 0.5%(w/v)의 히알루론산용액을 만들고, 증류수에 젤라틴을 용해시켜 10%(w/v)의 젤라틴용액을 만드는 단계;
    상기 제조된 히알루론산용액과 젤라틴용액을 혼합한 후, 10%(w/v)의 비페이직 칼슘 포스페이트(Biphasic Calcium Phosphate, BCP) 파우더를 첨가하여 교반시켜 슬러리화하여 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤 용액(HGB10)을 제조하는 단계;
    상기 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤 용액을 스폰지 공정법으로 제조된 BCP 지지체에 로딩하는 단계(HGB10 지지체); 및
    다공성의 구조를 형성하기 위하여 상기 HGB10 지지체를 동결건조시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루론산/젤라틴/BCP 하이드로젤이 로딩된 BCP지지체의 제조방법.
  2. 혈소판농축혈장(PRP)를 준비하는 단계;
    증류수에 히알루론산을 용해시켜 0.5%(w/v)의 히알루론산용액을 만들고, 증류수에 젤라틴을 용해시켜 10%(w/v)의 젤라틴용액을 만드는 단계;
    상기 제조된 히알루론산용액과 젤라틴용액을 혼합한 후, 10%(w/v)의 비페이직 칼슘 포스페이트(Biphasic Calcium Phosphate, BCP) 파우더를 첨가하여 교반시켜 슬러리화하여 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤 용액(HGB10)을 제조하는 단계;
    상기 준비된 혈소판농축혈장(PRP)을 상기 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤 용액에 첨가하는 단계;
    상기 제조된 혈소판농축혈장(PRP)가 첨가된 히알루론산/젤라틴/10%BCP 하이드로젤을 스폰지 공정법으로 제조된 BCP 지지체에 로딩하는 단계(HGB10/PRP 지지체); 및
    다공성의 구조를 형성하기 위하여 상기 HGB10/PRP 지지체를 동결건조시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루론산/젤라틴/BCP 하이드로젤이 로딩된 BCP지지체의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 혈소판농축혈장(PRP)를 준비하는 단계는,
    혈액을 채혈하는 단계;
    응고를 예방하기 위하여 3.8%(w/v)의 시트르산나트륨(sodium citrate) 용액을 즉시 첨가하는 단계;
    상기 채혈된 혈액을 원심분리를 하여 적혈구를 분리하고, 혈소판농축혈장층과 버피코트층만을 다시 원심분리를 하여 분리된 혈소판결핍혈장층인 PPP층과 혈소판농축혈장층인 PRP층을 각각 냉동 보관하는 단계; 및
    상기 냉동 보관되었던 PRP를 천천히 해동시킨 후, PRP에 함유되어 있는 성장인자들의 방출을 위하여 4%(w/v)의 염화칼슘(CaCl2) 용액을 넣어 주는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루론산/젤라틴/BCP 하이드로젤이 로딩된 BCP지지체의 제조방법.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 HGB10/PRP지지체의 동결건조 단계 후에,
    상기 동결 건조된 HGB10/PRP 지지체의 생분해 속도를 제어하기 위하여 EDC/NHS(N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropy)carbodiimide hydrochloride/Hydroxy-2,5-dioxopyrolidine-3-sulfonic acid sodium)를 사용하여 4℃에서 6시간씩 2번 반복수행하여 지지체를 가교시킨 후, 증류수를 사용하여 세척하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루론산/젤라틴/BCP 하이드로젤이 로딩된 BCP지지체의 제조방법.
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