CN113249301A - 一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒及应用，试剂盒包括DMEM/F12培养基、人血白蛋白以及干细胞外泌体冻干粉。本发明干细胞外泌体冻干粉由干细胞提取液干燥得到，采用生理盐水诱导干细胞制备提取液，成份多样富含多种干细胞外泌细胞因子、细胞外基质、外泌体囊泡等，复合组分培养子宫内膜细胞可以取得预料不到的技术效果。

Description

一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物技术，具体涉及一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒及应用。
背景技术
研究认为，子宫内膜细胞数量下降或者功能低下，将导致子宫内膜菲薄(子宫内膜厚度<7mm)或者子宫内膜功能失调，从而影响胚胎着床（Schwab KE,Gargett CE. Co-expression of two perivascular cell markers isolates mesenchymal stem-likecells from human endometrium）。子宫内膜损伤病因包括，产后刮宫术、自发性流产、人工流产、子宫内膜消融术和盆腔结核、感染等导致的子宫内膜基底层和子宫肌层的破坏，研究认为，当损伤到子宫内膜基底层时，可能导致子宫内膜细胞的丢失或损伤。现有技术将原代干细胞接种于培养基中，原代培养，隔天换液，当原代干细胞生长至80～90%时，去除培养基，剩余的干细胞经过漂洗后与生理盐水混合，诱导培养后进行离心分离，得到上清液；然后将上清液过滤后，得到干细胞提取液；进一步公开了干细胞提取液含有丰富的细胞因子、细胞外基质、外泌体囊泡等，可以直接作为药物制剂，或者冻干后与辅料混合配置药物。但是该现有技术未涉及干细胞提取液与常规培养基组合，也没有公开组合后的培养体系对细胞培养的影响。
发明内容
本发明在现有干细胞提取液的基础上，公开了一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒、培养体系及应用。
本发明采用如下技术方案：
一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，包括DMEM/F12培养基、人血白蛋白以及干细胞外泌体冻干粉；进一步的，本发明基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒由DMEM/F12培养基、白蛋白以及干细胞外泌体冻干粉、水组成。
本发明中，采用生理盐水诱导制备提取液，成份多样富含多种干细胞外泌细胞因子、细胞外基质、外泌体囊泡等，复合组分培养子宫内膜细胞可以取得预料不到的技术效果。具体的，本发明干细胞外泌体冻干粉为现有产品，由干细胞提取液干燥得到，参见本发明申请人之前公开的CN111759866A。
本发明中，水为超纯水。
本发明中，人血白蛋白的体积为DMEM/F12培养基的3～6%，优选为4～5%，最优选5%；干细胞外泌体冻干粉、DMEM/F12培养基的用量比例为1～10mg∶100mL，优选为3～7mg∶100mL，最优选5mg∶100mL；干细胞外泌体冻干粉、水的用量比例为1～10mg∶5mL，优选为4～6mg∶5mL，最优选5mg∶5mL。
细胞培养过程复杂，现有技术都以基础培养基为必要成分，添加合适的添加剂，期望获得好的增殖效果。现有技术从子宫内膜组织得到细胞，在培养基中加入不同浓度的IL-8和IFN-α2b，对腺上皮细胞进行培养24小时后用MTT法检测细胞增殖的状况。同时，用含有IL-8的培养基对内膜细胞进行培养，24小时后用透射电镜观察IL-8对腺上皮细胞和间质细胞的影响。发现细胞的增殖与IL-8的含量有着明显的剂量依赖关系，并且在IL-8浓度为10ng/mL时最为显著。电镜观察发现在1ng/ml的IL-8的作用下，内膜细胞功能活跃，分泌旺盛，可见细胞外有胶原产生。而IFN-α2b对腺上皮细胞的增殖却有明显的抑制作用，因此IFN-α2b与IL-8对内膜细胞有影响。现有技术采用组织消化法分离单克隆贴壁生长的子宫内膜细胞，能够获得纯化的子宫内膜干细胞，并能在成骨诱导培养基及平滑肌诱导培养基的诱导下，成功向成骨细胞和平滑肌细胞分化。用CCK-8法测定子宫内膜细胞增殖活性，并绘制生长曲线图，生长曲线均呈类S形，在前2天生长速度平缓，在4-7天细胞增殖速度加快，处于指数生长期，到9-12细胞增殖速度再次变为平缓，处于平台期，细胞数相对稳定。
本发明首次将先前研发的干细胞提取液冻干粉用纯水稀释溶解作为添加组成，与基础培养基、白蛋白一起组成培养体系，无需其他试剂或者细胞因子等加入，限定各组分比例，用于培养子宫内膜细胞，细胞生长过程中，可以贴壁生长，培养7天即可达到80～90%的生长密度，达到传代要求，并且经过CCK-8法测定子宫内膜细胞具有好的增殖活性。
附图说明
图1为实验组培养7天后细胞图；
图2为对照组培养7天后细胞图；
图3为空白组培养7天后细胞图。
具体实施方式
本发明从子宫内膜组织酶解消化得到子宫内膜细胞，再用由DMEM/F12培养基、人血白蛋白以及干细胞外泌体冻干粉、超纯水混合组成的培养体系培养，得到增殖活性好的子宫内膜细胞。子宫内膜组织来源于医院，已经使用0.9%生理盐水清洗，在常规保存液中存放，不同人体来源不影响子宫内膜细胞的培养；子宫内膜细胞用于自体细胞移植，改善自体子宫内膜功能用。
参见CN111759866A，将原代人脐带间充质干细胞按细胞密度106个/T150瓶，在无血清MSC培养基（ScienCell公司）中进行接种，然后于37℃，5%CO2的培养箱中进行原代培养，隔天换液；细胞生长密度接近90%时，使用一次性10mL移液管，去除培养瓶中培养基，每瓶加入20mL生理盐水漂洗，重复漂洗3次；再加入生理盐水（0.9%）25mL，不加入其他物质，诱导培养，在37℃、5%CO2的培养箱中进行诱导培养；诱导培养的时间72小时；然后1500rpm离心10分钟，收集上清液；将上清液过滤，滤膜为0.1微米，得到干细胞提取液溶液，然后真空冷冻干燥机进行冻干，得到干细胞外泌体冻干粉。
真空冷冻干燥机进行冻干的过程如下：
将干细胞提取液溶液分装西林瓶，5ml/瓶，-80℃预冻过夜；
冻干机预冷3小时，降温至-55℃，放入样品；
降低气压至800Pa，温度维持-55℃，时间2小时；
降低气压至120Pa，温度升至-40℃，降压升温过程时间2小时；
气压维持120Pa，温度维持-40℃，时间15小时；
降低气压至100Pa，温度升至-35℃，降压升温过程时间2小时；
气压维持100Pa，温度维持-35℃，时间5小时；
气压维持100Pa，温度升至-25℃，升温过程时间1小时；
气压维持100Pa，温度维持-25℃，时间2小时；
气压维持100Pa，温度升至20℃，升温过程时间1小时；
气压维持100Pa，温度维持20℃，时间2小时；
气压维持100Pa，温度升至30℃；
降低气压至10Pa，温度维持30℃，维持压力和温度时间2小时；
恢复正常温度和气压，冻干结束，得到干细胞外泌体冻干粉。
实施例一
一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，由DMEM/F12培养基（Gibco）、人血白蛋白（杰特贝林）以及干细胞外泌体冻干粉、超纯水组成，其中，人血白蛋白的体积为DMEM/F12培养基体积的5%，干细胞外泌体冻干粉、DMEM/F12培养基、超纯水的用量分别为5mg、100 mL、5mL。
应用实施例
采用实施例一的基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，将干细胞外泌体冻干粉加入超纯水中溶解，然后加入DMEM/F12培养基中，再加入人血白蛋白，得到实验培养体系。
将人血白蛋白加入DMEM/F12培养基中，得到空白培养体系，其中，人血白蛋白的体积为DMEM/F12培养基体积的5%。
将人血白蛋白加入DMEM/F12培养基中，再加入血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF），得到对照培养体系，其中，人血白蛋白的体积为DMEM/F12培养基体积的5%，血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）都为20 ng/ml。
取人子宫内膜组织5克，1500转/分离心5分钟，吸出上层保存液，再加入DMEM/F12培养基10mL，然后加入10mL 0.5%胶原酶工作液（Sigma），37℃消化60分钟，得到消化液，100um滤网过滤消化液，滤液以1500转/分离心5分钟，弃上清使用DMEM/F12培养基重悬细胞至5ml，用于以下实验组与对照组。
实验组：取1 ml细胞悬液，加入10mL上述实验培养体系，混合后，以1500转/分离心5分钟，弃上清，所得细胞沉淀用上述实验培养体系重悬至1ml，按照104/cm2的密度接种培养瓶，加入到T150细胞培养瓶中，每个培养瓶加入25ml上述实验培养体系，于37℃，5%CO2的培养箱中进行原代培养，作为细胞生长第0天，每3天更新上述实验培养体系，待细胞生长到第7天，细胞密度达到90%，可以进行细胞传代。
对照组：取1ml细胞悬液，加入10mL上述对照培养体系，混合后，以1500转/分离心5分钟，弃上清，所得细胞沉淀用上述对照培养体系重悬至1ml，按照104/cm2的密度接种培养瓶，加入到T150细胞培养瓶中，每个培养瓶加入25ml上述对照培养体系，于37℃，5%CO2的培养箱中进行原代培养，作为细胞生长第0天，每3天更新上述对照培养体系，待细胞生长到第7天，细胞密度达到65%，未达到细胞传代标准。
空白组：取1ml细胞悬液，加入10mL上述空白培养体系，混合后，以1500转/分离心5分钟，弃上清，所得细胞沉淀用上述空白培养体系重悬至1ml，按照104/cm2的密度接种培养瓶，加入到T150细胞培养瓶中，每个培养瓶加入25ml上述空白培养体系，于37℃，5%CO2的培养箱中进行原代培养，作为细胞生长第0天，每3天更新上述空白培养体系，待细胞生长到第7天，细胞密度达到40%，未达到细胞传代标准。
细胞密度的测试为常规方法，采用显微镜观察。细胞计数和细胞活力检测是细胞生物学特性的常用指标。细胞消化传代时，经过短暂的悬浮后，一般1-2h完成贴壁，随即进入潜伏期，然后进入细胞大量分裂增殖的对数生长期，达到饱和密度后，细胞停止增殖，进入平台期。以上实验中，实验组细胞生长到第7天，细胞密度达到90%，可以进行细胞传代；空白组细胞生长到第7天，细胞密度只能达到40 %，不可以进行细胞传代；对照组细胞生长到第7天，细胞密度达到65 %，不可以进行细胞传代。
培养的第7天，进行细胞拍照，对比细胞生长状态，参见图1、图2、图3，分别为实验组培养体系、对照组培养体系、空白组培养体系培养的第7天的细胞照片，显微镜型号奥林巴斯CKX53，数码摄像头Mshot，放大40倍。
CCK8（上海晶安生物科技有限公司）检测细胞活力。分别取三种培养体系培养到第7天的细胞，消化细胞按照1*103个细胞/孔接种96孔板，培养基使用对应的培养基，分别在12h、24h、36h和48h加入CCK8法检测吸光度，见表1，吸光度和细胞活力成正比。
表1 不同培养体系培养7天后的细胞吸光度
组别 12h 24h 36h 48h
实验组 1.863 2.162 2.240 2.280
对照组 0.866 0.971 1.039 1.056
空白组 0.325 0.431 0.499 0.421
实施例二
一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，由DMEM/F12培养基（Gibco）、人血白蛋白（杰特贝林）以及干细胞外泌体冻干粉、超纯水组成，其中，人血白蛋白的体积为DMEM/F12培养基体积的4%，干细胞外泌体冻干粉、DMEM/F12培养基、超纯水的用量分别为5mg、100 mL、5mL。根据应用实施例的实验方法，细胞生长到第7天，可以进行细胞传代。
实施例三
一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，由DMEM/F12培养基（Gibco）、人血白蛋白（杰特贝林）以及干细胞外泌体冻干粉、超纯水组成，其中，人血白蛋白的体积为DMEM/F12培养基体积的6%，干细胞外泌体冻干粉、DMEM/F12培养基、超纯水的用量分别为5mg、100 mL、5mL。根据应用实施例的实验方法，细胞生长到第7天，可以进行细胞传代。
实施例四
一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，由DMEM/F12培养基（Gibco）、人血白蛋白（杰特贝林）以及干细胞外泌体冻干粉、超纯水组成，其中，人血白蛋白的体积为DMEM/F12培养基体积的5%，干细胞外泌体冻干粉、DMEM/F12培养基、超纯水的用量分别为3mg、100 mL、5mL。根据应用实施例的实验方法，细胞生长到第7天，可以进行细胞传代。
实施例五
一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，由DMEM/F12培养基（Gibco）、人血白蛋白（杰特贝林）以及干细胞外泌体冻干粉、超纯水组成，其中，人血白蛋白的体积为DMEM/F12培养基体积的5%，干细胞外泌体冻干粉、DMEM/F12培养基、超纯水的用量分别为7mg、100 mL、5mL。根据应用实施例的实验方法，细胞生长到第7天，可以进行细胞传代。
实施例六
一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，由DMEM/F12培养基（Gibco）、人血白蛋白（杰特贝林）以及干细胞外泌体冻干粉、超纯水组成，其中，人血白蛋白的体积为DMEM/F12培养基体积的5%，干细胞外泌体冻干粉、DMEM/F12培养基、超纯水的用量分别为1mg、100 mL、5mL。根据应用实施例的实验方法，细胞生长到第7天，细胞密度达到75%。
实施例七
一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，由DMEM/F12培养基（Gibco）、人血白蛋白（杰特贝林）以及干细胞外泌体冻干粉、超纯水组成，其中，人血白蛋白的体积为DMEM/F12培养基体积的5%，干细胞外泌体冻干粉、DMEM/F12培养基、超纯水的用量分别为10mg、100 mL、5mL。根据应用实施例的实验方法，细胞生长到第7天，细胞密度达到80%。
采用如上同样的测试方法，实施例四至实施例七中，细胞生长到第7天测试的48小时吸光度较实施例一的实验组低，细胞活力不如实验组。
本发明以DMEM/F12培养基、人血白蛋白以及干细胞外泌体冻干粉、超纯水组成试剂盒，首次用量培养子宫内膜细胞，意外发现培养7天即可传代，且细胞活力检测结果表明，培养的细胞活力好，说明本发明公开的试剂盒具有实际应用价值。

Claims (10)

1.一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，其特征在于，包括DMEM/F12培养基、人血白蛋白以及干细胞外泌体冻干粉。
2.根据权利要求1所述基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，其特征在于，采用生理盐水诱导间充质干细胞制备提取液，再干燥得到干细胞外泌体冻干粉；水为超纯水。
3.根据权利要求1所述基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，其特征在于，白蛋白的体积为DMEM/F12培养基体积的3～6%。
4.根据权利要求3所述基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，其特征在于，白蛋白的体积为DMEM/F12培养基体积的4～5%。
5.根据权利要求1所述基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，其特征在于，干细胞外泌体冻干粉、DMEM/F12培养基的用量比例为1～10mg∶100mL；干细胞外泌体冻干粉、水的用量比例为1～10mg∶5mL。
6.根据权利要求1所述基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，其特征在于，所述基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒为子宫内膜细胞培养试剂盒。
7.根据权利要求6所述基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，其特征在于，干细胞外泌体冻干粉、DMEM/F12培养基的用量比例为3～7mg∶100mL。
8.一种子宫内膜细胞培养体系，其特征在于，由权利要求1所述基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒制备得到。
9.干细胞外泌体冻干粉在制备基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒中的应用。
10.权利要求1所述基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒在制备子宫内膜细胞培养体系中的应用；或者权利要求1所述基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒或者权利要求8所述子宫内膜细胞培养体系在子宫内膜细胞培养中的应用。
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