CN111068119A - 一种富含脂肪源细胞外囊泡基质胶的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种富含脂肪源细胞外囊泡基质胶的制备方法和应用，从脂肪组织中通过纯物理方法分离出细胞外基质和脂肪提取液，从细胞外基质中制得脱细胞脂肪基质DAT，并处理成可通过细针注射的脱细胞脂肪基质胶DAT‑Matrigel；从脂肪提取液中分离出细胞外囊泡AT‑EV，将脂肪源细胞外囊泡AT‑EV分散到所述DAT‑Matrigel中，制得富含脂肪源细胞外囊泡的脱细胞基质胶AT‑EV‑DAT‑Matrigel。与DAT基质胶相比，在同等条件下，AT‑EV‑DAT‑Matrigel注射后可在小鼠背部皮下形成血管、脂肪密度更高，体积、质量更大的脂肪新生物，因此，AT‑EV‑DAT‑Matrigel具有更优成脂效果及再血管化效果，且在具有成熟T细胞和B细胞免疫的C57小鼠体内异种移植未见明显排异反应，在临床上具有非常理想的异体移植前景，有望成为产品化的新一代可注射型软组织填充剂。

Description

一种富含脂肪源细胞外囊泡基质胶的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种富含脂肪源细胞外囊泡基质胶的制备方法及应用。
背景技术
可注射型软组织填充剂在医学整形及美容领域应用非常广泛，包括先天或后天所致的组织缺损部位的填充，具有美容需求的丰胸、丰脸颊、等方面，而当前软组织填充剂分为具有可降解性的“快餐式”填充剂，如透明质酸，其弊端在于在填充后6-12个月内出现降解，需定期补充注射。而具有持久填充效果的脂肪移植技术却由于免疫原性的因素，仅限自体移植，且由于脂肪细胞在抽脂过程中不同程度的破坏和移植部位血供因素，导致填充效果不稳定，移植后的体积保留率较低。综上所述，临床上急需一种可异体注射并具有稳定、持久填充效果的新型填充剂。
评价软组织填充剂另一个重要指标是诱导组织细胞分化的能力，其诱导组织分化能力越强，将越有利于组织的快速再生，实现整形或修复目的。脱细胞技术在组织工程领域的应用为这一临床需求提供了解决方案。近年来研究报道，脱细胞脂肪基质移植后可促进局部组织的再血管化和脂肪新生，但其血管化及成脂效果还难以满足临床需求，因此，寻求和开发一种免疫原性低、可诱导组织细胞分化的软组织填充剂是医学整形领域研究者的共同追求。
发明内容
（一）要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种富含脂肪源细胞外囊泡基质胶的制备方法及应用，该方法是利用脂肪组织分别制得脱细胞脂肪基质DAT和脂肪源细胞外囊泡AT-EV，将AT-EV分散于DAT基质胶中，制备富含脂肪源细胞外囊泡的脱细胞基质胶，将该基质胶用于构建脂肪新生物，不仅表现出优异的再血管化和脂肪新生能力，还表现出极低的免疫原性。
（二）技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一方面本发明提供一种富含脂肪源细胞外囊泡基质胶的制备方法，所述方法为：从脂肪组织中通过纯物理方法分离出细胞外基质和脂肪提取液，从细胞外基质中制得脱细胞脂肪基质DAT，并处理成可通过细针注射的脱细胞脂肪基质胶DAT- Matrigel；从脂肪提取液中分离出细胞外囊泡AT-EV，将脂肪源细胞外囊泡AT-EV分散到所述DAT- Matrigel中，制得富含脂肪源细胞外囊泡的脱细胞基质胶AT-EV-DAT- Matrigel。
根据本发明较佳实施例，所述方法包括以下步骤：
S1: 脂肪组织的处理:
将吸脂手术患者自愿捐赠的无菌脂肪组织在两个小时内进行离心处理，去除上层油脂和下层液体，保留中层纯化的脂肪组织；使用匀浆机将脂肪组织与等体积PBS混合并高转速匀浆，获得乳糜脂肪；
将乳糜脂肪反复进行冻融处理，将多次冻融处理的乳糜脂肪离心，获得四层物质，由上至下分别为油脂、细胞外基质、脂肪提取液和细胞外基质；去除上层油脂并收集第二层、第四层的细胞外基质和第三层的脂肪提取液；
S2:制备脱细胞脂肪基质DAT:
将按照步骤S1得到的细胞外基质进行脱细胞化处理，得到脱细胞脂肪基质DAT，其方法为：
将按照步骤S1得到的细胞外基质孵化于胰蛋白酶中，并在该胰蛋白酶活性最佳温度下消化10h以上，高速离心收集白色沉淀物；将白色沉淀物在无水有机溶剂中萃取以初步去除脂质，再使用等体积的核酸酶溶液与经初步去除脂质的白色沉淀物孵化过夜，再用无水有机溶剂进行多次萃取，以去除剩余的脂质，得到白色沉淀物为脱细胞脂肪基质DAT；
S3: 制备脱细胞脂肪基质DAT- Matrigel
将按照步骤S2获得的脱细胞脂肪基质DAT冻干处理，并在液氮中研磨成粉末；将研磨后的DAT用胃蛋白酶-HCL溶液在室温下进行消化40-60h，随后向DAT溶解液滴加碱溶液，使pH缓慢升高至7.2-7.8，获得液态DAT凝胶，将液态DAT凝胶在35-38°C下加热，制得DAT基质胶；
S4: 制备脂肪源细胞外囊泡AT-EV
将按照步骤S1得到的脂肪提取液先以400×g以下转速离心处理，去除组织碎片，收集上清液，再以1500~2500×g转速离心去除细胞碎片并收集上清液，最后以8000-12000×g转速离心去除大体积囊泡或凋亡小体，将上清液覆盖在铺有四层蔗糖垫溶液的超高速离心管上，在超高速离心机上以160000-200000×g转速离心1.5-3h，将离心后的5层上清液分别置于超高速离心管中，加入等体积PBS溶液并经微滤膜过滤，在80000-120000×g转速离心0.5-1.5 h，移除上清液，使用PBS溶液重悬沉淀，得到脂肪源细胞外囊泡AT-EV悬液，置于-80℃下保存备用；
S5: 制备AT-EV-DAT基质胶
将按照步骤S3获得的脱细胞脂肪基质DAT基质胶和步骤S4获得的脂肪源细胞外囊泡AT-EV悬液在低温下混合均匀，35-38°C下加热，制备得到AT-EV-DAT基质胶。
根据本发明较佳实施例，其中，S1中：将吸脂手术患者自愿捐赠的无菌脂肪组织在两个小时内以1000×g转速离心5 mi，去除上层油脂和下层液体，保留中层纯化的脂肪组织；使用匀浆机将脂肪组织与等体积PBS以12000 r/min匀浆3 min获得乳糜脂肪；将乳糜脂肪在37~－80℃反复冻融3次，每次冰冻时间不少于1 h，在3000×g的转速离心5 min，获得四层物质。
根据本发明较佳实施例，其中，S2中：将按照步骤S1得到的细胞外基质孵化于等体积0.05%胰蛋白酶中，在37℃恒温水浴摇床上消化16 h，再以3000×g的转速离心5 min后收集白色沉淀物，采用99.9%异丙醇溶液中萃取18 h以去除脂质，再使用等体积的核酸酶溶液与白色沉淀物孵化过夜处理，用99.9%异丙醇溶液中萃取6h，去除剩余的脂质，得到脱细胞脂肪基质DAT；其中核酸酶溶液来自Sigma公司，其含有500U/mL DNase TypeⅠ和1mg/mLRnase。
根据本发明较佳实施例，其中，S3中：将按照步骤S2获得的脱细胞脂肪基质DAT冻干并在液氮中研磨成粉末，将研磨后的DAT用胃蛋白酶-HCL溶液在室温下进行消化48h，该胃蛋白酶-HCL溶液是将每1mg胃蛋白酶溶解于0.5ml 0.1M HCl中制成；随后将DAT溶解液置于冰板上滴加1.0 M 的NaOH溶液，使pH缓慢升高至7.4，获得液态DAT凝胶，将液态DAT凝胶37°C水浴加热转变为固态DAT基质胶。
根据本发明较佳实施例，其中，S4中：将按照步骤S1得到的脂肪提取液在4°C以300×g转速离心5min 去除组织碎片，收集上清液，再在4°C以2000×g转速离心10min去除细胞碎片并收集上清液，最后在4°C以10000×g转速离心30min去除大体积囊泡或凋亡小体，将上清液覆盖在铺有四层蔗糖垫溶液的超高速透明管上，所述四层蔗糖垫溶液从上至下浓度依次为0.5 M、1.0 M、1.5 M、2.0 M；然后在超高速离心机上以180000×g转速离心2h，留取离心后的5层上清液的第二层和第三层置于超高速离心管中，加入等体积PBS溶液并经微滤膜过滤，在4℃下以100000×g转速离心70min，移除上清液，使用PBS溶液重悬沉淀，得到脂肪源细胞外囊泡AT-EV悬液，置于-80℃下保存备用。
根据本发明较佳实施例，其中，S5中：在制备AT-EV-DAT基质胶时，使DAT基质胶和AT-EV在冰板上混合均匀，且控制AT-EV的浓度，使AT-EV的浓度为50μg/ml。
本发明还涉及上述富含脂肪源细胞外囊泡的脱细胞基质胶在构建生物体脂肪新生物中的应用。
优选地，所述构建生物体脂肪新生物组织包括但不限于各类先天或后天所致的软组织缺损的填充，美容需求的丰胸、丰臀、丰脸颊，辅助自体脂肪移植，促进移植物的存活。
经实验证明，经纯物理方法分离的脂肪源细胞外囊泡具有促进人脂肪干细胞成脂分化和促进人脐静脉内皮细胞管样分化的能力。利用脱细胞脂肪组织基质胶作为可注射型生物支架搭载脂肪源细胞外囊泡可表现出更优越的再血管化和脂肪新生能力。
（三）有益效果
本发明的有益效果是：
经实验证明，本发明的富含脂肪源细胞外囊泡的脱细胞基质胶AT-EV-DAT-Matrigel与脂肪组织脱细胞基质胶DAT-Matrigel相比，在同等条件下，AT-EV-DAT-Matrigel注射后可在小鼠背部皮下形成血管、脂肪密度更高，体积、质量更大的脂肪新生物。因此，AT-EV-DAT-Matrigel具有更优的成脂效果及再血管化效果，且在具有成熟T细胞和B细胞免疫的C57小鼠体内异种移植未见明显排异反应，在临床上具有非常理想的异体移植前景，有望成为产品化的新一代可注射型软组织填充剂。
附图说明
图1A为步骤一中将脂肪组织分层得到细胞外基质和脂肪提取液的照片。
图1B为按照步骤三中利用细胞外基质制得的DAT基质胶的照片。
图1C为按照步骤四中利用脂肪提取液制备AT-EV过程示意图。
图2为按照步骤三中利用细胞外基质制得的DAT和DAT基质胶在扫描电镜下形态的比对图。
图3A为将步骤四中五层上清液分别进行Western blot检测膜蛋白标记物的结果，显示AT-EV集中在第二层和第三层。
图3B为将步骤四中第二层和第三层上清液中的AT-EV进行粒径分布检测。
图3C为将步骤四中第二层和第三层上清液中的AT-EV进行透射电镜观察的TEM图片。
图4A、图4B为按照步骤四制备的AT-EV体外与人脂肪干细胞共培养的成脂诱导实验结果，图4A上部为油红O染色。
图4A、图4C为按照步骤四制备的AT-EV体外与人脐静脉内皮细胞共培养的血管样诱导实验结果，图4A下部为管样分化。
图5A、图5D为将本发明制备的AT-EV-DAT基质胶注射雌性严重联合免疫缺陷小鼠（SCID、C57小鼠）8周后，观察得到的移植物照片。
图5B、图5E为将本发明制备的AT-EV-DAT基质胶注射雌性严重联合免疫缺陷小鼠（SCID、C57小鼠）8周后，移植物的湿重统计结果。
图5C、图5F为将本发明制备的AT-EV-DAT基质胶注射雌性严重联合免疫缺陷小鼠（SCID、C57小鼠）8周后，移植物的湿体积统计结果。
图6A、图6C为将本发明制备的AT-EV-DAT基质胶注射雌性严重联合免疫缺陷小鼠（SCID、C57小鼠）8周后，移植物的围脂滴蛋白荧光强度。
图6B、图6D为SCID小鼠和C57小鼠注射本发明制备的AT-EV-DAT基质胶8周后，通过PhotoshopCS6软件计数CD31+新生血管数量。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明的基本构思，是利用吸脂手术患者自愿捐赠的无菌脂肪组织，从该脂肪组织中分离出细胞外基质和脂肪提取液，从细胞外基质中制得脱细胞脂肪基质DAT，并处理成DAT基质胶；从脂肪提取液中制得脂肪源细胞外囊泡AT-EV，将脂肪源细胞外囊泡AT-EV分散到所述DAT基质胶中，制得富含脂肪源细胞外囊泡基质胶。
具体的实现方法可按照如下方式进行：
步骤一、脂肪组织的处理
将吸脂手术患者自愿捐赠的无菌脂肪组织在两个小时内以1000×g离心5 min后，去除上层油脂和下层液体，保留中层纯化的脂肪组织；使用匀浆机将脂肪组织与等体积PBS以12000 r/min匀浆3 min获得乳糜脂肪。将乳糜脂肪在37~－80℃反复冻融3次，每次冻融时间约1 h；将冻融3次后的乳糜脂肪以3 000×g离心5 min，可获取四层物质，由上至下分别为油脂、细胞外基质、脂肪提取液和细胞外基质。去除上层油脂并收集细胞外基质和脂肪提取液，参见图1A所示。
步骤二、制备脱细胞脂肪基质DAT
将按照步骤一获取的细胞外基质进行脱细胞化处理，得到脱细胞脂肪基质，具体方法如下：将细胞外基质孵化于等体积0.05%胰蛋白酶中，放置于37℃恒温水浴摇床上消化16h；3000×g离心5 min后收集白色沉淀。
然后，将白色沉淀物在99.9%异丙醇溶液中萃取18 h以去除脂质。使用等体积核酸酶溶液(Sigma公司，美国)（包括500 U/mL DNase TypeⅠ和1 mg/mL RNase）与白色沉淀物孵化过夜处理。用99.9%异丙醇溶液再次萃取6 h，去除剩余脂质，获取的白色沉淀物即为DAT。
以上步骤均在超净台下完成，且每个步骤结束后均使用PBS液至少清洗3遍。
步骤三、制备DAT基质胶
将DAT使用冻干机进行冻干并在液氮中研磨成粉末。将研磨后的的DAT用胃蛋白酶-HCL溶液 (1mg胃蛋白酶溶解于0.5ml 0.1 M HCl) 在室温下进行消化48h，比例为每10 mg DAT加入1 mg胃蛋白酶(使反应液中DAT浓度为50mg/ml)。随后，将该浓度的DAT溶解液置于冰板上滴加1.0 M NaOH溶液，使pH缓慢升高至7.4左右，即可获取液态DAT凝胶，DAT凝胶在4℃时为液体，在37°C水浴加热30分钟后变为凝胶状“DAT基质胶”，参见图1B所示。
其中，对按照步骤二制备的脱细胞脂肪基质DAT和步骤三制备的DAT基质胶分别表征如图2所示，表征方法为：
将DAT和DAT基质胶分别于2.5%戊二醛溶液中固定4 h，梯度乙醇脱水处理后临界点干燥，涂覆金，扫描电镜(Zeiss公司，德国)下观察并拍照。如图2上部所示，DAT中未发现细胞和细胞碎片存在，同时可见到粗大的纤维胶原束；而图2下部的DAT基质胶中可见大小不一的孔径。
步骤四、制备脂肪源细胞外囊泡AT-EV
将按照步骤一获取的脂肪提取液在4°C以300×g离心5分钟，去除组织碎片，收集上清液；以4°C、 2000×g离心10分钟去除细胞碎片并收集上清液，再以4°C、 10,000×g离心30分钟去除大体积囊泡（凋亡小体）；将上清液覆盖在铺有四层蔗糖垫溶液（从上至下分别为0.5 M、1.0 M、1.5 M、2.0 M，体积为1ml）的超高速透明管(SW41 Beckman，容量为13.2 ml）上，在超高速离心机(Beckman公司，美国)以4°C、 180,000×g离心120分钟。
然后将离心后的5层上清液分别置于超高速透明管中加入等体积PBS溶液并经过0.22μm滤头过滤后，以4°C、 100,000×g离心70min，移除上清液，使用PBS液重悬沉淀，将获取AT-EV悬液置于-80℃备用，分离过程参见图1C。
对按照步骤四获取的5层AT-EV进行Western blot检测AT-EV膜蛋白标记物：取步骤四获取的5层AT-EV通过RIPA裂解液获取蛋白悬液，并使用BCA蛋白测定法评估蛋白浓度。采用NuPage电泳系统对蛋白提取物进行SDS-PAGE电泳，然后转移固定至聚偏二氟乙烯膜上；分别加入兔抗人CD81、TSG 101、CD63一抗(Abcam公司，美国，1：200)孵育过夜。然后加入二抗室温孵育1 h，加入显影液，上机曝光。以脂肪组织作为对照。结果显示第二层和第三层蔗糖垫溶液(F2、F3)细胞外囊泡标记物（CD81，TSG 101、CD63）的表达最强。因此，确定AT-EV主要聚集在第二层F2和第三层F3蔗糖垫溶液中 (参见图3A) 。
以下对按照本步骤制备的AT-EV进行鉴定和表征，包括2个方面：
（1）AT-EV粒径分布检测
基于以上（1）中Western blot检测的结果，取浓度为50 μg/mL的F2（第二层）、F3（第三层）获取的AT-EV 100 μL重悬于1.5 mL PBS内，经纳米颗粒跟踪分析仪NanoSight进行检测品。F2获取的AT-EV粒径主要分布于87.4-323.2nm之间，平均粒径为170.7nm，F3获取的AT-EV粒径主要分布于94.4-230.2nm之间，平均粒径为147.1nm (参见图3B) 。
（2）AT-EV透射电镜下形态观察
取F2（第二层）、F3（第三层）获取的AT-EV 10 μL滴于透射电镜专用的载样铜网上，常温静置2 min，滤纸吸去浮液，用1%（W/V）磷钨酸溶液染色5 min后，滤纸吸去多余染色液，晾干，透射电镜(Zeiss公司，德国)成像并拍照，可见到F2获取的AT-EV直径为100nm左右的圆形囊泡状结构，F3获取的AT-EV直径为150nm左右的圆形囊泡状结构 (参见图3C) 。
为了研究AT-EV诱导组织细胞分化的特点、以了解其作为软组织填充剂的应用前景，以下为将本步骤制备的AT-EV ，分别在体外与人脂肪干细胞共培养、人脐静脉内皮细胞进行共培养实验，实验方法如下：
实验1：AT-EV诱导人脂肪干细胞成脂分化实验
第一步：人脂肪干细胞的获取
无菌条件下采集吸脂术获得的游离脂肪组织10 mL，PBS冲洗3次去除血液、结缔组织后，加入等体积0.2%Ⅰ型胶原酶，置于37℃恒温水浴箱消化，直至变为糊状。以1 200×g离心5 min，弃上清，保留最下层沉淀。完全培养基重悬沉淀后接种于培养瓶内，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，48 h后首次换液，之后每隔24 h换液，待细胞融合至90% 后传代。
第二步：AT-EV体外与人脂肪干细胞（ADSCs）共培养
使用BCA 法检测AT-EV的蛋白浓度，然后将其分别调至20μg/ml、50μg/ml、80μg/ml。取步骤二获取的人第3代ADSCs，以5×105个/孔浓度接种至6孔板中。实验分为5组每组3个复孔，分别为阴性对照组、阳性对照组和纯化AT-EV浓度分别为20μg/ml、50μg/ml、80μg/ml组。阴性对照组采用单纯完全培养基培养；阳性对照组采用成脂诱导培养基（10%的胎牛血清、1μmol/l地塞米松、0.5mmol/l IMBX 、10μmol/l胰岛素、200μmol/l吲哚美辛）培养；实验组采用添加20μg/ml、50μg/ml、80μg/ml纯化AT-EV的完全培养基培养。于第7天行油红O染色观察。使用倒置相差显微镜（Olympus 公司，日本）观察油红O染色表达区域的视野，通过ImageJ软件计算油红O染色阳性脂滴的密度。
结果显示成脂分化结果由高至低分别为阳性对照组、80μg/ml AT-EV组、50μg/mlAT-EV组、20μg/ml AT-EV组和阴性对照组。
此实验表明：本步骤制备的AT-EV对人脂肪干细胞具有成脂诱导能力。80μg/mlAT-EV组、50μg/ml AT-EV组成脂结果不存在统计学差异。因此，从节约成本角度考虑，可确定50μg/ml 为AT-EV成脂诱导的最适浓度。(参见图4A和图4B)
实验2：AT-EV诱导人脐静脉内皮细胞血管样分化
本实验使用的人脐静脉内皮细胞是第3代人脐静脉内皮细胞，购自ATCC美国细胞库，经复苏、传代和培养得到。
AT-EV体外与人脐静脉内皮细胞共培养的实验方法：
将基质胶置于冰上，4°C冰箱过夜孵化，将液态基质胶转移入预冷的一次性医用注射器中并平铺于96 孔板中，37℃孵育 30 min 使其凝固。用无血清培养基重悬第3 代 HUVECs后接种至 96 孔板中，每孔 2×104 个细胞。实验分为5组：分别为阴性对照组、阳性对照组和AT-EV浓度分别为20μg/ml、50μg/ml、80μg/ml的实验组。阴性对照组采用单纯完全培养基培养；阳性对照组采用成血管诱导培养基培养；实验组采用添加20μg/ml、50μg/ml、80μg/ml纯化AT-EV的完全培养基培养。每组 5 个复孔。于 37℃ 处理 12 h 后，倒置相差显微镜（Olympus 公司，日本）下观察管状结构形成情况，计数每孔管样结构数量。
结果显示管样结构形成从高至低依次为阳性对照组、50μg/ml AT-EV组、80μg/mlAT-EV组、20μg/ml AT-EV组、阴性对照组。
此实验表明：本步骤制备的AT-EV对人脐静脉内皮细胞具有一定的成血管诱导能力。80μg/ml AT-EV组、20μg/ml AT-EV组成脂结果不存在统计学差异，且均低于50μg/mlAT-EV组。因此，从作用效果角度考虑，可确定50μg/ml 为AT-EV成血管诱导的最适浓度。(参见图4A, 图4C)
步骤五、制备AT-EV-DAT基质胶
将按照步骤三获得的脱细胞脂肪基质DAT基质胶和步骤四获得的脂肪源细胞外囊泡AT-EV悬液在冰板上混合均匀，且控制AT-EV在基质胶中的分布浓度。由于上述实验1和实验2已发现AT-EV诱导脂肪干细胞成脂分化及血管内皮细胞管样分化的最适浓度为50μg/ml，因此，AT-EV-DAT基质胶中AT-EV的浓度较佳为50μg/ml。
应用例
以下将上述步骤五制备的AT-EV-DAT基质胶在小鼠（SCID小鼠和C57小鼠）中进行构建脂肪新生物的应用例，以探究本发明的AT-EV-DAT基质胶作为软组织填充剂，在促进脂肪组织再生和免疫原性方面的特点。应用实验方法如下：
步骤1：AT-EV-DAT基质胶皮下注射
取6-8周龄雌性严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠和C57小鼠各6只，按每千克10ml 1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，使用27G针头分别将AT-EV-DAT基质胶和DAT基质胶点状注射至小鼠右侧和左侧背部皮下，各0.3 mL。
步骤2：新生物的组织学检测
于注射后第8周脱颈处死实验小鼠，实验期间无小鼠死亡，剥离背部皮肤，均可见新生物外覆有纤维包膜和新生血管长入，将新生物与周边组织分离。观察第8周新生物，可见与DAT基质胶注射组相比，AT-EV-DAT基质胶注射组的新生物体积更大 (参见图5A、图5D)。
使用电子天平称量新生物的湿重，发现实验组新生物平均湿重大于对照组（SCID小鼠：127.8±43.7 vs. 86.9±37.8 mg; C57小鼠：123.6±42.5 vs. 80.9±36.1 mg），且存在统计学差异(P＜0.05) (参见图5B、图5E)。
利用排水法测量移植物的体积，发现实验组新生物平均湿体积于对照组（SCID小鼠：176.0±54.6 vs. 120.9±56.0 μL; C57小鼠：184.5±48.4vs. 113.0±43.9 μL），且存在统计学差异(P＜0.05) (参见图5C、图5F)。
将新生物经多聚甲醛固定、梯度酒精脱水、石蜡包埋按样本纵轴切片，行苏木精-伊红（HE）染色、CD31-围脂滴蛋白免疫荧光双标染色观察组织结构。HE染色可见实验组和对照组新生物中均有单房脂滴形成，实验组单房脂滴样结构的密度大于对照组，而对照组新生物中纤维结构明显多于实验组。CD31-围脂滴蛋白免疫荧光双标染色可见围脂滴蛋白荧光强度也高于对照组(参见图6A、图6C)。
通过PhotoshopCS6软件计数CD31+新生血管，结果显示：实验组新生血管数量多于对照组（SCID小鼠：36.1±12.7 vs. 18.4±9.2 个/视野（400×）; C57小鼠：41.7±8. 5vs. 24.4±11.0 个/视野（400×）），且有统计学差异(P＜0.05) (参见图6B、图6D)。
以上实验结果证实AT-EV-DAT基质胶在SCID小鼠和C57小鼠体内均可构建出脂肪新生物，成脂效果及再血管化程度均高于DAT基质胶，且在具有成熟T细胞和B细胞免疫的C57小鼠体内异种移植未见明显排异反应。因此，可以确定本发明的AT-EV-DAT基质胶具有极低的免疫原性，在临床上具有非常理想的异体移植前景，有望成为产品化的新一代软组织填充剂。

Claims (10)

1.一种富含脂肪源细胞外囊泡基质胶的制备方法，其特征在于，从脂肪组织中通过纯物理方法分离出细胞外基质和脂肪提取液，从细胞外基质中制得脱细胞脂肪基质DAT，并处理成可通过细针注射的脱细胞脂肪基质胶DAT- Matrigel；从脂肪提取液中分离出细胞外囊泡AT-EV，将脂肪源细胞外囊泡AT-EV分散到所述DAT- Matrigel中，制得富含脂肪源细胞外囊泡的脱细胞基质胶AT-EV-DAT- Matrigel。
2.根据权利要求1所述富含脂肪源细胞外囊泡基质胶的制备方法，其特征在于，其包括：
S1: 脂肪组织的处理:
将吸脂手术患者自愿捐赠的无菌脂肪组织在两个小时内进行离心处理，去除上层油脂和下层液体，保留中层纯化的脂肪组织；使用匀浆机将脂肪组织与等体积PBS混合并高转速匀浆，获得乳糜脂肪；
将乳糜脂肪反复进行冻融处理，将反复冻融处理的乳糜脂肪离心，获得四层物质，由上至下分别为油脂、细胞外基质、脂肪提取液和细胞外基质；去除上层油脂并收集第二层、第四层的细胞外基质和第三层的脂肪提取液；
S2:制备脱细胞脂肪基质DAT:
将按照步骤S1得到的细胞外基质进行脱细胞化处理，得到脱细胞脂肪基质DAT，其方法为：
将按照步骤S1得到的细胞外基质孵化于胰蛋白酶中，并在该胰蛋白酶活性最佳温度下消化10h以上，高速离心收集白色沉淀物；将白色沉淀物在无水有机溶剂中萃取以初步去除脂质，再使用等体积的核酸酶溶液与经初步去除脂质的白色沉淀物孵化过夜，再用无水有机溶剂进行多次萃取，以去除剩余的脂质，得到白色沉淀物为脱细胞脂肪基质DAT；
S3: 制备脱细胞脂肪基质胶DAT- Matrigel
将按照步骤S2获得的脱细胞脂肪基质DAT冻干处理，并在液氮中研磨成粉末；将研磨后的DAT用胃蛋白酶-HCL溶液在室温下进行消化40-60h，随后向DAT溶解液滴加碱溶液，使pH缓慢升高至7.2-7.8，获得液态DAT凝胶，将液态DAT凝胶在35-38°C下加热，制得DAT基质胶；
S4: 制备脂肪源细胞外囊泡AT-EV
将按照步骤S1得到的脂肪提取液先以400×g以下转速离心处理，去除组织碎片，收集上清液，再以1500~2500×g转速离心去除细胞碎片并收集上清液，最后以8000-12000×g转速离心去除大体积囊泡或凋亡小体，将上清液覆盖在铺有四层蔗糖垫溶液的超高速离心管上，在超高速离心机上以160000-200000×g转速离心1.5-3h，将离心后的5层上清液分别置于超高速离心管中，分别加入等体积PBS溶液并经微滤膜过滤，在80000-120000×g转速离心0.5-1.5 h，移除上清液，使用PBS溶液重悬沉淀，得到脂肪源细胞外囊泡AT-EV悬液，置于-80℃下保存备用；
S5: 制备AT-EV-DAT基质胶
将按照步骤S3获得的脱细胞脂肪基质DAT基质胶和步骤S4获得的脂肪源细胞外囊泡AT-EV悬液在低温下混合均匀，制得到AT-EV-DAT基质胶。
3.根据权利要求2所述富含脂肪源细胞外囊泡基质胶的制备方法，其特征在于，S1中：将吸脂手术患者自愿捐赠的无菌脂肪组织在两个小时内以1000×g转速离心5 mi，去除上层油脂和下层液体，保留中层纯化的脂肪组织；使用匀浆机将脂肪组织与等体积PBS以12000 r/min匀浆3 min获得乳糜脂肪；将乳糜脂肪在37~－80℃反复冻融3次，每次冰冻时间不少于1 h，在3000×g的转速离心5 min，获得四层物质。
4.根据权利要求2所述富含脂肪源细胞外囊泡基质胶的制备方法，其特征在于，S2中：将按照步骤S1得到的细胞外基质孵化于等体积0.05%胰蛋白酶中，在37℃恒温水浴摇床上消化16 h，再以3000×g的转速离心5 min后收集白色沉淀物，采用99.9%异丙醇溶液中萃取18 h以去除脂质，再使用等体积的核酸酶溶液与白色沉淀物孵化过夜处理，用99.9%异丙醇溶液中萃取6h，去除剩余的脂质，得到脱细胞脂肪基质DAT；其中核酸酶溶液来自Sigma公司，其含有500U/mL DNase TypeⅠ和1mg/mL Rnase。
5.根据权利要求2所述富含脂肪源细胞外囊泡基质胶的制备方法，其特征在于，S3中：将按照步骤S2获得的脱细胞脂肪基质DAT冻干并在液氮中研磨成粉末，将研磨后的DAT用胃蛋白酶-HCL溶液在室温下进行消化48h，该胃蛋白酶-HCL溶液是将每1mg胃蛋白酶溶解于0.5ml 0.1M HCl中制成；随后将DAT溶解液置于冰板上滴加1.0 M 的NaOH溶液，使pH缓慢升高至7.4，获得液态DAT凝胶，将液态DAT凝胶37°C水浴加热转变为固态DAT基质胶。
6.根据权利要求2所述富含脂肪源细胞外囊泡基质胶的制备方法，其特征在于，S4中：将按照步骤S1得到的脂肪提取液在4°C以300×g转速离心5min 去除组织碎片，收集上清液，再在4°C以2000×g转速离心10min去除细胞碎片并收集上清液，最后在4°C以10000×g转速离心30min去除大体积囊泡或凋亡小体，将上清液覆盖在铺有四层蔗糖垫溶液的超高速透明管上，所述四层蔗糖垫溶液从上至下浓度依次为0.5 M、1.0 M、1.5 M、2.0 M；然后在超高速离心机上以180000×g转速离心2h，留取离心后的5层上清液的第二层和第三层置于超高速离心管中，加入等体积PBS溶液并经微滤膜过滤，在4℃下以100000×g转速离心70min，移除上清液，使用PBS溶液重悬沉淀，得到脂肪源细胞外囊泡AT-EV悬液，置于-80℃下保存备用。
7.根据权利要求2所述富含脂肪源细胞外囊泡基质胶的制备方法，其特征在于，S5中：在制备AT-EV-DAT基质胶时，使DAT基质胶和AT-EV在冰板上混合均匀，且控制AT-EV的浓度使AT-EV的浓度为50μg/ml。
8.一种富含脂肪源细胞外囊泡基质胶，其是采用权利要求1-7任一项所述的制备方法制得。
9.权利要求8所述的富含脂肪源细胞外囊泡基质胶在构建生物体脂肪新生物组织中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述构建生物体脂肪新生物组织包括但不限于丰胸、丰臀、脂肪移植、脂肪组织填充和再生。
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