CN108478868A - 可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法及应用 - Google Patents

可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法及应用，由吸脂手术得到的脂肪组织，经过机械乳糜化处理、离心去油、后续温和的脱细胞工序，离心进一步脱脂所得；其中，脂肪组织来源于传统肥胖病人吸脂手术废弃的人源性的脂肪颗粒，本发明采用了物理破碎脂肪细胞和脱脂方法以及应用温和脱细胞的技术，操作简便，对脂肪的基质结构和成分破坏小，所获得的材料更接近人体天然脂肪组织微环境，保留了组织的三维结构和活性成分，可用27g的小针头进行注射，注射后更利于受区组织细胞的增殖和分化，从而促进组织的修复与再生，起到长久的填充和年轻化效果。本发明的产品适用于面部年轻化和软组织缺损的修复。

Description

可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及医学整形美容材料领域，具体涉及一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法及应用。
背景技术
随着社会发展，人们生活水平的提高及近年来微整形的普及，注射填充材料的应用在国际上和国内需求大增。目前常用的注射填充材料是玻尿酸，它优点明显，但也存在着降解吸收问题，而且不能刺激组织再生，所以也不能从基本上解决年轻化问题。
非手术或微创伤治疗是整形美容的发展方向之一，填充治疗常是面部细小皱纹或容量缺失处理的首选方法，全身软组织的填充都可以应用。安全、高效、微创、经济常被作为材料选择的客观标准。目前，市面上已有多种填充材料应用到整形领域，其中，人工合成材料如羟基磷灰石钙、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺水凝胶、聚乳酸等，虽然具有物理力学、可塑性和长效保持等优点，但由于存在生物相容性及安全性等方面的问题严重制约其发展。生物材料如胶原、透明质酸等目前临床应用较多，当前市场上可注射型胶原蛋白主要分为动物来源的胶原蛋白(来源于牛或者猪)、人胶原蛋白，牛胶原蛋白和猪胶原蛋白由于来源异种，有潜在的超敏反应，注射前须行过敏试验，并且其降解吸收较快，需短时间内补充注射以维持疗效。而人胶原蛋白则具有更佳的生物相容性，且无需皮试，但它同样存在保持时间短的问题，另外，人胶原蛋白还存在着原材料来源困难的问题，费用高。相比之下，透明质酸是一种由葡萄糖醛酸和氨基葡萄糖组成的二糖单体聚合形成的酸性粘多糖，多存在于动物的皮肤和结缔组织内，是构成细胞外基质的必须物质。由于所有生物体内的HA分子结构相同，没有物种及组织的差异，没有免疫原性，因此用于临床注射时，无需做皮试。鉴于其出色的生物相容性和填充效果正逐步取代胶原蛋白，成为当前主流的皮肤填充材料。然而，透明质酸仍是维持时间比较短，因此需要周期性注射，价格昂贵，受众面小。
脱细胞基质是通过各种物理化学方法去除组织中具有免疫原性的细胞成分，尽量其保留基质成分的一种生物材料。脱细胞基质具有天然的生物学结构，含有各类蛋白如胶原蛋白，纤连蛋白，弹性蛋白和蛋白聚糖可以为细胞提供良好的微环境，可以调节细胞行为，促进细胞增殖和分化潜能，因此可诱导注射部位的组织再生，起到长久的填充效果。脱细胞基质在皮肤再生修复、神经修复、防粘连莫、组织填充等方面已经有上市的应用产品。
而相比其他组织，脂肪是人体含量最多的组织类型，而脂肪来源基质成分能够更好诱导脂肪细胞分化，诱导脂肪组织再生。目前尚无采用异体脱细胞脂肪为原料制备可注射充填材料的产品面世。
中国专利CN201610967425.9公开了可注射的脱细胞脂肪基质微粒及其在植入剂中的应用，该方法采用动物组织中的胶原蛋白纤维来制备可注射的脱细胞脂肪基质微粒，存在着引起人体的免疫反应和动物源性病原体传播的顾虑。并且，以异丙醇等各种有机溶剂来进行脱脂，不但耗时长，而且会引起后续有机溶剂残留，影响基质材料的生物安全性和生物活性。此外，该专利制备微粒的方法是动物来源的大块脂肪组织切成薄片经脱细胞后进行低温研磨从而制得可注射微粒，过程复杂，较大的组织块或组织片增加了化学试剂脱细胞的作用时间以及作用浓度，增加试剂残留的风险。试剂残留对细胞有毒性作用，这种脱脂的方法可破坏细胞基质的天然化学结构和成分，材料的生物活性下降，进一步影响了支架材料诱导的组织再生，从而限制其注射填充效果。
发明内容
本发明提供了一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法及应用，包括获取吸脂术后人脂肪颗粒，利用机械乳糜化和离心的物理方法对其进行脱脂，并同时将脂肪颗粒进行微粒化处理，从而降低化学脱脂试剂和脱细胞试剂对支架结构的不良影响。
为了解决上述技术问题，本发明特提供如下技术方案：
一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)脂肪采集及纯化处理；
通过吸脂技术获取人源性的脂肪颗粒，将所得的脂肪颗粒用漂洗液清洗两遍，以去除脂肪组织中的红细胞，收集脂肪颗粒于注射器内，离心操作；
弃去上层油脂和下层液体，收集中部的脂肪颗粒；
(2)乳糜化处理；
将步骤(1)获得脂肪颗粒进行机械乳糜化处理，离心去油，制成脂肪微粒；
(3)脱细胞处理；
将步骤(2)所得的脂肪微粒脱去细胞碎片及抗原，同时通过漂洗和离心进一步去油和脱脂，获得脂肪脱细胞基质微粒；
(5)干燥灭菌处理；
将步骤(3)所得的脂肪脱细胞基质微粒进行冷冻干燥，辐照灭菌。
如上所述的一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，其中，
步骤(1)中的吸脂技术为水动力辅助吸脂技术、传统机械负压和手工注射器负压吸脂技术、超声辅助吸脂技术或共振辅助吸脂技术中的至少一种；
步骤(1)中的离心转速3000rpm～5000rpm，离心时间为10～12分钟；
所述漂洗液为无菌的蒸馏水、生理盐水或者PBS缓冲液；优选为蒸馏水。
如上所述的一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，其中，
所述乳糜化处理包括如下步骤：
3)用螺旋口注射器抽取脂肪颗粒，通过鲁尔接头与另一螺旋口注射器相连，来回推注这两个注射器直至脂肪颗粒在推注器中移动流畅；
4)依次连接孔径逐渐减小的鲁尔接头重复至少两次上述步骤1)进行逐层乳糜化，网筛过滤，获取直径小于200um的可注射型脂肪微粒；
如上所述的一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，其中，
所述鲁尔接头的孔径大小为1.2～2.4mm或0.8～1.2mm；
如上所述的一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，其中，
步骤(2)中的离心转速3000rpm～6000rpm，离心时间为5～10分钟，去油率≥90。
如上所述的一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，其中，
步骤(3)脱细胞处理中的脱去细胞碎片及抗原的具体过程包括：
将所得的脂肪微粒置于1M～2M高渗氯化钠溶液，在37℃浸泡2小时，漂洗3次，每次均离心换液；再放入1～3％Triton X-100室温下震荡处理10～12小时，漂洗4次，每次均离心换；最后用0.2％DNase和200lg/mL RNase在37℃震荡处理处理1～3小时，再漂洗；
上述离心转速为以1200rpm～1500rpm离心5min。
一种脂肪脱细胞基质水凝胶，其中，脂肪脱细胞基质水凝胶由脂肪脱细胞基质微粒进一步采用物理交联方法或化学交联方法制备而成。
如上所述的一种脂肪脱细胞基质水凝胶，其中，所述物理交联方法为使用紫外光、电子束、γ射线辐射中的至少一种；
物理交联方法还包括将得到的脂肪脱细胞基质微粒在室温下用胃蛋白酶充分溶解，然后调节pH值为7.4，置于37℃形成凝胶的方法。
如上所述的一种脂肪脱细胞基质水凝胶，其中，所述化学交联方法为交联剂碳化二亚胺、戊二醛、京尼平中的至少一种。
一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的应用，其适用于面部年轻化和软组织损伤修复、体表所有的软组织缺损的填充。
与现有技术相比，本发明产生的有益效果主要体现在：
1、随着中国肥胖病人增多，吸脂手术在不断增加，所以脂肪组织来源丰富；本发明的一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，采用人吸脂手术后多余的脂肪组织，属于废物再利用，故来源广泛，价廉易得；
2、本发明的一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，相比其它种属和其它组织来源的脱细胞基质，由人源性脂肪组织制备而成的脱细胞基质与人体天然脂肪组织微环境更接近，更利于注射部位脂肪组织的再生，从而起到更好的填充和修复的效果；
3、本发明的一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，采用物理乳糜化方法对脂肪组织进行去油和微粒化处理，并在后续脱细胞过程进一步采用离心的方法脱脂，降低化学脱脂试剂和脱细胞试剂残留的毒性影响，生物安全性更高；
4、本发明的一种脂肪脱细胞基质水凝胶，制备的脂肪脱细胞基质水凝胶质地柔软，富有弹性，与活体软组织质感相近，应用方便；可通过调节孔隙率、孔径大小等途径，促进细胞植入、黏附与生长；可通过调控其力学特性与降解速度，个性化的应用于不同组织、不同部位的填充和再生修复。
5、本发明的一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，发明制备的脂肪脱细胞基质微粒植入后，能诱导细胞长入，使组织有序更新，与人体自身组织很好兼容，可以永久存活。
6、本发明的一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，本发明制备的脂肪脱细胞基质微粒，可以作为干细胞、细胞因子和药物的载体，持续刺激组织再生和修复，具有较好的远期疗效。
具体实施方式
为了便于理解本发明的目的、技术方案及其效果，现将结合实施例对本发明做进一步详细阐述。
本发明的一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)脂肪采集及纯化处理；
通过吸脂技术获取人源性的脂肪颗粒，将所得的脂肪颗粒用漂洗液清洗两遍，以去除脂肪组织中的红细胞，收集脂肪颗粒于注射器内，离心操作；
弃去上层油脂和下层液体，收集中部的脂肪颗粒；
(2)乳糜化处理；
将步骤(1)获得脂肪颗粒进行机械乳糜化处理，离心去油，制成脂肪微粒；
(3)脱细胞处理；
将步骤(2)所得的脂肪微粒脱去细胞碎片及抗原，同时通过漂洗和离心进一步去油和脱脂，获得脂肪脱细胞基质微粒；
(4)干燥灭菌处理；
将步骤(3)所得的脂肪脱细胞基质微粒进行冷冻干燥，辐照灭菌。
本发明提供了一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质颗粒及其制备方法，因为随着生活水平的提高，肥胖发生率越来越高，在美国，吸脂手术是最受欢迎和做得最多的美容手术，中国的吸脂手术也是越来越多。而传统的吸脂手术都将吸出的脂肪废弃，而本发明将其废物利用。所述方法包括获取吸脂术后人脂肪颗粒，利用机械乳糜化和离心的物理方法对其进行脱脂，并同时将脂肪颗粒进行微粒化处理，从而降低化学脱脂试剂和脱细胞试剂对支架结构的不良影响。在此基础上用温和的脱细胞技术去除具有免疫原性的细胞成分，获取具有生物活性的脂肪脱细胞基质微粒。
相对于动物源性的脂肪组织，人源性的脂肪组织制备的注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒优势明显。首先是人源的组织生物相容性更好，更不易于发生排异反应；制备时不需要更强的化学试剂以及更长时间的脱细胞，基质的生物活性更好。应用的是吸脂的颗粒来制备的，配合机械的乳糜化的方法，制备方法相对更容易操作。
通过下述实施例进一步了解所述可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法及应用：
实施例1
本发明的一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法主要包括以下步骤：
(1)脂肪采集及纯化处理：选择需要进行吸脂的患者，应用机械负压、注射器手动负压、水动力辅助吸脂、振动辅助吸脂等方法将脂肪堆积的部位(上臂、肩部、腹部、腰部、臀部、大小腿等)进行吸脂，将获得颗粒脂肪用无菌蒸馏水洗2遍，以去除脂肪组织中的红细胞，收集脂肪颗粒于50ml或更大的离心管中，以3000rpm离心12min；弃去上层油脂和下层液体，收集中部脂肪颗粒；
脂肪是人体含量最多的组织类型，来源丰富，通过抽脂术即可获取，而人源性脂肪脱细胞基质跟人体的组织成分更接近，所以获取人源性脂肪组织制备可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒可能成为软组织填充的理想材料。这里选择的是经过抽吸的脂肪颗粒，已经是成了颗粒状了，特别利于进一步的制备和纯化，然后再进行高速而且长时间的离心旨在破坏不稳定的脂肪细胞同时也提高了纯化效率。
(2)乳糜化处理：用20ml螺旋口注射器抽取脂肪颗粒，用孔径为2.4mm的鲁尔接头(乳化器)连接至另一20ml螺旋口注射器，或者用更大容量的机械装置，来回推注这两个注射器约10-30次左右，直至脂肪颗粒在推注器中移动流畅。然后依次连接更小孔径(1.2mm、0.8mm)的鲁尔接头(乳化器)重复上述步骤进行逐层乳糜化。以3000-5000rpm离心3-5min，弃掉上层油。大量的脂肪可以通过电动推拉通过乳化器，同样达到乳化脂肪颗粒的目的。将获取的脂肪颗粒通过Nano Transfer进行过滤，可获取直径小于200um脂肪微粒，进一步3000-5000rpm离心3-5min，弃掉上层油。
来回推注形成的物理剪切力将脂肪组织中的成熟脂肪细胞进行最大程度的破坏，而相较于传统采用同一种孔径的鲁尔接头(乳化器)的乳糜化方法，逐级乳糜化降低了注射器推注的难度，获得的脂肪颗粒小且均匀。所获得的直径小于200um微粒即可通过25至27g小注射针头，无需在后续进行冷冻研磨等处理。此外，经过以上物理机械处理获取的脂肪微粒，可以增加去污剂或生物酶与组织的接触，缩短脱细胞时间，降低脱细胞化学试剂对基质结构和成分的影响。
(3)脱细胞处理：将所得的脂肪微粒以1：1的比例置于1M高渗氯化钠溶液，在37℃浸泡2小时，以1200rpm离心5min，进一步去掉上层油以及离心管中液体，无菌PBS缓冲液震荡漂洗3次，每次1小时。再放入1％Triton X-100室温下震荡处理12小时，无菌PBS缓冲液震荡漂洗4次，每次1小时，震荡速度为120rpm。用0.2％DNase(2000U)和200lg/mL RNase在37℃处理1小时；离心并用无菌PBS缓冲液震荡漂洗；储存在4C无菌蒸馏水待用。
在此步骤中，高渗氯化钠溶液和除垢剂用以去掉细胞膜和胞浆物质，并辅以漂洗和离心的方法进一步去除材料中的油脂。DNase和RNase用以脱去材料中剩余的核成分。
(4)干燥灭菌处理：程序性降温到－80℃，冻干后用γ射线照射(25～35kGy)消毒；真空放置在密封袋中，并于4℃保存备用。
(5)上述制备的脂肪脱细胞基质微粒可用于面部年轻化及软组织损伤修复，直接将该微粒置于注射器中，通过27G注射针头进行真皮内注射或局部精确注射填充即可。
实施例2
本发明一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法主要包括以下步骤：
(1)脂肪采集及纯化：选择患者腹部区域进行传统负压辅助吸脂术，将获得颗粒脂肪用无菌蒸馏水洗3遍，收集脂肪颗粒于50ml或更大的离心管中，以5000rpm离心10min，弃去上层油脂和下层液体，收集中部脂肪颗粒。
(2)乳糜化处理：用20ml螺旋口注射器抽取脂肪颗粒，用孔径为2.4mm的鲁尔接头(乳化器)连接至另一20ml螺旋口注射器，或者用更大容量的机械装置，来回推注这两个注射器约10～30次左右，直至脂肪颗粒在推注器中移动流畅。然后依次连接更小孔径(1.2mm、0.6mm)的鲁尔接头(乳化器)重复上述步骤进行逐层乳糜化。3000-5000rpm离心3-5min，弃掉上层油。大量的脂肪可以通过电动推拉通过乳化器，同样达到乳化脂肪颗粒的目的。将获取的脂肪颗粒通过的Nano Transfer进行过滤，可获取直径小于200um脂肪微粒，进一步3000-5000rpm离心3-5min，弃掉上层油。
(3)脱细胞处理：将所得的脂肪微粒以1：1的比例置于1.5M高渗氯化钠溶液，在37℃浸泡2小时，以1500rpm离心5min，进一步去掉上层油以及离心管中液体，无菌蒸馏水震荡漂洗3次，每次1小时。再放入3％Triton X-100室温下震荡处理110小时，无菌蒸馏水震荡漂洗4次，每次1小时，震荡速度为120rpm。用0.2％DNase(2000U)和200lg/mL RNase在37℃处理1小时；离心并用无菌蒸馏水震荡漂洗；储存在4C无菌蒸馏水待用。
(4)干燥灭菌处理：程序性降温到－80℃，冻干后用γ射线照射(25～35kGy)消毒；真空放置在密封袋中，并于4℃保存备用。
(5)将得到的脂肪脱细胞基质微粒在室温下用胃蛋白酶(浓度为1mg/mL,pH值为7.4)充分溶解48小时，然后用1M NaOH调节pH值为7.4，得到的溶液混合或不混合脂肪干细胞，置于37℃约10至1分钟形成凝胶。该水凝胶形成该水凝胶能支持人脂肪间充质干细胞的黏附生长。
上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (10)

1.一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)脂肪采集及纯化处理；
通过吸脂技术获取人源性的脂肪颗粒，将所得的脂肪颗粒用漂洗液清洗两遍，以去除脂肪组织中的红细胞，收集脂肪颗粒于注射器内，离心操作；
弃去上层油脂和下层液体，收集中部的脂肪颗粒；
(2)乳糜化处理；
将步骤(1)获得脂肪颗粒进行机械乳糜化处理，离心去油，制成脂肪微粒；
(3)脱细胞处理；
将步骤(2)所得的脂肪微粒脱去细胞碎片及抗原，同时通过漂洗和离心进一步去油和脱脂，获得脂肪脱细胞基质微粒；
(4)干燥灭菌处理；
将步骤(3)所得的脂肪脱细胞基质微粒进行冷冻干燥，辐照灭菌。
2.根据权利要求1所述的一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中的吸脂技术为水动力辅助吸脂技术、传统机械负压和手工注射器负压吸脂技术、超声辅助吸脂技术或共振辅助吸脂技术中的至少一种；
步骤(1)中的离心转速3000rpm～5000rpm，离心时间为3～5分钟；
所述漂洗液为无菌的蒸馏水、生理盐水或者PBS缓冲液；优选为蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，其特征在于：
所述乳糜化处理包括如下步骤：
1)用螺旋口注射器抽取脂肪颗粒，通过鲁尔接头与另一螺旋口注射器相连，来回推注这两个注射器直至脂肪颗粒在推注器中移动流畅；
2)依次连接孔径逐渐减小的鲁尔接头重复至少两次上述步骤1)进行逐层乳糜化，网筛过滤，获取直径小于200um的可注射型脂肪微粒。
4.根据权利要求1所述的一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，其特征在于：
所述鲁尔接头的孔径大小为1.2～2.4mm或0.8～1.2mm。
5.根据权利要求1所述的一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中的离心转速3000rpm～5000rpm，离心时间为3～10分钟，去油率≥90。
6.根据权利要求1所述的一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的制备方法，其特征在于：
步骤(3)脱细胞处理中的脱去细胞碎片及抗原的具体过程包括：
将所得的脂肪微粒置于1M～2M高渗氯化钠溶液，在37℃浸泡2小时，漂洗3次，每次均离心换液；再放入1～3％Triton X-100室温下震荡处理10～12小时，漂洗4次，每次均离心换；最后用0.2％DNase和200lg/mL RNase在37℃震荡处理处理1～3小时，再漂洗；
上述离心转速为以1200rpm～1500rpm离心5min。
7.一种脂肪脱细胞基质水凝胶，其特征在于：脂肪脱细胞基质水凝胶由脂肪脱细胞基质微粒进一步采用物理交联方法或化学交联方法制备而成。
8.根据权利要求7所述的一种脂肪脱细胞基质水凝胶，其特征在于：
所述物理交联方法为使用紫外光、电子束、γ射线辐射中的至少一种；
物理交联方法还包括将得到的脂肪脱细胞基质微粒在室温下用胃蛋白酶充分溶解，然后调节pH值为7.4，置于37℃形成凝胶的方法。
9.根据权利要求7所述的一种脂肪脱细胞基质水凝胶，其特征在于：
所述化学交联方法为交联剂碳化二亚胺、戊二醛、京尼平中的至少一种。
10.一种可注射型同种异体脂肪脱细胞基质微粒的应用，其特征在于：
其适用于面部年轻化和软组织损伤修复、体表所有的软组织缺损的填充。
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