CN115501393A - 用于修复神经缺损的水凝胶及其制备方法和用途 - Google Patents

用于修复神经缺损的水凝胶及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本申请提供一种用于修复神经缺损的水凝胶及其制备方法和用途，该水凝胶包括：用于提供适合神经缺损修复微环境的脂肪组织脱细胞基质水凝胶；和负载在所述脂肪组织脱细胞基质水凝胶用于促进神经缺损修复的干细胞。该水凝胶以脂肪组织脱细胞基质水凝胶为细胞载体，而脂肪组织脱细胞基质可来源于人体自身且原料丰富，可以解决现有技术中使用的细胞载体存在来源有限、容易发生免疫排斥反应、对供体损伤大以及伦理等问题。本申请提供的水凝胶制备方法简单，且对神经缺损具有良好的修复效果。

Description

用于修复神经缺损的水凝胶及其制备方法和用途
技术领域
本申请涉及组织工程与再生医学技术领域，具体涉及一种用于修复神经缺损的水凝胶及其制备方法和用途。
背景技术
组织工程技术作为神经缺损修复领域的研究热点，其中细胞移植是神经修复领域最具创新性的治疗方法。
单独移植细胞可能会导致细胞流失、活性降低和旁分泌作用减弱，且现有技术中使用的细胞载体存在来源有限、容易发生免疫排斥反应、对供体损伤大以及伦理等问题。
发明内容
本申请提供了一种用于修复神经缺损的水凝胶及其制备方法和用途，该用于修复神经缺损的水凝胶以脂肪组织脱细胞基质水凝胶为细胞载体，而脂肪组织脱细胞基质可来源于人体自身且原料丰富，可以解决现有技术中存在的各种问题。
第一方面，本申请提供了一种用于修复神经缺损的水凝胶，包括：
用于提供适合神经缺损修复微环境的脂肪组织脱细胞基质水凝胶；和
负载在所述脂肪组织脱细胞基质水凝胶用于促进神经缺损修复的干细胞。
在本申请的技术方案中，使用脂肪组织脱细胞基质水凝胶作为干细胞的载体，其中脂肪组织脱细胞基质可以来源于临床抽脂等获取的脂肪组织经过脱细胞处理后得到，因此来源丰富、不易发生免疫排斥反应且不会出现伦理问题；另外，水凝胶保留了脂肪组织脱细胞基质的生物活性成分，且具有与神经组织相似的机械性能、可作为物理支撑，能够有效促进血管再生，为神经修复提供营养，同时防止干细胞流失并提高干细胞活性，从而发挥有效的修复神经缺损的效果。
在本申请的一些实施例中，所述脂肪组织脱细胞基质水凝胶是溶胶-凝胶相变临界点为33～38℃的温敏水凝胶。
在本申请的一些实施例中，所述干细胞为脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、神经干细胞其中一种或几种；
优选的，所述干细胞为脂肪间充质干细胞。
在本申请的一些实施例中，所述脂肪组织脱细胞基质在所述水凝胶的浓度为3～12mg/mL。
在本申请的一些实施例中，所述脂肪组织脱细胞基质的DNA残留量≤20ng/mg。
在本申请的一些实施例中，所述干细胞在所述水凝胶的浓度为103～107cells/mL。
第二方面，本申请提供了一种如上述任一实施例所述的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S10：将脂肪组织脱细胞基质在胃蛋白酶消化液中进行消化得到消化液；
S20：调整所述消化液的pH值和离子强度得到脂肪组织脱细胞基质预凝胶；
S30：将所述脂肪组织脱细胞基质预凝胶与干细胞共混后孵育固化得到所述水凝胶。
在本申请的技术方案中，使用蛋白酶消化法制备脂肪组织脱细胞基质水凝胶，该制备方法不易残留有毒有害化学试剂，得到的水凝胶生物毒性低，具有良好的生物相容性，同时不会破坏脂肪组织脱细胞基质的生物活性成分，且制备方法简单，易于生产。
第三方面，本申请提供了一种如上述任一项实施例所述的水凝胶或如上述任一项实施例所述的制备方法制备得到的水凝胶在制备修复神经缺损的材料中的用途。
在本申请的技术方案中，本申请提供的用于修复神经缺损的水凝胶对于修复神经缺损具有良好的效果，因此可以将其应用于制备修复神经缺损的材料，由此制备的材料同样对于神经缺损具有较好的修复作用。
第四方面，本申请提供了一种用于修复神经缺损的支架，包括：
用于连接并支撑缺损神经纤维的导管；和
在所述导管内部中的用于促进神经缺损修复的如上述任一项实施例所述的水凝胶或如上述任一项实施例所述的制备方法制备得到的水凝胶。
在本申请的技术方案中，将导管内部包含用于修复神经缺损的水凝胶作为支架，其中导管具有一定的机械强度可以起到连接并支撑缺损神经的作用，并对用于修复神经缺损的水凝胶在神经缺损处进一步固定，更好保留脂肪组织脱细胞基质中生物活性成分以及负载的干细胞，更好地发挥修复神经缺损的效果；另外，可以根据神经缺损处的情况选用不同尺寸的导管，更适用于神经纤维的再生。
在本申请的一些实施例中，所述导管为硅胶导管、聚乳酸-羟基乙酸共聚物导管、聚乳酸导管以及几丁质导管其中一种。
在本申请的一些实施例中，所述导管的内径为0.1～4mm。
第五方面，本申请提供了一种如上述任一项实施例所述的支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述水凝胶注入或填充所述导管得到所述支架。
在本申请的技术方案中，将用于修复神经缺损的水凝胶直接注入或填充至导管中即可得到用于修复神经缺损的支架，制备方法简单，可现制现用，有很好的临床应用前景。
第六方面，本申请提供了一种用于治疗周围神经缺损的试剂盒，其特征在在于，包括：
如上述任一项实施例所述的支架或如上述任一项实施例所述的制备方法制备得到的用于修复神经缺损的支架；和
说明书，其中，所述说明书包括指示将试剂盒中用于修复神经缺损的支架施加至需要进行修复神经缺损治疗的对象的周围神经缺损处的说明。
在本申请的技术方案中，周围神经由于其复杂的结构及特殊的功能，现有技术中一般使用自体神经移植术进行修复，而本申请提供的用于修复周围神经缺损的试剂盒中的支架可以代替自体神经进行移植，其中导管可为神经损伤后再生的过程提供一个较独立的微环境，同时其一定机械强度可以连接并支撑缺损的周围神经，为再生轴突的生长提供方向性，另外，导管内部的水凝胶可为神经再生提供营养，同时还可以提高干细胞的增殖分化与旁分泌作用，有利于周围神经的快速修复再生。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。
图1为本申请一些实施例中DAM-gel的扫描电镜图。
图2为本申请一些实施例中DAM-gel的流变图。
图3为本申请一些实施例中用于神经缺损的支架的图片。
通过上述附图，已示出本申请明确的实施例，后文中将有更详细的描述。这些附图和文字描述并不是为了通过任何方式限制本申请构思的范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本申请的概念。
具体实施方式
本说明书中各实施例或实施方案采用递进的方案描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合实施方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方案结合。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本申请的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
申请人发现，细胞移植是神经修复领域最具创新性的治疗方法，但是单独移植细胞可能会导致细胞流失、活性降低和旁分泌作用减弱，导致修复效果较差，由此需要使用载体对移植细胞进行固定，而目前现有技术中使用的细胞载体大部分为各种商品化的水凝胶，虽然能够作为移植细胞的载体，但是缺乏良好的生物活性、成分单一且不能够提供良好的再生微环境。目前也有少部分研究使用各种组织来源的脱细胞基质作为细胞载体，通过进一步消化和溶解脱细胞基质制备的水凝胶，既保留了脱细胞基质中的生物活性成分，同时具有与神经组织相似的机械性能、可作为物理支撑，是装载细胞进行周围神经缺损修复的理想载体，但是这些脱细胞基质存在来源有限、容易发生免疫排斥反应、对供体损伤大以及伦理等问题。
由此，申请人通过提供以下技术方案来解决上述现有技术中存在的问题。
第一方面，本申请提供了一种用于修复神经缺损的水凝胶，包括：
用于提供适合神经缺损修复微环境的脂肪组织脱细胞基质水凝胶；和
负载在脂肪组织脱细胞基质水凝胶用于促进神经缺损修复的干细胞。
在本申请的技术方案中，使用脂肪组织脱细胞基质水凝胶(adipose tissuedecellularized matrix hydrogel,DAM-gel)作为干细胞的载体，其中脂肪组织脱细胞基质(adipose tissue decellularized matrix,DAM)可以来源于临床抽脂等获取的脂肪组织经过脱细胞处理后得到，因此来源丰富、不易发生免疫排斥反应且不会出现伦理问题；另外，DAM-gel保留了DAM的生物活性成分，且具有与神经组织相似的机械性能、可作为物理支撑，能够有效促进血管再生，为神经修复提供营养，同时防止干细胞流失并提高干细胞活性，从而发挥有效的修复神经缺损的效果。
在本申请的技术方案中，DAM相比其他组织脱细胞基质，如神经组织脱细胞基质、真皮组织脱细胞基质等，一个显著的优点在于来源丰富，对供体的损伤较小，因此不需要使用动物来源的脱细胞基质，从而不易发生免疫排斥反应以及相关伦理问题；另外，如图1所示，DAM-gel具有良好的三维纳米孔隙结构，纤维排列呈现为无规律排布，为细胞的生长提供了良好的支架结构，同时DAM具有良好的生物活性、易于细胞的粘附、降解性能好，因此负载干细胞同时提供适合干细胞增殖分化的微环境，有利于缺损神经的快速修复。
DAM的制备方法是本领域技术人员所公知的，例如本申请实施例中使用的DAM通过对收集的脂肪组织进行反复冻融→离心→胰酶消化→异丙醇萃取→胰酶消化→核酸酶消化→异丙醇萃取等过程处理得到。应当说明的是，DAM的来源不限于上述途径，使用现有技术中其他制备方法得到的DAM或直接购买得到的DAM均可达到本申请技术方案所达到的技术效果。
在本申请的一些实施例中，脂肪组织脱细胞基质水凝胶是溶胶-凝胶相变临界点为33～38℃的温敏水凝胶。
在上述一些实施例中，DAM-gel的流变图如图2所示，从流变图可知，DAM-gel是溶胶-凝胶相变临界点为33～38℃的温敏水凝胶，其溶胶-凝胶相变临界点接近于人体体温，一方面，DAM-gel在低温条件下黏度较低、流动性强，因此易于加工处理，同时也易于在低温条件下干细胞在凝胶中均匀分散，提高负载量；另一方面，当用于修复神经缺损的水凝胶植入体内时，在人体体温下发生固化，可以防止水凝胶以及负载的干细胞的流失，同时还能为神经组织再生提供较好的力学支撑，以达到良好的修改神经缺损的效果。
在本申请的一些实施例中，干细胞为脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、神经干细胞其中一种或几种；
优选的，干细胞为脂肪间充质干细胞。
在上述一些实施例中，脂肪间充质干细胞(adipose-derived stromal cells,ADSCs)、骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、神经干细胞都是常用的几种细胞移植的干细胞，其中骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、神经干细胞是常用于修复神经缺损的细胞，ADSCs相比上述三种干细胞来源更加丰富，也可以用于修复神经缺损，上述四种干细胞均可直接诱导或分化类施旺细胞，通过分泌各种神经营养因子和细胞外基质成分刺激轴突生长和施旺细胞增殖迁移，从而为神经再生提供合适的微环境，起到促进神经再生和功能恢复的作用。
进一步地，ADSCs相比神经干细胞，单独使用ADSCs移植用于修复神经缺损的效果不如神经干细胞；此外，在现有技术中，当使用DAM-gel负载ADSCs(ADSCs-DAM-gel)作为植入材料时，由于DAM-gel来源于脂肪组织，含有较多同源的生物活性成分，可与ADSCs相互作用，为促进脂肪干细胞成脂提供合适的微环境，诱导或分化成脂，从而促进脂肪细胞的增殖，因此，在本领域技术人员研究过程中，在使用DAM-gel作为干细胞载体用于修复神经缺损时，会尽量避免使用ADSCs，或使用其他组织脱细胞基质水凝胶以及商品化水凝胶负载ADSCs，以防止诱导成脂现象的发生，对神经修复产生不利影响。
但是，申请人通过大量实验发现，当使用ADSCs-DAM-gel用于修复神经缺损时，相比DAM-gel负载其他种类干细胞或使用其他组织脱细胞基质水凝胶以及商品化水凝胶负载ADSCs，其修复神经缺损的效果均优于其他组合。其可能的原因在于：申请人在将ADSCs-DAM-gel用于修复神经缺损的大鼠，在术后12周移植处ADSCs-DAM-gel进行油红O染色，未见脂滴，说明ADSCs-DAM-gel在植入患处后，并未如预想中诱导成脂而影响神经修复，反而DAM-gel提供的微环境和生物活性成分更有利于ADSCs的增殖，ADSCs诱导或分化类施旺细胞，或募集神经再生所需的细胞、分子，且通过旁分泌作用进一步提供适合神经细胞再生的微环境，进而加快了雪旺细胞增殖和轴突的再生。另一方面，ADSCs相较于其他干细胞来源更加丰富，且对供体的损伤较小，由此可降低所述用于修复神经缺损水凝胶的成本。
综上可知，在本领域技术人员对于ADSCs与DAM-gel的研究主要集中在诱导促进成脂的方面，也有现有技术中指出ADSCs-DAM-gel在应用于其他方面时具有良好诱导成脂的效果，由此本领域技术人员普遍存在由于其诱导成脂的作用不适用与修复神经方面的技术偏见，而申请人通过大量的实验证明了，ADSCs-DAM-gel相比其他用于修复神经缺损的水凝胶具有更好的修复效果，克服了本领域技术人员的上述技术偏见。
在本申请的一些实施例中，脂肪组织脱细胞基质在水凝胶的浓度为3～12mg/mL。
在上述一些实施例中，DAM在水凝胶的浓度应控制在3～12mg/mL，当其浓度过低时，无法形成具有完整形态以及一定机械强度的水凝胶，同时当其浓度过高时，可能导致水凝胶的孔隙率以及细胞负载量降低，从而影响其修复效果。
在本申请的一些实施例中，所述脂肪组织脱细胞基质的DNA残留量≤20ng/mg。
在上述一些实施例中，脂肪组织脱细胞基质的DNA残留量控制在20ng/mg以下，由于脂肪组织脱细胞基质来源于人体，因此DNA残留量会导致由其制得的水凝胶具有一定的免疫原性，目前现有技术中对于脱细胞基质中DNA残留量没有制定相关标准，一般认为脱细胞基质中DNA残留量低于50ng/mg时，不会引起机体的免疫反应。在本申请的实施例中，所使用的脂肪组织脱细胞基质的DNA残留量均低于20ng/mg，具有很低的免疫原性，由此制备得到的DAM-gel的生物相容性更高、安全性更好。
在本申请的一些实施例中，干细胞在水凝胶的浓度为103～107cells/mL。
在上述一些实施例中，干细胞在水凝胶的浓度控制在103～107cells/mL范围内，一般认为干细胞在水凝胶的浓度越高，水凝胶对神经修复的效果越好，但是水凝胶对于干细胞的负载量存在上限，若浓度过高，易出现干细胞从水凝胶中流失，达不到提高修复神经效率的效果，还会造成干细胞的浪费，由此干细胞在水凝胶的浓度存在上限，在本申请的实施例中，将干细胞在水凝胶的浓度控制在103～107cells/mL范围内。
第二方面，本申请提供了一种如上述任一实施例的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S10：将脂肪组织脱细胞基质在胃蛋白酶消化液中进行消化得到消化液；
S20：调整消化液的pH值和离子强度得到脂肪组织脱细胞基质预凝胶；
S30：将脂肪组织脱细胞基质预凝胶与干细胞共混后孵育固化得到水凝胶。
在本申请的技术方案中，使用蛋白酶消化法制备脂肪组织脱细胞基质水凝胶，该制备方法不易残留有毒有害化学试剂，得到的水凝胶生物毒性低，具有良好的生物相容性，同时不会破坏脂肪组织脱细胞基质的生物活性成分，且制备方法简单，易于生产。
在本申请的技术方案中，步骤S10使用胃蛋白酶消化液对DAM进行消化，主要是将DAM中大分子蛋白质分解为小分子多肽，一方面可以提高DAM凝胶化能力，另一方面小分子多肽更有利于ADSCs以及神经细胞利用，从而促进神经修复。
步骤S20调整消化液的pH和离子强度主要是为了使其适于机体环境，从而为细胞增殖分化提供良好的微环境，得到脂肪组织脱细胞基质预凝胶的pH和离子强度与人体组织液类似，使后续得到的DAM-gel可作为细胞良好的载体。
步骤S30将干细胞与脂肪组织脱细胞基质预凝胶直接共混后固化即得到用于修复神经缺损的水凝胶，由于与脂肪组织脱细胞基质预凝胶对细胞具有良好的粘附性，因此无需复杂的操作将干细胞负载于凝胶结构中，仅需将干细胞与脂肪组织脱细胞基质预凝胶共混固化即得到干细胞均匀分散的水凝胶。
第三方面，本申请提供了一种如上述任一项实施例的水凝胶或如上述任一项实施例的制备方法制备得到的水凝胶在制备修复神经缺损的医疗器械中的用途。
在本申请的技术方案中，本申请提供的用于修复神经缺损的水凝胶对于修复神经缺损具有良好的效果，因此可以将其应用于制备修复神经缺损的材料，由此制备的材料同样对于神经缺损具有较好的修复作用。
在本申请的一些实施例中，可将水凝胶直接作为修复神经缺损的药品。
在上述一些实施例中，由于水凝胶自身具有一定的机械强度，且人体温度水凝胶发生固化，可以降低干细胞流失并提供良好的促进神经修复的微环境，因此可以在低温下将水凝胶注入神经缺损处，或直接将水凝胶植入神经缺损处，均可以达到加快修复神经缺损的效果。
需要说明的是，本申请中的低温除特殊说明外是指，在0℃以上，DAM-gel的溶胶-凝胶相变点以下的温度，即在此低温下，DAM-gel为流动性良好的溶胶。
在本申请的一些实施例中，可将水凝胶作为3D打印生物墨水。
在上述一些实施例中，可以将水凝胶作为3D打印生物墨水，根据神经缺损处的情况，3D打印得到对应的修复神经缺损的材料，将其植入神经缺损处，达到加快修复神经缺损的效果。
第四方面，本申请提供了一种用于修复神经缺损的支架，包括：
用于连接并支撑缺损神经纤维的导管；和
在导管内部中的用于促进神经缺损修复的如上述任一项实施例的水凝胶或如上述任一项实施例的制备方法制备得到的水凝胶。
在本申请的技术方案中，将导管内部包含用于修复神经缺损的水凝胶作为支架，其中导管具有一定的机械强度可以起到连接并支撑缺损神经的作用，并对用于修复神经缺损的水凝胶在神经缺损处进一步固定，更好保留脂肪组织脱细胞基质中生物活性成分以及负载的干细胞，更好地发挥修复神经缺损的效果；另外，可以根据神经缺损处的情况选用不同尺寸的导管，更适用于神经纤维的再生。
在本申请的技术方案中，支架外面导管主要是起支撑连接神经纤维的作用，当出现较为严重的神经缺损时，单独使用水凝胶其强度无法连接神经纤维，由此神经细胞无法快速定向生长，对神经纤维的再生修复效果较差，因此，使用上述支架时，可以使用导管连接断裂的神经纤维，其中水凝胶促进神经细胞的增殖与迁移，而导管为神经细胞轴突的生长提供方向性，由此达到加速神经纤维再生的效果。
在本申请的一些实施例中，导管为硅胶导管、聚乳酸-羟基乙酸共聚物导管、聚乳酸导管以及几丁质导管其中一种。
在上述一些实施例中，支架的导管需要具有一定的机械性能以及良好的生物相容性，上述几种材料的导管是本领域常用的植入医疗导管，可以满足支架的要求，可以根据实际情况进行选择。
在本申请的一些实施例中，导管的内径为0.1～4mm。
在上述一些实施例中，可以根据神经缺损处的具体情况选择不同内径的导管，以达到最佳的修复效果，支架的尺寸是高度定制的，适用于不同情况的神经缺损处。
第五方面，本申请提供了一种如上述任一项实施例的支架的制备方法，包括以下步骤：
将水凝胶注入或填充导管得到支架。
在本申请的技术方案中，将用于修复神经缺损的水凝胶直接注入或填充至导管中即可得到用于修复神经缺损的支架，制备方法简单，可现制现用，有很好的临床应用前景。
在本申请的一些实施例中，用于修复神经缺损的支架的制备方法具体包括：
在低温条件下，将水凝胶注入导管，将注入水凝胶的导管浸没于细胞液体培养基中，在33～38℃条件下固化即得到用于修复神经缺损的支架。
在上述一些实施例中，由于水凝胶是温敏凝胶，在低温下是液态，方便注入导管中，如图3所示，注入水凝胶的导管浸没于细胞液体培养基中，目的在于防止未固化的凝胶从导管中流出，再将其在33～38℃条件下固化即得到用于修复神经缺损的支架。同时支架最佳使用方法是随制随用，若需要短时间保存，则需要浸泡在细胞液体培养基中，防止水凝胶中水分挥发。
第六方面，本申请提供了一种用于治疗周围神经缺损的试剂盒，其特征在在于，包括：
如上述任一项实施例的支架或如上述任一项实施例的制备方法制备得到的用于修复神经缺损的支架；和
说明书，其中，说明书包括指示将试剂盒中用于修复神经缺损的支架施加至需要进行修复神经缺损治疗的对象的周围神经缺损处的说明。
在本申请的技术方案中，周围神经由于其复杂的结构及特殊的功能，现有技术中一般使用自体神经移植术进行修复，而本申请提供的用于修复周围神经缺损的试剂盒中的支架可以代替自体神经进行移植，其中导管可为神经损伤后再生的过程提供一个较独立的微环境，同时其一定机械强度可以连接并支撑缺损的周围神经，为再生轴突的生长提供方向性，另外，导管内部的水凝胶可为神经再生提供影响，干细胞的增殖分化与旁分泌作用，有利于周围神经的快速修复再生。
以下，通过实施例更详细地说明本申请的一种用于修复神经缺损的水凝胶及其制备方法和用途，但本申请并不限于这些实施例。除非另有说明，在实施例中使用的试剂都为可商购获得的、具有合适纯度级别的商品。
DAM粉末的制备：
收集临床腹部或胸部进行吸脂手术的健康女(年龄18～35岁；BMI，<30；血红蛋白，>110g/L)术后废弃的无菌颗粒状脂肪组织。收集的脂肪组织用0.9％的氯化钠溶液彻底冲洗后，分装至50毫升的离心管，立即进行脱细胞或在-80℃冰箱中冷冻保存。从吸脂术中获得的脂肪组织通过反复冻融→离心→胰酶消化→异丙醇萃取→胰酶消化→核酸酶消化→异丙醇萃取等过程进行处理，获得絮状的白色DAM。提取的DAM在-80℃下冷冻过夜，然后用冷冻干燥器干燥不低于24小时。冻干的DAM用高速低温组织研磨机研磨成粉末，并通过80目筛子进行纯化得到DAM粉末。
其中脂肪组织收集在解放军总医院第一医学中心整形修复科行腹部或胸部吸脂手术患者术后废弃的无菌颗粒状脂肪组织，已获得患者及家属知情同意并签署了知情同意书。
需要说明的是，DAM的制备是本领域技术人员所公知的，因此本申请实施例中使用的DAM粉末制备过程并未完整说明，但并不影响本说明书对技术方案的充分公开，同时通过其他方法制备或购买得到DAM均落入本申请的保护范围内。
实施例1
用于修复神经缺损的水凝胶的制备：
将200mgDAM粉末加入到20mL 0.01mol/mL盐酸中，再加入20mg250U/mg胃蛋白酶(Sigma，美国)，在室温下持续摇动消化72h得到消化液；
在15℃下，取6mL消化液，加入1mL 10×DMEM-LG(Gibco，美国)和2.94ml去离子水，充分混合，然后加入60μL 1mol/L氢氧化钠水溶液得到脂肪组织脱细胞基质预凝胶，其中DAM在脂肪组织脱细胞基质预凝胶的浓度为6mg/mL；
在低温条件下，将脂肪组织脱细胞基质预凝胶与ADSCs(取自新生72h内的SD乳鼠腹股沟区的原代ADSCs，经传代纯化培养并鉴定后使用)混合，在37℃孵育30min，得到用于修复神经缺损的水凝胶，其中ADSCs在水凝胶的浓度为3×106cells/mL。
对比例1
DAM-gel的制备：
与实施例1相比，区别仅在于不添加ADSCs。
对比例2
用于修复神经缺损的水凝胶的制备：
将200mgDAM粉末加入到20mL 0.01mol/mL盐酸中，再加入20mg250U/mg胃蛋白酶，在室温下持续摇动消化72h得到消化液；
在低温条件下，取6mL消化液，加入1mL 10×DMEM-LG和2.94ml去离子水，充分混合，然后加入60μL 1mol/L氢氧化钠水溶液得到脂肪组织脱细胞基质预凝胶，其中DAM在脂肪组织脱细胞基质预凝胶的浓度为6mg/mL；
在低温条件下，将脂肪组织脱细胞基质预凝胶与神经干细胞(NCs)混合，在37℃孵育30min，得到用于修复神经缺损的水凝胶，其中神经干细胞在水凝胶的浓度为3×106cells/mL。
实施例2
用于修复神经缺损的支架的制备：
在低温条件下，将实施例1制备的水凝胶注入内径为1.2mm、长12mm的几丁质导管中，将注入水凝胶的导管浸没于细胞液体培养基中，其中，每个导管注射量为14μL；
将导管置于37℃的二氧化碳温箱中孵育30min得到用于修复神经缺损的支架。
对比例3
用于修复神经缺损的支架的制备：
与实施例2相比，区别仅在于注入的水凝胶为对比例1制备的DAM-gel。
对比例4
用于修复神经缺损的支架的制备：
与实施例2相比，区别仅在于注入的水凝胶为对比例2制备的水凝胶。
对比例5
用于修复神经缺损的支架的制备：
与实施例2相比，区别仅在于注入的水凝胶为负载ADSCs的商品化水凝胶，其中，商品化水凝胶指购自于Sigma Aldrich的I型牛胶原蛋白制备的水凝胶，ADSCs在水凝胶的浓度为3×106cells/mL。
对比例6
用于修复神经缺损的支架的制备：
与实施例2相比，区别仅在于注入的水凝胶为负载神经干细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)的商品化水凝胶，其中，商品化水凝胶指I型牛胶原蛋白(Sigma，美国)制备的水凝胶，神经干细胞在水凝胶的浓度为3×106cells/mL。
测试例1
动物实验：
将84只SD雌性大鼠随机分为7组，每组12只，2％戊巴比妥腹腔注射麻醉后，平行于大鼠右侧股骨下方0.5cm处剪开皮肤逐层钝性分离组织、充分暴露坐骨神经,剪断坐骨神经造成10mm缺损，左侧作为自身对照不进行任何处理。空白组应用单纯几丁质导管、实验组应用之前实施例2以及对比例3～6制备好的支架桥接神经断端，并用11-0显微缝合线将两侧神经断端各缝合2针固定在导管内约1mm处，Autograft组将剪下的神经翻转180°后用11-0显微缝合线每侧断端各缝合4针，各组于术后12周进行测试，计算坐骨神经指数(SFI)，结果如表1所示。
测试方法为：将每组12只大鼠分别通过Cat Walk XT 10.6小动物步态分析仪器分析评估运动功能恢复情况，并计算坐骨神经功能指数(SFI)。将大鼠置于测量台起始端，使其自行移动至测量台终点端，由软件系统通过荧光捕捉记录步行过程，每侧后肢各留下5～6个足印。然后应用软件对所得数据进行分析，通过以下公式测量和计算SFI：
公式：
Figure BDA0003856284580000151
注：其中，ETS代表实验侧足趾宽度；
NTS代表对照侧足趾宽度；
EPL代表实验侧足印长度；
NPL代表对照侧足印长度；
EIT代表实验侧中间足趾宽度；
NIT代表对照侧中间足趾宽度。
表1
分组 术后12周坐骨神经指数
空几丁质导管 -74.5±1.64<sup>**</sup>
实施例2 -42.4±2.22
对比例3 -68.4±1.35<sup>**</sup>
对比例4 -44.1±1.28<sup>*</sup>
对比例5 -49.8±1.39<sup>**</sup>
对比例6 -47.5±1.12<sup>**#</sup>
自体神经移植 -37±0.84
注：坐骨神经指数(SFI)反应坐骨神经功能恢复情况，其中0代表正常，-100代表完全损伤。*代表与实施例2相比p＜0.05，具有显著性差异；**代表与实施例2相比p＜0.01，具有非常显著性差异；#代表与实施例5相比相比p＜0.01，具有非常显著性差异。
从表1的结果可知，除自体神经移植组外，移植实施例2制备的支架的大鼠坐骨神经功能恢复情况最好，各实验使用的相同几丁质导管，因此导致实验组修复效果差别的原因在于支架中填充的水凝胶，实施例2、对比例3～6填充的水凝胶分别为ADSCs+DAM-gel、DAM-gel、NCs+DAM-gel、ADSCs+商品化水凝胶、NCs+商品化水凝胶，由此对上述数据进行分析：通过对比对比例5和对比例6可知，在使用商品化水凝胶作为干细胞载体时，使用NCs相比ADSCs修复坐骨神经效果更好，其原因可能在于，NCs相比ADSCs更易诱导或分化神经细胞，且其通过旁分泌作用构成的微环境更适合于神经细胞的增殖；通过分别对比实施例2和对比例5、对比例4和对比例6可知，负载相同的干细胞时，DAM-gel相比商品化水凝胶对修复坐骨神经效果更好，其原因可能在于：DAM-gel对干细胞的粘附性更强，同时其含有的生物活性成分一方面可有效促进血管再生，另一方面还能为神经修复提供影响，且DAM-gel高效模拟干细胞体内微环境，让干细胞更好的发挥其生物学功能；最后，将实施例2与对比例4进行对比，在使用DAM-gel作为干细胞载体时，ADSCs对坐骨神经的修复效果优于NCs，结果与预期相反，因为根据对比例5和对比例6的对比结果可知，在使用干细胞载体相同时，NCs对神经的修复效果优于ADSCs，同时，根据本领域技术人员对ADSCs与DAM-gel的研究，在DAM-gel的微环境下，ADSCs很易被诱导或分化为脂肪细胞，进而会影响ADSCs对神经损伤的修复效果。而测试结果与预期不同，申请人在该组术后12周移植支架处进行油红O染色，未见脂滴，说明含ADSCs-DAM-gel的支架在植入患处后，并未如预想中诱导成脂而影响神经修复，根据测试结果推测可能的原因在于：ADSCs-DAM-gel移植于神经缺损处时，神经缺损处的微环境会抑制ADSCs向脂肪细胞分化，另外，DAM-gel提供的微环境和生物活性成分更有利于ADSCs的增殖，ADSCs诱导或分化类施旺细胞，且通过旁分泌作用进一步提供适合神经再生的微环境，进而加快了雪旺细胞增殖和轴突的再生，因此当使用DAM-gel作为干细胞载体时，使用ADSCs对神经的修复效果优于NCs。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。

Claims (13)

1.一种用于修复神经缺损的水凝胶，其特征在于，包括：
用于提供适合神经缺损修复微环境的脂肪组织脱细胞基质水凝胶；和
负载在所述脂肪组织脱细胞基质水凝胶用于促进神经缺损修复的干细胞。
2.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述脂肪组织脱细胞基质水凝胶是溶胶-凝胶相变临界点为33～38℃的温敏水凝胶。
3.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述干细胞为脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、神经干细胞其中一种或几种；
优选的，所述干细胞为脂肪间充质干细胞。
4.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述脂肪组织脱细胞基质在所述水凝胶的浓度为3～12mg/mL。
5.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述脂肪组织脱细胞基质的DNA残留量≤20ng/mg。
6.根据权利要求1～6任一项所述的水凝胶，其特征在于，所述干细胞在所述水凝胶的浓度为103～107cells/mL。
7.一种如权利要求1～6任一项所述的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10：将脂肪组织脱细胞基质在胃蛋白酶消化液中进行消化得到消化液；
S20：调整所述消化液的pH值和离子强度得到脂肪组织脱细胞基质预凝胶；
S30：将所述脂肪组织脱细胞基质预凝胶与干细胞共混后孵育固化得到所述水凝胶。
8.一种如权利要求1～6任一项所述的水凝胶或如权利要求7所述的制备方法制备得到的水凝胶在制备修复神经缺损的医疗器械中的用途。
9.一种用于修复神经缺损的支架，其特征在于，包括：
用于连接并支撑缺损神经纤维的导管；和
在所述导管内部中的用于促进神经缺损修复的如权利要求1～6任一项所述的水凝胶或如权利要求7所述的制备方法制备得到的水凝胶。
10.根据权利要求9所述的支架，其特征在于，所述导管为硅胶导管、聚乳酸-羟基乙酸共聚物导管、聚乳酸导管以及几丁质导管其中一种。
11.根据权利要求9所述的支架，其特征在于，所述导管的内径为0.1～4mm。
12.一种如权利要求9～11任一项所述的支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述水凝胶注入或填充所述导管得到所述支架。
13.一种用于治疗周围神经缺损的试剂盒，其特征在于，包括：
如权利要求9～11任一项所述的支架或如权利要求12所述的制备方法制备得到的用于修复神经缺损的支架；和
说明书，其中，所述说明书包括指示将试剂盒中用于修复神经缺损的支架施加至需要进行修复神经缺损治疗的对象的周围神经缺损处的说明。
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