CN108714248A - 一种三明治式复合膜支架的制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种三明治式复合膜支架的制作方法，构建了负载生物活性因子的聚乳酸/生物活性玻璃/壳聚糖三明治式复合膜载体；包括以下步骤：1)分别制作聚乳酸薄膜、负载生物活性因子的介孔生物活性玻璃、负载种子细胞的壳聚糖膜作为外侧密封层、夹心层和内侧控释及干细胞支架层；2)将负载生物活性因子的生物活性玻璃的夹心层覆盖于聚乳酸薄膜上，再将负载种子细胞的壳聚糖膜覆盖在生物活性玻璃层上构建三明治式复合膜载体。本发明可以解决已经受到损伤(但未死亡)的单个神经束，现有技术无法修复和治疗的问题；现有载药系统不能实现药物的定向释放，无法保证损伤局部因子的高浓度的问题。

Description

一种三明治式复合膜支架的制作方法
技术领域
本发明涉及医药设备技术领域，尤其是涉及一种三明治式复合膜支架的制备方法。
背景技术
脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是由于各种不同原因所引起的椎管内脊髓或马尾神经不同程度的损伤。主要由交通伤和暴力损伤导致，它不仅直接造成了患者运动及劳动能力的丧失、感觉减退，还可因损伤平面以下中枢神经损伤，引起相应的呼吸、泌尿、消化系统等器官的功能障碍
脊髓损伤后影响脊髓功能恢复的原因除了神经细胞再生极其微弱外，还有以下几个方面，如：损伤局部神经营养因子缺乏、胶质瘢痕形成以及损伤区轴突崩解后由少突胶质细胞产生的抑制轴突再生的蛋白(轴突生长抑制因子、髓磷脂相关糖蛋白和少突胶质细胞-髓磷脂糖蛋白等)抑制了轴突的生长。此外，损伤区缺血缺氧、钙超载、自由基损伤、脂质过氧化物作用、一氧化氮/一氧化氮合酶神经毒性作用等均会加重脊髓损伤。由于脊髓的特殊结构及其损伤后复杂的病理生理变化，再加上神经再生能力较弱，使得脊髓损伤的修复治疗困难重重。
组织工程技术是目前治疗脊髓损伤最有前景的方法。因此，选用合适的材料设计合理的组织工程支架载体，负载有效的促神经元生长或保护神经元的药物并种植理想种子细胞是治疗脊髓损伤的关键性问题。
目前促神经生长或神经再生药物的最常见给药途径为静脉或鞘内注射。也有以凝胶结合活性因子贴膜敷于脊髓表面、以L-多聚赖氨酸结合活性因子作为支架植入脊髓，以解决因子通过血脑屏障问题。
有多种多样的材料应用于脊髓损伤组织工程技术研究。一类是人工合成的生物可降解材料，包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、PLA-PGA复合物，合成水凝胶(PHPMA、PHEMA、泊洛沙姆等)等；另一类是天然材料，如壳聚糖、胶原和纤维蛋白粘胶(FG)等。然而目前研究的支架尚存在多种缺点，难以应用于临床。
如PLA/PGA具有较高的结晶度，其作为细胞移植载体时，易导致迟发性组织反应，且高分子量PLA/PGA降解时间较长，限制了其在脊髓损伤修复临床上的应用。人工合成水凝胶无毒、无需生物降解通透性好、且可直接容纳细胞，然而水凝胶支架药物缓释时间短，而脊髓损伤的修复往往持续数月，同时其缺乏有效的脉管系统，机械力学强度较差，限制了其进一步应用。
天然材料中，FG作为细胞载体移植后，在动物体内降解速度过快，移植两周后已大部分降解，且种植种子细胞容易缩水，体积变小。壳聚糖属于天然多糖类大分子，通过调控可制备成多种形式支架材料，具有较稳定的降解速度和较大的孔隙率，与FG相比，壳聚糖在动物体内降解速度较长；与人工合成材料PLA/PGA相比，组织相容性更好，不易产生急性和迟发性组织反应；与水凝胶相比，生物力学强度较高，近年来，壳聚糖成为组织工程技术中理想的载体材料。
研究发现壳聚糖支架与细胞联合移植有助于家兔损伤脊髓功能的恢复。然而目前国内外在脊髓损伤修复组织工程研究中，往往将壳聚糖制备成导管/L-多聚赖氨酸体系，此支架需对脊髓半侧切除后植入，其药物释放方向和速率难以控制，且由于临床病人的脊髓损伤范围不规则，多呈不完全性，难以应用，更不可能切除一段安置导管。因此设计一种可方便应用于脊髓损伤临床治疗的壳聚糖支架具有重要的实践应用价值。
药物递送系统和干细胞生物支架都可用于治疗脊髓损伤，但目前未见两者结合使用。干细胞三维支架桥接神经的方法和材料中已经有类似的组合运用了如(一种用于桥接缺损神经的复合修复材料及其支架CN201510716279.8)。但是目前三维支架桥接神经的治疗方法，存在以下缺点：
一方面对已经受到损伤(但未死亡)的单个神经束，无法达到修复和治疗的目的；另一方面在桥接过程中，因为要对损伤处的脊髓剪切出一个和三维支架形状类似的——通常是管状——缺口，因此会对该处未损伤的神经细胞和已经受到损伤(但未死亡)的神经细胞进行清除，结果造成了该处脊髓细胞的进一步损失。
现有载药系统不能实现药物的定向释放，无法保证损伤局部因子的高浓度；多数载药系统易于降解，载药量低，药物释放不能贯穿于脊髓损伤修复过程始终；载药系统体积过大，可能压迫脊髓，同时不有利于缝合硬脊膜，导致脑脊液漏形成。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种三明治式复合膜支架的制作方法。本发明的目的一是提供一种新的脊髓治疗用的载药系统，避免采用背景技术中传统的载药系统时，需要对该处未损伤的神经细胞和已经受到损伤(但未死亡)的神经细胞进行清除，以造成了该处脊髓细胞的进一步损失；二是提供一种新的载药系统，解决药物的定向释放、载药量低的问题；三是提供一种新的载药系统，解决药物释放不能贯穿于脊髓损伤修复过程始终的问题；四是提供一种新的载药系统，解决现有载药系统体积过大，可能压迫脊髓，同时还有利于缝合硬脊膜的问题。
本发明的技术方案如下：
一种三明治式复合膜支架的制作方法，包括以下步骤：
(1)分别制作聚乳酸薄膜、负载生物活性因子的介孔生物活性玻璃、负载种子细胞的壳聚糖膜作为外侧密封层、夹心层和内侧控释及干细胞支架层；
(2)将负载生物活性因子的生物活性玻璃的夹心层覆盖于聚乳酸薄膜上，再将负载种子细胞的壳聚糖膜覆盖在生物活性玻璃层上构建三明治式复合膜载体。
另一种制备方法为：
上述步骤(1)中制作没有负载种子细胞的壳聚糖膜；
上述步骤(2)中将没有负载种子细胞的壳聚糖膜覆盖在生物活性玻璃层上；
随后进行步骤(3)，将干细胞悬液，采用均匀浸入上一步的壳聚糖薄膜内部进行种子细胞的培养。
另一种制备方法为：
上述步骤(1)中不制作壳聚糖膜；
上述步骤(2)中不将壳聚糖膜覆盖在生物活性玻璃层上；
随后进行步骤(3)制作干细胞和壳聚糖混合悬溶液，采用旋涂、滴涂方法将该混合溶液覆盖于生物活性玻璃层上，构建类三明治式复合膜载体。
优选的，将各层以能够渗透神经生长刺激因子和干细胞的医用生物胶进行粘连。
优选的，述夹心层负载生物活性因子为神经生长刺激因子。更优选的，所述神经生长刺激因子为bFGF、BD-NF、NT-3、IGF中的一种或者几种的组合。
优选的，复合膜支架周边以不渗透神经生长刺激因子和干细胞的医用生物胶进行封闭。
优选的，所述介孔生物活性玻璃小球替换为乙二醇乳酸共聚物PEG-PLA纳米微球。
优选的，所述种子细胞为脐带源间充质干细胞，即HUMSCs。更优选的，所述种子细胞选自：许旺细胞、骨髓间充质细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、神经干细胞或诱导多能干细胞中的一种或几种组合。
本发明有益的技术效果在于：
为了解决上述技术问题，本发明将神经生长刺激因子复合膜载体与组织工程干细胞科学有机结合，以负载神经活性因子的复合膜支架结合种子细胞HUMSCs，希望更有效地修复脊髓损伤。该支架利用壳聚糖良好的组织相容性和干细胞易在其上粘附和增殖的特性，利用生物活性玻璃对生物活性因子(bFGF、BD-NF、NT-3、IGF)有效负载与控制持续以一定浓度释放特性，同时具备以下作用：
1、复合膜可以直接贴敷于损伤脊髓部位，一方面克服了生物活性因子不能通过血脑屏障的问题，另一方面不需要对损伤部位周边的脊髓进行清除，避免了该处脊髓细胞的进一步损失。
2、根据生物活性因子作用时限，修复周边脊髓细胞需要的有效浓度，科学设计介孔生物活性玻璃小球的载药总量和释放速度、浓度，提高作用效能；
3、致密外层无法通过活性因子及干细胞，使得活性因子及干细胞只能向内层方向(即损伤部位)定向释放，如图3中箭头。
4、复合膜支架周边以医用生物胶封闭，以保证活性因子及干细胞不从支架周围溢出，保证了载药系统一方面定向释放，另一方面保证的释放的时间和浓度；
5、复合膜具有超薄的特点(厚度不超过2mm)，不会因为体积过大压迫脊髓，同时有利于缝合硬脊膜，防止脑脊液漏形成。
需要做一个特别说明的是，和本发明最接近的现有技术为：一种用于桥接缺损神经的复合修复材料及其支架CN201510716279.8。其公开了一种用于桥接缺损神经的复合修复材料及其支架，包括：所述复合材料是由丝素层-胶原层-高分子聚合物层依次排列组成，高分子聚合层呈T型或长方形设计，应用时通过折叠或卷折形成丝素层为内层、胶原层为中层、高分子聚合物层为外层的神经桥接支架。但是其所要解决的技术问题，和起到的技术效果，和本发明是完全不一样的。
CN201510716279.8解决的技术问题是实现缺损神经快速桥接，其实质即为背景技术中介绍的“桥接截断的神经束”。其使用时，先将支架通过折叠或卷折形成丝素层为内层、胶原层为中层、高分子聚合物层为外层的神经桥接支架，其次将折叠或者券折后的支架两端和截断的神经束两端通过外科手术方法缝合。其中丝素层不仅引导神经修复，而且隔开不同神经，防止形成神经瘤。胶原层提供神经轴突生长/所需的各种养分。高分子聚合物层，具有良好的力学性能，提供手术缝合或吻合所需的力学强度，并且防止周围神经的侵入，防止纤维疤痕的形成。
本发明的复合膜支架，应用于修复截断或者部分受损的神经束，不需要缝合，直接将复合膜贴附在神经束的受损部位即可(如图2)。其致密外层用于阻挡夹心层和内层的活性因子及干细胞向该方面渗透并且通过该层膜向外界渗出(如图3)；夹心层用于在一定时间内，形成持续浓度药物的析出；内层提供干细胞。本发明所要解决的技术问题，复合膜各层在复合膜中各自的作用和起到的技术效果，与CN201510716279.8完全不一样。
本发明可以解决已经受到损伤(但未死亡)的单个神经束，现有技术无法修复和治疗的问题；现有载药系统不能实现药物的定向释放，无法保证损伤局部因子的高浓度的问题；多数载药系统易于降解，载药量低，药物释放不能贯穿于脊髓损伤修复过程始终的问题；载药系统体积过大，可能压迫脊髓，同时不有利于缝合硬脊膜，导致脑脊液漏形成的问题。
附图说明
图1为本发明的三明治式复合膜支架示意图。
图2为本发明的三明治式复合膜支架贴附于脊髓示意图。
图3为复合膜支架药物释放方向(路径)。
具体实施方式
本发明采用具有良好生物相容性和可降解性的聚乳酸和壳聚糖为材料，制备了一种便于临床应用的膜式支架载体，并加载介孔生物活性玻璃，负载神经生长因子等生物活性因子，以提高生物活性因子的载药量，获得一种三明治式膜支架。
如图1所示，该三明治结构支架从上到下(如果贴合在脊髓上则是从外到内)分别是：低分子量聚乳酸膜致密外层即PLA薄膜、夹心层载药介孔生物活性玻璃夹层、内层CS薄膜即壳聚糖膜。其中夹心层介孔生物活性玻璃小球用来负载神经生长刺激因子或神经营养因子等生物活性因子，内层CS薄膜用来负载人脐带干细胞(HUMSCs)等种子细胞。其中介孔生物活性玻璃小球可以替换为乙二醇乳酸共聚物(PEG-PLA)纳米微球。
致密外层聚乳酸膜作为密封层，用于阻挡夹心层和内层的活性因子及干细胞向该方面渗透并且通过该层膜向外界渗出，阻止所负载的神经生长因子等释放到整个脊髓液中，以实现定向释放。生物活性玻璃负载神经生长因子等，以实现长期稳定释放，满足神经修复的时间需求。
目前的支架材料多为管式，需要将脊髓损伤部位整个切除才能应用，而本支架则采用敷贴的形式应用于脊髓损伤部位，不需要切除。本支架可以为方型或者圆形，或者其他治疗需要的形状。复合膜支架周边以医用生物胶封闭。活性因子及干细胞只能向脊髓损伤处运动(如图3)，达到只向脊髓损伤处提供干细胞和活性因子的目的。
壳聚糖作为内层，既可作为种子细胞的生长负载体，又起到对夹心层所负载药物释放速度的调整作用。通过活性玻璃层和壳聚糖层调控药物的负载量及缓释速率，使其具有长期局部定向释放功能，占位效应小，对脊髓不产生明显压迫和二次损伤，且可采用敷贴方式应用于SCI治疗的支架载体。
本发明具体的制备方法为：
(1)将一定分子量的聚乳酸(质均分子量为5000-1000000，优选5000-100000，聚乳酸分子量大小对释放速度影响不大，特别是优选范围内)，溶解到有机溶剂中(有机溶剂包括1,4-二氧六环，丙酮，三氯甲烷/乙醇混合溶剂，二氯甲烷，四氢呋喃，及上述溶剂的混合溶剂)，浓度为0.1-10wt％，采用旋涂、滴涂等方法制备聚乳酸薄膜，作为外侧密封层；
(2)将一定分子量的壳聚糖(质均分子量为5000-1000000，优选5000-100000)，溶解到酸性水溶液中(采用的酸包括盐酸、乙酸、硝酸)，得到浓度为0.1-10％(质量分数)的壳聚糖溶液；采用旋涂、滴涂等方法制备壳聚糖薄膜，作为内侧控释层及干细胞支架；
优选的，可以将京尼平溶解于适量醇水混合物中，制备京尼平溶液，然后取适量壳聚糖溶液和京尼平溶液加入到烧杯中，在磁力搅拌下使其充分混匀。接着，把混匀后的溶液倒入塑料培养皿中，先室温交联24h，而后冷冻干燥即得到壳聚糖膜。
(3)将干细胞悬液，采用逐层注入的方法使其均匀浸入上一步的壳聚糖薄膜内部进行培养；
(4)制作介孔生物活性玻璃的制备过程，具体如下所述：
将原硅酸乙酯，硝酸钙，F127，2M的硝酸按一定质量比加入无水乙醇的混合液中搅拌(典型比例为2.7g TEOS，1.18g Ca(NO3)2·4H2O，4.2g F127以及0.08g 2M HNO3加入8g无水乙醇)，室温下搅拌3h获得溶胶。
将所得溶胶放入真空干燥箱中在50℃进行溶胶凝胶过程，待溶胶凝胶化干燥后，于马弗炉中600℃下烧结除去模板剂，即得介孔生物活性玻璃。然后将所得介孔生物活性玻璃研磨成均匀粉末，此粉末即为MBGs。配制神经生长刺激因子的饱和溶液，采用灌注法将其负载到介孔生物活性玻璃(以下称之为MBGs)中，具体实施方法如下：用一定浓度的药物溶液浸润已知质量的MBGs粉末，将其置于真空干燥箱中，真空条件下使其快速干燥，完成一次灌注周期。多次重复灌注可调节其载药量，最后载药完成后，置于干燥箱中，备用。记录灌注次数，计算理论载药量。以介孔生物活性玻璃负载生物活性因子作为夹心层。
(5)叠加方式构建三明治式复合膜载体方法如下：采用旋涂、滴涂等方法制备聚乳酸薄膜作为外侧密封层，以生物活性玻璃负载生物活性因子并覆盖于聚乳酸薄膜，再通过将壳聚糖膜或者壳聚糖溶液覆盖在生物活性玻璃层上构建三明治式复合膜载体。
一个替换的方法为：步骤(5)将各层以能够渗透神经生长刺激因子和干细胞的医用生物胶进行粘连。
一个替换的方法为：省略了实施例1中步骤(3)的过程，制作了没有负载种子细胞的壳聚糖膜；在步骤(5)中将没有负载种子细胞的壳聚糖膜覆盖在生物活性玻璃层上；然后将干细胞悬液均匀浸入壳聚糖薄膜内部进行种子细胞的培养。
一个替换的方法为：省略实施例1中步骤(2)、(3)的过程，不制作壳聚糖膜；在步骤(5)中不将壳聚糖膜覆盖在生物活性玻璃层上；而是在步骤(5)之后，制作干细胞和壳聚糖混合悬溶液，采用旋涂、滴涂方法将该混合溶液覆盖于生物活性玻璃层上，构建类三明治式复合膜载体。
实施例1：
(1)将质均分子量为100000的聚乳酸溶解到有机溶剂四氢呋喃中，浓度为2wt％，采用旋涂方法制备聚乳酸薄膜，作为外侧密封层；
(2)将质均分子量为50万的壳聚糖1g，加入到50ml质量分数为2％的醋酸溶液中，磁力搅拌过夜制得浓度为20mg/ml的壳聚糖溶液待用。将0.018g京尼平溶解于3ml醇水混合物中(醇：水＝3：7体积比)中，制备京尼平溶液。取10ml壳聚糖溶液和京尼平溶液加入到烧杯中，在磁力搅拌60min使其充分混匀。接着，把混匀后的溶液倒入塑料培养皿中，先室温交联24h，而后冷冻干燥即得到壳聚糖膜，即得到作为内侧控释层及干细胞支架；
(3)将干细胞悬液，采用逐层注入的方法使其均匀浸入上一步的壳聚糖薄膜内部进行培养；
(4)制作介孔生物活性玻璃的制备过程，具体如下所述：
将2.7g TEOS，1.18g Ca(NO3)2·4H2O，4.2g F127以及0.08g 2M HNO3加入8g无水乙醇，室温下搅拌3h获得溶胶。
将所得溶胶放入真空干燥箱中在50℃进行溶胶凝胶过程，待溶胶凝胶化干燥后，于马弗炉中600℃下烧结除去模板剂，即得介孔生物活性玻璃。然后将所得介孔生物活性玻璃研磨成均匀粉末，此粉末即为MBGs。配制神经生长因子溶液，采用灌注法将其负载到MBGs中，具体实施方法如下：将1ml(10μg/ml)的药物溶液分多次浸润10mg的MBGs粉末，将其置于真空干燥箱中，真空条件下使其快速干燥，完成一次灌注周期。多次重复灌注可调节其载药量，最后载药完成后，置于干燥箱中，备用。记录灌注次数，计算理论载药量为1mg/g。以介孔生物活性玻璃负载生物活性因子作为夹心层。
(5)叠加方式构建三明治式复合膜载体方法如下：采用旋涂方法制备聚乳酸薄膜作为外侧密封层，以生物活性玻璃负载生物活性因子并覆盖于聚乳酸薄膜，再通过将壳聚糖膜覆盖在生物活性玻璃层上构建三明治式复合膜载体。
对比例1：
将神经生长因子的溶液灌注负载到MBGs中，载药量与实施例1相同。得到载药-MBGs。
对比例2：
按照实施例1的方法，采用旋涂方法制备聚乳酸薄膜作为外侧密封层，以生物活性玻璃负载生物活性因子并覆盖于聚乳酸薄膜，变化在于，再通过旋涂方法制备同样的聚乳酸薄膜覆盖在生物活性玻璃层上，构建三明治式复合膜载体，即采用聚乳酸薄膜作为内层控释层即干细胞支架。需注意的是，在制备聚乳酸薄膜作为内层控释层即干细胞支架时，同实施例1一样将干细胞悬液采用逐层注入的方法使其均匀浸入聚乳酸薄膜内部进行培养。
对比例3：
将壳聚糖膜作为外侧密封层，其余步骤与实施例1相同。也就是先采用旋涂方法制备壳聚糖膜作为外侧密封层，然后以生物活性玻璃负载生物活性因子并覆盖于聚乳酸薄膜，再通过将壳聚糖膜覆盖在生物活性玻璃层上构建三明治式复合膜载体。
测试例：神经因子释放实验
检测实施例1和对比例1、2、3制备得到的产品对鼠神经生长因子的释放速率。将产品浸入模拟脊髓液中，测试不同时间神经因子的释放速度，结果如表1所示。
表1神经生长因子累计释放量(％)
如表1所示，实施例1样品表现出最佳的控制释放速率，文献报道当神经生长因子的浓度维持在100ng/mL左右时可有利促进干细胞的生长，而实施例1样品在100min时模拟脊髓液中神经生长因子浓度达到103ng/mL，之后在所测试的127h内，模拟脊髓液中神经生长因子浓度基本维持在103-124ng/mL之间。推测其有利于干细胞的生长。
对比例1样品释放速率较快，一开始释放神经生长因子较多，之后释放速度变慢，模拟脊髓液中神经生长因子的浓度降低。这表明纯MBGs负载神经因子释放速度快，无法获得长期修复效果。
对比例2是将聚乳酸膜代替壳聚糖膜作为内层，可以看到其释放速度很慢，并且在释放高峰后持续变慢，释放浓度达不到修复要求。
对比例3是将壳聚糖代替聚乳酸膜作为外层，可以看到其释放规律与与对比例1相似，只是释放速度慢一些；这是因为外层是壳聚糖时，神经因子会从外层释放，得到最终的效果与未加内外层的纯载药MBGs相似。

Claims (10)

1.一种三明治式复合膜支架的制作方法，其特征为：包括以下步骤：
(1)分别制作聚乳酸薄膜、负载生物活性因子的介孔生物活性玻璃、负载种子细胞的壳聚糖膜作为外侧密封层、夹心层和内侧控释及干细胞支架层；
(2)将负载生物活性因子的生物活性玻璃的夹心层覆盖于聚乳酸薄膜上，再将负载种子细胞的壳聚糖膜覆盖在生物活性玻璃层上构建三明治式复合膜载体。
2.如权利要求1中所述的制作方法，其特征在于：
(1)中制作没有负载种子细胞的壳聚糖膜；
(2)中将没有负载种子细胞的壳聚糖膜覆盖在生物活性玻璃层上；
(3)将干细胞悬液，采用均匀浸入上一步的壳聚糖薄膜内部进行种子细胞的培养。
3.如权利要求1中所述的制作方法，其特征在于：
(1)中不制作壳聚糖膜；
(2)中不将壳聚糖膜覆盖在生物活性玻璃层上；
(3)制作干细胞和壳聚糖混合悬溶液，采用旋涂、滴涂方法将该混合溶液覆盖于生物活性玻璃层上，构建类三明治式复合膜载体。
4.如权利要求1-3之一中所述的制作方法，其特征在于：将各层以能够渗透神经生长刺激因子和干细胞的医用生物胶进行粘连。
5.如权利要求1中所述的制作方法，其特征在于：述夹心层负载生物活性因子为神经生长刺激因子。
6.如权利要求5中所述的制作方法，其特征在于：所述神经生长刺激因子为bFGF、BD-NF、NT-3、IGF中的一种或者几种的组合。
7.如权利要求1中所述的制作方法，其特征在于：复合膜支架周边以不渗透神经生长刺激因子和干细胞的医用生物胶进行封闭。
8.如权利要求1中所述的制作方法，其特征在于：所述介孔生物活性玻璃小球替换为乙二醇乳酸共聚物PEG-PLA纳米微球。
9.如权利要求1中所述的制作方法，其特征在于：所述种子细胞为脐带源间充质干细胞，即HUMSCs。
10.如权利要求9中所述的制作方法，其特征在于：所述种子细胞选自：许旺细胞、骨髓间充质细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、神经干细胞或诱导多能干细胞中的一种或几种组合。
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