CN116942911A - 一种复合骨修复材料及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种复合骨修复材料及其制备方法与应用。本发明提供的一种复合骨修复材料，包括：第一组份：骨粉，第二组份：壳聚糖和丝素蛋白；其中，第一组份与第二组份的质量比为75～85：15～25；壳聚糖和丝素蛋白的质量比为45～55：45～55；其中，复合骨修复材料的制备方法包括：将壳聚糖、丝素蛋白、骨粉与乙酸溶液进行混合，而后进行冷冻干燥，得到冻干材料，再将冻干材料进行交联；控制冻干材料的水分含量为2％以下。本发明制备的复合骨修复材料，与人体松质骨孔隙率以及力学性能相近，且具有体内血管化及成骨的突出潜力，在受损骨组织的修复临床应用中展现出巨大的前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种复合骨修复材料及其制备方法与应用。
背景技术
人体的主要结构组织中，骨起到提供支撑和保护各种器官，调节血液pH值，产生骨细胞并对多种干细胞(造血细胞和间充质)提供微环境的作用，但随着社会老龄化问题日益严重，骨骼系统疾病的发病率也呈现持续上升趋势。骨质疏松症、骨关节炎、成骨不全、骨髓炎等外伤、骨科手术(即全关节置换术、脊柱关节固定术、植入物固定等)和原发肿瘤切除术往往会造成不同成都的骨损伤和缺损。这些都需要医用骨科材料的植入来恢复和重建受损骨组织的结构和功能。因此，骨科修复材料是近年来医用材料领域研究的重点之一。
以同种异体骨粉为基础，复合聚合物形成三维多孔结构为骨科材料研究者们提供了新的方向。但骨粉本身结构松散很难形成多孔支架，特别是承重部位的骨组织修复时，将直接骨粉填充在缺损部位很难起到支撑作用，并且容易松散进入周围组织形成异位骨。
作为植入性修复材料，临床应用前进行灭菌处理为通用要求，并且要求无菌度水平达到SAL10-6级别，而该类材料主要以射线辐照方式进行终端灭菌处理，然而目前现有的方案中天然生物材料在经过辐照灭菌后通常会导致材料结构松散，力学性能较差，降解过快，不能满足天然骨的生长速率，且降解产物容易堆积，无法代谢。
发明内容
为解决上述缺陷，本发明首先提供一种复合骨修复材料，包括：
第一组份：骨粉，
第二组份：壳聚糖和丝素蛋白；
其中，第一组份与第二组份的质量比为75～85：15～25；
所述壳聚糖和丝素蛋白的质量比为45～55：45～55；
其中，所述复合骨修复材料的制备方法包括：将所述壳聚糖、丝素蛋白、骨粉与乙酸溶液进行混合，而后进行冷冻干燥，得到冻干材料，再将所述冻干材料进行交联；
控制所述冻干材料的水分含量为2％以下。
目前，蚕丝丝素蛋白/壳聚糖(以下简称SF/CS)支架在骨组织工程中应用广泛，其主要是将成骨细胞作为种子细胞，与SF/CS等支架材料进行体外复合培养，然而骨组织工程成本高，质量控制难度大，临床应用安全性难以保证，不具备产业化的条件。
本发明尝试将壳聚糖和丝素蛋白引入生物材料中作为体内移植材料，然而体内移植材料完全不同于上述体外复合，且体外试验也并不能反映出该材料长期植入体内可能发生的生物学反应。经过大量研究后本发明意外发现，将壳聚糖和丝素蛋白引入生物材料中时，通过控制冻干材料的水分含量的同时优化组份间和组份中的用量关系，能够使得所述复合骨修复材料实现接近人体松质骨的孔隙率和力学性能，应用其有望实现大段骨缺损的修复。
优选地，在所述复合骨修复材料中，所述骨粉的质量占比为75～85wt％。
优选地，所述的复合骨修复材料包括如下重量份组分：75～85份骨粉、7.5～12.5份壳聚糖和7.5～12.5份丝素蛋白。
本发明发现，上述组分的协同能使材料结构更均匀紧密，且在经过辐照灭菌后仍保持一定的力学性能，降解速率可以满足骨的生长速率，有助于新骨形成。
本发明还提供所述复合骨修复材料的制备方法，包括：
S1：将壳聚糖、丝素蛋白、骨粉与乙酸溶液进行混合，得到混合物；
S2：将所述混合物倒入模具，先在-40℃及以下温度冷冻，而后在以下条件下进行冷冻干燥，得到海绵状冻干材料，控制冻干材料水分含量为2％以下；
所述冷冻干燥的条件包括：先在-25～-15℃、50Pa下保持7～9h，再在-10～-5℃、50Pa下保持3～5h，而后在5～10℃、50Pa下保持7～9h，最后在20～25℃、50Pa下保持3～5h；
S3：将所述冻干材料在交联剂的无水乙醇溶液中进行化学交联，而后清洗、冷冻干燥后获得复合骨修复材料；
S4：将所述复合骨修复材料进行灭菌。
本发明发现，通过上述冻干曲线所述的冻干方法能够有效保证交联前过程品(冻干材料)的水分含量在2wt％以下，进而制备出孔隙率、孔隙结构可控的、具有较高力学性能的三维多孔支架材料，该材料在大段骨缺损修复中具有广阔的应用前景。此外，本发明还进一步发现将冻干品在其不可溶的乙醇溶液中进行化学交联，交联更均一，能够有效避免材料中只有局部组分过分交联而其他部分未充分交联的不足。
本发明中，壳聚糖在微酸环境下与骨粉中羟基磷灰石之间的电荷吸引，使骨粉在支架溶液中分散更均匀。壳聚糖与丝素蛋白间通过氢键、静电相互作用结合，使支架结构更稳固，骨粉壳聚糖和丝素蛋白混合均匀。
作为优选，所述S3中，所述乙醇溶液为无水乙醇。
本发明发现，乙醇中若含有水会在一定程度上影响交联效果，当使用无水乙醇时，交联效果更好。
作为优选，所述交联剂为摩尔比为1.5～2.5：1的EDC和S-NHS；更优选地，摩尔比为2：1。
作为优选，所述灭菌通过25kGy的γ射线辐照进行。
作为本发明的一种优选实施方案，壳聚糖/丝素蛋白/骨粉复合骨修复材料(也简称CS-SF-B)的制备方法包括：
(1)配制浓度2wt％乙酸溶液，并以此作为溶剂，配制浓度为3.3wt％壳聚糖的乙酸溶液；
(2)配制浓度为5wt％丝素蛋白水溶液；
(3)将所述壳聚糖的乙酸溶液、所述丝素蛋白水溶液和骨粉充分混合均匀，以干物质量计算，壳聚糖、丝素蛋白和骨粉的质量比为7.5～12.5：7.5～12.5：75～85；
(4)将所述混合物倒入模具，先在-40℃及以下温度冷冻，而后在以下条件下进行冷冻干燥，得到海绵状冻干材料；
所述冷冻干燥的条件包括：先在-25～-15℃、50Pa下保持7～9h，再在-10～-5℃、50Pa下保持3～5h，而后在5～10℃、50Pa下保持7～9h，最后在20～25℃、50Pa下保持3～5h；
优选地，先在-20℃、50Pa下保持8h，再在-5℃、50Pa下保持4h，而后在5℃、50Pa下保持8h，最后在25℃、50Pa下保持4h，取出后脱模，获得一次冻干过程品(含水量小于2％)；
(5)在一次冻干过程品中加入交联剂溶液；所述交联剂溶液为50mMEDC、25mMS-NHS的无水乙醇溶液，水洗、二次冷冻干燥后获得复合骨修复材料；
(6)使用25kGy以上剂量γ射线对所述复合骨修复材料进行辐照灭菌。
本发明发现使用上述交联技术，更有利于达到松质骨的力学性能和合适的降解速率，非常利于大段骨缺损的修复。
优选地，在所述S1中，固液比为1：3.75～6.25。
优选地，所述骨粉的制备方法包括：
将骨组织研磨成粉，先在10％双氧水中处理，水洗后在75％乙醇中处理；而后在氯仿与甲醇的混合溶液中处理，再用75％乙醇和蒸馏水交替清洗，-20℃，50Pa下冷冻干燥，得到所述骨粉。
本发明发现，上述处理能够使同种异体骨粉去除掉细胞和蛋白等具有高免疫原性的物质，有效降低异体骨高免疫排斥反应的问题的同时，保留组成人骨的主要成分——Ⅰ型胶原和羟基磷灰石，可以最大程度地使用人骨中的原成分来成型骨支架。同时，其中保留的微结构和微量元素，还有利于诱导细胞在其表面附着和爬行，其生物活性和骨传导性远好于高温下烧结的羟基磷灰石。此外，支架降解过程中骨粉自身的这些成分可以直接在缺损部位被利用，有助于骨的修复。
优选地，所述氯仿与甲醇的体积比为0.9～1.1：0.9～1.1。
作为本发明的一种优选实施方案，所述骨粉的制备方法包括：
将骨组织研磨成粉状，10％双氧水中脱脂60～80小时，纯化水清洗干净，75％乙醇灭活病毒1～3小时；氯仿：甲醇混合溶液脱除骨粉中杂蛋白3～5小时，再用75％乙醇和蒸馏水交替清洗，去除氯仿和甲醇，-20℃、50Pa条件下冷冻干燥15～20小时，获得部分脱蛋白的天然骨粉，其主要成分为天然骨羟基磷灰石与骨胶原。
在本发明中，所述骨组织取自同种或异种来源的天然骨组织材料。
本发明进一步提供所述复合骨修复材料在制作植入生物支架方面的应用。
基于上述技术方案，本发明的有益效果在于：
本发明制备的复合骨修复材料，可根据缺损部位的不同形状，进行精确加工；且与人体松质骨孔隙率以及力学性能相近，在受损骨组织的修复临床应用中展现出巨大的前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。其中，图1～7中，a代表对比例2所制样品、b代表对比例1所制样品、c代表实施例1所制样品。
图1是本发明提供的实施例1、对比例1～2所制的复合骨修复材料的扫描电镜图；
图2是本发明提供的实施例1、对比例1～2所制的复合骨修复材料的组织学H&E染色结果；图中箭头所指为材料，三角形所在区域是被细胞填充的材料间隙；
图3是本发明提供的实施例1、对比例1～2所制的复合骨修复材料的H&E染色定量分析细胞浸润结果；其中*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01。
图4是本发明提供的实施例1、对比例1～2所制的复合骨修复材料的免疫组化OCN染色，图中箭头所指处为OCN阳性；
图5是本发明提供的实施例1、对比例1～2所制的复合骨修复材料的OCN阳性表达计算结果；其中*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01；
图6是本发明提供的实施例1、对比例1～2所制的复合骨修复材料的免疫组化CD31染色；其中，图中三角形两个短边交叉处所指为新生成血管；
图7是本发明提供的实施例1、对比例1～2所制的复合骨修复材料的CD31阳性表达计算结果；其中*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1本实施例提供一种壳聚糖/丝素蛋白/骨粉(CS-SF-B)复合骨修复材料，CS、SF和骨粉的质量比例为10：10：80，含水量小于2％，其制备方法包括如下步骤：
配置2％乙酸溶液6mL；称取0.2g壳聚糖，加入到乙酸溶液中，磁力搅拌20min，加盖保鲜膜，防止灰尘落入，并减少蒸发；称取丝素蛋白0.2g加入4mL水中，磁力搅拌10min，调低转速，避免丝素蛋白成泡沫析出；待丝素蛋白溶解后，称取骨粉1.6g加入其中，磁力搅拌混合10min，加入壳聚糖-乙酸溶液，磁力搅拌20min；分装入冻干模具中，用医用胶布封口，先放入-40℃以下冰箱冷冻6～10h，取出后冷冻干燥，所述冷冻干燥条件包括：先在-20℃、50Pa条件下保持8h、再在-5℃、50Pa条件下保持4h、而后在5℃、50Pa条件下保持8h、最后在25℃、50Pa条件下保持4h，冻干结束后取出后脱模，获得一次冻干品(含水量低于2％)。将获得的冻干品中在浓度为50mM EDC、25mM S-NHS的无水乙醇溶液中充分交联，再经纯化水清洗后，放入冷冻干燥机，真空冷冻24h，取出。采用双层复合袋密封包装，25kGyγ射线辐照灭菌。
实施例2本实施例提供一种壳聚糖/丝素蛋白/骨粉(CS-SF-B)复合骨修复材料，其与实施例1的制备方法基本相同，区别仅在于：所述冷冻干燥的条件包括：先在-25℃、50Pa下保持7h，再在-10℃、50Pa下保持5h，而后在10℃、50Pa下保持7h，最后在20℃、50Pa下保持5h。
实施例3
本实施例提供一种壳聚糖/丝素蛋白/骨粉(CS-SF-B)复合骨修复材料，其与实施例1的制备方法基本相同，区别仅在于：壳聚糖、丝素蛋白和骨粉的质量比例为7.5：7.5：85。
对比例1
本对比例提供一种壳聚糖/丝素蛋白/骨粉(CS/SF/B)复合骨修复材料，其与实施例1基本相同，区别仅在于：壳聚糖、丝素蛋白和骨粉的质量比例为25：25：50。
对比例2
本对比例提供一种壳聚糖/丝素蛋白/骨粉(CS-SF/B)复合骨修复材料，其与实施例1基本相同，区别仅在于使用常规冷冻干燥条件：先在-80℃下预冻6h，然后在-50℃，真空度30Pa，持续干燥36h；得到的冻干材料的水分含量为6～10％。
试验例1
(1)复合骨修复材料的孔隙结构
将实施例1与对比例1、2所制备的三种复合骨修复材料分别切取横纵切面贴在导电胶上，喷金后通过扫描电镜观察同种材料横纵切面的孔隙形状和均匀性，对比四种材料的孔径大小。结果如图1所示。
(2)复合骨修复材料的孔隙率检测
将实施例与对比例所制备的三种复合骨修复材料置于10mL离心管中，每管加入5mL无水乙醇记为v1，抽真空1h后，读取液体体积记为v2，对照组为v0，将材料快速取出后读取液体体积记为v3，经过公式：
孔隙率＝[(v2-v1)+(v1-v0)]/[(v2-v3)+(v1-v0)]×100％
计算后得到各组材料孔隙率。
结果表明，实施例1所获得的冻干交联复合材料孔隙率为80.43％，实施例2为76.95％，实施例3为78.70％；对比例1所获得的复合材料孔隙率为89.49％，对比例2所获得的复合材料的孔隙率为80.42％。各方案所制得样品的孔径和孔隙率与天然松质骨相近似，符合理想骨修复材料的性能要求。
(3)复合骨修复材料的力学性能检测
将实施例与对比例所制备的三种复合骨修复材料制作成直径1cm，高2cm的柱状支架用于检测，使用岛津试验机，设置压力载荷区间为0～250N。由于测量试样为典型的多孔结构，考虑到试样可能具有较强的压缩韧性，没有典型的压缩断裂特性，设置压缩试验进行的极限为形变量到达30％，压缩速率为2mm/min。
结果表明，实施例1所获得的冻干交联复合材料(CS-SF-B)力学性能达到1.10MPa，实施例2为1.05MPa，实施例3为0.97MPa，均能达到人体松质骨的力学性能水平，满足一般骨缺损填充修补材料的基本要求，而对比例1和对比2所制备的样品力学性能仅分别为0.13MPa和0.56MPa。
(4)复合骨修复材料的体内埋植实验检测
材料植入：将24只6周龄雄性SD大鼠随机分为六组，每组四只。麻醉后，给大鼠背部材料植入部位剃毛、局部消毒，而后在每只大鼠背部分别植入实施例1和对比例1和2所制备的三种复合骨修复材料及对照组材料——市售胶原蛋白。具体的：将背部预植入部位皮肤沿背脊线剪出1.5-2cm的切口，钝性分离大鼠背部皮肤和皮下肌肉组织间的粘膜直至形成可容纳材料的口袋，将材料放入其中，使用伤口缝线缝合伤口。给大鼠提供充足的水、食物和已经温暖干净的环境，待大鼠苏醒后观察大鼠伤口愈合情况和活动行为。
材料取出：分别在植入3、7、14、21、28天和2个月后处死4只动物，取下大鼠背部植入材料及周围组织放入4％的组织固定液中固定。借助组织学染色、免疫组化染色与免疫荧光染色等手段检验支架材料的生物相容性以及血管化及成骨的潜力。对应结果如图2～7所示。其中，图2是本发明提供的实施例1、对比例1～2所制的复合骨修复材料的组织学H&E染色结果；图中箭头所指为材料，三角形所在区域是被细胞填充的材料间隙；图3是本发明提供的实施例1、对比例1～2所制的复合骨修复材料的H&E染色定量分析细胞浸润结果；其中*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01；图4是实施例1、对比例1～2所制的复合骨修复材料的免疫组化OCN染色，图中箭头所指处为OCN阳性；图5是实施例1、对比例1～2所制的复合骨修复材料的OCN阳性表达计算结果；其中*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01；图6是实施例1、对比例1～2所制的复合骨修复材料的免疫组化CD 31染色；其中，图中三角形两个短边交叉处所指为新生成血管；图7是本发明提供的实施例1、对比例1～2所制的复合骨修复材料的CD31阳性表达计算结果；其中*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01。
结果表明，几组支架材料植入大鼠皮下对创口愈合过程未见明显的不良反应，支架材料在大鼠体内不断被降解吸收，且降解产物不引起新的炎症反应。HE染色组织学观察显示植入的支架被纤维组织包裹，无炎性排斥反应，愈合期间成纤维细胞活跃，支架表面附着大量的成纤维细胞；胶原的Masson染色发现在支架的降解过程中支架周围组织中有大量的胶原纤维沉积。通过CD68、iNOS和CD16的双标记荧光染色，表明实施例1所制备的复合骨修复材料可明显促进巨噬细胞由促炎M1型向促愈合M2型转化。通过对CD31、OCN进行免疫荧光染色证实实施例1所制得的复合骨修复材料植入后显著促进血管生成与成骨分化。针对本发明中的几组实验组材料，实施例1所制得的复合骨修复材料在生物相容性及血管化成骨潜力方面最具优势，而对比例1和对比例2植入后仅在生物相容性上与实施例1相当，而在血管化及成骨潜力上均显著行低于实施例1的效果。可见，实施例1所述复合骨修复材料具有良好的生物相容性和成骨成血管潜力，是一种很有前途的骨修复植入物，具有潜在应用价值和前景。上述实施例2与实施例3的效果与实施例1相当，制备的复合骨修复材料与人体松质骨孔隙率以及力学性能等相近，能够应用于在受损骨组织的修复临床应用中。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种复合骨修复材料，其特征在于，包括：
第一组份：骨粉，
第二组份：壳聚糖和丝素蛋白；
其中，第一组份与第二组份的质量比为75～85：15～25；
所述壳聚糖和丝素蛋白的质量比为45～55：45～55；
其中，所述复合骨修复材料的制备方法包括：将所述壳聚糖、丝素蛋白、骨粉与乙酸溶液进行混合，而后进行冷冻干燥，得到冻干材料，再将所述冻干材料进行交联；
控制所述冻干材料的水分含量为2％以下。
2.根据权利要求1所述的复合骨修复材料，其特征在于，在所述复合骨修复材料中，所述骨粉的质量占比为75～85wt％。
3.根据权利要求1或2所述的复合骨修复材料，其特征在于，包括如下重量份组分：75～85份骨粉、7.5～12.5份壳聚糖和7.5～12.5份丝素蛋白。
4.权利要求1～3任一项所述的复合骨修复材料的制备方法，其特征在于，包括：
S1：将壳聚糖、丝素蛋白、骨粉与乙酸溶液进行混合，得到混合物；
S2：将所述混合物倒入模具，先在-40℃及以下温度冷冻，而后在以下条件下进行冷冻干燥，得到冻干材料，控制冻干材料水分含量为2％以下；
所述冷冻干燥的条件包括：先在-25～-15℃、50Pa下保持7～9h，再在-10～-5℃、50Pa下保持3～5h，而后在5～10℃、50Pa下保持7～9h，最后在20～25℃、50Pa下保持3～5h；
S3：将所述冻干材料在交联剂的乙醇溶液中进行化学交联，而后清洗、冷冻干燥后获得复合骨修复材料；
S4：将所述复合骨修复材料进行灭菌。
5.根据权利要求4所述的复合骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述S3中，所述乙醇溶液为无水乙醇。
6.根据权利要求4所述的复合骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述交联剂为摩尔比为1.5～2.5：1的EDC和S-NHS。
7.根据权利要求4所述的复合骨修复材料的制备方法，其特征在于，在所述S1中，固液比为1：3.75～6.25。
8.根据权利要求4～7任一项所述的复合骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述骨粉的制备方法包括：
将骨组织研磨成粉，先在10％双氧水中处理，水洗后在75％乙醇中处理；而后在氯仿与甲醇的混合溶液中处理，再用75％乙醇和蒸馏水交替清洗，-20℃，50Pa下冷冻干燥，得到所述骨粉。
9.根据权利要求8所述的复合骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述氯仿与甲醇的体积比为0.9～1.1：0.9～1.1。
10.权利要求1～3任一所述复合骨修复材料或权利要求4～9任一项所述制备方法制得的复合骨修复材料在制作植入生物支架方面的应用。
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