CN114028613A - 一种功能性骨修复复合支架、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及骨组织工程技术领域，公开了一种功能性骨修复复合支架的制备方法，包括纳米脱细胞骨粉的制备、功能性多孔纳米骨粉‑明胶‑壳聚糖‑地塞米松复合支架的制备及交联；还公开了纳米骨粉‑明胶‑壳聚糖‑地塞米松功能性骨修复复合支架及应用。本发明具备骨基质成分、细胞粘附位点、足够机械强度、适于细胞生长增殖及营养物质代谢的三维结构，骨粉结合明胶和壳聚糖创造的复合支架具有良好的联通性，且纳米骨粉均匀地分散于支架孔壁、孔隙及骨架，具有较高的表面积，有利于成骨细胞的粘附和生长增殖，地塞米松的引入可有效减少异体支架的植入所引起的炎症反应带来的组织纤维化等问题，且其对成骨细胞的增殖和分化具有明显促进作用。

Description

一种功能性骨修复复合支架、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及骨组织工程技术领域，具体涉及一种功能性骨修复复合支架、制备方法及应用。
背景技术
由于外伤、肿瘤、感染等原因导致的骨缺损患者十分常见，中国每年约有350万人因不同原因出现骨缺损，骨移植手术约为150万例。目前，临床修复骨缺损的方法主要有三种：自体骨移植、异体骨移植和骨替代物移植。自体骨一直被认为是骨移植材料的金标准，但由于捐献骨的来源、捐献部位不健全及并发症易造成供骨部位二次创伤等原因，限制了其在临床应用的发展。异体骨虽然不存在供区创伤且骨源充足、具有与自体骨类似的生物活性及机械性能，但其存在较为严重的感染和免疫排斥反应，有时甚至导致移植的失败，大大降低了成功率。骨替代物移植是将具有惰性或生物相容性的金属、陶瓷等作为骨替代物植入患者体内，这种方法虽然不会对患者造成二次伤害且降低了免疫排斥反应，但是不能做到功能性的修复。随着组织工程技术的不断发展，采用骨组织工程技术为骨缺损的修复提供了新的方向。
骨组织工程技术的原理和方法是选择具有生物相容性的合适材料制备出特定结构功能的骨组织工程支架，再将具有特定分泌/分化功能的种子细胞接种在支架上生长增殖，将长有细胞的工程支架植入患者体内，种子细胞可根据支架材料的预定结构生长，材料在体内降解的同时细胞也在不断增殖，从而起到修复骨缺损的作用。由此可见骨组织工程技术中选择合适的支架是构建工程骨成功的关键。组织工程骨支架相当于人工的骨细胞外基质，其具有暂时支持组织或细胞生长的三维结构，为新骨的发生提供空间支持和功能诱导。理想的骨组织修复的生物支架材料应该具有良好的生物相容性、足够的机械强度、适宜的孔隙率和孔径、生物可降解性、骨整合、与天然骨类似的理化性能等等。单一材料不能满足上述性能的要求，通常需要将不同材料联合使用，从而改善支架，并进一步获得优质的组织工程骨。由于目前所采用的外源性复合支架植入体内后往往引起炎症反应，导致组织纤维化，因此发明人为了克服该缺陷并获得仿生性能更好的支架而研发并制备了一种兼具“抗炎与生物活性”的功能性骨修复复合支架。
发明内容
基于以上问题，本发明提供一种功能性骨修复复合支架、制备方法及应用，本发明的复合支架兼具良好生物相容性、骨诱导性及抗炎性，在骨组织工程中具有潜在应用价值。
为解决以上技术问题，本发明提供了一种功能性骨修复复合支架的制备方法，包括如下步骤：
S1：剔除猪骨股骨远端表面的骨膜、附着组织及骨髓，用双蒸水漂洗股骨3-5次后用骨刀和电锯将股骨分割成0.5cm3～1cm3的骨块，之后用粉碎机将骨块粉碎成5mm3～8mm3的细小骨颗粒；
S2：用双蒸水及pH为7.4的PBS缓冲液分别清洗步骤S1中的骨颗粒3～5次，每次清洗均置于磁力搅拌器上搅拌，每次清洗时间均为0.5～1h；
S3：向经步骤S2处理之后的骨颗粒中加入氯仿甲醇混合溶液，用磁力搅拌器搅拌2～4h，以除去颗粒表面及内部的脂肪成分，其中氯仿甲醇混合溶液中氯仿和甲醇的体积比为3:1；
S4：于室温下向经步骤S3处理之后的骨颗粒中先后加入TritonX-100和NaCl溶液，用磁力搅拌器分别搅拌5～8h和12～15h，进行脱细胞处理；
S5：室温下，用双蒸水和pH为7.4的PBS缓冲液先后清洗经步骤S4处理之后的骨颗粒3～5次，每次清洗的持续时间均为0.5～1h；
S6：将步骤S5中得到的骨颗粒置于-20～-30℃条件下预冻8～12h后，进行冷冻干燥处理，得到干燥后的脱细胞骨颗粒；
S7：将步骤S6中的干燥脱细胞骨颗粒置于球磨机中研磨1～2h，得纳米脱细胞骨粉；
S8：将步骤S7中的纳米脱细胞骨粉加入明胶-壳聚糖溶液中，混合均匀后加入地塞米松，得复合支架原溶液，待复合支架原溶液中的气泡被完全除去后，将复合支架原溶液置于-20～-30℃条件下预冻12～24h，得样品；
S9：冷冻干燥步骤S8中的样品，制得功能性多孔纳米骨粉-明胶-壳聚糖-地塞米松复合支架；
S10：向步骤S9中的复合支架中加入交联剂进行化学交联12～24h，之后加入0.1mol/L的Na2HPO4溶液中和醋酸2h后，用浓度为75％的乙醇和pH为7.4的PBS缓冲液先后清洗3～5次，每次清洗0.5～1h，对清洗后的复合支架进行二次冷冻干燥12～18h，获得交联后的纳米骨粉-明胶-壳聚糖-地塞米松功能性骨修复复合支架。
进一步的，步骤S4中的TrintonX-100的体积分数为1％～2％，NaCl的质量分数为0.9％。
进一步的，步骤S6中冷冻干燥的冷阱温度为-70～-80℃，冷冻干燥时间为15～20h。
进一步的，步骤S8中的纳米脱细胞骨粉的质量分数为0.5％～1.5％，明胶的质量分数为2％，壳聚糖的质量分数为1％，地塞米松的浓度为50～100nmol/L。
进一步的，纳米脱细胞骨粉的质量分数为1％，地塞米松的浓度为80nmol/L。
进一步的，步骤S9中冷冻干燥的冷阱温度为-70～-80℃，冷冻干燥时间为24～30h。
进一步的，步骤S10中的交联剂为由体积分数为70％的乙醇溶液溶解的EDC、NHS和MES的混合缓冲溶液，其中EDC、NHS的浓度均为50mmol/L，MES的浓度为20mmol/L。
为解决以上技术问题，本发明还提供了功能性骨修复复合支架。
为解决以上技术问题，本发明还提供了功能性骨修复复合支架在制备骨修复替代品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明选取去除抗原后的脱细胞猪松质骨骨粉作为仿生骨修复支架的主要材料，含有骨形态发生蛋白及多种成骨因子，利于成骨细胞粘附及增殖，骨粉为纳米尺寸，可均匀分布于明胶-壳聚糖孔壁及表面，保证了支架结构的均匀性，可有效介导细胞间信号传递，使最终制备的仿生骨支架具备骨基质成分、细胞粘附位点、足够机械强度、适于细胞生长增殖及营养物质代谢的三维结构；本发明在制备过程中极大减少了脱脂及脱细胞试剂的用量及时间，减少了脱细胞过程对骨基质的损伤，提高了纳米骨粉的质量；骨粉结合明胶和壳聚糖创造的复合支架具有大孔套小孔结构，具有良好的联通性，且纳米骨粉均匀地分散于支架孔壁、孔隙及骨架，具有较高的表面积，有利于成骨细胞的粘附和生长增殖；本发明的地塞米松具有抗炎作用，可有效减少异体支架的植入所引起的炎症反应带来的组织纤维化等问题，且其对成骨细胞的增殖和分化具有明显促进作用。
附图说明
图1为本发明的实施例2所获得的骨粉和骨粉-明胶-壳聚糖仿生骨复合支架的外观图和SEM图；
图2为本发明的实施例2中不同元素在复合支架中的分布及含量情况图；
图3为本发明的实施例4中1％骨粉-明胶-壳聚糖-地塞米松复合支架接种MC3T3-E1细胞7天后细胞存活的激光共聚焦显微镜图；
图4为本发明的实施例4中1％骨粉-明胶-壳聚糖-地塞米松复合支架接种MC3T3-E1细胞后成骨细胞增殖的荧光显微镜图；
图5为本发明的实施例4中1％骨粉-明胶-壳聚糖-地塞米松复合支架接种MC3T3-E1细胞后成骨细胞分布和增殖活性的激光共聚焦图；
图6为本发明的实施例5中成骨细胞在复合支架中的成骨分化能力结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
本实施例提供一种功能性骨修复复合支架的制备方法，包括如下步骤：
S1：剔除猪骨股骨远端表面的骨膜、附着组织及骨髓，用双蒸水漂洗股骨3-5次后用骨刀和电锯将股骨分割成0.5cm3～1cm3的骨块，之后用粉碎机将骨块粉碎成5mm3～8mm3的细小骨颗粒；
S2：用双蒸水及pH为7.4的PBS缓冲液分别清洗步骤S1中的骨颗粒3～5次，每次清洗均置于磁力搅拌器上搅拌，每次清洗时间均为0.5～1h；
S3：向经步骤S2处理之后的骨颗粒中加入氯仿甲醇混合溶液，用磁力搅拌器搅拌2～4h，以除去颗粒表面及内部的脂肪成分，其中氯仿甲醇混合溶液中氯仿和甲醇的体积比为3:1；
S4：于室温下向经步骤S3处理之后的骨颗粒中先后加入TritonX-100和NaCl溶液，用磁力搅拌器分别搅拌5～8h和12～15h，进行脱细胞处理；本实施例此处的TrintonX-100的体积分数为1％～2％，NaCl的质量分数为0.9％；
S5：室温下，用双蒸水和pH为7.4的PBS缓冲液先后清洗经步骤S4处理之后的骨颗粒3～5次，每次清洗的持续时间均为0.5～1h；
S6：将步骤S5中得到的骨颗粒置于-20～-30℃条件下预冻8～12h后，进行冷冻干燥处理，得到干燥后的脱细胞骨颗粒；其中冷冻干燥的冷阱温度为-70～-80℃，冷冻干燥时间为15～20h；
S7：将步骤S6中的干燥脱细胞骨颗粒置于球磨机中研磨1～2h，得纳米脱细胞骨粉；
S8：将步骤S7中的纳米脱细胞骨粉加入明胶-壳聚糖溶液中，混合均匀后加入地塞米松，得复合支架原溶液，待复合支架原溶液中的气泡被完全除去后，将复合支架原溶液置于-20～-30℃条件下预冻12～24h，得样品；本实施例所使用的纳米脱细胞骨粉的质量分数为0.5％～1.5％，明胶的质量分数为2％，壳聚糖的质量分数为1％，地塞米松的浓度为50～100nmol/L；
S9：冷冻干燥步骤S8中的样品，制得功能性多孔纳米骨粉-明胶-壳聚糖-地塞米松复合支架；其中冷冻干燥的冷阱温度为-70～-80℃，冷冻干燥时间为24～30h；
S10：向步骤S9中的复合支架中加入交联剂进行化学交联12～24h，之后加入0.1mol/L的Na2HPO4溶液中和醋酸2h后，用浓度为75％的乙醇和pH为7.4的PBS缓冲液先后清洗3～5次，每次清洗0.5～1h，对清洗后的复合支架进行二次冷冻干燥12～18h，获得交联后的纳米骨粉-明胶-壳聚糖-地塞米松功能性骨修复复合支架；本实施例的交联剂为由体积分数为70％的乙醇溶液溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和MES(乙磺酸)的混合缓冲溶液，其中EDC、NHS的浓度均为50mmol/L，MES的浓度为20mmol/L。
本实施例所制备的功能性骨修复复合支架可应用于骨修复替代品的制备中。
实施例2：
本实施例提供一种功能性骨修复复合支架的制备方法，具体步骤如下：
S1：剔除猪骨股骨远端表面的骨膜、附着组织及骨髓等，用双蒸水漂洗股骨3次后用骨刀和电锯将股骨分割成0.5cm3的骨块，之后用粉碎机将骨块粉碎成5mm3的细小颗粒；
S2：用双蒸水及PBS缓冲液(pH＝7.4)分别清洗步骤S1中的骨颗粒5次，每次清洗均置于磁力搅拌器上搅拌，每次清洗时间均为0.5h；
S3：在经步骤S2处理之后的骨颗粒中加入氯仿：甲醇(体积比3:1)溶液，用磁力搅拌器搅拌4h，除去颗粒表面及内部较多的脂肪成分；
S4：于室温下向经步骤S3处理之后的骨颗粒中先后加入体积分数为1％的TritonX-100和质量分数为0.9％(w/v)的NaCl溶液，用磁力搅拌器分别搅拌6h和12h，进行脱细胞处理；
S5：室温下，用双蒸水和PBS缓冲液(pH＝7.4)先后清洗经步骤S4处理之后的骨颗粒5次，每次清洗的持续时间均为0.5h；
S6：将步骤S5中得到的骨颗粒置于-20℃条件下预冻10h后，进行冷冻干燥处理15h，得到干燥后的脱细胞骨颗粒；
S7：将步骤S6中的干燥脱细胞骨颗粒置于球磨机中研磨2h，得纳米脱细胞骨粉；
S8：将步骤S7中的纳米脱细胞骨粉加入明胶-壳聚糖溶液中，待混合均匀并完全除去气泡后加入24孔板中，置于-20℃条件下预冻12h；分别添加了三个质量分数的纳米骨粉，分别为0.5％、1％和1.5％，其中明胶的质量分数为2％，壳聚糖的质量分数为1％；
S9：将经步骤S8预冻后的样品冷冻干燥28h，得到多孔纳米骨粉-明胶-壳聚糖-复合支架；
S10：向经步骤S9干燥后的复合支架中每孔加入2mL 70％乙醇溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，50mmol/L)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，50mmol/L)/MES(乙磺酸，20mmol/L)交联剂进行化学交联12h，再加入0.1mol/L的Na2HPO4溶液中和醋酸2h后，用浓度为75％的乙醇和PBS缓冲液(pH＝7.4)先后清洗5次，每次清洗0.5h，对清洗后的复合支架进行二次冷冻干燥15h，获得交联后的纳米骨粉-明胶-壳聚糖仿生骨复合支架。
见附图1，可见猪源性股骨经脱脂、脱细胞、粉碎及研磨等一系列操作后得到的骨粉为白色粉末，平均粒径小于100nm。骨粉进一步和明胶-壳聚糖混合后制备的仿生复合支架为白色多孔网状结构，SEM下可见0.5％骨粉/明胶/壳聚糖复合支架和1％骨粉/明胶/壳聚糖复合支架中大小孔穿插且孔与孔之间还具有良好的连通性，1.5％骨粉/明胶/壳聚糖复合支架则较为致密，纳米骨粉较均匀地分散于各组支架孔壁中，随着骨粉-明胶-壳聚糖浓度的增加，复合支架孔径逐渐减小。
见附图2，EDS能谱分析对复合支架中元素种类及每种元素所占比例进行测定，结果发现复合支架的主要元素为C、N和O，这三种元素对应mapping点图很好呈现出支架的多孔形态。另外，P和Ca元素点图说明骨粉均匀的分布在复合支架的骨架、孔壁和表面，且随着骨粉掺入量的增加，P和Ca元素的含量也逐渐增加。
实施例3：
本实施例提供一种功能性骨修复复合支架的制备方法，具体步骤如下：
S1：剔除猪骨股骨远端表面的骨膜、附着组织及骨髓等，用双蒸水漂洗股骨3次，用骨刀和电锯将股骨分割成0.5cm3的骨块，之后用粉碎机将骨块粉碎成5mm3的细小骨颗粒；
S2：用双蒸水及PBS缓冲液(pH＝7.4)分别清洗步骤S1中的骨颗粒5次，每次清洗均置于磁力搅拌器上搅拌，每次清洗时间均为0.5h；
S3：在经步骤S2处理之后的骨颗粒中加入氯仿：甲醇(体积比3:1)溶液，用磁力搅拌器搅拌4h，除去颗粒表面及内部较多的脂肪成分；
S4：于室温下向经步骤S3处理之后的骨颗粒中先后加入体积分数为1％的TritonX-100和质量分数为0.9％(w/v)的NaCl溶液，用磁力搅拌器分别搅拌6h和12h，进行脱细胞处理；
S5：室温下，用双蒸水和PBS缓冲液(pH＝7.4)先后清洗经步骤S4处理之后的骨颗粒5次，每次清洗的持续时间均为0.5h；
S6：将步骤S5中得到的骨颗粒置于-20℃条件下预冻10h后，进行冷冻干燥处理15h，得到干燥后的脱细胞骨颗粒；
S7：将步骤S6中的干燥骨颗粒置于球磨机中研磨2h，得纳米脱细胞骨粉；
S8：将步骤S7中的纳米脱细胞骨粉加入明胶-壳聚糖溶液中，充分搅拌混合均匀后，加入地塞米松，待溶液完全除去气泡后加入24孔板中，置于-20℃条件下预冻12h，得样品，其中纳米脱细胞骨粉的质量分数为0.5％～1.5％，明胶的质量分数为2％，壳聚糖的质量分数为1％，地塞米松的浓度为50～100nmol/L；
S9：将经步骤S8预冻后的样品冷冻干燥28h，得到功能性多孔纳米骨粉-明胶-壳聚糖-地塞米松复合支架；
S10：向步骤S9中的复合支架中每孔加入2mL 70％乙醇溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，50mmol/L)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，50mmol/L)/MES(乙磺酸，20mmol/L)交联剂进行化学交联12h，再加入0.1mol/L的Na2HPO4溶液中和醋酸2h后，用浓度为75％的乙醇和PBS缓冲液(pH＝7.4)先后清洗5次，每次清洗0.5h，对清洗后的复合支架进行二次冷冻干燥15h，获得交联后的纳米骨粉-明胶-壳聚糖-地塞米松功能性骨修复复合支架。
本实施例选取去除抗原后的脱细胞骨粉作为仿生骨修复支架的主要材料，去抗原脱细胞骨粉保留骨基质成分，且含有骨形态发生蛋白及多种成骨因子，具有良好细胞亲和性及骨诱导作用。本实施例将猪源性股骨切块粉碎后再进行脱脂及脱细胞处理，可极大减少脱脂及脱细胞试剂的用量及时间，减少脱细胞过程对骨基质的损伤。在此基础上，选取生物相容性极好的明胶和壳聚糖作为复合支架成分之一，三者创造的复合支架具有大孔套小孔结构，具有良好的联通性，且纳米骨粉均匀地分散于支架孔壁、孔隙及骨架，具有较高的表面积，有利于成骨细胞的粘附和生长增殖。再者，添加的地塞米松具有抗炎作用，可有效减少异体支架的植入所引起的炎症反应带来的组织纤维化等问题，且其对成骨细胞的增殖和分化具有明显促进作用。因此，本实施例基于纳米骨粉/明胶/壳聚糖制备仿生骨复合支架，并进一步引入地塞米松制备兼具良好生物相容性、骨诱导性及抗炎性的功能性骨组织支架用于骨缺损的修复，其在骨组织工程中具有潜在应用价值。
实施例4：
本实施例将猪股骨远端表面的骨膜、附着组织及骨髓等剔除，用电锯将其分割成0.5cm3的骨块，将骨块加入到粉碎机中将其粉碎成5mm3的细小颗粒。之后将骨颗粒置于烧杯中，加入1000mL双蒸水，磁力搅拌30min后更换新的双蒸水，重复两次后，加入1000mLPBS同样清洗3次，每次磁力搅拌45min，直至清洗液澄清无血色为止。然后加入1000mL氯仿：甲醇(体积比3:1)溶液，磁力搅拌3h，除去颗粒表面及内部较多的脂肪成分。待溶液中无任何油脂后，筛网过滤液体，加入1000mL 1％(v％，下同)TritonX-100溶液搅拌6h进行脱细胞处理；随后，加入1000mL 0.9％(w/v％，下同)NaCl溶液搅拌12h，进一步除去剩余细胞。待细胞完全脱除后，加入1000mL双蒸水和PBS缓冲液分别清洗骨颗粒3次，每次持续时间45min，用于洗净脱细胞试剂。随后，将骨粒置于-20℃冰箱中预冻8h后，放入冷冻干燥机中-80℃干燥15h，获得干燥的脱细胞骨颗粒，进一步将脱细胞骨颗粒放入球磨机中研磨2h，获得纳米脱细胞骨粉。
分别配置2％(w/v)的明胶水溶液和1％(w/v)的壳聚糖-乙酸溶液，待两者在40℃水浴锅中完全溶解后，混合在一起继续搅拌至均匀，加入1％(w/v)纳米骨粉和80nmol/L地塞米松，继续搅拌至完全混匀后，将混合溶液置于离心机中离心20min，转速为4000rpm用于去除气泡，随后将其搅拌均匀后，于超声机中超声20min使骨粉分散均匀。随后将混合液缓慢加入24孔板中并置于-20℃冰箱中预冻15h后，将其放入-80℃冷冻干燥机中干燥28h，获得脱细胞骨粉-明胶-壳聚糖-地塞米松复合支架。
小心切除所制备的复合支架的外表面后，向每个孔中加入2mL 70％乙醇溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，50mmol/L)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，50mmol/L)/MES(乙磺酸，20mmol/L)交联剂，静置交联12h后，吸去交联剂，每孔加入0.1mol/LNa2HPO4溶液2h以中和复合支架中的乙酸。随后，将复合支架转移至500mL烧杯中，用75％的乙醇和PBS缓冲液(pH＝7.4)先后清洗3次，每次清洗45min，将清洗后的复合支架预冻8h后再进行二次冷冻干燥15h，获得交联后的纳米骨粉-明胶-壳聚糖-地塞米松功能性骨修复复合支架(1％骨粉-明胶-壳聚糖-地塞米松复合支架)。
将上述复合支架切成6mm×6mm×1mm薄片后置于培养皿中，倒满75％酒精并于紫外照射下浸泡2h后，除去剩余酒精，重复同样操作，以保证支架完全除菌。换用PBS交替浸泡复合支架2h后，除去PBS，并于超净台内风干至支架到3/4干时，正反面接种MC3T3-E1成骨细胞(5×106个/mL)各20μL，持续培养10天，在培养不同时间点取出部分支架做相关检测。其中一部分支架经钙黄绿素Calcein-AM、碘化丙啶PI和Hoechst染色后评估细胞在复合支架中的存活情况；一部分支架经Calcein-AM染色后置于荧光显微镜下考察成骨细胞的生长增殖情况；另一部分支架经Ki67和F-actin荧光染色后，置于激光共聚焦显微镜下考察成骨细胞在支架的增殖活性和分布情况。
见附图3，可看出成骨细胞接种支架7天后，绝大多数活细胞被Calcein-AM染色呈强绿色荧光，仅有个别死细胞被PI染色呈现红色荧光，另外被Calcein-AM和Hoechst染色的细胞也很好呈现了支架的多孔结构，其大孔套小孔多孔结构有利于营养物质和代谢物质的传递，这是支架中仅有极少死细胞的原因之一，另外，死活染色结果也表明本实施例制备的功能性骨仿生复合支架具有极好的生物相容性。
见附图4，结果表明，接种1天后，大部分细胞在复合支架骨架、表面及孔壁铺展开来，一部分细胞因为消化及环境改变的影响虽贴壁但未很好伸展；培养3天后，所有细胞沿支架骨架及孔壁很好生长，且部分细胞增殖出现小集落现象；到第7天的时候，细胞充满整个支架，细胞间连接非常紧密，细胞增殖明显，形成的集落进一步增大，此时依然可识别支架多孔结构；培养至10天，细胞集落逐渐覆盖复合支架表面及孔隙，支架骨架及表面多孔结构因填满的细胞逐渐变得模糊。
见附图5，可见培养3天后，从F-actin免疫荧光染色可以看出，细胞沿着支架骨架、孔壁和表面分布较为均匀且具有良好伸展，部分细胞增殖形成了较小的集落，培养至7天，细胞收缩形成球形，细胞间连接紧密形成大小不一集落，逐渐充填于支架孔隙及覆盖支架骨架和表面；Ki67强绿色荧光结果说明成骨细胞培养3天细胞具有极好的增殖活性，一周后细胞逐渐堆叠形成集落但仍然保持较强的增殖活性，且支架表面的细胞因为更易接触营养物质表现出更高的Ki67强表达。
实施例5：
本实施例将猪股骨远端表面的骨膜、附着组织及骨髓等剔除，用电锯将其分割成1cm3的骨块，将骨块加入粉碎机中粉碎成8mm3的细小骨颗粒。再将骨颗粒置于烧杯中，加入1000mL双蒸水，磁力搅拌30min后更换新的双蒸水，重复两次后，加入1000mLPBS同样清洗5次，每次磁力搅拌30min，直至清洗液澄清无血色为止。之后再加入1000mL氯仿：甲醇(体积比3:1)溶液，磁力搅拌4h，除去颗粒表面及内部较多的脂肪成分。待溶液中无任何油脂后，筛网过滤液体，加入1000mL 1.5％(v％，下同)TritonX-100溶液搅拌5h进行脱细胞处理；随后，加入1000mL 0.9％(w/v％，下同)NaCl溶液搅拌15h，进一步除去剩余细胞。待细胞完全脱除后，加入1000mL双蒸水和PBS缓冲液分别清洗骨颗粒5次，每次持续时间30min，用于洗净脱细胞试剂。随后，将骨颗粒置于-20℃冰箱中预冻10h后，放入冷冻干燥机中-80℃干燥20h，获得干燥的脱细胞骨颗粒，进一步将其放入球磨机中研磨2h，获得纳米脱细胞骨粉。
分别配置2％(w/v)明胶水溶液和1％(w/v)壳聚糖-乙酸溶液，待两者在42℃水浴锅中完全溶解后，混合在一起继续搅拌至均匀，加入1.5％(w/v)纳米骨粉和100nmol/L地塞米松，继续搅拌至完全混匀，将混合溶液置于离心机中离心30min，转速为3500rpm用于去除气泡，随后将其搅拌均匀后，于超声机中超声30min使骨粉分散均匀。随后将混合液缓慢加入24孔板中并置于-20℃冰箱中预冻12h后，将其放入-75℃冷冻干燥机中干燥30h，获得脱细胞1.5％骨粉-明胶-壳聚糖-地塞米松复合支架。
将上述支架小心切除外表面后，每个孔中加入2mL 70％乙醇溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，50mmol/L)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，50mmol/L)/MES(乙磺酸，20mmol/L)交联剂，静置交联12h后，吸去交联剂，每孔加入0.1mol/LNa2HPO4溶液2h以中和支架中的乙酸。随后，将支架转移至300mL烧杯中，用75％的乙醇和PBS缓冲液(pH＝7.4)先后清洗5次，每次清洗30min，将清洗后的复合支架预冻10h后进行二次冷冻干燥18h，获得交联后的1.5％骨粉-明胶-壳聚糖-地塞米松骨复合支架。
将1.5％骨粉-明胶-壳聚糖-地塞米松复合支架切成5mm×5mm×1mm薄片后置于无菌培养皿并放入超净台中，皿中倒满75％酒精并于紫外照射情况下浸泡过夜，以达到除菌效果。换用PBS浸泡1h后，移除并再次加入PBS浸泡1h，于超净台内风干后，接种MC3T3-E1成骨细胞，持续培养14天，在培养7天和14天时取出部分支架行碱性磷酸酶ALP染色，考察成骨细胞在复合支架的成骨分化能力。
结果如附图6所示，培养7天后，在支架的表面、骨架呈现蓝紫色，表明MC3T3-E1细胞在本实施例制备的复合支架体外培养分化过程中分泌出一定ALP；待培养14天后，蓝紫色ALP明显增多，表明地塞米松的引入显著促进了MC3T3-E1的成骨能力。
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种功能性骨修复复合支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：剔除猪骨股骨远端表面的骨膜、附着组织及骨髓，用双蒸水漂洗股骨3-5次后用骨刀和电锯将股骨分割成0.5cm3～1cm3的骨块，之后用粉碎机将骨块粉碎成5mm3～8mm3的细小骨颗粒；
S2：用双蒸水及pH为7.4的PBS缓冲液分别清洗步骤S1中的骨颗粒3～5次，每次清洗均置于磁力搅拌器上搅拌，每次清洗时间均为0.5～1h；
S3：向经步骤S2处理之后的骨颗粒中加入氯仿甲醇混合溶液，用磁力搅拌器搅拌2～4h，以除去颗粒表面及内部的脂肪成分，其中氯仿甲醇混合溶液中氯仿和甲醇的体积比为3:1；
S4：于室温下向经步骤S3处理之后的骨颗粒中先后加入TritonX-100和NaCl溶液，用磁力搅拌器分别搅拌5～8h和12～15h，进行脱细胞处理；
S5：室温下，用双蒸水和pH为7.4的PBS缓冲液先后清洗经步骤S4处理之后的骨颗粒3～5次，每次清洗的持续时间均为0.5～1h；
S6：将步骤S5中得到的骨颗粒置于-20～-30℃条件下预冻8～12h后，进行冷冻干燥处理，得到干燥后的脱细胞骨颗粒；
S7：将步骤S6中的干燥脱细胞骨颗粒置于球磨机中研磨1～2h，得纳米脱细胞骨粉；
S8：将步骤S7中的纳米脱细胞骨粉加入明胶-壳聚糖溶液中，混合均匀后加入地塞米松，得复合支架原溶液，待复合支架原溶液中的气泡被完全除去后，将复合支架原溶液置于-20～-30℃条件下预冻12～24h，得样品；
S9：冷冻干燥步骤S8中的样品，制得功能性多孔纳米骨粉-明胶-壳聚糖-地塞米松复合支架；
S10：向步骤S9中的复合支架中加入交联剂进行化学交联12～24h，之后加入0.1mol/L的Na2HPO4溶液中和醋酸2h后，用浓度为75％的乙醇和pH为7.4的PBS缓冲液先后清洗3～5次，每次清洗0.5～1h，对清洗后的复合支架进行二次冷冻干燥12～18h，获得交联后的纳米骨粉-明胶-壳聚糖-地塞米松功能性骨修复复合支架。
2.根据权利要求1所述的一种功能性骨修复复合支架的制备方法，其特征在于，步骤S4中的TrintonX-100的体积分数为1％～2％，NaCl的质量分数为0.9％。
3.根据权利要求1所述的一种功能性骨修复复合支架的制备方法，其特征在于，步骤S6中冷冻干燥的冷阱温度为-70～-80℃，冷冻干燥时间为15～20h。
4.根据权利要求1所述的一种功能性骨修复复合支架的制备方法，其特征在于，步骤S8中的纳米脱细胞骨粉的质量分数为0.5％～1.5％，明胶的质量分数为2％，壳聚糖的质量分数为1％，地塞米松的浓度为50～100nmol/L。
5.根据权利要求4所述的一种功能性骨修复复合支架的制备方法，其特征在于，纳米脱细胞骨粉的质量分数为1％，地塞米松的浓度为80nmol/L。
6.根据权利要求1所述的一种功能性骨修复复合支架的制备方法，其特征在于，步骤S9中冷冻干燥的冷阱温度为-70～-80℃，冷冻干燥时间为24～30h。
7.根据权利要求1所述的一种功能性骨修复复合支架的制备方法，其特征在于，步骤S10中的交联剂为由体积分数为70％的乙醇溶液溶解的EDC、NHS和MES的混合缓冲溶液，其中EDC、NHS的浓度均为50mmol/L，MES的浓度为20mmol/L。
8.权利要求1-7中任意一项所述的制备方法制备的功能性骨修复复合支架。
9.权利要求7中的功能性骨修复复合支架在制备骨修复替代品中的应用。
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