CN114867501A - 用于骨组织工程的生物材料 - Google Patents

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CN114867501A
CN114867501A CN202080087670.5A CN202080087670A CN114867501A CN 114867501 A CN114867501 A CN 114867501A CN 202080087670 A CN202080087670 A CN 202080087670A CN 114867501 A CN114867501 A CN 114867501A
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tissue
bone
cells
scaffold
plant
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M·勒布朗·拉图尔
R·希基
C·M·柯里尔
A·E·佩林
M·塔拉尔
I·卡特拉
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Tradescantia Co
University of Ottawa
Original Assignee
Tradescantia Co
University of Ottawa
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Abstract

本文提供了支架生物材料，包含从其中去除了组织的细胞物质和核酸的脱细胞植物或真菌组织，该脱细胞植物或真菌组织具有3维多孔结构；其中脱细胞植物或真菌组织可以任选地至少部分地被包被或矿化，其中支架生物材料可以任选地进一步包含基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶或两者。本文还提供了此种支架生物材料的方法和用途，例如，包括制造方法以及用于骨组织工程的方法和用途。

Description

用于骨组织工程的生物材料
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年12月19日提交的标题为“用于骨组织工程的生物材料”的美国临时专利申请62/950,544的优先权，其内容通过引用全文并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及支架生物材料。更具体地，本发明涉及用于骨组织工程的支架生物材料，其包含脱细胞的植物或真菌组织。
背景技术
由损伤或疾病引起的大骨缺损通常需要生物材料移植物才能完全再生[1]。典型地，旨在增强骨组织再生的技术通常采用自体、同种异体、异种或合成移植物[2]。自体骨移植，其中材料源自患者，被认为是大骨缺损修复中的“黄金标准”移植实践，但存在一些缺点，包括尺寸和形状限制、组织可用性和供体部位发病率[3]。自体移植手术容易发生感染、随后的骨折、供体或修复部位的血肿形成以及术后疼痛[4]。骨组织工程为传统骨移植方法提供了潜在的替代方案[5]。
骨组织工程(BTE)结合使用结构性生物材料和细胞来创造新的功能性骨组织。用于BTE的生物材料通常旨在提供与天然骨基质相似的机械性能和结构[6]。先前的研究表明，用于BTE的生物材料的最佳孔径为约100-200μm[7]，并且弹性模量为0.1至20GPa，具体取决于移植部位[8]。此外，孔隙度和孔隙连通性是可能影响细胞迁移、营养扩散和血管生成的两个重要因素[8]。BTE已显示出有前景的结果，开发了多种生物材料作为骨移植物的替代品。这些生物材料包括骨诱导材料、杂化材料和先进的水凝胶[8]。骨诱导材料诱导周围环境从头开始形成骨结构。杂化材料由合成和/或天然聚合物制成[8]。先进的水凝胶模拟ECM并递送所需的生物活性剂以促进骨组织整合[8]。羟基磷灰石是一种钙磷灰石，因为其生物相容性、组成及其在天然骨骼矿物结构中的作用，是一种可用于BTE的材料[9]。BTE的另一种生物材料是生物活性玻璃，它可以刺激特定的细胞反应以激活骨生成基因[10]、[11]。可生物降解的聚合物，如聚(乙醇酸)和聚(乳酸)，也可用于BTE[12]。天然(或天然衍生的)聚合物，如壳聚糖、甲壳素和细菌纤维素也已经测试用于BTE[13]。尽管这些聚合物，无论是天然的还是合成的，都可能在BTE中显示出一些潜力，但使用广泛的、困难的和/或昂贵的协议来获得功能性生物材料和/或宏观结构，并且每种都有各自的局限性。
需要用于骨组织工程(BTE)的替代的、额外的和/或改进的生物材料和/或其制备方法。
发明内容
本文提供了可用于骨组织工程应用的材料(生物材料)，例如用于修复和/或再生受损、退化、有缺损和/或缺失的骨结构。本发明人现已开发出包含脱细胞植物或真菌组织的支架生物材料，其中所述脱细胞植物或真菌组织可以任选地被至少部分地包被或矿化，其中所述支架生物材料可以任选地进一步包括基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶或两者。本文所述的实验研究表明，此种支架生物材料可以是生物相容的，并且可以支持前成骨细胞的生长，所述前成骨细胞可以在支架生物材料中分化。因此，如本文所述的支架生物材料可用于骨组织工程，例如用于修复和/或再生例如受损、退化、有缺损和/或缺失的骨结构。结果表明，基于蛋白质的水凝胶，例如胶原蛋白水凝胶，可用于此类支架生物材料，并且可以使用例如用羟基磷灰石预矿化支架生物材料。
在一个实施方式中，本文提供了一种支架生物材料，包含：
从其中去除了组织的细胞物质和核酸的脱细胞植物或真菌组织，该脱细胞植物或真菌组织包含3维多孔结构；和
基于蛋白质的水凝胶、基于多糖的水凝胶或其组合。
在上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、骨形态生成蛋白、其他基质蛋白或它们的任何组合。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述基于多糖的水凝胶可以包含琼脂糖、海藻酸盐、透明质酸或另一种基于碳水化合物的水凝胶。
在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含一种或多种成骨分化标志物，诸如骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖或它们的任何组合。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含在正常骨基质中发现的一种或多种蛋白质。
在任何上述一种或多种支架生物材料的又另一个实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白水凝胶。
在任何上述一种或多种支架生物材料的还另一个实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白I。
在任何上述一种或多种支架生物材料的另一个实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可包含约100至约200μm或约150至约200μm的孔径。
在任何上述一种或多种支架生物材料的还另一个实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以包含脱细胞的苹果托杯组织。
在任何上述一种或多种支架生物材料的另一个实施方式中，所述支架生物材料可以包含一种或多种骨相关细胞类型，诸如前成骨细胞、成骨细胞、破骨细胞和/或间充质干细胞、或它们的任何组合。在另一个实施方式中，所述支架生物材料可以预先接种有一种或多种骨相关细胞类型，诸如前成骨细胞、成骨细胞、破骨细胞和/或间充质干细胞、或它们的任何组合。
在任何上述一种或多种支架生物材料的还另一个实施方式中，所述支架生物材料可具有约20kPa至约1MPa之间的杨氏模量。
在任何上述一种或多种支架生物材料的还另一个实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织的孔壁可以被所述成骨细胞矿化。
在任何上述一种或多种支架生物材料的又另一个实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被包被或矿化。
在任何上述一种或多种支架生物材料的另一个实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被磷灰石、磷酸骨钙、生物相容性陶瓷、生物相容性玻璃、生物相容性金属纳米颗粒、纳米晶纤维素或它们的任何组合包被或矿化。
在任何上述一种或多种支架生物材料的又另一个实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被磷灰石包被或矿化。
在任何上述一种或多种支架生物材料的还另一个实施方式中，磷灰石可以包括羟基磷灰石。
在另一个实施方式中，本文提供了一种支架生物材料，其包含：
从其中去除了组织的细胞物质和核酸的脱细胞植物或真菌组织，所述脱细胞植物或真菌组织包含3维多孔结构；
所述脱细胞植物或真菌组织至少部分地被包被或矿化。
在上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被磷灰石、磷酸骨钙、生物相容性陶瓷、生物相容性玻璃、生物相容性金属纳米颗粒、纳米晶纤维素或它们的任何组合包被或矿化。
在任何上述一种或多种支架生物材料的还另一个实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被磷灰石包被或矿化。
在任何上述一种或多种支架生物材料的又另一个实施方式中，磷灰石可以包括羟基磷灰石。
在任何上述一种或多种支架生物材料的另一个实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以包含苹果。
在任何上述一种或多种支架生物材料的还另一个实施方式中，可以通过交替暴露于氯化钙溶液和磷酸二钠溶液，所述脱细胞植物或真菌组织至少部分地被磷灰石包被或矿化。
在任何上述一种或多种支架生物材料的又另一个实施方式中，所述支架生物材料可进一步包含基于蛋白质的水凝胶或基于多糖的水凝胶或两者。
在任何上述一种或多种支架生物材料的还另一个实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、骨形态生成蛋白、其他基质蛋白或它们的任何组合。
在任何上述一种或多种支架生物材料的另一个实施方式中，所述基于多糖的水凝胶可以包含琼脂糖、海藻酸盐、透明质酸或另一种基于碳水化合物的水凝胶。
在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含一种或多种成骨分化标志物，诸如骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖或它们的任何组合。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含在正常骨基质中发现的一种或多种蛋白质。
在任何上述一种或多种支架生物材料的又另一个实施方式中，基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白水凝胶。
在任何上述一种或多种支架生物材料的另一个实施方式中，基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白I。
在任何上述一种或多种支架生物材料的还另一个实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以是基于纤维素的、基于甲壳素的、基于壳聚糖的、基于木质素的、基于半纤维素的或基于果胶的或它们的任何组合。
在任何上述一种或多种支架生物材料的另一个实施方式中，所述植物或真菌组织可以包含来自以下的组织：苹果托杯(苹果(Malus pumila))组织、蕨类植物(单系蕨类植物(Monilophytes))组织、萝卜(芜菁(Brassica rapa))根组织、银杏树枝组织、马尾草(木贼属(equisetum))组织、萱草(hermocallis)杂交叶片组织、羽衣甘蓝(甘蓝(Brassicaoleracea))茎组织、针叶树花旗松(花旗松(Pseudotsuga menziesii))组织、仙人掌果实(火龙果(pitaya))果肉组织、斑纹长春花(Maculata Vinca)组织、水生莲花(荷花(Nelumbonucifera))组织、郁金香(郁金香(Tulipa gesneriana))花瓣组织、大蕉(香蕉(Musaparadisiaca))组织、绿菜花(甘蓝)茎组织、枫叶(假挪威槭(Acer psuedoplatanus))茎组织、甜菜(甜菜(Beta vulgaris))初生根组织、大葱(玉葱(Allium cepa))组织、兰花(兰科(Orchidaceae))组织、萝卜(芜菁)茎组织、韭葱(象大蒜(Allium ampeloprasum))组织、枫(槭属(Acer))树枝组织、芹菜(芹菜(Apium graveolens))组织、大葱(玉葱)茎组织、松组织、芦荟组织、西瓜(栽培西瓜品系(Citrullus lanatus var.lanatus))组织、草甸排草(绿金钱草(Lysimachia nummularia))组织、仙人掌组织、高山剪秋罗组织、大黄(波叶大黄(Rheum rhabarbarum))组织、南瓜果肉(西葫芦(Cucurbita pepo))组织、匐地仙人掌(天门冬科(Asparagaceae))茎组织、蜘蛛草(紫露草(Tradescantia virginiana))茎组织、芦笋(芦笋(Asparagus officinalis))茎组织、蘑菇(真菌)组织、茴香(茴香(Foeniculumvulgare))组织、玫瑰(蔷薇属(Rosa))组织、胡萝卜(胡萝卜(Daucus carota))组织或梨(苹果类(Pomaceous))组织、或通过直接基因组修饰或通过选择性育种产生的转基因组织、或它们的任何组合。
在任何上述一种或多种支架生物材料的还另一个实施方式中，所述支架生物材料可进一步包含在所述脱细胞植物或真菌组织上和/或内的活细胞，特别是非原生细胞。
在任何上述一种或多种支架生物材料的还另一个实施方式中，所述活细胞可以是动物细胞。
在任何上述一种或多种支架生物材料的还另一个实施方式中，所述活细胞可以是哺乳动物细胞。
在任何上述一种或多种支架生物材料的还另一个实施方式中，所述活细胞可以是人类细胞。
在任何上述一种或多种支架生物材料的还另一个实施方式中，所述支架生物材料可以包含胶合、交联或联锁在一起的两个或更多个亚单元。
在任何上述一种或多种支架生物材料的另一个实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以包含来源于不同组织或不同来源的两种或更多种不同的脱细胞植物或真菌组织。
在任何上述一种或多种支架生物材料的又另一个实施方式中，所述两种或更多种不同的脱细胞植物或真菌组织可以胶合、交联或互锁在一起。
在任何上述一种或多种支架生物材料的另一个实施方式中，所述支架生物材料可用于骨组织工程(BTE)。
在另一个实施方式中，本文提供了一种骨移植物，其包含任何本文所述的一种或多种支架生物材料。
在另一个实施方式中，本文提供了任何本文所述一种或多种支架生物材料用于骨组织工程(BTE)、用于骨移植、用于骨修复或再生、或它们的任何组合的用途。
在另一个实施方式中，本文提供了任何本文所述的一种或多种支架生物材料用于以下任何一种或多种的用途：颅面重建手术；牙科和/或颌面重建手术；主要骨缺损和/或创伤重建；骨填料应用；植入物稳定；和/或药物递送；或它们的任何组合。
在另一个实施方式中，本文提供了任何本文所述的一种或多种支架生物材料在牙科骨填料应用中的用途。
在另一个实施方式中，本文提供了任何本文所述的一种或多种支架生物材料作为大型植入物用应力屏蔽减压器的用途。
在又一个实施方式中，本文提供了任何本文所述的一种或多种支架生物材料用于促进活跃成骨；用于植入以修复临界和/或非临界尺寸缺损；在骨修复过程中提供机械支撑；替代入长骨、颅骨、颌面骨、牙齿和/或颌骨的损失或损伤中；用于畸齿矫正和/或牙周移植物，诸如牙槽嵴增大、牙齿脱落、牙齿植入和/或重建手术；用于移植在特定部位以增大由骨质疏松症造成的损失、由于年龄、先前的植入物和/或受伤导致的骨质流失所致的骨体积；或改善骨-植入物组织整合；或它们的任何组合的用途。
在另一个实施方式中，本文提供了一种用于工程化骨组织；用于骨移植；用于修复或再生骨骼；用于颅面重建手术；用于牙科和/或颌面重建手术；用于主要骨缺损和/或创伤重建；用于牙科或其他骨填料应用；用于植入物稳定；用于大型植入物的应力屏蔽；用于促进活跃成骨；用于修复临界和/或非临界尺寸缺损；用于在骨修复过程中提供机械支撑；用于替代损失或损伤的长骨、颅骨、颌面骨、牙齿和/或颌骨；用于畸齿矫正和/或牙周移植，诸如牙槽嵴增大、牙齿脱落、牙齿植入和/或重建手术；用于移植在特定部位以增大由骨质疏松症造成的损失、由于年龄、先前的植入物和/或受伤导致的骨质流失所致的骨体积；用于改善骨-植入物组织整合；或用于药物递送；或用于它们的任何组合的方法；所述方法包括：
提供任何本文所述的一种或多种支架生物材料；和
将所述支架生物材料植入到有此需要的受试者的有此需要的部位或区域。
在另一个实施方式中，本文提供了一种用于生产支架生物材料的方法，所述方法包括：
提供从其中去除了组织的细胞物质和核酸的脱细胞植物或真菌组织，所述脱细胞植物或真菌组织包含3维多孔结构；和
向所述脱细胞植物或真菌组织中引入基于蛋白质的水凝胶、基于多糖的水凝胶或两者。
在上述方法的另一个实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、骨形态生成蛋白、其他基质蛋白、或它们的任何组合。
在任何上述一种或多种方法的另一实施方式中，所述基于多糖的水凝胶可以包含琼脂糖、海藻酸盐、透明质酸或另一种基于碳水化合物的水凝胶。
在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含一种或多种成骨分化标志物，诸如骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、或它们的任何组合。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含在正常骨基质中发现的一种或多种蛋白质。
在上述一种或多种方法的另一实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白水凝胶。
在任何上述一种或多种方法的还另一实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白I。
在另一个实施方式中，本文提供了一种用于生产支架生物材料的方法，所述方法包括：
提供从其中去除了组织的细胞物质和核酸的脱细胞植物或真菌组织，所述脱细胞植物或真菌组织包含3维多孔结构；和
至少部分地包被或矿化所述脱细胞植物或真菌组织。
在上述方法的另一个实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被磷灰石、磷酸骨钙、生物相容性陶瓷、生物相容性玻璃、生物相容性金属纳米颗粒、纳米晶纤维素、或它们的任何组合包被或矿化。
在任何上述一种或多种方法的还另一实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被磷灰石包被或矿化。
在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，磷灰石可以包含羟基磷灰石。
在任何上述一种或多种方法的另一实施方式中，将所述脱细胞植物或真菌组织包被或矿化的步骤可以包含使所述脱细胞植物或真菌组织交替暴露于氯化钙溶液和磷酸二钠溶液。
在任何上述一种或多种方法的还另一实施方式中，所述方法可以进一步包括将基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶引入所述支架生物材料。
在任何上述一种或多种方法的另一实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、骨形态生成蛋白、其他基质蛋白、或它们的任何组合。
在任何上述一种或多种方法的另一实施方式中，所述基于多糖的水凝胶可以包含琼脂糖、海藻酸盐、透明质酸、或另一种基于碳水化合物的水凝胶。
在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含一种或多种成骨分化标志物，诸如骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、或它们的任何组合。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含在正常骨基质中发现的一种或多种蛋白质。
在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白水凝胶。
在任何上述一种或多种方法的还另一个实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白I。
在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，所述方法可以进一步包括在所述脱细胞植物或真菌组织上和/或内引入活细胞(特别是非原生细胞)的步骤。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述活细胞可以是动物细胞。
在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，所述活细胞可以是哺乳动物细胞。
在任何上述一种或多种方法的还另一个实施方式中，所述活细胞可以是人类细胞。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述细胞可以是一种或多种骨相关细胞类型，诸如前成骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、和/或间充质细胞、或它们的任何组合。在另一个实施方式中，所述方法可以包含预接种一种或多种骨相关细胞类型的步骤，所述细胞类型诸如前成骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、和/或间充质干细胞、或它们的任何组合。
在另一个实施方式中，本文提供了一种试剂盒，其包含以下中的任何一种或多种：
从其中去除了组织的细胞物质和核酸的脱细胞植物或真菌组织，所述脱细胞植物或真菌组织包含3维多孔结构；
基于蛋白质的水凝胶；
基于多糖的水凝胶；
磷灰石；
氯化钙；
磷酸二钠；
磷酸骨钙；
生物相容性陶瓷；
生物相容性玻璃；
生物相容性金属纳米颗粒；
纳米晶纤维素；
哺乳动物细胞，诸如一种或多种骨相关细胞类型，诸如前成骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、和/或间充质干细胞、或它们的任何组合(在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以预接种有诸如前成骨细胞、成骨细胞、破骨细胞和/或间充质干细胞或它们的任何组合等此类哺乳动物细胞和/或骨相关细胞类型中的一种或多种)；
植物或真菌组织，脱细胞试剂，或两者；
缓冲剂；和/或
用于执行任何如本文所述一种或多种方法的说明。
在上述试剂盒的另一个实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、骨形态生成蛋白、其他基质蛋白、或它们的任何组合。
在任何上述一种或多种试剂盒的另一个实施方式中，所述基于多糖的水凝胶可以包含琼脂糖、海藻酸盐、透明质酸、或另一种基于碳水化合物的水凝胶。
在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含一种或多种成骨分化标志物，诸如骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、或它们的任何组合。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含在正常骨基质中发现的一种或多种蛋白质。
在任何上述一种或多种试剂盒的另一个实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白水凝胶。
在任何上述一种或多种试剂盒的还另一个实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白I。
在任何上述一种或多种试剂盒的还另一个实施方式中，磷灰石可以包含羟基磷灰石。
在另一个实施方式中，本文提供了一种用于将软骨或骨前体细胞分化成软骨或骨组织细胞的方法，所述方法包括：
在分化培养基中在任何本文所述的一种或多种支架生物材料上培养所述软骨或骨前体细胞；
其中所述培养包括将培养的细胞暴露于高于环境压力的增加的大气压力中至少一次。
在另一个实施方式中，本文提供了一种用于将软骨或骨前体细胞分化成软骨或骨组织细胞的方法，所述方法包括：
在分化培养基中在任何本文所述的一种或多种支架生物材料上培养所述软骨或骨前体细胞；
其中所述培养包括至少一个处理期，在此期间使培养的细胞在该处理期的至少一部分中暴露于高于环境压力的增加的大气压力中，其中所述处理期为至少约10分钟的持续时间并且每周进行至少一次；
从而将所述软骨或骨前体细胞分化为软骨或骨组织细胞。
在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，每次暴露于增加的大气压力后，可以使培养的细胞恢复到低压或环境压力条件。
在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，所述处理期可以包括使用培养的细胞在低压或环境压力条件和增加的大气压条件之间交替。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述处理期可以包括使所述细胞暴露的大气压力在低压或环境压力和增加的大气压之间振荡。
在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，所述处理期可以包含以约1-10Hz的频率使所述细胞暴露的大气压力在低压或环境压力和增加的大气压力之间振荡。
在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，所述处理期可以包含使所述细胞暴露的大气压力在低压或环境压力和增加的大气压力之间振荡，其中所述低压或环境压力为环境压力(即典型地约101kPa+约0kPa)，并且所述增加的大气压力为比环境压力高约+280kPa(即典型地约101kPa+约280kPa＝约381kPa)，并且任选地其中所述振荡的频率为约1-10Hz。
在任何上述一种或多种方法的还另一个实施方式中，所述处理期可以包含使培养的细胞暴露于增加的大气压力中一段持续的时间。
在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，所述处理期可以包括使培养的细胞暴露于基本恒定增加的大气压力中一段持续的时间。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述处理期可以为约1小时的持续时间或更长。
在任何上述一种或多种方法的还另一个实施方式中，所述处理期可以每天进行一次，或每天进行多于一次。
在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，所述培养可以进行至少约1周。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述培养可以进行约2周或更长时间。
在任何上述一种或多种方法的还另一个实施方式中，可以以静水压力来施用所述增加的大气压力。
在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，可以通过调节培养的细胞上方的气相压力来施用增加的大气压力。
在任何上述一种或多种方法的还另一个实施方式中，所述增加的大气压力可以比环境压力高约+280kPa(即典型地约101kPa+约280kPa＝约381kPa)。
附图说明
参考以下描述和附图将进一步理解这些和其他特征，其中：
图1示出了在成骨分化培养基中4周后，去除植物细胞和表面活性剂后的苹果衍生纤维素支架(A)(比例尺＝2mm–也适用于B和C)、以及裸支架(B)和钙化复合水凝胶支架(C)的照片。代表性的共聚焦激光扫描显微镜图像显示了裸支架(D)(比例尺＝50μm–也适用于E)和复合水凝胶支架(E)上接种的细胞。分别使用碘化丙啶和DAPI染色对支架进行纤维素(红色)和细胞核(蓝色)染色。针对每种实验条件分析了三种不同的支架。图1A显示了去除植物细胞和表面活性剂后的苹果衍生纤维素支架；图1B显示了在成骨分化培养基中4周后的MC3T3-E1接种支架，且图1D显示了代表性共聚焦激光扫描显微镜图像，显示了支架中接种的细胞；
图2显示了在MC3T3细胞接种之前，来自共焦图像Z轴上的最大投影的脱细胞苹果衍生纤维素支架的孔径分布。共分析了3个不同支架中的共54个孔(每个支架3个随机选择区域中的6个孔)；
图3显示了在非分化或分化培养基中培养4周后，细胞接种的裸和复合水凝胶(具有胶原蛋白)支架的杨氏模量。将不含细胞的脱细胞苹果衍生纤维素支架用作对照。使用单向ANOVA和Tukey事后检验确定统计学显著性。(N-D)和(D)：分别在非分化和分化培养基中培养的支架。数据表示为每个条件下三个重复样品的平均值±S.E.M.；
图4示出了使用5-溴-4-氯-3’-吲哚磷酸酯和硝基蓝四唑(BCIP/NBT)(A-E)或茜素红S(ARS)(F-J)染色的支架照片(A中的比例尽＝2mm–适用于全部)。使用BCIP/NBT染色将碱性磷酸酶(ALP)活性可视化。对照支架(没有细胞的裸支架，“CTRL”)(A)没有用BCIP/NBT染色。与具有未分化细胞“N-D”的对应物(分别为B和C)相比，裸支架(D)和含有分化细胞“D”的复合水凝胶支架(E)中通过更强的蓝色对比度可视化了更强的ALP活性。对于ARS染色，对照支架(无细胞的裸支架)(F)、具有未分化细胞的裸支架(G)和具有未分化细胞的复合水凝胶支架(H)显示浅红色。在裸支架(I)和含有分化细胞的复合水凝胶支架(J)中，以强烈的深红色突出显示了钙沉积。针对每种实验条件分析了三种不同的支架；
图5显示了支架组织学横截面的代表性图像。将石蜡包埋的支架切成5μm厚的切片并用苏木精和伊红(H&E)染色以可视化细胞侵袭(A、B、E和F)或用Von Kossa(VK)染色以可视化矿化(C、D、G和H)。(A中的比例尺＝1mm–适用于全部)。裸支架和复合水凝胶支架被MC3T3-E1细胞浸润，在外围和整个支架上可见多个细胞核和细胞质(A、B、E和F，分别为蓝色和粉红色)。在复合水凝胶支架中也可以看到浅粉色和更明显的胶原蛋白。当在非分化培养基中培养时，裸支架和复合水凝胶支架中的孔壁仅显示在支架外围存在矿化(C、G)。当在分化培养基中培养时，裸支架和复合水凝胶支架中的孔壁完全被染成黑色(D、H)。在非分化培养基中培养的裸支架在切片时受损(A、C)。(N-D)和(D)：分别为在非分化和分化培养基中培养的支架。在在非分化培养基中培养的每种类型的一个支架上和在分化培养基中培养的每种类型的2个支架上进行分析；
图6显示了代表性的扫描电子显微镜显微照片(A-C)和能量色散光谱(D-F)：使用金包被具有分化后的MC3T3-E1细胞的裸支架(A)和复合水凝胶支架(B)以及未接种的纤维素支架(C)，并且使用JEOL JSM-7500F FESEM扫描电子显微镜在2.0kV下成像(A中的比例尺＝20m–适用于全部)。胶原蛋白纤维可见(B插图，比例尺＝3μm)。在每个支架上的聚集体上获得能量色散光谱。每个光谱上指示了磷(2.013keV)和钙(3.69keV)峰。针对每种实验条件分析了三种不同的支架；
图7显示了使用交替的氯化钙和磷酸二钠的溶液包被的生物材料(圆盘形)。左上角的数字指示温育循环数；
图8显示了圆柱形生物材料。非包被的移植物(A)；大鼠皮下植入4周后预包被的移植物(B)(N＝1只大鼠3个植入物)；大鼠皮下植入4周后移植物的Ct扫描(C)(N＝1只大鼠3个植入物)；
图9显示了盘形预包被的生物材料的组织学染色。苏木精和伊红(A-C)，马松三色(D-F)和Von Kossa/Van Geisson(G-I)；
图10显示了圆柱形预包被的生物材料的组织学染色(横向切割)。苏木精和伊红(A-C)，马松三色(D-F)和Von Kossa/Van Geisson(G-I)；
图11显示了胶合并夹在脱细胞苹果托杯组织之间的挂膜(脱细胞橙髓)；
图12显示了在4周(A)和8周(B)，临界尺寸缺损中植入的生物材料(带有穿孔)的3D渲染；
图13显示了相对于缺损内总体积的骨体积分数。通过在CT扫描切片中拟合与缺损尺寸大致相同的圆柱体来获得目的圆柱体区域。4周时间点的N＝6个缺损(3只动物)且8周时间点的N＝6个缺损(3只动物)；
图14显示了脱位实验。(A)中示出了在推出实验期间获得的典型力-距离和力-位移曲线。脱位被视为力-距离图中的近似最大力(红色箭头)。(B)左和右示出了带试样的推出装置，提供了单轴压缩装置的照片(星号指示称重传感器；箭头指示样品)；
图15显示了如实施例4中所述的在8周时，植入的支架组织学横截片的代表性图像。切片用苏木精和伊红(H&E)或戈尔德纳三色(GTC)染色。箭头指示红细胞。在8周时可见存在的胶原蛋白(比例尺＝1mm，插图为200μm)；
图16显示了植入后4周后的组织学切片(4WCH2)。(A)中示出了苏木精和伊红染色，(B)中示出了Von Kossa/Van Gieson染色，并且(C)中示出了马松戈尔德纳三色染色。(A)、(B)和(C)的比例尺＝2mm；
图17显示了植入后8周后的组织学切片(8WCH1)。(A)中示出了苏木精和伊红染色，(B)中示出了Von Kossa/Van Gieson染色，并且(C)中示出了马松戈尔德纳三色染色。(A)、(B)和(C)的比例尺＝2mm；
图18显示了大鼠临界尺寸颅骨缺损模型中的植入。(A)示出了穿孔的5mm直径x1mm厚度的生物材料。(B)示出了将生物材料植入双侧缺损处。在左侧，植入了生物材料，空缺损在右侧。大鼠ID：4WME。(A)显示了支架植入物，并且(B)显示了有双侧缺损的暴露颅骨(箭头指示植入部位)；
图19显示了植入8周后的组织切除。(A)中示出了颅盖骨完全切除前的视图；(B)中示出了切除的颅盖骨的顶视图；并且(C)中示出了切除的颅盖骨的底视图；
图20A-D显示了苹果和胡萝卜的联锁复合材料(SCC)；
图21示出了如实施例5中所述的装载MC3T3 E1细胞的复合材料中钙沉积的茜素红S染色。从左到右：透明质酸和脱细胞苹果(预分化)，海藻酸盐和脱细胞苹果(预分化)，透明质酸和脱细胞苹果(分化后)，海藻酸盐和脱细胞苹果(分化后)。
图22示出了如实施例5中所述的装载MC3T3 E1细胞的复合材料中用BCIP NBTSigmaFastTM片剂的碱性磷酸酶染色。从左到右：透明质酸和脱细胞苹果(预分化)，海藻酸盐和脱细胞苹果(预分化)，透明质酸和脱细胞苹果(分化后)，海藻酸盐和脱细胞苹果(分化后)；
图23示出了(A)如实施例6所述的循环静水压装置示意图。在定制的压力室中，通过调节培养孔上方的气相压力施加静水压力。使用压缩机压缩培养箱大气中的空气，并使用电磁阀将其注入压力室内。(B)显示了如实施例6所述的实验条件。增殖1周后，相对表环境压力以频率1Hz在0和280kPa之间振荡来施加循环静水压刺激，每天1小时，持续长达2周。每次循环后，将样品从压力室中取出，并在刺激阶段之间保持在环境压力下；
图24显示了如实施例6中所述在1周或2周刺激后的细胞密度。使用单向ANOVA和Tukey事后检测确定统计学显著性(*指示p<0.05)。数据表示为每种条件下三个重复样品的平均值±S.E.M.，每个样品三个区域。结果显示，与对照相比，在培养2周后，在经历循环压力负荷的支架上存在的细胞显著更多；
图25显示了如实施例6中所述在1周或2周刺激后的碱性磷酸酶(ALP)活性。使用单向ANOVA和Tukey事后检测确定统计学显著性(*指示p<0.05)。数据表示为每种条件下三个重复样品的平均值±S.E.M.。结果显示，与对照相比，在培养2周后，在经历循环压力负荷的支架上的细胞中存在显著的ALP活性(分化的标志物)；
图26显示了如实施例6中所述在1周或2周刺激后使用茜素红S(ARS)染色的矿物沉积量化。使用单向ANOVA和Tukey事后检测确定统计学显著性(*指示p<0.05)。数据表示为每种条件下三个重复样品的平均值±S.E.M.。结果显示，与对照相比，在培养2周后，经历循环压力负荷的支架的矿化更加显著；
图27显示了如实施例5中所述，不具有细胞(对照)和具有分化后的细胞(Diff)的、具有透明质酸(HA)或海藻酸盐水凝胶的脱细胞AA的杨氏模量；
图28显示了代表性共聚焦激光扫描显微镜图像，显示了接种的细胞支架(比例尺＝100μm–适用于全部)。如图24和实施例5中所述，对支架进行纤维素(红)和细胞核(蓝)染色；和
图29显示了如实施例6中所述在1周或2周刺激后支架的杨氏模量。使用单向ANOVA和Tukey事后检测确定统计学显著性(*指示p<0.05)。数据表示为每种条件下三个重复样品的平均值±S.E.M.。
具体实施方式
本文描述了支架生物材料、其制备方法以及其在包括例如骨组织工程(BTE)在内的多种应用中的方法和用途。应当理解的是，提供实施方式和实施例是为了本领域技术人员的说明性目的，并不意味着以任何方式进行限制。
本文提供了可用于BTE应用的材料(生物材料)，例如用于修复和/或再生受损、退化、有缺损和/或缺失的骨结构。本发明人现已开发出包含脱细胞植物或真菌组织的支架生物材料，其中所述脱细胞植物或真菌组织可以任选地至少部分地被包被或矿化(使用例如磷灰石)，其中所述支架生物材料可以任选地进一步包括基于蛋白质的水凝胶(诸如例如胶原蛋白水凝胶)和/或基于多糖的水凝胶(诸如例如琼脂糖或琼脂糖-基凝胶/水凝胶，或海藻酸盐或海藻酸盐-基凝胶/水凝胶，或者透明质酸或透明质酸-基凝胶/水凝胶)或两者。本文所述的实验研究表明这种支架生物材料可以是生物相容的，并且可以支持前成骨细胞的生长，所述前成骨细胞可以在所述支架生物材料中分化。因此，本文所述的支架生物材料可用于BTE，诸如例如用于修复和/或再生受损、退化、有缺损和/或缺失的骨结构。结果表明，基于蛋白质的水凝胶，诸如胶原蛋白水凝胶，可用于此类支架生物材料，并且可以使用例如用羟基磷灰石对支架生物材料的预矿化。
支架生物材料
在一个实施方式中，本文提供了一种支架生物材料，包含：
从其中去除了组织的细胞物质和核酸的脱细胞植物或真菌组织,所述脱细胞植物或真菌组织包含3维多孔结构；和
基于蛋白质的水凝胶，基于多糖的水凝胶，或两者。
在某些实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含含有一种或多种蛋白质或其衍生物的任何合适的水凝胶。在某些实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、骨形态生成蛋白、其他基质蛋白、或它们的任何组合。在某些实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白水凝胶。在某些实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白I。
在某些实施方式中，所述基于多糖的水凝胶可以包含含有一种或多种碳水化合物或多糖或其衍生物的任何合适的水凝胶。在某些实施方式中，所述水凝胶可以包含琼脂糖-基凝胶/水凝胶或另一种基于碳水化合物的水凝胶。
在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含一种或多种成骨分化标志物，诸如骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、或它们的任何组合。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含在正常骨基质中发现的一种或多种蛋白质。
在另一个实施方式中，本文提供了一种支架生物材料，包含：
从其中去除了组织的细胞物质和核酸的脱细胞植物或真菌组织,所述脱细胞植物或真菌组织包含3维多孔结构；
所述脱细胞植物或真菌组织至少部分地被包被或矿化。
在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被一种或多种磷酸盐矿物质包被或矿化。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被磷灰石、磷酸骨钙、生物相容性陶瓷、生物相容性玻璃、生物相容性金属纳米颗粒、纳米晶纤维素、或它们的任何组合包被或矿化。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被磷灰石包被或矿化。在某些实施方式中，磷灰石可以包含羟基磷灰石。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被纳米晶纤维素包被或矿化以增加所述脱细胞植物或真菌组织的硬度。
在又一个实施方式中，本文提供了一种支架生物材料，其包含：
从其中去除了组织的细胞物质和核酸的脱细胞植物或真菌组织，所述脱细胞植物或真菌组织包含3维多孔结构，并且所述脱细胞植物或真菌组织至少部分地被包被或矿化；和
基于蛋白质的水凝胶，基于多糖的水凝胶，或两者。
在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被一种或多种磷酸盐矿物质包被或矿化。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被磷灰石、磷酸骨钙、生物相容性陶瓷、生物相容性玻璃、生物相容性金属纳米颗粒、纳米晶纤维素、或它们的任何组合包被或矿化。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被磷灰石包被或矿化。在某些实施方式中，磷灰石可以包含羟基磷灰石。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被纳米晶纤维素包被或矿化以增加所述脱细胞植物或真菌组织的硬度。
在某些实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含含有一种或多种蛋白质或其衍生物的任何合适的水凝胶。在某些实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、骨形态生成蛋白、其他基质蛋白、或它们的任何组合。在某些实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白水凝胶。在某些实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白I。
在某些实施方式中，所述基于多糖的水凝胶可以包含含有一种或多种碳水化合物或多糖或其衍生物的任何合适的水凝胶。在某些实施方式中，所述水凝胶可以包含琼脂糖-基水凝胶或另一种基于碳水化合物的水凝胶。
在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含一种或多种成骨分化标志物，诸如骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、或它们的任何组合。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含在正常骨基质中发现的一种或多种蛋白质。
在某些实施方式中，本文所述的生物材料可源自植物和真菌界中发现的细胞壁结构和/或维管结构，以创建可促进细胞浸润、细胞生长、骨组织修复和/或骨重建等的3D支架。如将理解的，本文所述的生物材料可以由植物或真菌有机体的任何合适部分产生。生物材料可以包含例如诸如纤维素、甲壳素、木质素、半纤维素、果胶等物质，和/或天然存在于这些生物体中的任何其他合适的生物化学品/生物聚合物。
如将理解的，除非另有说明，本文使用的植物和真菌界的含义/定义基于Cavalier-Smith分类(1998)。
在某些实施方式中，植物或真菌组织通常可以包含任何合适的植物或真菌组织或者含有适合特定应用的合适支架结构的部分。
在上述一种或多种支架材料的某些实施方式中，所述植物或真菌组织可以包含苹果托杯(苹果)组织、蕨类植物(单系蕨类植物)组织、萝卜(芜菁)根组织、银杏树枝组织、马尾草(木贼属)组织、萱草杂交叶片组织、羽衣甘蓝(甘蓝)茎组织、针叶树花旗松(花旗松)组织、仙人掌果实(火龙果)果肉组织、斑纹长春花组织、水生莲花(荷花)组织、郁金香(郁金香)花瓣组织、大蕉(香蕉)组织、绿菜花(甘蓝)茎组织、枫叶(假挪威槭)茎组织、甜菜(甜菜)初生根组织、大葱(玉葱)组织、兰花(兰科)组织、萝卜(芜菁)茎组织、韭葱(象大蒜)组织、枫(槭属)树枝组织、芹菜(芹菜)组织、大葱(玉葱)茎组织、松组织、芦荟组织、西瓜(栽培西瓜品系)组织、草甸排草(绿金钱草)组织、仙人掌组织、高山剪秋罗组织、大黄(波叶大黄)组织、南瓜果肉(西葫芦)组织、匐地仙人掌(天门冬科)茎组织、蜘蛛草(紫露草)茎组织、芦笋(芦笋)茎组织、蘑菇(真菌)组织、茴香(茴香)组织、玫瑰(蔷薇属)组织、胡萝卜(胡萝卜)组织或梨(苹果类)组织。标题为“来自植物和真菌的脱细胞细胞壁结构及其作为支架材料的用途”的WO2017/136950的实施例18中描述了植物和真菌组织的其他示例，通过引用以其整体并入本文。
还可以理解的是，植物或真菌组织的细胞材料和核酸可包括细胞内内容物，例如细胞器(例如叶绿体、线粒体)、细胞核、细胞核酸和/或细胞蛋白质。这些可以从所述植物或真菌组织和/或从所述支架生物材料中基本上去除、部分去除或完全去除。可以认识到，痕量的此类成分可能仍存在于本文所述的脱细胞植物或真菌组织中。还可以理解的是，本文提及脱细胞植物或真菌组织旨在反映已经基本上去除了在所述组织的植物或真菌来源中发现的此类细胞材料–这并且排除所述脱细胞植物或真菌组织在某些实施方式中可以含有或包含随后引入的或重新引入的通常任何种类的细胞、细胞材料和/或核酸(例如动物或人类细胞，例如骨或骨祖细胞/组织)的可能性。
各种方法可用于生产本文所述的支架生物材料。例如，在上述支架生物材料的某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以包含已通过热冲击、用洗涤剂(例如SDS、Triton X、EDA、碱性处理、酸、离子洗涤剂、非离子洗涤剂和两性离子洗涤剂)处理、渗透压休克、冻干、物理溶解(例如静水压力)、电气破坏(例如非热不可逆电穿孔)或酶消化、或它们的任何组合进行脱细胞的植物或真菌组织。在某些实施方式中，可以通过采用可包含多种方法(单独或组合)中的任何一种的脱细胞过程来从植物和/或真菌获得本文所述的生物材料，所述多种方法包括但不限于热冲击(例如快速冻融)、化学处理(例如，洗涤剂)、渗透压休克(例如蒸馏水)、冻干、物理溶解(例如压力处理)、电气破坏和/或酶消化。
在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可包括已通过用洗涤剂或表面活性剂处理进行脱细胞的植物或真菌组织。洗涤剂的示例可以包括但不限于十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton X、EDA、碱性处理、酸、离子洗涤剂、非离子洗涤剂和两性离子洗涤剂。
在更进一步的实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以包含已经通过用SDS处理进行脱细胞的植物或真菌组织。在还另一个实施方式中，可以通过用二价盐水溶液洗涤从植物或真菌组织中去除残留的SDS。二价盐水溶液可用于将含有SDS胶束的盐残留物从溶液/支架中沉淀/破碎出来，并且可以使用dH2O、乙酸或二甲亚砜(DMSO)处理或超声波处理来去除盐残留物或SDS胶束。在某些实施方式中，二价盐水溶液的二价盐可以包括例如MgCl2或CaCl2。
在另一个实施方式中，植物或真菌组织可以通过使用0.01％至10％SDS(例如约0.1％至约1％，或例如约0.1％SDS或约1％SDS)在溶剂(如水、乙醇或另一合适的有机溶剂)中的溶液处理来进行脱细胞，并且可以使用浓度为约100mM的CaCl2水溶液去除残留的SDS，之后在dH2O中温育。在某些实施方式中，SDS溶液的浓度可以高于0.1％，这可能有助于脱细胞化，并且可能伴随着增加洗涤以去除残留的SDS。在特定的实施方式中，可以使用约0.1％SDS在水中的SDS溶液处理来对植物或真菌组织进行脱细胞，并且可以使用浓度为约100mM的CaCl2水溶液去除残留的SDS，随后在dH2O中温育。
在标题为“来自植物和真菌的脱细胞细胞壁结构及其作为支架材料的用途”的WO2017/136950中可以找到可适用于生产用于本文所述支架生物材料的脱细胞植物或真菌组织的脱细胞化协议的进一步示例，其通过引用整体并入本文。
在某些实施方式中，如本文所述的支架生物材料可包含脱细胞植物或真菌组织，其孔径为约100至约200μm，或约150至约200μm。在某些实施方式中，所述支架生物材料可包含约20kPa至约1MPa之间的杨氏模量。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以包含脱细胞苹果，诸如脱细胞苹果托杯组织。
在某些实施方式中，如本文所述的支架生物材料可以包含基于多糖的水凝胶和/或基于蛋白质的水凝胶，诸如胶原蛋白水凝胶，其可浸入和/或渗透通过脱细胞植物或真菌组织的3D多孔结构，可包被在脱细胞植物或真菌组织上或周围，或其组合。
可以理解的是，在某些实施方式中，如本文所述的水凝胶可包括任何合适的稀释3D交联系统，其包含水作为主要组分，水可以是基本上不可流动的。在某些实施方式中，交联可以为水凝胶提供形状/机械稳定性。在某些实施方式中，可以通过在支架生物材料和/或脱细胞植物或真菌组织周围创建水凝胶来增强水凝胶。在某些实施方式中，例如，如本文所述的水凝胶可包含一种或多种ECM蛋白、透明质酸或两者。考虑到本文的教导，本领域技术人员将了解各种水凝胶。在某些实施方式中，可以调整水凝胶的粘弹性特性以产生非牛顿水凝胶，这种水凝胶在低频的机械应变下可以变硬(即，例如，行走时应变变硬，以机械方式刺激细胞并为骨骼生长提供结构)。在某些实施方式中，例如，预期了水凝胶可以是非交联的，并且可以替代地包含缠结的聚合物。
在某些实施方式中，胶原蛋白水凝胶可以包含胶原蛋白I。
在某些实施方式中，所述支架生物材料可以包含一种或多种骨相关细胞类型，诸如前成骨细胞、成骨细胞、破骨细胞和/或间充质干细胞、或它们的任何组合。在另一个实施方式中，所述支架生物材料可以预先接种有一种或多种骨相关细胞类型，诸如前成骨细胞、成骨细胞、破骨细胞和/或间充质干细胞、或它们的任何组合。在本文所述的支架生物材料的某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织的孔壁可以被成骨细胞矿化。
在某些实施方式中，水凝胶可包含骨祖细胞，或骨细胞或骨组织细胞，诸如但不限于例如前成骨细胞和/或成骨细胞。在某些实施方式中，干细胞(例如间充质干细胞、骨骼干细胞或其他干细胞)可以添加到水凝胶中和/或以其他方式添加到支架生物材料中。在某些实施方式中，水凝胶可以包含磷酸骨钙、生物相容性陶瓷、生物相容性玻璃、生物相容性金属纳米颗粒、纳米晶纤维素、或它们的任何组合。在某些实施方式中，水凝胶可以包含磷灰石，例如羟基磷灰石。
在某些实施方式中，如本文所述的支架生物材料的脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被包被或矿化。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被一种或多种磷酸盐矿物质包被或矿化。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被磷灰石、磷酸骨钙、生物相容性陶瓷、生物相容性玻璃、生物相容性金属纳米颗粒、纳米晶纤维素、或它们的任何组合包被或矿化。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被磷灰石包被或矿化。在某些实施方式中，磷灰石可以包含羟基磷灰石。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被纳米晶纤维素包被或矿化，以增加所述脱细胞植物或真菌组织的硬度。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被磷灰石(例如羟基磷灰石)包被或矿化。
在某些实施方式中，预期可通过多种合适技术中的任一种来至少部分地包被或矿化所述脱细胞植物或真菌组织。例如，在某些实施方式中，可以例如通过交替地暴露于氯化钙溶液和磷酸二钠溶液，使用磷灰石至少部分地包被或矿化所述脱细胞植物或真菌组织。在某些实施方式中，预期可以通过浸入模拟体液；热喷涂；溅射涂覆；溶胶-凝胶沉积；热等静压；浸涂；静电纺丝；或它们的任何组合，将所述脱细胞植物或真菌组织至少部分地包被或矿化。Shin et al.,2017,Biomimetic Mineralization of Biomaterials UsingSimulated Body Fluids for Bone Tissue Engineering and Regenerative Medicine,Tissue Engineering Part A,23:19-20,https://dx.doi.org/10.1089％ 2Ften.tea.2016.0556中描述了包被或矿化技术的示例，其全部内容通过引用并入本文。
在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织是基于纤维素的、基于甲壳素的、基于壳聚糖的、基于木质素的、基于半纤维素的或基于果胶的或它们的任何组合。在某些实施方式中，植物或真菌组织可以包含来自苹果托杯(苹果)组织、蕨类植物(单系蕨类植物)组织、萝卜(芜菁)根组织、银杏树枝组织、马尾草(木贼属)组织、萱草杂交叶片组织、羽衣甘蓝(甘蓝)茎组织、针叶树花旗松(花旗松)组织、仙人掌果实(火龙果)果肉组织、斑纹长春花组织、水生莲花(荷花)组织、郁金香(郁金香)花瓣组织、大蕉(香蕉)组织、绿菜花(甘蓝)茎组织、枫叶(假挪威槭)茎组织、甜菜(甜菜)初生根组织、大葱(玉葱)组织、兰花(兰科)组织、萝卜(芜菁)茎组织、韭葱(象大蒜)组织、枫(槭属)树枝组织、芹菜(芹菜)组织、大葱(玉葱)茎组织、松组织、芦荟组织、西瓜(栽培西瓜品系)组织、草甸排草(绿金钱草)组织、仙人掌组织、高山剪秋罗组织、大黄(波叶大黄)组织、南瓜果肉(西葫芦)组织、匐地仙人掌(天门冬科)茎组织、蜘蛛草(紫露草)茎组织、芦笋(芦笋)茎组织、蘑菇(真菌)组织、茴香(茴香)组织、玫瑰(蔷薇属)组织、胡萝卜(胡萝卜)组织、或梨(苹果类)组织、或通过直接基因组修饰或通过选择性育种产生的转基因组织、或它们的任何组合的组织。
在本文所述的支架生物材料的某些实施方式中，支架生物材料可进一步在脱细胞植物或真菌组织上和/或内包含活细胞，特别是非原生细胞。在某些实施方式中，活细胞可以是动物细胞。在某些实施方式中，活细胞可以是哺乳动物细胞。在某些实施方式中，活细胞可以是人类细胞。
在某些实施方式中，如本文所述的支架生物材料可包含胶合、交联或联锁在一起的两个或更多个支架亚单元。在如本文所述的支架生物材料的某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可包含源自不同组织或不同来源的两种或更多种不同的脱细胞植物或真菌组织。在某些实施方式中，所述两种或更多种不同的脱细胞植物或真菌组织可以胶合、交联或联锁在一起。
在另一个实施方式中，本文提供了一种用于骨组织工程的如本文所述的支架生物材料。在还另一个实施方式中，本文提供了一种包含如本文所述的支架生物材料的骨移植物。在另一个实施方式中，本文提供了一种包含如本文所述的支架生物材料的BTE植入物。
在某些实施方式中，与许多商业生物材料不同，本文所述的植物/真菌衍生生物材料可以是基本上不可再次吸收的或可再次吸收性差的(即它们不会大量分解并被身体吸收)。这些支架的不可再次吸收特性可以带来某些益处。例如，在某些实施方式中，本文所述的生物材料可以抵抗形状变化，和/或可以长时间保持其预期几何形状。在某些实施方式中，由于与某些其他产品相比，它们的足迹可以最小化，因此它们可以被认为对身体有效地不可见，几乎不会引起免疫反应。在某些情况下，当一些可再次吸收的生物材料分解时，它们的副产物可能会引发不良免疫反应，以及诱导氧化应激并导致正恢复组织中的pH值增加，这可以通过使用不可再次吸收的生物材料来避免。
事实上，在某些实施方式中，如本文所述的脱细胞植物或真菌组织和/或支架生物材料可以进一步在支架生物材料上和/或之内包含活细胞。在某些实施方式中，活细胞可以是动物细胞、哺乳动物细胞或人类细胞。在某些实施方式中，活细胞可以包含前成骨细胞、成骨细胞和/或其他骨或骨组织相关细胞。
在某些实施方式中，植物或真菌组织可以通过直接基因组修饰或通过选择性育种进行遗传改造，以创造额外的植物或真菌结构，其可以被配置为物理模拟组织和/或在功能上促进靶组织效应，特别是骨组织和骨工程效应。考虑了本文教导的技术人员将能够选择合适的支架生物材料以适合特定应用。在某些实施方式中，可以基于例如诸如尺寸、结构(多孔/管状)、刚度、强度、硬度和/或延展性等物理特性为特定应用选择合适的组织，这些物理特性可以测量并与特定应用相匹配。
另外，选择时还可以考虑化学性质，例如反应性、配位数、形成焓、稳定性、毒性和/或键的类型，以适合特定的应用。也可以在脱细胞和/或功能化之前或之后直接修改这些特性(物理和化学)以响应特定应用。
在某些实施方式中，支架生物材料可以源自植物或真菌的相同组织或部分，或源自植物或真菌的不同部分或组织。在某些实施方式中，支架生物材料可以源自同一个体植物或真菌，或源自同一物种的多个植物或真菌。在某些实施方式中，支架生物材料可以源自不同物种的植物或真菌，使得支架包含来自多于一个物种的结构。在某些实施方式中，支架生物材料可以经选择以便提供特定特征。例如，在某些实施方式中，可选择孔隙率和/或刚度在一定范围内的支架生物材料，以模拟参与骨组织再生、修复和/或工程的天然组织和/或结构。在某些实施方式中，植物或真菌组织可包含苹果或苹果托杯、组织或具有相似孔隙率和/或刚度特征的另一种植物或真菌组织。
在某些实施方式中，支架生物材料可以是被配置为在物理上模拟受试者的组织和/或在功能上促进受试者中的靶组织效应的支架生物材料。在某些实施方式中，使用如本文所述的这种支架生物材料的方法可以包括步骤：选择如本文所述的支架生物材料，其中脱细胞植物或真菌组织被配置为在物理上模拟受试者的组织和/或在功能上促进受试者中的靶组织效应。将可以理解的是，组织通常是骨相关组织，并且靶组织效应通常是骨再生、修复、生长和/或骨工程效应。考虑了本文教导的技术人员将能够选择合适的支架生物材料以适合特定应用。
在某些实施方式中，如本文所述的脱细胞植物或真菌组织和/或支架生物材料可进一步在植物或真菌组织上和/或内包含活细胞。在某些实施方式中，活细胞可以是动物细胞、哺乳动物细胞或人类细胞。在某些实施方式中，所述细胞可以是引入或接种到支架生物材料和/或脱细胞植物或真菌组织中和/或上的细胞，或者可以是例如，在将支架生物材料和/或脱细胞植物或真菌组织植入活体动物或植物受试者后，浸润到支架生物材料和/或脱细胞植物或真菌组织中或上的细胞。在某些实施方式中，活细胞可以包含骨组织细胞或骨祖细胞。在某些实施方式中，活细胞可以包含前成骨细胞或成骨细胞。
在另一个实施方式中，本文提供了一种试剂盒，包括以下任何一种或多种：
从其中去除了组织的细胞物质和核酸的脱细胞植物或真菌组织，所述脱细胞植物或真菌组织包含3维多孔结构；
基于蛋白质的水凝胶；
基于多糖的水凝胶；
磷灰石；
氯化钙；
磷酸二钠；
磷酸骨钙；
生物相容性陶瓷；
生物相容性玻璃；
生物相容性金属纳米颗粒；
纳米晶纤维素；
哺乳动物细胞，诸如前成骨细胞、成骨细胞、分化的骨和/或颅盖组织细胞、或它们的任何组合；
植物或真菌组织、脱细胞试剂、或两者；
缓冲剂；和/或
用于执行任何如本文所述一种或多种方法的说明。
在某些实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、骨形态生成蛋白、其他基质蛋白、或它们的任何组合。在某些实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白水凝胶。在某些实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白I。在某些实施方式中，所述基于多糖的水凝胶可以包含琼脂糖-基凝胶/水凝胶、海藻酸盐-基凝胶/水凝胶、透明质酸-基凝胶/水凝胶、或另一种基于碳水化合物的水凝胶。在某些实施方式中，磷灰石可以包含羟基磷灰石。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含一种或多种成骨分化标志物，诸如骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、或它们的任何组合。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含在正常骨基质中发现的一种或多种蛋白质。
支架生物材料的生产方法、以及方法和用途
在另一个实施方式中，本文提供了一种用于生产支架生物材料的方法，所述方法包括：
提供从其中去除了组织的细胞物质和核酸的脱细胞植物或真菌组织，所述脱细胞植物或真菌组织包含3维多孔结构；和
向所述脱细胞植物或真菌组织中引入基于蛋白质的水凝胶、基于多糖的水凝胶或两者。
在某些实施方式中，可以通过考虑了本文教导的本领域技术人员已知的任何适合技术将基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶引入脱细胞植物或真菌组织中。在某些实施方式中，例如，可以通过浸没、浇注、成型、在电场下、引导光刻或静电纺丝，将基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶引入脱细胞植物或真菌组织中。
在某些实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含含有一种或多种蛋白质或其衍生物的任何合适的水凝胶。在某些实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、骨形态生成蛋白、其他基质蛋白、或它们的任何组合。在某些实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白水凝胶。在某些实施方式中，所述基于蛋白质的水凝胶可以包含胶原蛋白I。
在某些实施方式中，所述基于多糖的水凝胶可以包含含有一种或多种碳水化合物或多糖或其衍生物的任何合适的水凝胶。在某些实施方式中，水凝胶可以包含琼脂糖-基水凝胶、海藻酸盐-基水凝胶、透明质酸-基水凝胶或另一种基于碳水化合物的水凝胶。
在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含一种或多种成骨分化标志物，诸如骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、或它们的任何组合。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织和/或基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶可以包含在正常骨基质中发现的一种或多种蛋白质。
在又一个实施方式中，本文提供了一种用于生产支架生物材料的方法，所述方法包括：
提供从其中去除了组织的细胞物质和核酸的脱细胞植物或真菌组织，所述脱细胞植物或真菌组织包含3维多孔结构；和
至少部分地包被或矿化所述脱细胞植物或真菌组织。
在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被一种或多种磷酸盐矿物质包被或矿化。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被磷灰石、磷酸骨钙、生物相容性陶瓷、生物相容性玻璃、生物相容性金属纳米颗粒、纳米晶纤维素、或它们的任何组合包被或矿化。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被磷灰石包被或矿化。在某些实施方式中，磷灰石可以包含羟基磷灰石。在某些实施方式中，所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地被纳米晶纤维素包被或矿化以增加脱细胞植物或真菌组织的硬度。在某些实施方式中，磷灰石可以包含羟基磷灰石。
在某些实施方式中，对脱细胞植物或真菌组织进行包被或矿化的步骤包含使所述脱细胞植物或真菌组织交替暴露于氯化钙溶液和磷酸二钠溶液。
在某些实施方式中，预期可通过多种合适技术中的任一种将所述脱细胞植物或真菌组织至少部分地包被或矿化。例如，在某些实施方式中，可以例如通过交替暴露于氯化钙溶液和磷酸二钠溶液，使用磷灰石将所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地包被或矿化。在某些实施方式中，预期可以通过浸入模拟体液；热喷涂；溅射涂覆；溶胶-凝胶沉积；热等静压；浸涂；静电纺丝；或它们的任何组合，将所述脱细胞植物或真菌组织可以至少部分地包被或矿化。Shin et al.,2017,Biomimetic Mineralization of Biomaterials UsingSimulated Body Fluids for Bone Tissue Engineering and Regenerative Medicine,Tissue Engineering Part A,23:19-20,https://dx.doi.org/10.1089％ 2Ften.tea.2016.0556中描述了包被或矿化技术的示例，其全部内容通过引用并入本文。
在某些实施方式中，本文描述的方法可以包含将基于蛋白质的水凝胶和/或基于多糖的水凝胶引入支架生物材料，以及矿化脱细胞植物或真菌组织，从而提供预矿化的支架生物材料，其中包括包被和/或装载的水凝胶。
在还另一个实施方式中，如本文所述的方法可以进一步包括步骤：在脱细胞植物或真菌组织上和/或内引入活细胞，特别是非原生细胞。在某些实施方式中，活细胞可以包含动物细胞。在某些实施方式中，活细胞可以包含哺乳动物细胞。在某些实施方式中，活细胞可以包含人类细胞。在某些实施方式中，活细胞可以包含前成骨细胞、成骨细胞、分化的骨和/或颅盖组织细胞、或它们的任何组合。
本文详细地描述了植物或真菌组织的分离和脱细胞方法，以及制备支架生物材料的方法。同样，在下面的实施例部分中详细描述这些方法的实验例。
在标题为“来自植物和真菌的脱细胞细胞壁结构及其作为支架材料的用途”的WO2017/136950中，可以找到可适用于生产用于本文所述支架生物材料的脱细胞植物或真菌组织的脱细胞协议的进一步示例，其全部内容通过引用并入本文。
在任何上述一种或多种方法的还另一个实施方式中，植物或真菌组织可以包含来自苹果托杯(苹果)组织、蕨类植物(单系蕨类植物)组织、萝卜(芜菁)根组织、银杏树枝组织、马尾草(木贼属)组织、萱草杂交叶片组织、羽衣甘蓝(甘蓝)茎组织、针叶树花旗松(花旗松)组织、仙人掌果实(火龙果)果肉组织、斑纹长春花组织、水生莲花(荷花)组织、郁金香(郁金香)花瓣组织、大蕉(香蕉)组织、绿菜花(甘蓝)茎组织、枫叶(假挪威槭)茎组织、甜菜(甜菜)初生根组织、大葱(玉葱)组织、兰花(兰科)组织、萝卜(芜菁)茎组织、韭葱(象大蒜)组织、枫(槭属)树枝组织、芹菜(芹菜)组织、大葱(玉葱)茎组织、松组织、芦荟组织、西瓜(栽培西瓜品系)组织、草甸排草(绿金钱草)组织、仙人掌组织、高山剪秋罗组织、大黄(波叶大黄)组织、南瓜果肉(西葫芦)组织、匐地仙人掌(天门冬科)茎组织、蜘蛛草(紫露草)茎组织、芦笋(芦笋)茎组织、蘑菇(真菌)组织、茴香(茴香)组织、玫瑰(蔷薇属)组织、胡萝卜(胡萝卜)组织、或梨(苹果类)组织、或通过直接基因组修饰或通过选择性育种产生的转基因组织、或它们的任何组合的组织。在另一个实施方式中，植物或真菌组织可以包含苹果托杯。标题为“来自植物和真菌的脱细胞细胞壁结构及其作为支架材料的用途”的WO2017/136950的实施例18中描述了植物和真菌组织的其他实例，其全部内容通过引用并入本文。
在标题为“来自植物和真菌的脱细胞细胞壁结构及其作为支架材料的用途”的WO2017/136950中可以找到可适用于生产用于本文所述支架生物材料的脱细胞植物或真菌组织的脱细胞协议的示例，其全部内容通过引用并入本文。
多种方法可用于脱细胞。例如，在某些实施方式中，脱细胞可以包括通过热冲击、用洗涤剂处理(例如SDS、Triton X、EDA、碱性处理、酸、离子洗涤剂、非离子洗涤剂和两性离子洗涤剂)、渗透压休克、冻干、物理溶解(例如静水压力)、电气破坏(例如非热不可逆电穿孔)、或酶消化、或它们的任何组合进行的脱细胞。在某些实施方式中，脱细胞过程可以包含多种方法中的任何一种(单独或组合)，包括但不限于热冲击(例如，快速冻融)、化学处理(例如，洗涤剂)、渗透压休克(例如，蒸馏水)、冻干、物理溶解(例如，压力处理)、电气破坏和/或酶消化。
在某些实施方式中，脱细胞可以包括用洗涤剂或表面活性剂处理。洗涤剂的例子可以包括但不限于十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton X、EDA、碱性处理、酸、离子洗涤剂、非离子洗涤剂和两性离子洗涤剂。
在还进一步的实施方式中，脱细胞植物或真菌组织可以包括已经通过用SDS处理进行脱细胞的植物或真菌组织。在还另一个实施方式中，可以通过用二价盐水溶液洗涤从植物或真菌组织中去除残留的SDS。二价盐水溶液可用于将含有SDS胶束的盐残留物从溶液/支架中沉淀/破碎出来，并且可以使用dH2O、乙酸或二甲亚砜(DMSO)处理或超声波处理来去除盐残留物或SDS胶束。在某些实施方式中，二价盐水溶液的二价盐可以包含例如MgCl2或CaCl2。
在另一个实施方式中，植物或真菌组织可以通过使用0.01％至10％SDS(例如约0.1％至约1％，或例如约0.1％SDS或约1％SDS)在溶剂(如水、乙醇或另一合适的有机溶剂)中的溶液处理来进行脱细胞，并且可以使用浓度为约100mM的CaCl2水溶液去除残留的SDS，之后在dH2O中温育。在某些实施方式中，SDS溶液的浓度可以高于0.1％，这可能有助于脱细胞化，并且可能伴随着增加洗涤以去除残留的SDS。在特定的实施方式中，可以通过使用约0.1％SDS在水中的SDS溶液处理来对植物或真菌组织进行脱细胞，并且可以使用浓度为约100mM的CaCl2水溶液去除残留的SDS，随后在dH2O中温育。
虽然当前描述的支架材料的某些设计考虑可能与标题为“来自植物和真菌的脱细胞细胞壁结构及其作为支架材料的用途”的WO2017/136950(其全部内容通过引用并入本文)的支架生物材料描述的某些设计考虑相关，但例如，当前描述的生物材料可提供因包含一种或多种水凝胶和/或包含预矿化而产生的益处。因此，例如，目前描述的生物材料对于需要骨组织工程、修复、再生、生长和/或替代的应用可能特别有利。
在某些实施方式中，例如，本文所述的生物材料可应用于生物医学实验室研究和/或人类和/或兽医应用中的临床再生医学。这种生物材料可以有效地作为支架，其可以用作工业/学术生物医学研究人员的调查工具、用于生物医学植入物和/或骨移植物、和/或用于可以使用支架的其他合适的应用。在某些实施方式中，本文所述的支架生物材料可用于骨再生。在某些实施方式中，如本文所述的支架生物材料可用作简单或复杂的组织。例如，支架可用于在发生事故、畸形、损伤或其他骨骼受伤后替换/再生骨组织。
在另一个实施方式中，任何上述一种或多种方法可进一步包括将活植物或动物细胞引入植物或真菌组织的步骤。在另一个实施方式中，任何上述一种或多种方法可以进一步包括在支架生物材料上和/或中培养活植物或动物细胞的步骤。在一个实施方式中，活细胞可以包含哺乳动物细胞，诸如人类细胞。在某些实施方式中，细胞可以包含一种或多种骨组织细胞，诸如例如前成骨细胞和/或成骨细胞。
在某些实施方式中，特别是对于BTE和/或修复应用，预期可以将源自患者的骨祖细胞添加至如本文所述的支架以促进修复和/或恢复。
在还另一个实施方式中，本文提供了任何本文所述的一种或多种支架生物材料用于BTE、用于骨移植、用于修复或再生骨骼、或它们的任何组合的用途。在又一个实施方式中，本文提供了任何本文所述的一种或多种支架生物材料用于以下中任何一种或多种的用途：颅面重建手术；牙科和/或颌面重建手术；主要骨缺损和/或创伤重建；骨填料应用；植入物稳定；和/或药物递送；或它们的任何组合。在还另一个实施方式中，本文提供了任何本文所述的一种或多种支架生物材料在牙科骨填料应用中的用途。在另一个实施方式中，本文提供了任何本文所述的一种或多种支架生物材料作为大型植入物用应力屏蔽减压器的用途。
在又一个实施方式中，本文提供了任何本文所述的一种或多种支架生物材料用于以下的用途：用于促进活跃成骨；用于植入以修复临界和/或非临界尺寸缺损；在骨修复过程中提供机械支撑；替代入长骨、颅骨、颌面骨、牙齿和/或颌骨的损失或损伤中；用于畸齿矫正和/或牙周移植物,诸如牙槽嵴增大、牙齿脱落、牙齿植入和/或重建手术；用于移植在特定部位以增大由骨质疏松症造成的损失、由于年龄、先前的植入物和/或受伤导致的骨质流失所致的骨体积；或改善骨-植入物组织整合；或它们的任何组合。
在又一个实施方式中，本文提供了一种用于工程化骨组织；用于骨移植；用于修复或再生骨骼；用于颅面重建手术；用于牙科和/或颌面重建手术；用于主要骨缺损和/或创伤重建；用于牙科或其他骨填料应用；用于植入物稳定；用于大型植入物的应力屏蔽；用于促进活跃成骨；用于修复临界和/或非临界尺寸缺损；用于在骨修复过程中提供机械支撑；用于替代损失或损伤的长骨、颅骨、颌面骨、牙齿和/或颌骨；用于畸齿矫正和/或牙周移植诸如牙槽嵴增大、牙齿脱落、牙齿植入和/或重建手术；用于移植在特定部位以增大由骨质疏松症造成的损失、由于年龄、先前的植入物和/或受伤导致的骨质流失所致的骨体积；用于改善骨-植入物组织整合；或用于药物递送；或用于它们的任何组合的方法，所述方法包括：
提供如本文所述的支架生物材料；和
将所述支架生物材料植入到有此需要的受试者的有此需要的部位或区域。
在某些实施方式中，所述支架生物材料可以植入在受伤部位(例如，骨折、空隙填充物、受损的骨组织)。在某些实施方式中，支架生物材料可以是无细胞的，或者预接种了细胞，这些细胞可以任选地来自患者(即自体)或来自供体(即同种异体)。在某些实施方式中，支架生物材料可以预成型、模块化或原位成型以匹配缺损或损伤部位。在某些实施方式中，可在植入前将成骨生长因子预加载到支架生物材料中，或可在植入后和/或术后给药，或两者。
在某些实施方式中，例如为了处理小的断裂或裂缝，可能需要包裹或注射支架生物材料。在某些实施方式中，例如对于较大的缺损，可能需要插入支架生物材料。
在某些实施方式中，支架生物材料可以植入在骨折或断裂部位，可以包裹在骨头周围或插入断裂或间隙，或两者。在某些实施方式中，骨细胞可预先接种到支架生物材料中，或随后引入支架生物材料中。在某些实施方式中，触发前成骨细胞分化的药剂可以存在于支架生物材料中，或者可以被引入到支架生物材料中。在某些实施方式中，例如，用于植入的支架生物材料可以配置为不需要移除，或者可以在一段时间后移除。
在某些实施方式中，所述方法可以进定步包含步骤：在植入前，将骨祖细胞或骨或骨组织细胞添加或接种到支架生物材料中。在某些实施方式中，骨祖细胞或骨或骨组织细胞可以包含源自患者的细胞。在某些实施方式中，细胞可以包含前成骨细胞、成骨细胞、分化的骨和/或颅盖组织细胞、或它们的任何组合。
在某些实施方式中，预期如本文所述的支架生物材料可以源自和/或包含纤维素、半纤维素、甲壳素、壳聚糖、果胶、木质素或它们的任何组合。
本文提供了支架生物材料及其用于BTE的用途。预期在某些实施方式中，本文所述的支架生物材料可用于提供可调节的矿化表面，根据需要选择各种分子比以调节生物活性、骨诱导和/或骨整合。
如本文所述的支架生物材料可受益于源自其天然存在的植物来源的复杂几何形状、孔隙率和/或结构。这种支架生物材料，由于它们的化学组成，在体内也可能是生物降解性较差或不可生物降解的，这可能有利于骨组织工程(BTE)应用。
在某些实施方式中，本文所述的支架生物材料可以基本上或至少部分地基于纤维素。此类纤维素支架可有利地在体内难以生物降解，并且可有利地易于可包被和/或可预矿化以提供具有所需BTE特性的预包被的支架生物材料。
在某些实施方式中，如本文所述的支架生物材料和/或移植物可以预包被有不同的分子比(例如通过改变温育循环的数目和/或试剂的浓度)，以提供可调性。在某些实施方式中，可以选择衍生所述支架生物材料/移植物的植物组织来源以适合特定应用。例如，在某些实施方式中，可以选择潜在的孔隙率和/或孔互连性以招募和/或整合支架生物材料/移植物中的细胞。由于在自然界中可找到许多宏观和微观结构，因此有很多选择并且选择合适的来源可以优化支架生物材料/移植物的性能，以用于特定的目的应用。例如，在某些实施方式中，对于某些应用，与具有特定孔径和孔互连性的均质多孔支架相比，非均质、较少孔的致密材料可能效率更低或更不可取，因此可以相应地选择植物组织来源。
在某些实施方式中，预期如本文所述的支架生物材料/移植物可被修饰以改变表面化学从而提供更好的预涂层粘附。在某些实施方式中，例如，可以将一个或多个官能团添加到表面以更好地粘附涂层。在某些实施方式中，此类方式可用于将药物、激素、代谢物等添加到本文所述的支架生物材料。在某些实施方式中，可以使用用于某些细胞类型的引诱剂和/或威慑剂，和/或可以改变局部环境(生物化学和/或物理)以适合特定应用。在某些实施方式中，可以向细胞提供不同的局部空间和/或时间线索。
在某些实施方式中，预期可以执行添加胶原蛋白和/或生长因子和/或干细胞(或祖细胞)和/或其他结构性或功能性蛋白质以进一步调整和/或定制如本文所述的支架生物材料/移植物以用于特定目的应用。
在某些实施方式中，如本文所述的支架生物材料/移植物可用于以下任何一种或多种：颅面重建手术；牙科和/或颌面重建手术；主要骨缺损和/或创伤重建；骨填料应用；植入物稳定；和/或药物递送。在某些实施方式中，如本文所述的支架生物材料/移植物可用于牙骨填料应用。在某些实施方式中，预期如本文所述的支架生物材料/移植物可用作大型植入物用应力屏蔽减压器。
在某些实施方式中，可以对支架生物材料进行处理以使用化学计量的和/或钙缺乏的羟基磷灰石将支架生物材料的表面或全部矿化。在某些实施方式中，可以使用化学计量的和/或钙缺乏的羟基磷灰石进行时间依赖性或非依赖性表面矿化。在某些实施方式中，可以对材料进行时间依赖性或非依赖性的表面电荷改性。在某些实施方式中，不同机械性能的复合材料可用于调节应力屏蔽(例如，骨材料响应)。在某些实施方式中，可以调整应力屏蔽，使得相关体内环境的硬度基本匹配(即，对于功能来说足够坚固但不会过度僵硬)，从而避免或减少邻近组织(例如周围骨组织)中的骨退化。
在另一个实施方式中，本文提供了一种用于将软骨或骨前体细胞分化成软骨或骨组织细胞的方法，所述方法包括：
在分化培养基中，在任何本文所述的一种或多种支架生物材料上培养所述软骨或骨前体细胞；
其中所述培养包括使培养的细胞暴露于高于环境压力的增加的大气压力下至少一次。
在另一个实施方式中，本文提供了一种用于将软骨或骨前体细胞分化成软骨或骨组织细胞的方法，所述方法包括：
在分化培养基中在任何本文所述的一种或多种支架生物材料培养所述软骨或骨前体细胞；
其中所述培养包括至少一个处理期，在此期间使培养的细胞在该处理期的至少一部分中暴露于高于环境压力的增加的大气压力下，其中所述处理期为至少约10分钟的持续时间并且每周进行至少一次；
从而将所述软骨或骨前体细胞分化为软骨或骨组织细胞。
在某些实施方式中，所述软骨或骨前体细胞可以包含以下的任何一种或多种：间充质干细胞；骨骼干细胞；诱导的多能干细胞；前成骨细胞；前破骨细胞；骨软骨祖细胞；软骨膜细胞；成软骨细胞；软骨细胞；或肥大软骨细胞；或它们的任何组合。
在某些实施方式中，所得软骨或骨组织细胞可包含完全分化的细胞，或与初始软骨或骨前体细胞相比进一步分化或更成熟的前体细胞的细胞。根据特定应用，可能需要不同水平的分化。在某些实施方式中，所得软骨或骨组织细胞可以包含以下中的任何一种或多种：造骨细胞；骨衬细胞；骨细胞；破骨细胞；软骨细胞；或肥大软骨细胞；或它们的任何组合。
Rutkovskiy,A.,
Figure BDA0003693237360000381
K.O.,&Vaage,I.J.(2016).OsteoblastDifferentiation at a Glance.Medical science monitor basic research,22,95–106.https://doi.org/10.12659/msmbr.901142中描述了骨前体细胞分化的一般原理，其全部内容通过引用并入本文。
在某些实施方式中，分化培养基可以包括适合于允许前体细胞分化成所需的软骨或骨组织细胞的任何适合细胞培养基。考虑了本文教导的技术人员将了解适用于制备所需类型分化细胞的多种细胞培养基或肉汤。在某些实施方式中，分化培养基可以包括成骨培养基，诸如含有以下的成骨培养基：Dulbecco改良基本培养基或最低基本培养基α；胎牛血清；青霉素-链霉素；地塞米松；抗坏血酸；B-甘油磷酸盐或无机磷酸盐。在某些实施方式中，分化培养基可以包括软骨形成培养基，例如含有以下的软骨形成培养基：Dulbecco改良Eagle培养基，胎牛血清，青霉素-链霉素，地塞米松(例如Sigma)，抗坏血酸-2-磷酸盐，丙酮酸钠，转化生长因子-β1(TGF-β1，例如Peprotech,Rocky Hill,NJ)。
在某些实施方式中，增加的大气压力可以是高于环境压力的任何合适的大气压力。在某些实施方式中，环境压力可包含小于约1GPa的压力。在某些实施方式中，可以选择增加的大气压力来模拟正常施加在骨组织上的负载。在某些实施方式中，增加的大气压力可以比环境压力高约100至约1000kPa，例如约200至约500kPa，或约250至约350kPa，或任何这些范围内的任何整数值，或跨越任何这些范围内的任何两个整数值之间的任何子范围。
在某些实施方式中，所述处理期可以是至少约10分钟的持续时间、至少约30分钟的持续时间、至少约1小时的持续时间、或至少约2小时的持续时间、至少约5小时的持续时间、至少约10小时的持续时间、至少约1天的持续时间、至少约2天的持续时间、至少约1周的持续时间、或更长。在某些实施方式中，所述处理期可以为约10分钟至约2周的持续时间，或其间的任何整数时间值，或跨越任何两个此类整数时间值之间的任何子范围。
在某些实施方式中，处理期可以进行每周至少一次，每周至少两次，每周至少3次，每周至少4次，每周至少5次，每周至少6次、每周至少7次、每周至少14次或更多。在某些实施方式中，处理期的执行频率可以为每周一次到每周168次，或它们之间的任何整数值，或跨越任何两个此类整数值之间的任何子范围。在某些实施方式中，处理期期可以每天至少进行一次。
在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，每次暴露于增加的大气压力后，可以将培养的细胞可返回到低压或环境压力条件。在某些实施方式中，培养的细胞可以返回到低压条件，包括低于增加的大气压的压力，通常是接近环境压力的低压。在某些实施方式中，培养的细胞可以返回到环境压力条件，该环境压力条件是或接近环境压力(例如，典型地约101kPa)。
在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，所述处理期可以包含在低或环境压力条件和增加的大气压条件之间交替所述培养的细胞。在某些实施方式中，交替可以较慢，使得低/环境压力阶段和增加的压力阶段持续时间较长，或者交替可以较快，使得低/环境压力阶段和增加的压力阶段持续时间较短且快速交替。在某些实施方式中，从低/环境压力到增加的压力的转变可以是缓慢的或快速的。在某些实施方式中，从增加的压力到低/环境压力的转变可以是缓慢的或快速的。在某些实施方式中，转变速率可以基本上是线性的，或者可以是非线性的。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，处理期可以包含使所述细胞暴露的大气压力在低或环境压力和增加的大气压力之间振荡。在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，处理期可以包含以1-10Hz、或它们之间的任何值、或它们之间的任何子范围的频率使所述细胞暴露的大气压力在低或环境压力和增加的大气压力之间振荡。
在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，处理期可包含使所述细胞暴露的大气压力在低或环境压力和增加的大气压之间振荡，其中所述低或环境压力是环境压力(即典型地约101kPa+约0kPa)，并且所述增加的大气压力为比环境压力高约+280kPa(即典型地约101kPa+约280kPa＝约381kPa)，并且任选地其中所述振荡的频率为约1-10Hz。
在任何上述一种或多种方法的还另一个实施方式中，处理期可包含将培养的细胞暴露于增加的大气压力下一段持续的时间。在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，处理期可包含将培养的细胞暴露于基本恒定的增加的大气压力下一段持续的时间。在某些实施方式中，持续的持续时间可能至少为约10分钟。在某些实施方式中，持续的持续时间可以为约10分钟至约3周，或它们之间的任何时间值，或它们之间的任何子范围。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，处理期可以约1小时的持续时间或更长。
在任何上述一种或多种方法的还另一个实施方式中，处理期可以进行每天一次，或每天多于一次。
在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，培养可以进行至少约1周。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，培养可以进行约2周或更长。
在任何上述一种或多种方法的还另一个实施方式中，可以以静水压力施加所述增加的大气压力。
在任何上述一种或多种方法的又另一个实施方式中，可以通过调节培养细胞上方的气相压力来施加增加的大气压力。
在任何上述一种或多种方法的还另一个实施方式中，增加的大气压可以是高于环境压力约+280kPa(即典型地约101kPa+约280kPa＝约381kPa)。
实施例1——用于骨组织工程的植物源性生物材料-用于体内和体外骨组织工程的纤维素支架的生物力学表征
天然宏观纤维素结构可以来源于各种植物。已经证明，使用表面活性剂处理的源自植物的纤维素-基支架可以通过利用植物的天然结构用作各种组织重建用材料[14]。这些生物材料可用于体外哺乳动物细胞培养[14]，并且是生物相容性的，可在皮下自发地血管化[14]–[16]。生物材料可以根据预期应用而来源于特定的植物[14]–[18]。例如，植物茎和叶的维管结构显示出与动物组织中发现的结构类似的血管结构[18]。植物来源的纤维素支架也可以很容易地雕刻成特定的形状并进行处理以改变其表面生物化学性质[16]。脱细胞过程中可以包括盐缓冲液，这可导致在体外和体内的细胞附着增加[16]。通过将水凝胶浇注到支架表面上，植物来源的纤维素可用于复合生物材料中。支架在动物体内可以具有生物相容性，并可在皮下自发地血管化[15]、[16]。苹果托杯组织可以提供骨样结构，具有直径从100到200μm的互连孔[14]。
虽然其他研究已经显示将细菌纤维素用于BTE的结果有前景[19]，先前没有以目前的方式将植物来源的纤维素用于这一特定应用。重要的是，托杯组织具有与骨小梁相似的几何特征的微观结构[7]。在以下研究中，证明了苹果来源的纤维素支架可作为BTE用的合适生物材料。通过脱细胞化以两种配方制备了来源于苹果托杯组织的支架(见[14]–[16])。
在下列研究中，将MC3T3-E1前造骨细胞接种在裸纤维素支架上或由嵌入在纤维素支架内的基于蛋白质的水凝胶(胶原蛋白水凝胶)组成的复合支架生物材料上。两种支架制剂都支持广泛的细胞侵袭和增殖，此时将含有细胞的支架置于骨诱导培养基中。在细胞成骨分化后，两种支架类型均表现出较高的杨氏模量、碱性磷酸酶活性以及钙沉积和矿化。结果支持低成本、可持续和可再生的植物源性支架用于BTE应用的适用性。
天然来源的纤维素支架可具有与多种组织相关的结构特征，支持哺乳动物细胞的侵袭和增殖，以及高度的体内生物相容性。脱细胞的苹果托杯组织可具有类似于骨小梁的孔径和特性。如本文所述，本文所述的支架可承载成骨细胞分化。在这项研究中，检查了苹果来源的纤维素支架作为骨组织工程(BTE)用生物材料的潜力。还检查了体外和体内的相关机械性能。为了检查它们的体外矿化潜力，将MC3T3-E1前造骨细胞接种在裸纤维素支架上或由纤维素和胶原蛋白I组成的复合支架上。在化学诱导分化后，对支架进行机械测试和矿化评估。发现在两种条件下，分化后的杨氏模量均增加。茜素红和碱性磷酸酶染色进一步突出了支架的成骨潜力和支架上的矿化。支架结构的组织学切片显示细胞完全侵入，并且矿化发生在整个结构中。最后，扫描电子显微镜和能量色散光谱证明了在分化后支架上存在沉积的矿物聚集体，并证实了磷酸盐和钙的存在。将非细胞支架植入大鼠颅骨缺损中并评估脱位力和组织学。机械评估显示，脱位力与天然颅骨和其他类型的非细胞植入物的量相似。总之，这些结果支持植物来源的纤维素可用于骨组织工程(BTE)应用。
材料和方法
支架制备：
按照既定方法制备样品[16]。简言之，用曼陀林切片机将麦金托什苹果(加拿大花式)切成8mm厚的薄片。将苹果片的托杯组织切成5mm×5mm的正方形。方形组织在0.1％十二烷基硫酸钠(SDS,Fisher Scientific,Fair Lawn,NJ)中脱细胞处理两天。然后在去离子水中洗涤脱细胞样品，然后在100mM CaCl2中温育过夜以去除残余的表面活性剂(进一细节见WO2017/136950，标题为“来自植物和真菌的脱细胞细胞壁结构及其作为支架材料的用途”，其全部内容通过引用并入本文)。随后将样品用70％乙醇灭菌30分钟，用去离子水洗涤，并在细胞接种前置于24孔培养板中。支架(8-mm厚)保持未处理(裸支架)或用胶原蛋白溶液包被(复合水凝胶支架)，如下所述。
细胞培养和支架接种：
本项研究中使用MC3T3-E1亚克隆4细胞(
Figure BDA0003693237360000431
CRL-2593TM,Manassa,VA)，并且保持在37℃下在95％空气和5％CO2的加湿气氛中。在补充有10％胎牛血清(FBS HycloneLaboratories Inc.,Logan,UT)和1％青霉素/链霉素(Hyclone Laboratories Inc)的最低基本培养基(α-MEM,Gibco,ThermoFisher,Waltham,MA)中培养细胞，并且在被胰蛋白酶化之前使其生长至80％汇合。然后以105个细胞/mL重新悬浮于α-MEM或1.5g/L胶原蛋白溶液中，如下，以分别制备裸支架或包被有胶原蛋白溶液的支架。简言之，在4℃下将50％(v/v)3mg/mL类型1胶原蛋白(ThermoFisher)与2.5％1N NaOH、1％FBS、10％10x磷酸盐缓冲盐水(PBS,ThermoFisher)和36.5％无菌无离子水混合来制备胶原蛋白溶液。将40μL等份在α-MEM或1.5g/L胶原蛋白溶液中的细胞悬浮液移液到支架上。使细胞在细胞培养条件(即在37℃下在95％空气和5％CO2的加湿气氛中)下粘附1小时。随后，每个培养孔加入2mL培养基。每2-3天更换一次培养基，持续14天。在这14天的培养之后，通过向培养基(分化培养基)中添加50μg/mL抗坏血酸和4mM磷酸钠来诱导MC3T3-E1分化。分化培养基每3-4天更换一次，持续4周。将非分化培养基(不含诱导分化的补充剂)中的支架以相同的培养基更换频率温育相同的时间，并作为阴性对照。所有后续分析均在该4周温育期结束时进行。最后，在4周温育之后，使用1200万像素数码相机将脱细胞苹果支架以及接种了细胞的裸和复合支架成像。
使用共聚焦激光扫描显微镜进行孔径测量和细胞分布分析：
为了测量支架孔径，使用PBS将脱细胞苹果支架在胶原蛋白处理和MC3T3-E1细胞接种之前)彻底清洗，并且使用1mL 10％(v/v)Calcofluor White溶液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)在黑暗和室温下染色25分钟。随后，支架(n＝3)用PBS洗涤并且用高速共振共聚焦激光扫描显微镜(Nikon Ti-E A1-R；Nikon,Mississauga,ON)成像。使用ImageJ软件[20]来处理和分析共焦图像。简而言之，创建了Z轴上的最大投影，并使用Find Edges功能突出孔的边缘。共分析了54个孔(每个支架3个随机选择区域中的6个孔，n＝3个支架)。使用ImageJ中的手绘选择工具手动追踪孔。将选择拟合为椭圆以输出长轴长度。
为了分析支架中的MC3T3-E1细胞分布，用PBS彻底清洗裸和复合细胞接种的支架(每个实验条件下n＝3)并用4％多聚甲醛固定10分钟。然后用去离子水彻底清洗，然后用Triton-X 100溶液(ThermoFisher)透化细胞5分钟，并用PBS再次洗涤。如先前的描述进行支架染色[14]、[16]。简而言之，将支架在1％高碘酸(Sigma-Aldrich)中温育40分钟。用去离子水冲洗后，在黑暗和室温下在补充有100μg/mL碘化丙啶(Invitrogen,Carlsbad,CA)的100mM焦亚硫酸钠(Sigma-Aldrich)和0.15M盐酸(ThermoFisher)中温育2小时。最后，在PBS中洗涤，在黑暗中使用5mg/mL DAPI(ThermoFisher)染色10分钟，再次洗涤并且在成像之前保存在PBS中。用高速共振共聚焦激光扫描显微镜(Nikon Ti-E A1-R)对支架的细胞接种表面进行成像。使用ImageJ软件[20]处理共焦图像并在Z轴上创建最大投影以进行图像分析。
杨氏模量测量：
使用定制的单轴压缩装置获得具有非分化和分化细胞的支架的杨氏模量测量(每个试验条件n＝3)。将不具有细胞的脱细胞苹果源性纤维素支架用作对照。用150g称重传感器(Honeywell)和光学尺记录力和位置。通过以3mm min-1的恒定速率和10％的最大应变压缩样品，获得力-位移曲线。通过拟合应力-应变曲线的线性部分以获得杨氏模量。
碱性磷酸酶和茜素红S染色：
在使用5-溴-4-氯-3’-吲哚磷酸酯和硝基蓝四唑(BCIP/NBT,ThermoFisher)或是茜素红S(ARS,Sigma-Aldrich)染色之前，使用PBS(不具有Ca2+和Mg2+，HycloneLaboratories Inc.)将支架洗涤三次，并且用10％中性缓冲福尔马林固定30分钟。
用BCIP/NBT评估细胞接种的支架的碱性磷酸酶(ALP)活性。通过将一片BCIP/NBT片剂(Sigma-Aldrich)溶解于10mL去离子水中制备BCIP/NBT染色液。固定后，支架(每个实验条件n＝3)用0.05％Tween溶液洗涤，并在室温下用BCIP/NBT染色20分钟。最后，用0.05％Tween洗涤并且在成像之前保存在PBS(不含Ca2+和Mg2+)中。
使用ARS评估支架的钙沉积和矿化。固定后，用去离子水洗涤支架(每个实验条件n＝3)并在室温下暴露于2％(w/v)ARS中1小时。然后用去离子水洗涤以去除多余的ARS染色液，并在成像前保存在PBS(不含Ca2+和Mg2+)中。
最后，使用1200万像素数码相机对所有支架进行成像。
使用扫描电子显微镜和能量色散光谱进行矿化分析：
将支架(每个实验条件n＝3)在4％多聚甲醛中固定48小时，随后如先前所述[32]，在不断增加浓度的乙醇(从50％至100％)中连续脱水。然后使用临界点干燥器干燥样品。将干燥的样品镀金至最终涂层厚度为5nm。使用JEOL JSM-7500F FESEM扫描电子显微镜(JEOL,Peabody,MA)在2kV下采集扫描电子显微镜(SEM)图像。在接种有MC3T3-E1细胞的支架或未接种支架上进行能量色散光谱(EDS)。分析每个支架表面的三个不同区域的矿物聚集体。
大鼠颅盖骨缺损模型
按照既定协议进行双侧开颅手术[33]。雄性Sprague-Dawley大鼠(n＝5)用3％异氟烷麻醉直至失去知觉，并在整个过程中保持在2-3％异氟烷下。1.5cm暴露底层颅骨。使用配备有5mm直径环钻的牙钻，在矢状缝的每一侧，以0.9％NaCl持续冲洗的情况下，在两个顶骨中产生缺损。用0.9％NaCl轻轻清洁周围的骨头以去除任何骨头碎片。在这种情况下，完全按照上述方法制备脱细胞支架，但是用活检打孔器将它们制成圆盘，以匹配5mm的缺损尺寸。对照动物没有接受支架。用缝合线缝合覆盖的皮肤。大鼠可以不受限制地获得食物和水，并由渥太华大学动物护理和使用委员会的认证动物技术人员每日监测。植入后八周后，通过吸入CO2和作为二次安乐死措施的胸腔穿孔对大鼠实施安乐死。用手术刀刀片去除覆盖颅骨的皮肤，露出颅骨。使用牙钻，在额骨和枕骨以及两个顶骨的侧面切割头骨，完全取出头骨的顶部。将样品置于冷PBS中并立即进行机械评估，或用10％福尔马林(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)固定72小时。固定后，将头骨储存在70％乙醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中并进行组织学处理。
推出测试
为了评估从周围骨骼中取出植入物所需的力量，在植入8周后使用单轴压缩装置(MTI Instruments,Albany,NY)和500磅称重传感器(Omega Engineering,Norwalk,CT))进行脱位推出测试。取出后，将样品(n＝7个植入物；4只动物)置于样品架上，骨背侧朝上(图14)。活塞慢慢下降，直到稍微接触到其中一个缺损。记录力-距离曲线，直到以0.5mm/min的速度通过植入物的完全脱位。在力-距离曲线的断点处记录最大力。
组织学分析：
在体外将支架(非分化培养基中的支架n＝1，且分化培养基中的支架n＝2)在4％多聚甲醛中固定48小时，并且在石蜡包埋之前保存在70％乙醇中。通过渥太华大学的PALM组织学核心设施进行包埋、切片和染色。简言之，使用苏木精和伊红(H&E；ThermoFisher)或Von Kossa(VK；ThermoFisher)将5μm厚的连续切片染色，从支架内部1mm处开始。使用ZeissAXIOVERT 40 CFL显微镜(Zeiss,Toronto,ON)对切片(n＝2/支架)成像，以评估细胞浸润(H&E)和矿化(VK)。使用ImageJ软件进行图像分析。如上固定体内支架，但所有随后的包埋、切片和染色都由AccelLAB Inc.(Boisbriand,QC)进行。从缺损连续朝向植入物的中心，以三个不同的水平将包埋在甲基丙烯酸甲酯中的样品连续切割成6μm切片。这些切片含有两个横向缺损。使用苏木精和伊红(H&E)或戈尔德纳三色(GTC)将切片染色。使用ZeissAXIOVERT 40 CFL显微镜将组织切片染色以评价传入物的细胞浸润(H&E)和胶原蛋白沉积(MTC)。使用ImageJ软件分析图像。
使用扫描电子显微镜(SEM)和能量色散光谱(EDS)的矿化分析，将支架(每个实验条件n＝3)在4％多聚甲醛中固定48小时，随后如先前所述[21]，在不断增加浓度的乙醇(从50％至100％)中进行连续脱水。然后使用临界点干燥器干燥样品。将干燥的样品镀金至最终涂层厚度为5nm。使用JEOL JSM-7500F FESEM扫描电子显微镜(JEOL,Peabody,MA)在2kV下采集SEM图像。在裸支架和接种了MC3T3-E1细胞的复合水凝胶支架上进行EDS。分析每个支架表面的三个不同区域的矿物聚集体。
统计分析：
所有数据报告为平均值±平均值的标准误差(S.E.M.)。假设数据呈正态分布。对于杨氏模量均值比较，使用单向ANOVA和Tukey事后检测进行了统计分析。对于骨体积密度比较，进行了学生T检验。p<0.05的值被认为具有统计显著性。
结果
本研究在体外和体内研究了这些支架的机械性能。当前的结果显示，具有分化的成骨细胞的支架的杨氏模量为193.8±16.4kPa，这远高于具有非分化细胞的支架(23.9±1.2kPa)和非细胞支架(24.4±0.9kPa)。此外，在啮齿动物颅骨缺损模型中植入8周后，细胞能够将支架整合到周围的骨骼中，导致测量的脱位力为114±18N，类似于先前关于皮质骨位移的报道[24]。
支架成像和孔径测量
在SDS和CaCl2处理后，实现了苹果组织的原生细胞成分的完全去除(图1A，1B，1D)。该过程已在本文中进行了详细描述，并产生支持许多细胞类型的浸润和增殖的三维(3D)支架。在使用MC-3T3前成骨细胞接种支架后，它们生长到汇合并在分化培养基中维持长达四周(图2)。此时在整个支架中观察到白色矿物质沉积物，正如预期的细胞成功分化。在整个用分化培养基培养4周的裸支架和复合水凝胶支架中观察到白色钙沉积物(分别为图1B和C)。两种类型的具有分化细胞的支架都具有明显的不透明白色，这在没有细胞的对照支架中不存在(图1A)。
共聚焦激光扫描显微镜显示细胞均匀地分布在裸支架和复合水凝胶支架中(分别为图1D和E和图4B)。在共焦图像中很容易观察到支架的高度多孔性。图像量化显示，脱细胞苹果-源性纤维素支架(在胶原蛋白处理之前且在MC3T3细胞接种前)展示了154±40μm的平均孔径。孔径分布范围为73μm至288μm，大多数孔为100至200μm(图2)。
为了分析碱性磷酸酶(ALP)活性和矿化，分别使用BCIP/NBT和ARS将支架染色(分别为图4A-E和F-J)。BCIP/NBT染色结果表明，与未使用细胞温育的支架或使用未在分化培养基中维持的细胞温育的支架相比，ALP活性显著增加(如强烈的紫色所示)。同样地，在分化培养基中培养的支架中的细胞在ARS染色后显示出更强的红色，表明钙矿化程度高于对照支架(无细胞)或具有在非分化培养基中培养的细胞的支架。然而，一些背景染色在对照中清晰可见，我们推测这可能是由于在脱细胞协议中使用的CaCl2所致。
机械性能
为了研究支架的机械性能，在培养中保持后测定了支架的杨氏模量。在非分化或分化培养基中温育4周后，测量了两种支架类型(裸和复合水凝胶)以及对照支架(无细胞)的杨氏模量(图3)。
结果显示，在对照支架(无细胞的支架)(24.4±0.9kPa)和裸支架以及在非分化培养基中培养的复合水凝胶支架(分别为23.9±1.2kPa p＝0.9和36.9±1.0kPa)之间，杨氏模量没有显着差异(图3)。另一方面，在对照支架(24.4±0.9kPa)和裸支架以及在分化培养基中培养的复合水凝胶支架(分别为193.8±16.4kPa和178.9±32.4kPa；在两种情形下均为p<0.001)之间观察到了显著差异。另外，对于裸支架和复合水凝胶支架，在非分化和分化培养基中培养的支架的杨氏模量显著不同(两种情况下均为p<0.001)。然而，在非分化或分化培养基中培养的裸支架和复合水凝胶支架的杨氏模量之间不存在显著差异。碱性磷酸酶和茜素红S染色以分析ALP活性和矿化，分别使用BCIP/NBT和ARS将支架染色(图4)。
与具有非分化细胞的支架(两种类型)(分别为图4B和C)相比，具有分化细胞的裸支架和复合水凝胶支架中的BCIP/NBT染色(反映ALP活性)远更强烈(分别为图4D和E)。对照支架(没有细胞的支架)没有显示任何染色(图4A)。此外，在非分化培养基(图4B和C)或分化培养基(图4D和E)中培养的裸支架和复合水凝胶支架之间未观察到染色差异。
与在非分化培养基中培养的支架(两种类型)中的细胞(图4G,H)相比，在分化培养基中培养的裸支架和复合水凝胶支架中的细胞在ARS染色后显示出更强的红色(图4I,J)。在非分化培养基中培养的对照支架(无细胞)和具有细胞的支架显示出非特异性染色，但这种颜色要浅得多(图4F-H)。
组织学分析
为了进一步检查CaCl2和成骨细胞在支架表面上沉积钙中的作用，采用了组织学染色、扫描电子显微镜(SEM)和能量色散光谱(EDS)。使用组织学分析评估细胞浸润和支架矿化。将支架固定、包埋在石蜡中，并用H&E或VK染色。使用H&E展示了细胞浸润(图5A,B,E,F)并且使用VK染色分析了支架矿化(图5C,D,G,H)。
裸支架和复合水凝胶支架被MC3T3-E1细胞完全浸润(图5)。用H&E展示的细胞浸润(图5)显示，非分化的和分化的支架均显示出良好的MC3T3-E1细胞浸润。在外围和通过构建体可见多个细胞核和细胞质(图5A,B,E,F，分别为蓝色和粉色)。胶原蛋白也以淡粉色可见并且在复合水凝胶支架中更加明显。在分化培养基中培养4周后，裸支架和复合水凝胶支架的孔壁完全染成黑色(分别为图5G和H)。在非分化培养基中培养的裸支架和复合水凝胶支架的孔壁仅显示在构建体外围外侧存在矿化(分别为图5C和D)。
使用扫描电子显微镜和能量色散光谱进行矿化分析，将样品固定并且使用SEM对矿物聚集体进行成像。进行了EDS以分析聚集体的化学组成。
在分化培养基中培养4周后，在裸支架和接种有细胞的复合水凝胶支架中可见局部矿化(分别为图6A和B)。两种类型支架的孔的边缘上均以球状聚集体的形式出现了矿物沉积物。在没有细胞的裸支架上看不到矿物聚集体(图6C)。在选定的目的区域上，即在细胞接种的支架的矿物聚集体上(图6D和E)以及在用作对照的未接种支架的孔壁上(图6F)，采集了EDS光谱。与未接种的支架相比，在分化培养基中培养的两种类型的支架中，光谱显示了出更强的磷(P)和钙(Ca)信号。
VK染色显示在分化培养基中培养4周后，支架的孔壁完全染成黑色。在非分化培养基中培养的支架的孔壁仅显示在构建体外围外侧存在矿化，并且预期(不希望被理论束缚)这可能主要是由于脱细胞处理中钙的吸收。还将样品固定并且使用SEM成像以分析未分化的和分化的支架上的矿物沉积物的化学组成(图6A和D显示硫化的，图6C和F显示对照)。在分化培养基中培养4周后，在接种有细胞的支架中可见局部矿化。在孔的边缘上，矿物沉积物呈球状聚集体。在对照支架上看不到矿物聚集体。在选定的目的区域上，即在细胞接种的支架的矿物聚集体上(图6)和在对照的孔壁上，采集了EDS光谱。与未接种的支架相比，在分化培养基中培养的支架中的光谱清楚地显示出了明显的特征信号，对应于磷(P)和钙(Ca)的沉积。
讨论
植物来源的纤维素生物材料在再生医学的各个领域都有潜力。体外和体内研究已经证明了植物来源纤维素的生物相容性及其在组织工程中的潜在用途[14]–[18]。当前描述的研究(以及实施例4的研究)的目的是使用体外和体内两种途径研究植物来源的纤维素用作BTE用材料的潜力。这是通过进一步研究体外支架杨氏模量的变化并测量体内植入物的脱位力来实现的。本研究支持植物来源的支架生物材料用于BTE。
从苹果组织中去除原生细胞后，将前造骨细胞(MC3T3-E1)接种在裸支架或复合水凝胶支架(包被有胶原蛋白溶液的支架)中。让细胞增殖并浸润支架构建体14天，然后使用分化培养基进行4周诱导成骨分化(在非分化培养基中培养的支架用作对照)。
使用共聚焦显微镜、压缩测量、矿化染色、组织学、SEM和EDS，这些研究表明所述细胞能够在支架内增殖和分化，从而支持使用植物来源的纤维素支架来支持骨形成的用途。共聚焦激光扫描显微镜证实细胞粘附在裸纤维素支架和复合水凝胶支架上(分别为图1D和E)。有趣的是，在支架中观察到了钙沉积(图1B和C)，且更具体地是在孔的边缘。注意到了两种类型支架的这些聚集体的形状(球状)。此外，在纤维素孔周围以及支架孔内部观察到了大量细胞核(图1D和E)。此外，据观察，支架单个孔的直径为约154μm，大多数孔为100至200μm(图2)。这与骨生长的最佳孔径一致，已证明骨生长的最佳孔径在100–200μm范围内[7]。
此外，在分化培养基中培养后，已经证明裸支架和复合水凝胶支架的杨氏模量都有显著变化(增加约3至8倍)(图3,5,6)。另一方面，在非分化培养基中培养的裸支架或复合水凝胶支架中，添加的细胞对构建体的杨氏模量没有显着影响，并且模量与对照支架(不含细胞)的模量相似。有趣的是，在非分化或分化培养基中培养的裸支架和复合水凝胶支架之间没有观察到显著差异。总的来说，这些结果表明，在分化培养基中培养的两种支架中的矿化导致了杨氏模量增加，但复合支架中存在的1型胶原蛋白凝胶没有进一步增加杨氏模量。需要注意的是，尽管在分化培养基中培养时，两种类型的支架的杨氏模量都有所增加，但模量均低于骨的模量(骨小梁为0.1至2GPa且皮质骨为15至20GPa[8])，因此，与承重应用相比，该实施例的特定支架对于非承重应用可能更可取(例如手部和腕部骨折)。
染色结果显示，与对照支架(图4A和F)和在非分化培养基中培养的两种类型的支架(分别为图4B,C和G,H)中的相比，在分化培养基中培养4周后(图4I和J)，在两种类型的支架中的ALP表达更高(图4D和E)且存在更多的钙沉积物(图4D和E)。组织学分析显示了两种类型的支架中MC3T3-E1细胞的侵袭和增殖(图5A,B,E,F)，也具有相似的细胞分布。在两种类型的支架中，在4周的分化期后，构建体的孔壁被成骨细胞矿化(图5D和H)。值得注意的是，具有非分化细胞的构建体的外围也被VK染色。这种非特异性染色可能是由于脱细胞过程后支架中残留的CaCl2所致。通过SEM图片的定性分析进一步评估了矿化的目视确认。在分化培养基中4周后，两种细胞接种的支架类型均显示出了ECM矿化迹象。事实上，在支架构建体上可以看到矿物聚集体，特别是在孔边缘(图6)，这与Addison et al.[35]使用MC3T3-E1细胞外基质的研究一致。这些聚集体在没有细胞的裸支架上不可见。聚集体的EDS分析显示了高水平的P和Ca，从而表明在支架构建体上存在磷灰石。
将脱细胞苹果支架植入大鼠中5mm临界尺寸的颅骨缺损中。8周后取出植入物进行机械评估或进行组织学处理。脱位力的机械评估指示了平均值114±18N。将植入物从周围骨骼中脱位所需的力与将完整的颅骨移位所需的力相似(图14A)，如Zhao et al.,2012(127.06±9.58N)[36]所报告的。因此，表明植入物附着在周围的骨骼和结缔组织上。此外，所述脱位力与使用加载有形态形成性蛋白2的缺钙羟基磷灰石支架植入8周后所报告的脱位力相似(119.12±17.82N)[36]。在4和8周通过H&E染色显示，组织学分析显示了支架和被刺穿的管内存在细胞(图14,18)。支架内也可见血管(图14,18)。此外，通过MTC染色，在4和8周在支架内观察到了1型胶原蛋白。
在这些研究中表明，前造骨细胞可以在未处理的或包被有胶原蛋白溶液的苹果来源的纤维素支架结构中粘附和增殖。在化学诱导预接种的前成骨细胞的成骨分化，在两种类型的支架内发生了矿化，这导致构建体杨氏模量的增加。有趣的是，这些苹果来源的支架具有适合BTE应用的孔径。植入的植物源性纤维素支架需要与颅骨和用于BTE的其他类型支架相似的力量才能从植入部位脱位。细胞浸润植入物并且沉积了1型胶原蛋白。总体而言，结果支持植物源性纤维素作为BTE应用的生物材料。
实施例2——用于骨组织工程的用磷灰石预包被的(预矿化的)植物源性生物材料
用于骨组织工程应用的定制三维支架、基质、移植物和/或人工组织是可取的。为了构建这种材料，将天然来源(即植物)脱细胞并且提取目的特征(多孔结构、微观和宏观通道、半透膜)并且随后使用交替的氯化钙溶液和磷酸二钠溶液进行预包被。
当骨组织因外伤或各种疾病而严重受损时，可能需要移植物或骨替代物。这种骨移植物可以促进活跃的骨生成。其可以被植入以修复临界和/或非临界尺寸缺损。这种骨移植物可以在骨修复过程中提供机械支撑。例如，可以使用这种移植物替代入长骨、颅骨、颌面骨、牙齿和/或颌骨的损失或损伤中。这种移植物也可用于畸齿矫正和牙周移植物，诸如牙槽嵴增大、牙齿脱落、牙齿植入和/或重建手术。其也可以移植在特定部位以增大由于骨质疏松症、因年龄、先前的植入物和/或受伤导致的骨质流失所致的骨体积。例如，此种移植物也可以用于改善骨-植入物组织整合。
为了制造这些研究的移植物/支架生物材料，将苹果切成薄片(大小和厚度取决于所需移植物的大小)。从苹果片中雕刻、成形和提取样品。使用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤样品并且用0.1％SDS溶液在室温下在搅拌下进行脱细胞48小时。另外，使用蒸馏水彻底洗涤样品中并且在室温下在搅拌下浸没在100mM氯化钙溶液中24小时。样品用蒸馏水彻底洗涤，并用70％乙醇溶液消毒1小时，然后用蒸馏水彻底洗涤。最后，将样品储存在4℃的0.9％冲洗盐水或无菌PBS中直至包被。有关脱细胞的进一步详细信息，参见标题为“来自植物和真菌的脱细胞细胞壁结构及其作为支架材料的用途”的WO2017/136950，其全部内容通过引用并入本文。
为了包被移植物，在室温下在搅拌下，将移植物在无菌50mM氯化钙溶液中浸没24小时。用无菌蒸馏水轻轻洗涤移植物，并且在室温下在搅拌下在无菌100mM磷酸二钠中浸没24小时。用无菌蒸馏水轻轻洗涤移植物，并且重复氯化钙-磷酸二钠的交替浸泡循环直到达到所需的移植物厚度(目测评估厚度，见图6)。将移植物储存在在4℃下的0.9％冲洗盐水或无菌PBS中直至使用。
创建了两个移植形状：5mm x 1.5cm圆柱体和5mm x 1mm圆盘(见图7和8，和随附的图例)。将两种形状均皮下植入在大鼠的三个不同区域中(每个形状N＝1)。4周后取出植入物并进行组织切片和染色处理。组织学染色如图9和10所示。
图7显示了包被的时间演变。图8显示了植入前、植入后的棒状材料和植入后的x射线。图9显示了植入后盘状材料的组织学染色。图10显示了植入后棒状材料的组织学染色。
实施例3——复合生物材料
在这些研究中，寻求开发复合生物材料，组合了本文所述的两种或更多种支架生物材料和/或移植物，从而为本文所述的支架生物材料和/或移植物提供更进一步的可调性。如可以理解的，此类复合生物材料不仅在本文所述的BTE应用中是可取的，而且在可使用支架生物材料且需要支架结构和/或化学性质的可调节性的多种其他应用中也是可取的。
在这项研究中，通过胶合组合不同的生物材料亚单元。尽管可能有许多胶水，但这项研究使用了用戊二醛胶水交联的明胶(用硼氢化钠还原)。首先，将起始材料雕刻成所需的形状。然后通过在曼陀林切片机上切片从散装材料中取出所需的形状。曼陀林切片的厚度设置材料的z厚度。随后，按照上述实施例以及通过引用整体并入本文的标题为“来自植物和真菌的脱细胞细胞壁结构及其作为支架材料的用途”的WO2017/136950，将材料脱细胞和灭菌。
然后该材料已准备好用于细胞培养/植入，并且很容易通过胶合组装成最终单元。该胶水迅速凝固且比纤维蛋白胶更牢固。可以通过调整明胶和戊二醛的比例来改变强度。通过将明胶粉在培养基或水中蒸压来制备明胶。然后将其加热至37℃并引入戊二醛(典型比例为1mL 10％明胶与5μL戊二醛)。将溶液快速混合，然后移液到粘附部位。
图11示出了如上制备的胶合并且夹层在脱细胞苹果托杯组织之间的挂膜(脱细胞橙髓)的图像。
结果表明，以这种方式胶合的可以在以下方面提供益处：通过组装两个或多个亚单元来提供更大的尺寸，克服起始材料的尺寸限制；通过使用较小的材料然后组装在一起，克服大材料的漫长脱细胞；克服大构建体的扩散困难；允许设计在自然界中通常不存在的某些结构和/或特征，同时利用各个亚单元中支架生物材料的天然复杂性；允许产生更复杂的物理和/或机械特性(即应力屏蔽和/或位点特异性模量、通道、孔隙等)；和/或允许在不同区域组合不同的细胞类型；或它们的任何组合。
在某些实施方式中，预期如本文所述的方法可进行各种修饰，诸如胶合、凝胶浇注、化学官能化、负载(即药物、信号分子、生长因子、代谢物等)，任何或所有这些都可以极大地扩展和/或提供材料功能的可调整性。
在某些实施方式中，预期本文的方法可以允许将药物、信号分子、细胞因子、代谢物、ECM蛋白、和/或其他组分添加到支架生物材料和/或移植物中作为修饰。在某些实施方式中，例如，本文的方法可以允许在水凝胶浇铸、胶合、化学改性和/或交联方面进行定制。
在某些实施方式中，预期如本文所述的支架生物材料可来源于和/或包含纤维素、半纤维素、甲壳素、壳聚糖、果胶、木质素或它们的任何组合。在某些实施方式中，预期纤维素、半纤维素、甲壳素、壳聚糖、果胶和/或木脂素支架的生化、生物物理和/或机械性质可以是可调的。
在某些实施方式中，预期通过本文所述的支架生物材料和/或移植物可以提供药物、信号分子、生长因子、代谢物、ECM蛋白和/或其他组分的时间依赖性/非依赖性释放。
在某些实施方式中，预期可以通过复合材料、胶水、涂层、凝胶、和/或糊剂选择和/或操作来定制如本文所述的支架生物材料和/或移植物的形状和/或结构。
在某些实施方式中，预计可以创建具有不同程度的柔韧性和/或关节的大型宏对象。在某些实施方式中，例如，预期可以组合两个或多个亚单元以制备更大的宏观结构。在某些实施方式中，预期代替胶合或者除了胶合之外，还可以使用几何学来将亚单元保持在一起。在某些实施方式中，由于可能涉及不同的结构(例如，海绵骨与皮质骨等……)，预计此类方法可用于骨组织工程。
在某些实施方式中，预期本复合材料和胶合方法可用于以下中的任何一种或多种：定制体外3D细胞培养装置；体内研究；医疗装置；骨骼、结缔组织、皮肤、肌肉、神经和/或界面；复杂组织修复和/或替换；膜和/或过滤器(即人工肾和/或简单生化分离柱)；用于位点特异性和/或时间特异性药物递送的载体；通过用本支架生物材料包被或制造复合材料，提高现有医疗装置的生物相容性；原代细胞培养用载体；整容手术(即植入物和/或皮下拓扑结构)；支架和/或分流器；非医疗应用，例如合成生物机器人的关节部件；电子电路集成；或它们的任何组合。在某些实施方式中，预期本复合材料和胶合方法可用于复杂组织设计和/或组织修复/再生用的生物材料植入物。
实施例4——体内临界尺寸颅盖骨缺损模型
进行本研究以评估本文所述的支架生物材料在大鼠临界尺寸双侧缺损模型中用于骨再生应用的潜力。将生物材料(未处理)植入大鼠体内，为期4周和8周。在大鼠颅盖上形成5mm双侧圆形缺损。切离骨缺损后，将生物材料(直径5mm，厚度1mm)置于缺损内。缝合覆盖的皮肤，让大鼠恢复4至8周。在每个时间点采集样本并进行计算机断层扫描(CT扫描)、种植体脱位力学测试和组织学检查。
本项研究分2波进行。在第一波(从CD0到CD20)中，将苹果和胡萝卜用作脱细胞植物组织的来源，但只有苹果来源的植入物进一步测试了组织学、CT扫描和植入物脱位(见下文)。在第二波(从4WCH1到8WME3，见标签部分)中，苹果来源的生物材料用200μm针头间隔500μm以网格状图案穿孔，以增强整个支架的扩散和细胞迁移。此处显示的数据是从第2波中的动物获得的。
由于在测试条件下胡萝卜来源的细胞浸润可能缺乏或减少，因此在当前的骨相关应用中没有选择胡萝卜作为最佳候选者。如图20所示，与苹果对应物(苹果和胡萝卜的联锁复合物(SSC)，在皮下植入大鼠4周时间)相比，细胞侵袭相当差。似乎支架的微观结构(孔径、孔互连性和孔几何形状)可能在细胞浸润中起作用，苹果具有更有利的特性。例如，苹果托杯组织可以提供类似于骨小梁的微结构。因此，具有相似结构的组织可能是骨再生应用的绝佳候选者。也就是说，具有相互连孔且孔径在约100-200μm范围内的植物来源的支架可能是此类应用的最佳选择。
标签：
Figure BDA0003693237360000571
Figure BDA0003693237360000581
结果：
图12显示了在4周(A)和8周(B)时，植入的(带穿孔的生物材料)临界尺寸缺损的三维渲染。
图13显示了相对于缺损内总体积的骨体积分数。通过在CT扫描切片中拟合与缺损大致相同尺寸的圆柱体来获得圆柱体体积ROI。4周时间点N＝6个缺损(3只动物)且8周时间点N＝6个缺损(3只动物)。
图14显示了脱位实验。(A)中示出了典型力-距离曲线。脱位被视为力-距离图中的近似最大力(红色箭头)。(B)中示出了带试样的推出装置。
图16显示了植入4周后的组织学切片(4WCH2)。(A)中示出了苏木精和伊红，(B)中示出了Von Kossa/Van Gieson，并且(C)中示出了马松戈尔德纳三色。(A)、(B)和(C)的比例尺＝2mm。
图17显示了植入8周后的组织学切片(8WCH1)。(A)中示出了苏木精和伊红，(B)中示出了Von Kossa/Van Gieson，并且(C)中示出了马松戈尔德纳三色。(A)、(B)和(C)的比例尺＝2mm。
图18显示了大鼠临界尺寸颅盖骨缺损模型中的植入。(A)示出了穿孔的5mm直径x1mm厚度的生物材料。(B)示出了将生物材料植入双侧缺损中。在左侧，植入了生物材料，空缺损在右侧。
图19显示了植入8周后的组织切除。颅骨完全切除前如(A)所示。(B)中示出了切除的颅盖骨的顶视图。(C)中示出了切除的颅盖骨的底视图。
图20A-D显示了苹果和胡萝卜的联锁复合材料(SCC)。
在表征了苹果源性支架的结构和机械性能以及在体外支持前成骨细胞分化的性能之后(进一步详情参见实施例1)，进行这项研究以研究这种支架在体内的表现如何[33]。采用常用的大鼠颅盖骨缺损模型来研究支架与骨骼的整合程度如何。对Sprague-Dawley大鼠进行开颅手术。在两个顶骨中产生了双侧5mm缺损，并在缺损中植入裸的、无细胞的、苹果来源的纤维素支架(图18A、B)。植入物被放置八周且在安乐死后，取出颅骨顶部并进行组织学处理或机械评估。
八周后，通过目视检查，支架似乎已经被颅骨周围的组织很好地浸润。因此，为了定量测量支架与骨组织的结合程度，进行了机械推出测试。在动物安乐死后，使用单轴压缩装置立即评估移植植入物的测量值(图14B)。简而言之，将活塞推向支架，并且用称重传感器测量逐出植入物所需的力。结果表明，在本项研究中，将植入物从周围骨骼中脱位所需的平均力为114±28N。最后，使用组织学切片和染色来评估在动物中八周后植入移植物中的细胞浸润和细胞外基质沉积(图15)。H&E染色显示了植入物孔内的细胞浸润。支架内也有血管化的形态学迹象，与我们之前的动物研究一致[15]、[16]。GTC染色显示了植入物内大量存在1型胶原蛋白。总之，这些结果支持将这些支架用于骨组织工程应用。
方法：
图20所示支架的支架生产通常如上文实施例中所述进行，并且使用CNC铣床切割出形状。简而言之，将麦金托什红苹果(加拿大花式)被切割成两个平行的平面。使用Carbide 3D Shapeoko 3CNC机床和Chilipeppr jpadie软件来将苹果切割成挂钩(5mm x5mm x 2mm，从中心延伸出2mm挂钩)和孔洞(5mm x 5mm x 2mm，在中心具有2mm直径孔洞)乐高积木。使用直径0.8mm的钻头和180°角以1mm/s的速度切割支架。子单元是使用Inkscape设计的，并使用Jscut转换为gcode。通过在设置为适当厚度的曼陀林切片机上翻转和切片，从大块苹果组织中取出样品(挂钩4mm且孔洞2mm)。将样品转移到0.1％SDS溶液中并在以180RPM摇动的同时脱细胞72小时。脱细胞后，样品用dH2O洗涤3次。接下来，将亚单元在室温下在100mM CaCl2中温育24小时以去除任何表面活性剂残留物。样品用dH2O洗涤3次以去除盐残留物，然后用70％乙醇温育灭菌。去除乙醇后，用dH2O洗涤3次，得到无污染物的无菌支架。对于应力屏蔽实验，将胡萝卜切成如上所述的孔洞亚元形状。
将支架皮下植入大鼠(N＝1只大鼠)背部上的三个不同区域。4周后取出植入物并进行组织切片和染色处理。组织学染色如图19所示。
实施例5——用于成骨细胞分化的、在脱细胞苹果周围浇铸了透明质酸和海藻酸盐的复合支架
本研究表明，组合有透明质酸凝胶或海藻酸盐凝胶的脱细胞苹果支架是适合成骨细胞培养的生物材料。完成了MC3T3 E1亚克隆4前成骨细胞的分化。检测了钙沉积和碱性磷酸酶活性。
生物材料配方
对于本项研究，用于细胞培养的复合支架使用如本文所述的脱细胞AA(苹果)材料制成。脱细胞过程始于将麦金托什苹果切成1mm厚的切片和去皮；然后将这些切片在0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)中温育3天，每天将温育溶液更换为新鲜的SDS。SDS温育第三天后，AA切片用蒸馏水洗涤3次，并在0.1M氯化钙(CaCl2)中温育1天。次日，切片用水清洗3次，并在70％乙醇(EtOH)中温育30分钟进行灭菌。灭菌后，AA切片再水洗3次，保存在蒸馏水中。然后使用无菌的4mm活检打孔器从脱细胞AA切片中戳出圆形圆盘(pucks)，制作用于细胞培养的支架。将样品储存在～4℃冰箱中的适当细胞培养基(即α-MEM)中，直到用于细胞接种。
对于这些AA复合支架上的细胞培养，制备了两种不同的水凝胶，用于在细胞接种前将MC3T3细胞重新悬浮在其中：透明质酸(HA)和海藻酸盐。对于HA水凝胶圆盘，使用Advanced BioMatrix HyStem试剂盒预先制备HA溶液。对于海藻酸盐水凝胶圆盘，预先制备0.5％海藻酸盐溶液(基于盐水和高压灭菌)并且在细胞培养前加热至37℃；将细胞重新悬浮在海藻酸盐溶液中并接种到圆盘上后，然后加入0.1M CaCl2对凝胶进行化学交联。
细胞培养
在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素(分别为100U/mL和100μg/mL)的MEM-α中培养MC 3T3 E1亚克隆4前造骨细胞。为了引起前成骨细胞分化，添加4mM无机磷酸盐(Sigma)和50μg/mL乙酸(Sigma)。对于继代培养，将细胞培养板上培养的细胞胰蛋白酶消化并重新悬浮在适当的培养基中。对细胞进行计数并离心以将细胞与胰蛋白酶和培养基分离。吸出上清液，将细胞重悬于合适的培养基中。在第1天和第7天将2.5x104个细胞接种到支架上。允许细胞增殖并侵入支架2周，然后再更换为分化培养基2周。培养基每两天更换一次。
固定、染色和成像
碱性磷酸酶染色：
在固定之前，用PBS清洗支架。然后用3.5％多聚甲醛将它们固定90秒，然后用洗涤缓冲液(即PBS中的0.05％Tween)洗涤。使用BCIP-NBT SigmaFastTM片剂；将每片剂溶解在10mL dH2O中。BCIP浓度为0.15mg/mL，NBT浓度为0.3mg/mL，Tris buffer浓度为100mM，MgCl2浓度为5mM，并且pH为9.25至9.75。在染色过程中，将样品保持在黑暗中并进行监测。染色完成后(5-10分钟)，清洗样品并拍照。染色和成像在制作染色溶液后一小时内完成。
茜素红S染色：
染色前，样品按上述方法固定，不同之处在于固定过程的持续时间为1小时。然后用PBS洗涤生物材料。使用预制的Millipore Sigma茜素红S染色剂在pH 4.1±0.1下进行钙染色。将样品浸没在染色剂中并温育45分钟。钙染色后，用dH2O彻底清洗样品，直到颜色不再从样品中消失。不久后对样品成像。
结果
茜素红S：
样品为脱细胞苹果支架与透明质酸(HyStem剂剂盒)或用CaCl2交联的海藻酸盐的复合材料。
简而言之，将细胞固定并用PBS洗涤。加入茜素红S以完全覆盖样品(pH 4.2)，45分钟。然后去除染色剂，并且用蒸馏水轻轻但彻底地洗涤样品，直到颜色停止变化。
被染色的样品为预分化的海藻酸盐和透明质酸材料以及分化的材料。强烈的红色表明钙沉积。两种分化的样品在染色后都呈现出这种颜色。对照透明质酸样品并非如此。对照海藻酸盐样品显示中间红色，因为钙是水凝胶中的交联剂。然而，海藻酸盐对照没有分化样品那么暗，这表明发生了由于分化引起的矿化钙沉积。
图21示出了载MC3T3 E1细胞的复合材料中钙沉积的茜素红S染色。从左到右：透明质酸和脱细胞苹果(预分化)，海藻酸盐和脱细胞苹果(预分化)，透明质酸和脱细胞苹果(分化后)，海藻酸盐和脱细胞苹果(分化后)。
碱性磷酸酶：
碱性磷酸酶测定使用较短的固定时间以防止酶活性丧失。样品用3.5％多聚甲醛固定90秒，然后用PBS中的0.05％Tween洗涤。将BCIP-NBT SigmaFastTM片剂溶解于dH2O以创建即用型染色溶液。紫色表明碱性磷酸酶活性，在这种情况下，其是成骨细胞分化的标志物。
被染色的样品是预分化的海藻酸盐和透明质酸材料以及分化的材料。两种分化的样品在染色后均呈现紫色。对照透明质酸和海藻酸盐样品并非如此。
图22显示了装载MC3T3 E1细胞的复合材料中用BCIP NBT SigmaFastTM片剂进行的碱性磷酸酶染色。从左到右：透明质酸和脱细胞苹果(预分化)，海藻酸盐和脱细胞苹果(预分化)，透明质酸和脱细胞苹果(分化后)，海藻酸盐和脱细胞苹果(分化后)。
基于收集的结果，预测分化样品的硬度大于未分化样品。事实上，图27提供了结果，显示与透明质酸凝胶或海藻酸盐凝胶组合的脱细胞苹果支架是适合成骨细胞培养的生物材料。完成了MC3T3 E1亚克隆4前成骨细胞的分化。检测到钙沉积和碱性磷酸酶活性，并且获得了增加的硬度。机械测试：由应力-应变曲线的线性区域计算得出杨氏模量。凝胶类型之间没有统计学上的显著差异，并且双向ANOVA(p＝0.05)中也没有任何静态显著的相互作用。但是，对照和分化样品之间存在显著差异(p＝8.9x10-4)。由于不均匀的初始接触面积和材料的复合性质，在应力-应变曲线的开始处存在脚趾区域。分析是在这个脚趾区域之后进行的。图27显示了不具有细胞(对照)和具有分化后的细胞(Diff)的、具有透明质酸(HA)或海藻酸盐水凝胶的脱细胞AA(苹果)的杨氏模量。对照样品和分化样品的杨氏模量的描述性统计如下：
Figure BDA0003693237360000631
上述结果与图27中的结果显示，由脱细胞苹果和围绕该材料浇铸的水凝胶(本实施例中的透明质酸或海藻酸盐)制成的复合材料，可作为成骨细胞分化和骨组织工程的可行支架。
本研究的结果支持：由脱细胞支架(如本文所述源自苹果的那些)和围绕该材料浇铸的水凝胶(本实施例中的透明质酸或海藻酸盐)制成的复合材料，可作为成骨细胞分化和骨组织工程的可行支架。
实施例6——静水压缩对骨组织工程用天然纤维素支架的影响
受伤或断裂时，骨骼具有自我更新的能力。然而，由损伤或疾病造成的大缺损可能需要移植物放置以避免骨组织不愈合或畸形愈合[39]。这种移植物可以来自患者自己的身体(自体移植物)，通常是髂嵴，被认为是再生骨科的“黄金标准”[40]–[43]。然而，有限的移植物尺寸、供体部位的发病率和感染、成本以及供体和受体部位的术后疼痛可能导致移植物的替代来源[41]、[42]：来自尸体供体(同种异体移植)、来自动物来源(异种移植)或人工来源(异质成形的)。这些替代物都有其自身的优点和缺点，但后者可以提供一种潜在的替代物，降低传播疾病和感染的风险，并克服尺寸限制障碍[41]、[42]。异质成形的移植物也被认为比同种异体移植物和异种移植物更符合伦理[44]。物理性质是异质成形的移植物发展的关键参数，例如孔径、孔互连性和弹性模量[43]、[45]、[46]。微调这些参数可能导致更好的机械支撑、植入物的稳定性和/或可能导致改善的骨传导性和骨诱导性。因此，为骨组织工程(BTE)应用设计此类材料可能会受益于根据周围环境进行微调。
长骨是高度动态的结构组织，具有从身体支撑到身体运动的功能。一整套力作用于骨骼系统的不同区域。例如，成年人股骨头中的压力在正常运动时可达5MPa，并且在其他活动时可达18MPa[47]。在微观水平上，这些力通过腔隙-微管网络中的Wnt/β-连环蛋白机械传感途径传递给骨细胞[48]。这种力调节机制导致骨组织的形成和去除，槽骨重塑过程[48]。已经表明，腔隙-微管网络内的压力为约280kPa[49]。正在开发生物反应器以对培养的造骨细胞(及其下方的基材)施加应激，以更好地复制原生骨骼环境。这种生物反应器可以施加接触单轴压缩/拉伸、接触双轴压缩/拉伸、流动诱导剪切应力、机械剪切应力电或这些刺激的组合[50]、[51]。此外，通过在不可压缩培养基上方压缩气相或通过直接压缩培养基来施加静态或循环静水压力的生物反应器可用于接种的细胞[52]–[58]。
除了机械刺激之外，细胞的三维培养对于更好地表现体内条件也是可取的。三维结构可以支持细胞的生长和增殖，并且可以模拟在特定组织中发现的细胞外基质。使用特定的面向组织的支架结构(或生物材料)和适当应用的机械刺激，预期可以实现更好的骨整合和体内整体性能。源自植物的纤维素基支架可用作组织工程支架[59]–[61]。这些生物材料可以来自与要复制的组织的微观结构密切匹配的植物[61]。成功的体外和体内实验表明，这些生物材料可以容纳多种细胞类型，具有生物相容性并支持活跃的血管生成[59]–[61]。可以通过分化的成骨细胞将支架矿化[62]。此外，一些支架可以通过浸泡在模拟体液中进行人工矿化[63]。
在本项研究中，检查了增加的大气压力(通过施加的循环静水压力)对在苹果源性3D支架生物材料上培养的前成骨细胞分化能力的影响。每天将细胞暴露于循环压力循环(最大280kPa，1Hz)一小时，总共两周。结果大体表明，在成骨培养基中，细胞压力循环导致细胞数量、碱性磷酸酶(分化标志物)活性和矿化随时间增加。
材料和方法
支架制造
样品按照本文所述的协议制备。简而言之，用曼陀林切片机将麦金托什苹果(加拿大花式)切成1mm厚的切片。使用活检打孔器(Fisher)在苹果切片的托杯组织中制作5mm直径的圆盘。将圆盘在0.1％十二烷基硫酸钠溶液(SDS,Fisher Scientific,Fair Lawn,NJ)中脱细胞两天。然后，在去离子水中轻轻洗涤脱细胞圆盘，然后在100mM CaCl2中温育两天。将样品用70％乙醇灭菌30分钟，在去离子水中轻轻洗涤，并在细胞接种前置于96孔培养板中。
在95％空气和5％CO2的加湿气氛中在37℃下培养并维持MC3T3-E1亚克隆4细胞(
Figure BDA0003693237360000651
CRL-2593TM,Manassas,VA)[64]。在补充有10％胎牛血清(FBS,HycloneLaboratories Inc.,Logan,UT)和1％青霉素/链霉素(Hyclone Laboratories Inc)的最低基本培养基(α-MEM,ThermoFisher,Waltham,MA)中培养细胞。将细胞胰蛋白酶化并悬浮在培养基中。将支架分别放置在96孔板中。在细胞接种之前，将支架浸入培养基中并在95％空气和5％CO2的加湿气氛中在37℃下温育30分钟。培养基完全从孔中吸出。将细胞胰蛋白酶化并且悬浮，向每个支架移液30μL含有5·104个细胞的细胞培养悬液滴。在向培养孔中加入200μL培养基之前，让细胞在支架上粘附2小时。培养基每3-4天更换一次，持续1周。然后，在施加或不施加静水压力(HP)的条件下，通过向培养基中添加50μg/mL抗坏血酸和10mMβ-甘油磷酸酯在成骨培养基(OM)中温育细胞接种的支架，或在培养基(CM)中温育2周。
循环静水压力刺激
通过在定制压力室中调节培养孔上方的气相压力来施加循环静水压力(图23,A)。简而言之，使用压缩机(Mastercraft)压缩加湿的95％空气和5％CO2温育箱气氛，并使用电磁阀将其注入压力室。使用微控制器(Particle Photon)通过定制的手机应用程序远程控制施加压力的频率和持续时间。在每天1小时的期间施加循环静水压力刺激长达两周(图23)，以1Hz频率相对于环境压力在0和280kPa之间振荡。使用压力传感器监测压力。每次循环后将样品从压力室中取出，并在刺激阶段之间保持在环境压力下。
在有和没有成骨培养基存在的情况下，用或不用循环静水压力刺激细胞接种的支架，导致四种实验条件(图23,B)：常规培养基中的循环静水压力(CHP)、成骨培养基中的循环静水压力(CHP-OM)、成骨培养基中的无刺激的(OM)和常规培养基中的无刺激(对照)。将OM和控制条件保持在压力室外，在37℃下加湿的5％CO2温育箱中。
支架成像
1周或2周后，用PBS彻底洗涤支架，并用10％中性缓冲福尔马林固定10分钟。用PBS洗涤支架并在0.01％刚果红染色溶液(Sigma)中在室温下温育20分钟。支架用PBS洗涤3次。细胞核在黑暗中用1:1000Hoechst(ThermoFisher)染色30分钟。样品用PBS洗涤3次，并在成像前保存在洗涤缓冲溶液(PBS中的5％FBS)中。使用配备10X物镜的高速共振激光扫描共聚焦显微镜(Nikon Ti-E A1-R)对支架的细胞接种表面进行成像。将图像切片的最大强度投影用于使用ImageJ软件进行细胞计数[65]。在1.3x1.3mm2的面积上计数细胞(每个实验条件N＝3，每个支架随机选择3个区域)。
碱性磷酸酶活性测定
使用ALP测定试剂盒(BioAssay Systems,Hayward,CA)测量培养基中的碱性磷酸酶(ALP)活性。简而言之，按照制造商的协议，在测定缓冲液中将工作溶液制备成5mM醋酸镁和10mM pNPP浓度。将150μL工作溶液移液到96孔板中。将200μL校准品溶液和200μL dH2O移液到同一96孔板的单独孔中。在第1周和第2周时，将20μL温育培养基(CM或OM)移液到工作溶液孔中。所有孔(样品、校准品和dH2O)在405nm下读取10分钟，每30秒一次。通过取405nm读数与时间的斜率计算ALP活性，用校准溶液和dH2O校准。一式三份读取孔(每个实验条件N＝3)。
茜素红S染色与矿沉积量化
1周或2周后，用10％中性缓冲福尔马林固定样品10分钟。使用既定协议进行钙量化(C.A.Gregory,W.G.Gunn,A.Peister,and D.J.Prockop,“An Alizarin red-basedassay of mineralization by adherent cells in culture:Comparison withcetylpyridinium chloride extraction,”Anal.Biochem.,vol.329,no.1,pp.77–84,Jun.2004，其全部内容通过引用并入本文，[66])。简而言之，将样品转移到24孔板中，用去离子水仔细洗涤，并在室温下在1mL 40mM(pH＝4.1)茜素红s(ARS)溶液中轻轻搅拌，温育20分钟。然后将样品用去离子水洗涤3次，并放入装有10mL dH2O的15mL falcon管中。将试管置于120rpm的旋转振荡器上60分钟，并且每15分钟更换一次dH2O。此后，将样品在800μL10％乙酸中在60rpm的轨道振荡器上温育30分钟。将洗脱的ARS/乙酸溶液从孔中移出并转移到1.5mL离心管中。在17 104g下将管离心15分钟。将500μL上清液转移到新的离心管中，并且将200μL 10％氢氧化铵移入管中。最后，将150μL溶液移入96孔板中，并使用读板器读取在405下的吸收。一式三份读取孔(每个实验条件N＝3)。
杨氏模量测量
按照先前描述的方法[61]，使用定制的单轴压缩装置对支架进行杨氏模量测量。简而言之，在1周或2周后，支架以3mm min-1的速率机械压缩至10％的最大应变。用500g称重传感器(Honeywell,Charlotte,NC)和光学尺(Honeywell)记录力-位移曲线。通过拟合所得应力-应变曲线的线性部分得到不同实验条件下支架的杨氏模量。
统计分析
本实施例中报告的值是平均值±平均值的标准误差(SEM)。使用单向ANOVA和事后Tukey检验确定统计显著性。p<0.05的值被认为具有统计显著性。
结果
图23显示了(A)循环静水压力装置示意图。通过调节定制压力室中培养孔上方的气相压力来施加静水压力。来自培养箱气氛的空气使用压缩机压缩并使用电磁阀注入压力室。(B)显示了实验条件。增殖1周后，每天1小时期间施加循环静水压力刺激，持续2周，以1Hz频率相对于环境压力在0和280kPa之间振荡。每次循环后将样品从压力室中取出，并在刺激阶段之间保持在环境压力下。
图24显示了在1周或2周刺激后的细胞密度。使用单向ANOVA和Tukey事后检测确定统计学显著性(*指示p<0.05)。数据表示为每种条件下三个重复样品的平均值±S.E.M.，每个样品三个区域。结果显示，与对照相比，在培养2周后，在经历循环压力负荷的支架上存在的细胞显著更多。
图25显示了在1周或2周刺激后的碱性磷酸酶(ALP)活性。使用单向ANOVA和Tukey事后检测确定统计学显著性(*指示p<0.05)。数据表示为每种条件下三个重复样品的平均值±S.E.M.。结果显示，与对照相比，在培养2周后，在经历循环压力负荷的支架上的细胞中存在显著的ALP活性(分化的标志物)。
图26显示了在1周或2周刺激后使用茜素红S(ARS)染色的矿物沉积量化。使用单向ANOVA和Tukey事后检测确定统计学显著性(*指示p<0.05)。数据表示为每种条件下三个重复样品的平均值±S.E.M.。结果显示，与对照相比，在培养2周后，经历循环压力负荷的支架的矿化更加显著。
支架成像和细胞计数：
对共聚焦切片的最大投影进行细胞计数(图28，24)。数据显示(图28，24)，在经受静水压力1周后，在OM中温育的支架中的细胞密度与在CM中相比有显著增加(分别为723±80个细胞/mm2和353±71个细胞/mm2；p＝0.02)，但在刺激2周后显示出非显著增加(分别为611±149个细胞/mm2和350±71个细胞/mm2；p＝0.23)。在静态情况下，在OM中温育的支架中的细胞密度与在CM中的相比未观察到显著增加，1周刺激(分别为125±27个细胞/mm2和88±16个细胞/mm2；p＝0.99)和2周刺激(分别为291±52个细胞/mm2和221±50个细胞/mm2；p＝0.99)。在刺激1周后，在OM中温育的支架，静水压力的应用与静态情况相比显著增加了细胞密度(分别为723±80个细胞/mm2和125±27个细胞/mm2；p＝10-5)。在类似条件下刺激2周后也观察到增加，但不显著(分别为611±149个细胞/mm2和291±52个细胞/mm2；p＝0.07)。另外，通过在CM中培养的支架中应用HP，观察到细胞密度的非显著增加，1周刺激后(分别为353±71个细胞/mm2和88±16个细胞/mm2；p＝0.21)和2周刺激后(分别为350±71个细胞/mm2和221±50个细胞/mm2；p＝0.92)。在各自的实验条件下，对于经受HP的支架，在第一周和第二周之间没有观察到细胞密度的显著变化(OM-HP支架，723±80个细胞/mm2和611±149个细胞/mm2；p＝0.96；CTRL-HP支架，353±71个细胞/mm2和350±71个细胞/mm2；p＝1)。最后，对于在静态情况下的支架，在第一周和第二周之间没有观察到细胞密度的显著变化(CM-HP支架，125±27个细胞/mm2和291±52个细胞/mm2；p＝1；CM-CTRL支架，88±16个细胞/mm2和221±50个细胞/mm2；p＝0.91)。
碱性磷酸酶活性测定：
在1或2周后，按照制造商的协议，通过pnpp动力学反应评估碱性磷酸酶活性(图25)。在成骨培养基中培养，在施加静水压力的支架中观察到ALP活性与与静态情况相比有显著增加，1周刺激后(分别为0.245±0.003IU/L和0.189±0.002IU/L；p＝4x10-8)和2周刺激后(分别为0.214±0.002IU/L和0.159±0.002IU/L；p＝4x10-8)。另外，静水压力的施用也显著增加了培养基中的ALP活性，1周后(分别为0.203±0.001IU/L和0.195±0.001IU/L；p＝0.03)和2周后(分别为0.213±0.001IU/L和0.152±0.001IU/L；p＝5x10-8)。在施加静水压力的情况下，在成骨培养基中温育的样品中ALP活性与培养基相比，在1周后有显著增加(分别为0.245±0.003IU/L和0.203±0.001IU/L；p<10-8)，但2周后没有显著差异(分别为0.159±0.002IU/L和0.152±0.001IU/L；p＝0.99)。最后，对于成骨培养基中温育的样品，与培养基相比，在没有静水压力的情况下，ALP没有显着变化，无论是在第1周(分别为0.189±0.002IU/L和0.195±0.001IU/L；p＝0.25)还是在第2周(分别为0.159±0.002IU/L和0.152±0.001IU/L；p＝0.08)。
茜素红s染色和矿物沉积物量化：
在1或2周后进行用于量化矿化的ARS测定(图26)。在1周时，对于分化培养基(HP与CTRL，分别为0.73±0.03a.u.和0.55±0.02a.u.；p＝2x10-7)或培养基(HP与CTRL，分别为0.59±0.03a.u.和0.42±0.02a.u.；p＝1x10-6)，静水压力的应用显著增加了矿物沉积量。在分化培养基(HP与CTRL，分别为0.68±0.01a.u.和0.22±0.02a.u.；p＝2x10-8)和培养基(HP与CTRL，分别为0.69±0.02a.u.和0.17±0.02a.u.；p＝2x10-8)中温育2周后，矿物沉积量也显著增加。在1周时，在成骨培养基中温育与培养基相比也显著增加了矿物沉积，静水压力下的样品(OM与CM，0.73±0.03a.u.和0.59±0.03a.u.；p＝2x10-4)和非压缩实验(OM与CM，0.55±0.02a.u.和0.42±0.02a.u.；p＝10-3)。在2周时，通过在成骨培养基中温育与培养基相比未观察到矿物沉积的显著变化，静水压力下的样品(OM与CM，0.68±0.01a.u.和0.69±0.02a.u.；p＝0.99)和非压缩实验(OM与CM，0.22±0.02a.u.和0.17±0.02a.u.；p＝0.75)。
杨氏模量测量：
刺激1周或2周后，评估了支架的杨氏模量变化(图29)。数据显示，在施加静水压力和不施加静水压力的条件下，成骨培养基中温育的样品之间没有显著变化1周后(HP与CTRL，0.016±0.002MPa和0.017±0.003MPa；p＝0.99)或2周后(HP与CTRL，0.014±0.001MPa和0.019±0.001MPa；p＝0.85)。此外，在施加静水压力或不施加静水压力的条件下，在培养基中温育的样品中未观察到杨氏模量的显著变化，在实验1周后(HP与CTRL，0.014±0.002MPa和0.014±0.001MPa；p＝1)或2周后(HP与CTRL，0.020±0.002MPa和0.014±0.005MPa；p＝0.64)。此外，在施加静水压力下在成骨培养基和培养基中的样品之间没有观察到杨氏模量的显著变化，在1周时(OM与CM，0.016±0.002MPa和0.014±0.002MPa；p＝0.99)或2周后(OM与CM，0.014±0.001MPa和0.020±0.002MPa；p＝0.6)。类似地，在大气压下的在成骨培养基和培养基中的样品之间没有观察到杨氏模量的显著变化，在1周时(OM与CM，0.017±0.003MPa和0.014±0.001MPa；p＝0.98)或2周后(OM与CM，0.019±0.001MPa和0.014±0.005MPa；p＝0.88)。
讨论
物理环境的密切表现对于骨组织恢复是可取的[41]-[43]、[45]、[46]。类似地，周围骨组织的紧密匹配可能是异质成形移植成功的关键因素[45],[46]。源自与物理环境密切匹配的植物组织的纤维素生物材料已在体外和体内靶向组织工程中显示出可喜的结果[59]-[61]。在本实施例中，通过复制人类运动的机械环境来研究生物材料。以类似人类运动的频率(1Hz)以类似大小的腔隙-微管网络在支架上施加外部压力[49]、[52]。支架接种有前成骨细胞(MC3T3-E1)。增殖后，支架要么在标准培养基(CM)中培养，要么在成骨诱导分化培养基(OM)中培养。然后使这些支架承受循环静水压力(HP)或保持在大气压(CTRL)下1或2周。施加的HP设置为1Hz，每天1小时，然后是在大气压下的休息期。使用类似细胞系[57]、[67]、人类或动物骨髓骨骼干细胞(BMSC)[54]、[55]、[58]或离体小鸡股骨[52]的其他组报告了循环HP对2D表面、随机或对齐PCL网格或离体骨骼的影响。本实施例测量了HP对接种有MC3T3-E1细胞的天然纤维素支架的影响。通过激光扫描共聚焦显微镜细胞计数显示，在成骨培养基中应用HP1周和(不显著；p＝0.07)2周后，细胞密度显著增加。在培养基中应用HP 1周和2周后也注意到了增加，但也是非显著的。这些结果表明，当在OM中培养时，HP的应用增强了MC3T3-E1增殖。这一结果得到了其他研究的证实[54]、[55]。使用类似的机械刺激(270kPa；1Hz刺激，每天1小时，2周内5天)，Reinwald et al.,2018表明与未刺激的样品相比，人类BMSC代谢活性上调[54]。Zhao et al.,2015表明，对大鼠BMSC应用静水压力通过上调细胞周期启动，加速了细胞增殖[55]。类似地，Stavenschi et al.,2018报道，MC3T3-E1细胞的物理刺激诱导了旁分泌因子的表达，导致细胞增殖增强[58]。因此，物理刺激会影响三维支架中细胞的增殖。与CM样品相比，在1周的HP后，OM样品中细胞密度显著增加，但在HP中2周后的增加不显著，说明了温育培养基的性质影响细胞密度。对于非刺激样品，在1周和2周后观察到OM和CM之间的非显著增加。Quarles et al.,1992也报告了在含有抗坏血酸和β-甘油磷酸酯的培养基中培养的MC3T3细胞数目的时间依赖性显著增加[64]。此外，还报告了复制率的时间依赖性下降[64]。Hong et al.,2010报告了与培养基相比，在类似的成骨培养基中温育的MC3T3-E1细胞显著减少，并且在培养2周时没有显著差异[68]。本实施例中的发现进一步表明，HP的应用会影响在OM中培养的样品在刺激早期阶段的复制率。碱性磷酸酶是一种在成骨细胞分化早期表达的酶[69]。目前的结果表明，与静态情况相比，循环静水压力的应用显著增加了细胞接种支架的ALP活性。通过在成骨诱导分化培养基中温育支架也注意到了ALP活性的显著增加，类似于2D培养系统的报告[64]、[68]。在两种类型的温育培养基中，HP的应用在刺激1周和2周后显著增加了支架中的矿物含量。Stavenschi 2018et al.表明，在人类BMSC上2Hz频率的循环300kPa压力促进了显著的矿物沉积[58]。Henstock et al.,2013以类似的静水压力应用也注意到离体骨样品中矿物沉积的增加[52]。此外，成骨培养基中的温育增加了支架中的矿物含量，这与其他系统中的其他研究一致[64]、[68]。除了ALP表达，矿物含量表达进一步证实了MC3T3-E1持续向成骨细胞分化，无论是通过应用HP、化学(在OM中诱导)还是两者的组合。最后，动态力学分析显示，所有实验条件之间以及实验的第一周和第二周之间的杨氏模量没有显著变化。用MC3T3-E1接种的类似支架的杨氏模量显示，在成骨培养基中温育的支架的值比这里(OM-HP和OM-CTRL)的支架远更高。在成骨培养基中温育的持续时间和初始接种密度不同，这可以解释值之间的差异。
在本实施例检查中，检查了增加的大气压对在苹果源性3D支架生物材料上培养的前成骨细胞的分化能力的影响。每天将细胞暴露于循环压力循环(最大280kPa，1Hz)一小时，总共两周。结果表明，静水压力的应用与成骨诱导培养基相结合导致细胞数量、碱性磷酸酶(分化标标志物)活性和矿化随时间增加。
已经通过实施例描述了一个或多个说明性实施方式。本领域技术人员将理解的是，在不脱离如权利要求书所限定的本发明范围的情况下，可以进行多种变化和修改。
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此处和说明书其他地方引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文。

Claims (80)

1.一种支架生物材料，包含：
从其中去除了组织的细胞物质和核酸的脱细胞植物或真菌组织，所述脱细胞植物或真菌组织包含3维多孔结构；和
基于蛋白质的水凝胶、基于多糖的水凝胶、或两者。
2.根据权利要求1所述的支架生物材料，其中所述基于蛋白质的水凝胶包含胶原蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、骨形态生成蛋白、其他基质蛋白、或它们的任何组合；所述基于多糖的水凝胶包含琼脂糖、海藻酸盐、透明质酸、或另一种碳水化合物或它们的组合；或两者。
3.根据权利要求1或2所述的支架生物材料，其中所述基于蛋白质的水凝胶包含胶原蛋白水凝胶。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的支架生物材料，其中所述基于蛋白质的水凝胶包含胶原蛋白I。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的支架生物材料，其中所述脱细胞植物或真菌组织包含约100至约200μm或约150至约200μm的孔径。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的支架生物材料，其中所述脱细胞植物或真菌组织包括脱细胞苹果托杯组织。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的支架生物材料，其中所述支架生物材料进一步包含一种或多种骨相关细胞类型，诸如前成骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、间充质干细胞、分化的骨和/或颅盖组织细胞、或它们的任何组合。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的支架生物材料，具有在约20kPa至约1MPa之间的杨氏模量。
9.根据权利要求7所述的支架生物材料，其中所述脱细胞植物或真菌组织的孔壁被成骨细胞矿化。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的支架生物材料，其中所述脱细胞植物或真菌组织至少部分地被包被或矿化。
11.根据权利要求10所述的支架生物材料，其中所述脱细胞植物或真菌组织至少部分地被磷灰石、磷酸骨钙、生物相容性陶瓷、生物相容性玻璃、生物相容性金属纳米颗粒、纳米晶纤维素、或它们的任何组合包被或矿化。
12.根据权利要求10或11所述的支架生物材料，其中所述脱细胞植物或真菌组织至少部分地被磷灰石包被或矿化。
13.根据权利要求12所述的支架生物材料，其中所述磷灰石包括羟基磷灰石。
14.一种支架生物材料，包含：
从其中去除了组织的细胞物质和核酸的脱细胞植物或真菌组织，所述脱细胞植物或真菌组织包含3维多孔结构；
所述脱细胞植物或真菌组织至少部分地被包被或矿化。
15.根据权利要求14所述的支架生物材料，其中所述脱细胞植物或真菌组织至少部分地被磷灰石、磷酸骨钙、生物相容性陶瓷、生物相容性玻璃、生物相容性金属纳米颗粒、纳米晶纤维素、或它们的任何组合包被或矿化。
16.根据权利要求14或15所述的支架生物材料，其中所述脱细胞植物或真菌组织至少部分地被磷灰石包被或矿化。
17.根据权利要求16所述的支架生物材料，其中所述磷灰石包括羟基磷灰石。
18.根据权利要求14-17中任一项所述的支架生物材料，其中所述脱细胞植物或真菌组织包括苹果。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的支架生物材料，其中所述脱细胞植物或真菌组织通过交替暴露于氯化钙溶液和磷酸二钠溶液而至少部分地被磷灰石包被或矿化。
20.根据权利要求14-19中任一项所述的支架生物材料，其中所述支架生物材料进一步包含基于蛋白质的水凝胶、基于多糖的水凝胶、或两者。
21.根据权利要求20所述的支架生物材料，其中所述基于蛋白质的水凝胶包含胶原蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、骨形态生成蛋白、其他基质蛋白、或它们的任何组合；所述基于多糖的水凝胶包含琼脂糖、海藻酸盐、透明质酸、或另一种碳水化合物或它们的组合；或两者。
22.根据权利要求20或21所述的支架生物材料，其中所述基于蛋白质的水凝胶包含胶原蛋白水凝胶。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的支架生物材料，其中所述基于蛋白质的水凝胶包含胶原蛋白I。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的支架生物材料，其中所述脱细胞植物或真菌组织是基于纤维素的、基于甲壳素的、基于壳聚糖的、基于木质素的、基于半纤维素的、或基于果胶的、或它们的任何组合。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的支架生物材料，其中所述植物或真菌组织包括来自以下的组织：苹果托杯(苹果)组织、蕨类植物(单系蕨类植物)组织、萝卜(芜菁)根组织、银杏树枝组织、马尾草(木贼属)组织、萱草杂交叶片组织、羽衣甘蓝(甘蓝)茎组织、针叶树花旗松(花旗松)组织、仙人掌果实(火龙果)果肉组织、斑纹长春花组织、水生莲花(荷花)组织、郁金香(郁金香)花瓣组织、大蕉(香蕉)组织、花椰菜(甘蓝)茎组织、枫叶(假挪威槭)茎组织、甜菜(甜菜)初生根组织、大葱(玉葱)组织、兰花(兰科)组织、萝卜(芜菁)茎组织、韭葱(象大蒜)组织、枫(槭属)树枝组织、芹菜(芹)组织、大葱(玉葱)茎组织、松组织、芦荟组织、西瓜(栽培西瓜品系)组织、草甸排草(绿金钱草)组织、仙人掌组织、高山剪秋罗组织、大黄(波叶大黄)组织、南瓜果肉(西葫芦)组织、匐地仙人掌(天门冬科)茎组织、蜘蛛草(紫露草)茎组织、芦笋(芦笋)茎组织、蘑菇(真菌)组织、茴香(茴香)组织、玫瑰(蔷薇属)组织、胡萝卜(胡萝卜)组织、或梨(苹果类)组织、或通过直接基因组修饰或通过选择性育种产生的转基因组织、或它们的任何组合。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的支架生物材料，进一步在所述脱细胞植物或真菌组织上和/或内包含活细胞，特别是非原生细胞。
27.根据权利要求26所述的支架生物材料，其中所述活细胞是动物细胞。
28.根据权利要求27所述的支架生物材料，其中所述活细胞是哺乳动物细胞。
29.根据权利要求28所述的支架生物材料，其中所述活细胞是人类细胞。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的支架生物材料，包含胶合、交联或联锁在一起的两个或更多个亚单元。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的支架生物材料，其中所述脱细胞植物或真菌组织包含来源于不同组织或不同来源的两种或更多种不同脱细胞植物或真菌组织。
32.根据权利要求31所述的支架生物材料，其中所述两种或更多种不同的脱细胞植物或真菌组织被胶合、交联或联锁在一起。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的支架生物材料，用于骨组织工程。
34.一种包含权利要求1-33中任一项所述的支架生物材料的骨移植物。
35.权利要求1-32中任一项所述的支架生物材料用于骨组织工程、用于骨移植、用于修复或再生骨骼、用于成骨细胞分化、或它们的任何组合的用途。
36.权利要求1-32中任一项所述的支架生物材料用于以下任何一种或多种的用途：颅面重建手术；牙科和/或颌面重建手术；主要骨缺损和/或创伤重建；骨填料应用；植入物稳定；和/或药物递送；或它们的任何组合。
37.权利要求1-32中任一项所述的支架生物材料用于牙科骨填料应用中的用途。
38.权利要求1-32中任一项所述的支架生物材料作为大型植入物用应力屏蔽减压器的用途。
39.权利要求1-32中任一项所述的支架生物材料用于以下的用途：促进活跃成骨；植入以修复关键和/或非关键尺寸缺损；在骨修复过程中提供机械支撑；在长骨、颅骨、颌面骨、牙齿和/或颌骨的损失或损伤中替代；畸齿矫正和/或牙周移植物诸如牙槽嵴增大、牙齿脱落、牙齿植入和/或重建手术；移植在特定部位以增大由骨质疏松症造成的损失、由于年龄、先前的植入物和/或受伤导致的骨质流失所致的骨体积；或改善骨-植入物组织整合；或它们的任何组合。
40.一种用于以下的方法：工程化骨组织；骨移植；修复或再生骨骼；颅面重建手术；牙科和/或颌面重建手术；主要骨缺损和/或创伤重建；牙科或其他骨填料应用；植入物稳定；大型植入物的应力屏蔽；促进活跃成骨；修复关键和/或非关键尺寸缺损；在骨修复过程中提供机械支撑；替代损失或损伤的长骨、颅骨、颌面骨、牙齿和/或颌骨；畸齿矫正和/或牙周移植，诸如牙槽嵴增大、牙齿脱落、牙齿植入和/或重建手术；移植在特定部位以增大由骨质疏松症造成的损失、由于年龄、先前的植入物和/或受伤导致的骨质流失所致的骨体积；改善骨-植入物组织整合；或药物递送；或它们的任何组合，所述方法包括：
提供权利要求1-32中任一项定义的支架生物材料；和
将所述支架生物材料植入到有此需要的受试者的有此需要的部位或区域。
41.一种用于生产支架生物材料的方法，所述方法包括：
提供从其中去除了组织的细胞物质和核酸的脱细胞植物或真菌组织，所述脱细胞植物或真菌组织包含3维多孔结构；和
向所述脱细胞植物或真菌组织中引入基于蛋白质的水凝胶、基于多糖的水凝胶或两者。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述基于蛋白质的水凝胶包含胶原蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、骨形态生成蛋白、其他基质蛋白、或它们的任何组合；所述基于多糖的水凝胶包含琼脂糖、海藻酸盐、透明质酸、或另一种碳水化合物或它们的组合；或两者。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述基于蛋白质的水凝胶包含胶原蛋白水凝胶。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述基于蛋白质的水凝胶包含胶原蛋白I。
45.一种用于生产支架生物材料的方法，所述方法包括：
提供从其中去除了组织的细胞物质和核酸的脱细胞植物或真菌组织，所述脱细胞植物或真菌组织包含3维多孔结构；和
至少部分地包被或矿化所述脱细胞植物或真菌组织。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述脱细胞植物或真菌组织至少部分地被磷灰石、磷酸骨钙、生物相容性陶瓷、生物相容性玻璃、生物相容性金属纳米颗粒、纳米晶纤维素、或它们的任何组合包被或矿化。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述脱细胞植物或真菌组织至少部分地被磷灰石包被或矿化。
48.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述磷灰石包括羟基磷灰石。
49.根据权利要求45-48中任一项所述的方法，其中包被或矿化所述脱细胞植物或真菌组织的步骤包括：使所述脱细胞植物或真菌组织交替暴露于氯化钙溶液和磷酸二钠溶液。
50.根据权利要求45-49中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述支架生物材料引入基于蛋白质的水凝胶、基于多糖的水凝胶、或两者。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述基于蛋白质的水凝胶包含胶原蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、骨形态生成蛋白、其他基质蛋白、或它们的任何组合；所述基于多糖的水凝胶包含琼脂糖、海藻酸盐、透明质酸、或另一种碳水化合物或它们的组合；或两者。
52.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述基于蛋白质的水凝胶包含胶原蛋白水凝胶。
53.根据权利要求50-52中任一项所述的方法，其中所述基于蛋白质的水凝胶包含胶原蛋白I。
54.根据权利要求41-53中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：在所述脱细胞植物或真菌组织上和/或内引入活细胞，特别是非原生细胞。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述活细胞是动物细胞。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述活细胞是哺乳动物细胞。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述活细胞是人类细胞。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述细胞是前成骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、间充质干细胞、分化的骨和/或颅盖组织细胞、或它们的任何组合。
59.一种试剂盒，包含以下中的任何一种或多种：
从其中去除了组织的细胞物质和核酸的脱细胞植物或真菌组织，所述脱细胞植物或真菌组织包含3维多孔结构；
基于蛋白质的水凝胶；
基于多糖的水凝胶；
磷灰石；
氯化钙；
磷酸二钠；
磷酸骨钙；
生物相容性陶瓷；
生物相容性玻璃；
生物相容性金属纳米颗粒；
纳米晶纤维素；
哺乳动物细胞，诸如一种或多种骨相关细胞类型，诸如前成骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、间充质干细胞、分化的骨和/或颅盖组织细胞、或它们的任何组合；
植物或真菌组织、脱细胞试剂、或两者；
缓冲剂；和/或
用于进行权利要求40-58中任一项定义的方法的说明。
60.根据权利要求59所述的试剂盒，其中所述基于蛋白质的水凝胶包含胶原蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、骨形态生成蛋白、其他基质蛋白、或它们的任何组合；所述基于多糖的水凝胶包含琼脂糖、海藻酸盐、透明质酸、或另一种碳水化合物或它们的组合；或两者。
61.根据权利要求59或60所述的试剂盒，其中所述基于蛋白质的水凝胶包含胶原蛋白水凝胶。
62.根据权利要求59-61中任一项所述的试剂盒，其中所述基于蛋白质的水凝胶包含胶原蛋白I。
63.根据权利要求59-62中任一项所述的试剂盒，其中所述磷灰石包括羟基磷灰石。
64.一种将软骨或骨前体细胞分化为软骨或骨组织细胞的方法，所述方法包括：
在分化培养基中在权利要求1-33中任一项定义的支架生物材料上培养所述软骨或骨前体细胞；
其中所述培养包括使培养的细胞暴露于高于环境压力的增加的大气压力下至少一次。
65.根据权利要求1-33中任一项所述的支架生物材料用于将软骨或骨前体细胞分化为软骨或骨组织细胞的用途，其中所述支架生物材料用于在分化培养基中培养所述软骨或骨前体细胞，并且所述培养包括使所述细胞暴露于高于环境压力的增加的大气压力下至少一次。
66.一种将软骨或骨前体细胞分化为软骨或骨组织细胞的方法，所述方法包括：
在分化培养基中在权利要求1-33中任一项定义的支架生物材料上培养所述软骨或骨前体细胞；
其中所述培养包括至少一个处理期，在该处理期期中，使培养的细胞在该处理期的至少一部分中暴露于高于环境压力的增加的大气压力下，其中所述处理期为至少约10分钟的持续时间并且每周进行至少一次；
由此将所述软骨或骨前体细胞分化为软骨或骨组织细胞。
67.根据权利要求66所述的方法，其中在每次暴露于所述增加的大气压力后，将培养的细胞返回到低压或环境压力条件。
68.根据权利要求66或67所述的方法，其中所述处理期包括使所述培养的细胞在低压或环境压力条件与增加的大气压力条件之间交替。
69.根据权利要求66-68中任一项所述的方法，其中所述处理期包括使所述细胞所暴露的大气压力在低压或环境压力与增加的大气压力之间振荡。
70.根据权利要求66-68中任一项所述的方法，其中所述处理期包括以约1-10Hz的频率，使所述细胞暴露的大气压力在低压或环境压力与增加的大气压力之间振荡。
71.根据权利要求66-70中任一项所述的方法，其中所述处理期包括使所述细胞暴露的大气压力在低压或环境压力与增加的大气压力之间振荡，其中所述低压或环境压力为环境压力，诸如约101kPa，并且所述增加的大气压力高于环境压力约+280kPa，诸如约381kPa，并且任选地其中所述振荡的频率为约1-10Hz。
72.根据权利要求66或67所述的方法，其中所述处理期包括使所述培养的细胞暴露于增加的大气压力下持续一段时间。
73.根据权利要求66、67或72中任一项所述的方法，其中所述处理期包括使所述培养的细胞暴露在基本恒定的增加的大气压力下持续一段时间。
74.根据权利要求66-73中任一项所述的方法，其中所述处理期为约1小时或更长的持续时间。
75.根据权利要求66-74中任一项所述的方法，其中所述处理期每天进行一次，或每天进行多于一次。
76.根据权利要求66-75中任一项所述的方法，其中所述培养进行至少约1周。
77.根据权利要求66-76中任一项所述的方法，其中所述培养进行约2周或更长时间。
78.根据权利要求66-77中任一项所述的方法，其中所述增加的大气压以静水压力施加。
79.根据权利要求66-78中任一项所述的方法，其中通过调节所述培养的细胞上方的气相压力来施加所述增加的大气压力。
80.根据权利要求66-79中任一项所述的方法，其中所述增加的大气压力比环境压力高约+280kPa，例如约381kPa。
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