WO2011023531A2 - Zwei- oder dreidimensionales gereinigtes chitingerüst von hornschwämmen, verfahren zu seiner herstellung und verwendung - Google Patents

Zwei- oder dreidimensionales gereinigtes chitingerüst von hornschwämmen, verfahren zu seiner herstellung und verwendung Download PDF

Info

Publication number
WO2011023531A2
WO2011023531A2 PCT/EP2010/061595 EP2010061595W WO2011023531A2 WO 2011023531 A2 WO2011023531 A2 WO 2011023531A2 EP 2010061595 W EP2010061595 W EP 2010061595W WO 2011023531 A2 WO2011023531 A2 WO 2011023531A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
chitin
aplysina
sponges
cells
dimensional
Prior art date
Application number
PCT/EP2010/061595
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2011023531A3 (de
Inventor
Hermann Ehrlich
Eike Brunner
Wiltrud Richter
Micha Ilan
Peter Schupp
Original Assignee
Technische Universität Dresden
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Technische Universität Dresden filed Critical Technische Universität Dresden
Publication of WO2011023531A2 publication Critical patent/WO2011023531A2/de
Publication of WO2011023531A3 publication Critical patent/WO2011023531A3/de

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/20—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3637—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the origin of the biological material other than human or animal, e.g. plant extracts, algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges

Definitions

  • the invention relates to the fields of biology and medicine and relates to a two- or three-dimensional purified Chitingerüst of horny sponges, which can be used for example in wound healing, as bone replacement materials, for filtering purposes or as a carrier material and a method for its preparation and use.
  • the present invention is directed to the extraction of chitin from horny sponges. Specifically, this relates to the extraction of chitin from marine sponges of the type of horn sponges (Demospongia: Pohfera). The invention is also directed to a method of extracting two- and three-dimensional scaffolds formed by the fibrous chitin of sponges.
  • the chitin produced by this method is proposed for use in wound healing, as a tissue replacement and for the deposition of gels and liquids.
  • chitin is one of the most abundant carbohydrates in nature. It usually occurs along with other carbohydrates, proteins and even minerals.
  • chitin As a naturally occurring material, chitin is found in insects, crustaceans / KrNI, benthic marine organisms / diatoms, mollusks and various yeasts and fungi. Chitin is insoluble in water and most other common solvents. This property complicates the process of making chitin fibers, chitin films or other chitin products.
  • Chitin is a carbohydrate poly (N-acetyl-D-glucosamine), and forms, for example, the cell wall of fungi and the hard shell of insects or crustaceans. Recently, it has been found that ⁇ -chitin occurs as a major component in the skeleton of horny sponges (Ehrlich, H. et al .: J. Exp. Zool. (Mol Dev Evol) 308B; 347-356; Ehrlich, H. et al: J. Exp. Zool. (Mol Dev Evol) 308B 473-483).
  • Chitin has hitherto been made from crab, lobster, shrimp, crab, king crab, insect or other shellfish waste, in the form of granules, foils, powders.
  • chitin from sponges resembles the two- or three-dimensional shape of naturally occurring fibrous sponge skeletons.
  • spongine also referred to as fibrous skeleton, pseudokeratin, neurokeratin, horn protein, collagen-like protein, scleroprotein
  • the fibers and filaments of spongy are resistant to bacterial collagenase, pepsin, trypsin, chymotrypsin, pronase, papain, elastase, lysozyme, cellulase and amylase.
  • spongy fibers completely dissolve in 5-20% KOH solution, whereas chitin does not dissolve.
  • chitin and chitosan Numerous potential applications of chitin and chitosan are currently under discussion.
  • the commercial application of chitin and chitosan concludes pharmaceutical and other remedies and aids, such as wound healing products and medical implants, as well as the application in agriculture, in the cosmetics industry, in the food industry, in the textile industry and in water and wastewater treatment processes.
  • Their application brings biocompatibility benefits, with the bioactivity of chitin and chitosan being of particular interest.
  • chitosan prevents the formation of scar tissue by inhibiting the formation of fiber strands in the wound. This property means that chitin and chitosan can be used as sutures, as bandages or for other remedies.
  • chitin and chitosan have properties that other products do not possess.
  • the protein lysozyme which is found in wounds, destroys chitin. Therefore, a suture and a wound dressing can be made which is biodegradable and does not require later removal of the material.
  • the bioactivity of chitin and chitosan is also important for non-medical applications. For example, chitin stimulates microorganisms from the soil to produce enzymes that chitin. These enzymes, for example, act pest-control on roundworms that have chitin as part of their structure. In addition, chitin has been found to stimulate the growth of bacteria in the gut, a property that could be used in the food industry and in the production of cell cultures.
  • shellfish wastes such as shrimp consist of a chitin-containing matrix containing covalently bound proteins.
  • This chitin / protein composite is "filled” with undesirable fine CaCO 3 granules (Roer & Dillamen, Amer. Zool., 24: 893-909; U.S. 4,199,496 B).
  • the size of the "fillings" appears to be characteristic of any crustacean species be and is variable.
  • there is a variable amount of unwanted lipids associated with the skeletal matrix These lipids were first found in the form of lipoprotein membranes, for example in epicuticles.
  • chitin In order to be able to use chitin functionally, it has to be freed from unwanted non-chitin components such as the abovementioned lipids and proteins as well as minerals such as CaCO 3 . Since chitin is insoluble in most solvents except for concentrated acids, the undesirable non-chitin components usually need to be removed from the insoluble chitin matrix with concentrated environmentally damaging acid solutions.
  • Useful sources of chitin are lobster, shrimp and other crustaceans.
  • the chitin extraction from these sources requires the reduction of the chitin particle size to less than 150 microns, less than 50 microns are advantageous. Due to the hard and rather fibrous nature of chitin from these sources of chitin, the grinding processes are complicated and costly. Therefore, the use of mushroom chitin is preferred. It was found that it is not necessary to chitin to separate from the cell material. After sterilization by heat or gas (for example, ethylene oxide), the whole fungal mat obtained by fermentation of the fungi in a nutrient solution can be used to promote wound healing. Nevertheless, the mushroom mat must be treated to obtain pure chitin skeletons. This treatment reduces the possibility of allergic reactions and reduces possible interactions during the healing process with other foreign materials.
  • WO 86006082 a method is known with which chitin and astaxanthin can be obtained from shrimp and KhII. It describes the decomposition of minerals and the removal of the enzymatic proteins.
  • a method for the separation of chitin, protein and astaxanthin and its esters is known from US 5,210,186 B.
  • the method involves extracting crustacean tissue with hot bases, thereby obtaining a base extract and a residue. During cooling, the base extract forms separate layers. Proteins, astaxanthin, carotenoids and astaxanthin. Esters can be separated in this way.
  • the extracted residue contains the chitin.
  • No. 5,053,113 B describes a process for chitin extraction in which chitin and chitosan are obtained by a base treatment of the chitin-containing raw material including an electrochemical process in a NaOH solution.
  • Crustacean waste chitin is obtained by a mechanical process without chemical additives (US 4,293,098 B). For this crustacean waste is dried, ground and separated in an air classifier into two main components, one component containing mainly chitin and the other component mainly proteins and calcium carbonate.
  • a method for the quantitative extraction of natural chitin from biological structures of the Sordaria and / Ascar / s species is based on the use of ozone and neutralized hydrogen peroxide ethylenediaminetetraacetic acid.
  • This reagent allows the extraction of chitin components at neutral pH without cell breakage or substantial fractionation, while maintaining cell wall integrity and structure.
  • the resulting products are essentially free of proteins and enriched chitin is present. The purity depends on the source of chitin. Chitin is obtained in a highly acetylated form.
  • a method of producing mollusc chitin from its shells is known from CN 1462756.
  • the method comprises immersing the worm shells in hydrochloric acid solution and in a NaOH or KOH solution at 90-95 0 C for 3 - 4 h.
  • chitin fibers chitin tubes, chitin bands or chitin filaments.
  • a chitosan matehal is treated in a dilute organic acid such as formic acid or acetic acid.
  • the interaction between the chitosan starting material and the organic acid leads to a chitosium-ion complex.
  • This chitosium ion complex is water-soluble, odorless and non-toxic and requires no special treatment.
  • the chitosium-ion complex can be processed in the form of a film or processed by extrusion into fibers or filaments.
  • chitosium-ion complex is slightly heated and there is an N-acetyl-D-glucosamine polymer.
  • acetic acid was used to form the chitosium ion complex
  • chitin is obtained as the final product.
  • the films and fibers produced by this process are completely water-insoluble and mechanically stable. They are non-toxic and biodegradable.
  • US 2,217,823 B a process for the production of chitin articles such as filaments, films, tubes, tapes and threads is given. Thereafter, chitin is converted into chitin xanthate using a caustic base and carbon disulfide.
  • the chitin xanthate is a viscous dispersion, which is then converted by extrusion into a coagulation bath of, for example, sulfuric acid and ammonium sulphate.
  • the chitin regenerates in the coagulation bath and gets a gel-like consistency. By drying this gel-like substance, various articles can be produced.
  • it is proposed to combine chitin and cellulose, but this method has various difficulties. On the one hand, corrosive bases and carbon disulfide must be used, leading to environmental problems, health hazards and process safety, and driving up costs (containers must withstand harsh environmental conditions). Further, the process promotes partial conversion of chitin into chitosan, which is diluted Acids is sufficiently soluble. Finally, the process requires dissolution, filtration and regeneration, which is not considered beneficial in the rayon industry because of environmental risks and process complexity. Therefore, industrial production will hardly be realized by this method.
  • US 4,029,727 B describes the formation of high strength chitin films and fibers in a four-step process.
  • chitin is dissolved in a mixture of dichloroacetic acid and an anhydrous organic solvent. Then the chitin is coagulated using an excess of organic liquid which chitin does not dissolve. Subsequently, the coagulated material is neutralized with a base bath. This may cause chitin deacetylation to produce acid-soluble chitosan under very harsh conditions.
  • an oriented chitin fiber is produced from the chitin by means of cold drawing.
  • the process is not environmentally safe as it requires the use of organic solvents. In addition, it requires different steps and different, additional reagents.
  • the formation of chitin acetate fibers is known from US 5,021,207 B. In US 4,029,727 a similar process is described.
  • Synthetic chitin materials in sponge-like form are proposed for use as tissue replacement.
  • Abe et al, Tissue Eng. 10, 2004 585-594 states the production of bioresorbable ⁇ -chitin matehals and uses them as a scaffold for a three-dimensional culture of chondrocytes.
  • ß-Chitin is obtained from the arms of Loligo squid.
  • the cartilage-scaffold composites are prepared by applying cartilaginous layers to the surface of the ⁇ -chitin matehal. After 4 weeks, the surface has adherent chondrocytes.
  • Biochemical analyzes using histochemical and immunohistochemical techniques as well as RT-PCR analyzes show that the cartilaginous layers in the chondrocyte- ⁇ -chitin composite resemble a vitreous cartilage. Electron microscopic studies showed that the cell layers on the surface are filled with chondrocytes and an extensive extracellular matrix. ß-chitin materials are biocompatible with chondrocytes. They are adequate scaffolds for three-dimensional chondrocyte cultures. Since column-like composites could be made with this method, it became possible to fit them into joint frame defects.
  • chitin with a sponge-like structure is also described by Suziki et al, J. Mater. Be. Med. 2008, 19, 1307-1315.
  • Pure ß-chitin, pure chitosan (3: 1 or 1: 1) and 1: 3 ß-chitin: chitosan are made from a mixture made of ⁇ -chitin hydrogel and chitosan hydrogel.
  • the hydrogels are frozen and vacuum dried for 24 hours. From this, a material of columnar shape (5 mm in diameter and 10 mm in length) is produced.
  • JP 07-47113 a porous ⁇ -chitin is known, which is produced by high-speed mixing and freeze-drying. According to JP 03-41131, the same method is used to produce ⁇ -chitin having a higher tensile strength.
  • a ⁇ -chitin material in a sponge-like form is known as a wound dressing.
  • chitin and chitosan are used together as a wound dressing.
  • the object of the present invention is to provide a two- or three-dimensional purified Chitingerüstes of horny sponges in which the skeleton structure of the horn sponges is substantially preserved and which have a high specific surface area, and a simple and inexpensive process for its preparation and their use.
  • the object is achieved by the invention specified in the claims.
  • Advantageous embodiments are the subject of the dependent claims.
  • the scaffold surface is colonized directly with human or animal cells.
  • the chitin scaffold consists of horn sponges of the genus Aplysina, Aiolochroia and / or Verongula, and more advantageously of horny sponges of the species Aplysina cauliformis, Aplysina fistrularis, Aplysina cavernicola, Aplysina aerophoba, Aplysina gerardogreeni, Aplysina archeri, Aplysina fulva, Aplysina insularis, Aplysina caissara, Aplysina lacunosa, Aplysina pergamentacea, Aplysina alcicornis, Aplysina cristagallus, Aplysina capensis, Aplysina lactuca sp.n., Aplysina lingua sp.n., Aplysina murcyana sp.n., Aplysina orthoreticul
  • the two-dimensional chitin scaffold consists of horn sponges of the family lanthella, and more preferably horn sponges of the species lanthella basta, lanthella aerophobia, lanthella concentrica, lanthella flabelliformis, lanthella homei, lanthella labirinthus, lanthella macula, lanthella quandrangulata, lanthella reticulate and / or lanthella topsenti ,
  • the horn sponges originate from the sea or have been bred in farms or by biotechnological methods, wherein advantageously the horn sponges have been bred by biotechnological methods from Primmorphen.
  • the horn sponges are fresh, dried, frozen or freeze-dried. It is also advantageous if the horn sponges are cleaned and / or sterilized and have been processed in size and shape for the application.
  • cartilage cells cartilage cells (chondrocytes), skin cells, muscle cells (myocytes), fibroblasts, liver cells (hepatocytes), pancreatic cells, bone cells (osteoblasts, osteoclasts, osteocytes), nerve cells (neurons) and / or embryonic and / or adult Stem cells of plant and / or animal, and / or human origin are present.
  • the chitin skeleton is introduced into an aqueous acid and then washed.
  • the base and / or base acid and / or base acid / water peroxide treatment is carried out several times in succession.
  • acids HCl or acetic acid propionic acid, succinic acid
  • acids HCl or acetic acid propionic acid, succinic acid
  • aqueous bases and acids are used, wherein advantageously 2 to 4 molar aqueous bases and 20 to 40% aqueous acids are used.
  • the two- or three-dimensional purified Chitingerüsten of horn sponges according to the invention are used in biology, medicine and technology according to the invention.
  • the two- or three-dimensional, purified chitin clusters from horn sponges become cell carriers in tissue engineering or for breeding, plastic surgery, wound healing; as frameworks for mineralization by means of calcium phosphate, calcium carbonate and / or silicate phases for the production of bone substitute materials; as scaffolds for the adsorption of structural proteins, such as collagen, keratin, fibrin, and / or as extracellular and / or acidic matrix proteins for the production of bone substitute materials; as gels for gelation by means of polysaccharides, such as alginate, chitosan, carrageenan, proteins, such as gelatin, and / or artificial polymers; as a scaffold for metallization; as scaffoldings for filter systems for the adsorption of heavy metals, and / or soluble waste products of the paint industry, leather production and electroplating; as scaffolds for the adsorption of enzymes for the development of constructs with increased enzymatic surface area; as scaffolds for the biotechnological rearing of microorgan
  • the two- or three-dimensional purified chitin sponges of horny sponges are used as scaffolds for metallization by means of metal ions having catalytic activity for the production of two- and three-dimensional constructs with increased catalytic surface area.
  • the present solution describes the extraction and purification of two- or three-dimensional Chitingerüste different morphology of horny sponges whose framework structure is essentially determined by the structure of the horn sponges.
  • These scaffolds have a high specific surface area, which favors cell colonization. A simple and inexpensive process for obtaining these scaffolds as well as their applications in medicine and technology are described.
  • the solution according to the invention it becomes possible for the first time to obtain two- or three-dimensional purified chitin scraps of naturally occurring horn sponges whose scaffold surface can serve with a very high specific surface area for the settlement of human or animal cells.
  • the chitin framework according to the invention can be used with or without cells for wound healing, but also for many other purposes outside of biology and medicine.
  • the Art Verongida comprises four families, all of which differ in structure and composition.
  • Aplysinidae is the largest Verongida family with 26 species of three genera (Aplysina, Verongula, Aiolochroia). They are defined by an anatomical fiber skeleton with medulla and bark. Verongida Bergquist includes sponges with a fibrous skeleton that is interconnected or constructed in dendritic form.
  • lanthellidae is the second largest Verongida family with 12 species of three genera (lanthella, Anomoianthella, Hexadella). They differ from other Verongida families in the presence of the choanocyte chambers.
  • Aplysinellidae consists of 9 species of three genera (Aplysinella, Porphyria, Suberea) and they are defined by a dendritic fiber skeleton with medulla and cortex.
  • Aplysina Nardo are often large sponges with intense color and different shapes. These sponges have a skeleton characterized only by marrow-like fibers arranged in three-dimensional meshes, without needles or foreign debris.
  • a number of bioactive properties are known for the Aplysina-derived brominated compounds: they are antibiotic, antibacterial, antifungal, antiviral, and especially cytotoxic / antitumoral.
  • Aplysina is widespread in the tropical south-west Atlantic, widespread off the Brazilian coast.
  • Aplysina is one of the few sponge genera found in much greater quantities in the Atlantic than in the Indian or Pacific Oceans.
  • Pseudoceratinidae consists of 4 species of one genus (Pseudoceratina) and is defined by a dendritic fiber skeleton with only marrow.
  • Chitingerüste invention consists mainly in its large inner surface. This surface is estimated at 25 - 34 m 2 for a sponge skeleton piece of 3 - 4 g dry weight. This large internal surface makes it possible to store a large amount of fluid or gel.
  • the large inner surface is crucial for application as a two- or three-dimensional chitin network as a liquid reservoir for a variety of Liquids and gel-forming media, such as biotechnologically used cells, bacteria, yeasts or electrolytic solutions for subsequent mineralization processes or for the metallization of the fiber surface.
  • the fibrous skeleton of horn sponges is used as a biomimetic scaffold for the attachment of human bone cells, for the growth and differentiation of cells, for the study of specific elastic and bioactive properties of cells for biomedical application and for application in materials science.
  • the Chitingerüst of horn sponges will be used as a fiber-based natural product for a large number of practical applications.
  • the horn sponges may originate from the natural environment, have been cultivated in marine farms or aquacultures or from Primmorphen in aquariums.
  • the following describes methods for extracting and purifying chitin from marine sponges of the species Verongida.
  • Chitin can be obtained from sponge bodies by applying a chemical treatment, which is described below. To minimize the contamination of chitin as an end product, the samples are subjected to a series of extraction steps. Each step serves to reduce the Impurities.
  • the extraction process may include base extraction, acid extraction, hydrogen peroxide treatment and washes, for example, with deionized water before and after each of the treatment steps. However, other treatment steps can also be included.
  • Washing with deionized water involves treating the samples with deionized water at room temperature, or at 37 ° C. or at 50 ° C. This extracts all water-soluble substances, such as pigments, from the sponge and achieves the dissolution of the sponge cells.
  • the base extraction at the o.g. Temperatures involve treating the samples with a solution having a high enough pH to destroy and dissolve the proteins contained in the samples and to remove the residues of silicon and pigments.
  • the base is stirred for 24 h, 12 h or 6 h, depending on the nature of the sample.
  • the remaining two- or three-dimensional scaffold, a fibrous skeletal material, is neutralized and ready for further treatment.
  • the base treatment is carried out with NaOH or KOH depending on the sample.
  • the base treatment may be carried out in a solution having a concentration of 1.5 to 5 M NaOH or KOH. Usually, the final concentration is 2.5 M NaOH or KOH.
  • Temperatures and duration of base treatment depend on the sample and can be optimized along with the molarity of the base. Other base treatments also fall under the solution according to the invention.
  • Extraction with deionized water can be performed on sea sponges at room temperature to remove contaminants that are water soluble.
  • the acid extraction at the above temperatures includes treating the sample with an acidic solution at a sufficiently low pH to allow the calcium carbonate to decompose and to dissolve protein residues and pigment residues.
  • the acid is typically stirred for 6 to 24 hours.
  • the remaining two- or three-dimensional framework, a fibrous skeletal material, is neutralized and ready for further processing or application.
  • acetic acid is used at a concentration of 5-25%, typically using 20% acetic acid.
  • Temperature and duration of treatment depend on the concentration of the acid and the nature of the sample.
  • the sample is in a hydrogen peroxide treatment
  • Hydrogen peroxide solution inter alia to decompose pigments.
  • the two- or three-dimensional sponge framework is neutralized and ready for further processing or application.
  • the hydrogen peroxide treatment is carried out in a solution having a final concentration of 5% to 55%. Typical is a final concentration of 35%.
  • the temperature and duration of the treatment depend on the concentration of hydrogen peroxide and the nature of the sample.
  • the chitin scaffold thus obtained can be characterized by various methods, such as enzymatic chitin digestion, X-ray diffraction, infrared and Raman or NMR spectral analysis.
  • the two- or three-dimensional purified Chitingerüste invention can be populated directly with cells.
  • a scaffold is generally applicable to wound dressings depends on the ability to rapidly and effectively form and grow cells, spread, extracellular matrix formation, homogeneous cells and matrix distribution, dimensional stability and biodegradation over a period of 3 - 6 months in vivo. All of these properties are met in a very good manner by the two- or three-dimensional purified chitin clusters of horn sponges according to the invention, so that they are very well suited as a scaffold for wound dressing applications.
  • the chitin scaffolds according to the invention can be used for in vivo or in vitro cultivation of cells, in particular tissue, especially dermal fibroblasts! become. Basically, there is also a settlement with other Zelien possible.
  • the material preferably serves as a graft for skin wounds, where its pores are gradually colonized by the body's own fibroblasts and, with the formation of a neodermal skin structure, the pigment is gradually degraded enzymatically.
  • the chitin scaffolds can be used to immobilize different types of cells.
  • the open-pore, coarse-textured and absorbent chitin scaffold favors colonization with dermal fibroblasts to form a dermis and the smooth or (eg, meander-like) surface-finely structured separating layer on the opposite side colonization with keratinocytes for the synthesis of an epidermis.
  • the chitin clusters separate the types of cells and protect the wound from infections and also allow the exchange of signal substances and nutrients. Stimulants etc.
  • a piece of a sea sponge of the species Aplysina cauliformis is dried and cut into small pieces of 1 cm in length.
  • a piece of the dried sponge is transferred to a caustic plastic vessel with a capacity of 2 l. 1 liter of deionized water is added and the sponge piece is stirred by means of a mechanical stirrer at 100 rpm for 6 hours at room temperature. To prevent the evaporation of the water, the vessel is sealed and sealed. After stirring for 6 h, the stirrer is removed.
  • artificial chondrocytes are cultured in vitro in the purified three-dimensional chitin scaffold from a horn sponge.
  • the artificial chondrocytes from pig bone cartilage with collagenase B (1, 5 mg / ml) and hyaluronidase (0.1 mg / ml) are kept overnight at 37 0 C.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • 5 ⁇ g / ml insulin 5 ⁇ g / ml transferrin
  • 5 ng / ml selenious acid o
  • 1 ⁇ M dexamethasone 0.17 mM ascorbic acid-2-phosphate
  • 1 mM sodium pyruvate 0.35 mM proline
  • 1.25 mg / ml BSA cell distribution, cell vitality and cartilage-like matrix synthesis were examined.
  • the framework was dehydrated in 4% formalin and stored in paraffin.
  • the samples are split into sections of 5 ⁇ m as standard. After deparaffinization, the samples are stained with alcian blue with collagen type II alcian blue (1% chroma) antibodies according to the standard protocol, labeled Nuclear almost red (chroma), washed three times, dehydrated, washed with XEM and embedded in Eukitt.
  • chroma collagen type II alcian blue
  • the sections become incubated with 2mg / ml hyaluronidase (700 WHO-U / mg) and 1 mg / ml pronase in PBS at 37C for 15 and 30 min. This is followed by a wash and block with 5% BSA.
  • the sections are incubated with a first mouse anti-type II collagen monoclonal antibody (1, 000 in% BSA, ICN), washed overnight at 4 ° C, incubated with biotin-SP-conjugated goat anti-mouse IgG (1/500 in TBS) and finally incubated with a streptavidin-biotin complex / AP for 30 min at room temperature, washed and stained with almost red substrate.
  • the nucleus is stained with hematoxylin and the samples were stored constantly in Aquatex.
  • the chondrocytes adhere well to the chitin scaffold and the cells synthesize a cartilaginous extracellular matrix.
  • chondrocytes obtained according to Example 1 are used for cell formation at 1.5 ⁇ 10 4 / cm 2 in low-glucose DMEM with 10% FCS and 100 parts / ml penicillin , Streptomycin mixed and kept in a humid atmosphere with 6% CO2 at 37 0 C.
  • the cells are divided at the confluence of 2 passages. About 1 million cells are soaked in fibrinogen, mixed with thrombin and injected into the chitin scaffold, and after 6 weeks of culture in TGV ⁇ , a chondrogenic medium according to Example 1 is obtained.
  • the framework is embedded in 2% low melting agarose in 1X PBS and cut into 50 ⁇ m sections for use in a vibratome (Leica VT 1000S).
  • the samples are transferred to a slide and stained with fluorescein diacetate (100 nm) to visualize the live cells and with propidum iodide (5 ⁇ g / ml) to visualize the dead cells.
  • fluorescein diacetate 100 nm
  • propidum iodide 5 ⁇ g / ml
  • chondrocytes are used. Approximately 1 million of the freshly recovered chondrocytes are dipped in fibrinogen mixed with thrombin and injected into a chitin scaffold after polymerization of fibrin gel. Subcutaneous parts are prepared from the back of small SCID mice (age 8-10 weeks) to obtain chondrocytes implanted in chitin scaffolds for cell formation. The samples are examined 4 weeks later.
  • the freshly obtained chondrocytes adhere well to the chitin skeleton and the cells synthesize a cartilaginous extracellular matrix.
  • the sponge piece is stirred by means of a mechanical stirrer with 100 U / m for 30 min at room temperature.
  • the hydrogen peroxide solution is then poured off and the sponge piece washed with deionized water until the pH of the solution is neutral and no bubbles are visible.
  • the sponge piece is then stored at 4 ° C.
  • artificial chondrocytes are cultured in vitro in the purified two-dimensional chitin scaffold from a horn sponge.
  • the artificial chondrocytes from pig bone cartilage with collagenase B (1, 5 mg / ml) and hyaluronidase (0.1 mg / ml) are kept overnight at 37 0 C.
  • a chondrogenic medium / DMEM supplemented with 5 ⁇ g / ml insulin, 5 ⁇ g / ml transferrin, 5 ng / ml selenious acid, o, 1 ⁇ M dexamethasone, 0, 17 mM ascorbic acid 2-phosphate, 1 mM sodium pyruvate, 0.35 mM proline, 1.25 mg / ml BSA) were added to the 10 ng / ml TGF ⁇ . After 6 weeks, cell distribution, cell vitality and cartilage-like matrix synthesis were examined.
  • the framework was dehydrated in 4% formalin and stored in paraffin.
  • the samples are split into sections of 5 ⁇ m as standard. After deparaffication, the samples are stained with alcian blue with collagen type II alcian blue (1% chroma) antibodies according to standard protocol, labeled Nuclear almost red (chroma), washed 3 times, dehydrated, washed with XEM and embedded in Eukitt.
  • chroma collagen type II alcian blue
  • the sections are incubated with 2 mg / ml hyaluronidase (700 WHO U / mg) and 1 mg / ml pronase in PBS at 37C for 15 and 30 min. This is followed by a wash and block with 5% BSA.
  • the sections are incubated with a first mouse anti-type II collagen monoclonal antibody (1, 000 in% BSA, ICN), washed overnight at 4 ° C., incubated with biotin-SP-conjugated goat anti-mouse IgG (1/500 in TBS) and finally incubated with a streptavidin-biotin complex / AP for 30 min at room temperature, washed and stained with almost red substrate.
  • the nucleus is stained with hematoxylin and the sample is constantly stored in Aquatex. The freshly obtained chondrocytes adhere well to the chitin skeleton and the cells synthesize a cartilaginous extracellular matrix.
  • the primary cultures were incubated for 7 days at 37 ° C in the incubator with 5 vol .-% CO2 and water vapor-saturated air to allow the growth of biopsies.
  • Around the bone biopsies first formed individual osteoblasts, which later grew into a confluent cell lawn and covered the bottom of the culture flask.
  • 1 ml and once 1.5 ml of medium were added every 3-4 days, so that a total of 5 ml of medium was in the culture flask. Every 3-4 days a medium change was performed on the samples.
  • trypsin was mixed with PBS in the ratio 1: 3 and pipetted onto the cell lawn.
  • the bottles were incubated for 10 minutes at 37 ° C / 5% CO2 to dissolve and isolate the cells from the cell assemblage.
  • the medium was aspirated from the edge of the culture flask and rinsed the cell lawn with 10 ml of PBS, since the medium antagonized the action of trypsin.
  • 1 ml of trypsin was added to the culture bottles, in a ratio of 1: 3 mixed with PBS, and incubated for 10 minutes in the incubator. Under the light microscope, it was checked whether the cells had peeled off and detached from the bottom of the bottle. The detached cells were taken up in 30 ml PBS and centrifuged in a tube for 12 minutes at 1120 g.
  • the buffer solution was aspirated and the resulting cell pellet resuspended depending on the size in 1-3 ml of medium.
  • the newly obtained osteoblasts adhere well to the chitin skeleton and the cells synthesize a collagenous extracellular matrix.
  • the donors of the skin were patients undergoing a plastic surgery. Exclusion criteria were acute or chronically ill, or patients undergoing cytotoxic / cytostatic therapy.
  • the recovered skin was filled in the operating room under sterile conditions in 50 ml plastic tubes containing approx. 15 ml calcium- and magnesium-free PBS medium and immediately taken to the laboratory. In order to continue to ensure sterile conditions, all subsequent work steps were carried out on a sterile workbench with laminar air flow (Microflow, MDH, England). For the installation of a primary culture, a sterile preparation kit with at least one cuticle scissors, a scalpel and two tweezers was necessary.
  • the 10 ug / ml gentamycin and Hepes buffer 2.5% were buried, either for 3 to 4 hours at 37 ° C in the incubator (Fa. WTB Binder, Tuttlingen) or overnight at + 4 ° C in the refrigerator (Siemens, Kunststoff), incubated.
  • the epidermis was then removed from the dermis with tweezers. The dermis was later needed for the attachment of the fibroblast culture. After another wash in PBS, the epidermis was cut into many small pieces and portioned into 15 ml plastic tubes (M9) each filled with 5 ml trypsin / EDTA.
  • the cell pellet was resuspended in 10.5 ml of serum-free keratinocyte medium supplemented with 0.1-0.2 ng / ml EGF (epidermal growth factor), 20-30 ⁇ g / ml bovine pituitary extract and 2 ⁇ g / ml gentamycin were added, resuspended.
  • EGF epidermal growth factor
  • the culture medium was stored in the refrigerator and heated to 37 ° C before use.
  • For cell counting 0.5 ml of the suspension was withdrawn. Of these, 50 ⁇ l were mixed with 50 ⁇ l trypan blue in a reaction vessel, thus filling a Neubauer counting chamber. Damaged cells picked up the dye and were not counted.
  • the culture medium was incubated in 3 ml of trypsin / EDTA for 5 minutes at 37 ° C in an incubator. By tapping the culture bottles the solution processes were mechanically supported. The resulting single cell suspension was checked under the reflected-light microscope (Axiovert 25, Zeiss, Jena) before the trypsin activity was again stopped with 5 ml of 10% NCS. After centrifugation, resuspension and counting, the cells were again sown in a 75 cm 2 cell culture flask, inserted into a spinner culture and used to colonize a three-dimensional chitin scaffold.
  • the freshly obtained keratinocytes adhere well to the chitin scaffold and the cells synthesize a collagenous extracellular matrix.
  • the primary procedure was analogous to the creation of a keratinocyte culture.
  • the dermis obtained after dispase treatment was washed in PBS and then minced with a pair of cuticle scissors.
  • the resulting dermis pulp was incubated for separation of the intercellular contacts in an enzyme mixture of 15 ml of collagenase and hyaluronidase in a 50 ml plastic tube for 3 hours in a shaking water bath at 37 ° C. After centrifugation of the fibroblast single cell suspension and resuspension in fibroblast medium supplemented with 1% penicillin-streptomycin and 10% FBS was counted. The cells were then seeded in 13 ml of fibroblast medium per 75 cm 2 culture flask.
  • the medium change took place every 2 days.
  • 5 ml of trypsin per culture flask and a contact time of 10 minutes were needed for the detachment of the cells from the culture bottle bottom and for the cleavage of the intercellular contacts.
  • the freshly obtained fibroblasts adhere well to the three-dimensional chitin skeleton and the cells synthesize an extracellular matrix.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Biologie und betrifft ein Chitingerüst von Hornschwämmen, das beispielsweise in der Wundheilung zum Einsatz kommen kann. Die Aufgabe der vorliegenden Lösung besteht in der Angabe eines zwei-oder dreidimensionalen gereinigten Chitingerüstes von Hornschwämmen, bei denen die Gerüststruktur der Hornschwämme erhalten ist und die eine hohe spezifische Oberfläche aufweisen. Die Aufgabe wird gelöst durch ein Chitingerüst von Hornschwämmen, welches direkt auf der Gerüstoberfläche mit menschlichen oder tierischen Zellen besiedelt ist. Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch ein Verfahren,bei dem von den Hornschwämmen mittels einer Base und/oder Base-Säure und/oder Base-Säure- Wasserstoffperoxid-Behandlung bei Temperaturen zwischen 20 und 50 °C alle anderen Bestandteile von Chitingerüst entfernt werden,und nachfolgend Zellkulturen auf die Chitingerüstoberfläche aufgebracht werden. Und die Aufgabe wird auch gelöst durch die Verwendung von Chitingerüstenvon Hornschwämmen in der Biologie, Medizin und Technik.

Description

Zwei- oder dreidimensionales gereinigtes Chitingerüst von Hornschwämmen, Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung
Die Erfindung bezieht sich auf die Gebiete der Biologie und Medizin und betrifft ein zwei- oder dreidimensionales gereinigtes Chitingerüst von Hornschwämmen, das beispielsweise in der Wundheilung, als Knochenersatzmaterialien, zu Filterzwecken oder als Trägermaterial zum Einsatz kommen kann und ein Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung.
Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf die Extraktion von Chitin aus Hornschwämmen. Im Einzelnen betrifft dies die Extraktion von Chitin aus Meeresschwämmen der Art der Hornschwämme (Demospongia: Pohfera). Die Erfindung ist auch gerichtet auf ein Verfahren zur Extraktion von zwei- und dreidimensionalen Gerüsten, die durch das fasrige Chitin von Schwämmen gebildet werden. Das durch dieses Verfahren hergestellte Chitin wird vorgeschlagen zur Anwendung bei der Wundheilung, als Gewebeersatz und für die Ablagerung von Gelen und Flüssigkeiten. Neben Zellulose ist Chitin eines der am meisten vorkommenden Kohlenhydrate in der Natur. Gewöhnlich tritt es zusammen mit anderen Kohlenhydraten, Proteinen und auch Mineralstoffen auf. Als ein natürlich auftretendes Material wird Chitin in Insekten, Krustentieren/ KrNI, benthischen Meeresorganismen/ Diatomeen, Mollusken sowie verschiedenen Hefen und Pilzen gefunden. Chitin ist unlöslich in Wasser und den meisten anderen üblichen Lösungsmitteln. Diese Eigenschaft kompliziert den Prozess der Herstellung von Chitinfasern, Chitinfolien oder anderen Chitinprodukten.
Chitin ist ein Kohlenhydrat Poly(N-acetyl-D-glucosamin), und bildet beispielsweise die Zellwand von Pilzen und die harte Schale von Insekten oder Krustentieren. Vor kurzem wurde gefunden, dass α-Chitin als Hauptkomponente im Skelett von Hornschwämmen vorkommt (Ehrlich, H. et al: J. Exp. Zool. (Mol Dev Evol) 308B; 347-356; Ehrlich, H. et al: J. Exp. Zool. (Mol Dev Evol) 308B 473-483). Chitin wurde bisher aus Krabben, Hummern, Shrimps, Krebsen, Königskrabben, Insekten oder aus anderem Abfall von Schalentieren hergestellt, in Form von Granulat, Folien, Pulvern. Im Gegensatz dazu ist das Chitin von Schwämmen der zwei- oder dreidimensionalen Form von natürlich vorkommenden faserartigen Schwammskeletten ähnlich.
Es ist gut bekannt, dass das fasrige Skelett der meisten Schwämme durch das collagenähnliche Protein Spongin gebildet wird. Es gibt dem Schwamm seine Flexibilität. Crookewitt stellte 1843 erstmalig fest, dass das Skelett des gewöhnlichen Badeschwamms von einer Hautschicht gebildet wird und bezeichnete diese als Spongin. Bis heute hat Spongin (auch bezeichnet als fasriges Skelett, Pseudokeratin, Neurokeratin, Hornprotein, collagenähnliches Protein, Scleroprotein) keine klare chemische Definition. Die Fasern und Filamente des Spongins sind resistent gegen bakterielle Collagenase, Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Pronase, Papain, Elasthase, Lysozyme, Zellulase und Amylase. Allerdings ist es seit langen bekannt, dass Spongin-Fasern sich in 5 - 20% KOH Lösung vollständig auflösen, wogegen das Chitin dabei nicht gelöst wird.
Zahlreiche potentielle Anwendungen von Chitin und Chitosan werden derzeit diskutiert. Die kommerzielle Anwendung von Chitin und Chitosan schließt pharmazeutische und andere Heil- und Hilfsmittel, wie Wundheilungsprodukte und medizinische Implantate genauso mit ein, wie die Anwendung in der Landwirtschaft, in der Kosmetikindustrie, in der Lebensmittelindustrie, in der Textilindustrie und bei Wasser- sowie Abwasserbehandlungsverfahren. Ihre Anwendung bringt Vorteile bei der Biokompatibilität, wobei die Bioaktivität von Chitin und Chitosan von besonderem Interesse sind. Beispielsweise verhindert Chitosan die Bildung von Narbengewebe indem die Bildung von Fasersträngen in der Wunde gehemmt wird. Diese Eigenschaft führt dazu, dass Chitin und Chitosan als Nahtmaterial, als Verbandsmaterial oder für andere Heilmittel eingesetzt werden kann. Dies wird dadurch möglich, dass Chitin und Chitosan Eigenschaften aufweisen, die andere Produkte nicht besitzen. Das Protein Lysozym, welches in Wunden vorgefunden wird, zerstört Chitin. Daher kann eine Wundnaht und ein Wundverband hergestellt werden, die bioabbaubar ist und keine spätere Entfernung des Materials erfordert. Die Bioaktivität von Chitin und Chitosan ist auch wichtig für nichtmedizinische Anwendungen. Beispielsweise stimuliert Chitin Mikroorganismen aus der Erde zur Produktion von Enzymen, die Chitin spalten. Diese Enzyme, wirken schädlingsbekämpfend beispielsweise auf Fadenwürmer, die Chitin als Teil ihrer Struktur besitzen. Zusätzlich wurde gefunden, dass Chitin das Wachstum von Bakterien im Darm stimuliert, eine Eigenschaft, die zur Anwendung in der Lebensmittelindustrie und zur Herstellung von Zellkulturen führen könnte.
Verschiedene Extraktionsverfahren von natürlichem Chitin aus Skeletten von Meereskrustentieren, beispielsweise aus dem Abfall von Schalentieren, sind bekannt (Chang & Tsai, J.Agric. Food Chem. 45; 1900-1904; US 4,066,735 B; US 4,199,496 B; US 5,053,113 B; US5.210.186).
Allgemein bekannt ist, dass die Abfälle von Schalentieren, wie Shrimps, aus einer chitinhaltigen Matrix bestehen, die kovalent gebundene Proteine enthält. Dieses Chitin/Protein-Komposit ist „gefüllt" mit unerwünschten feinen CaCO3-Granulaten (Roer & Dillamen, Amer. Zool. ,24: 893-909; US 4,199,496 B). Die Größe der „Füllungen" scheint charakteristisch für jede Krustentierspezies zu sein und ist variabel. Weiterhin gibt es eine variable Menge an unerwünschten Lipiden, die mit der Skelettmatrix verbunden sind. Diese Lipide wurden erstmals in Form von Lipo- Protein-Membranen z.B. in Epicuticeln gefunden. Um Chitin funktionsgemäß einsetzen zu können, muss es von unerwünschten Nicht- Chitin-Komponenten, wie den oben genannten Lipiden und Proteinen sowie Mineralien wie CaCO3 befreit werden. Da Chitin in den meisten Lösungsmitteln bis auf konzentrierte Säuren unlöslich ist, müssen die unerwünschten Nicht-Chitin- Komponenten gewöhnlich von der unlöslichen Chitinmatrix mit konzentrierten umweltschädigenden Säurelösungen entfernt werden.
Frühere Versuche zur Erreichung der Trennung erfolgten unter Verwendung von Chemikalien, wie Basen durch Verfahren, wie Kochen (US 5,210,186 B), Basenbehandlungen unter einem konstanten elektrischen Strom (US 5,053,113 B), oder mit Schwefelsäure (US 4,066,735 B), mit Natriumhydroxid (US 4,199,496 B), gefolgt von einer Säuredemineralisation (z.B. HCl) sowie mittels enzymatischem Protein-Aufschluss unter Verwendung von Fischeingeweiden (WO 86 06082) oder durch Säuredemineralisation gefolgt von einer Zersetzung der Proteine mittels einer Seife (JP 53-10804).
Percot, Viton & Domard, Biomacromalecules 2003, 4, 12-18 beschreiben optimierte Verfahrensbedingungen für die Extraktion von Chitin aus Shrimps-Schalen. Die Kinetik der Zersetzung der Minerale und Proteine wurde als Funktion der Temperatur untersucht. Durch die Charakterisierung des Restkalziums der verbleibenden Proteine ergeben sich die folgenden optimalen Verfahrensbedingungen: die vollständige Zersetzung des Minerales kann in 15 min bei Raumtemperatur und bei Überschuss von HCl (0,24 mol mit einem Fest-Flüssig-Verhältnis von 1 : 40) erreicht werden. Die Zersetzung der Proteine wird durch NaOH erreicht (1 molar, 24 h bei 700C). Die Restgehalte an Kalzium und Chitin sind geringer al 0,01 % und die Acetylierung beträgt unter diesen Bedingungen annähernd 95 %.
Brauchbare Quellen von Chitin sind Hummer, Shrimps und andere Krustentiere. Die Chitinextraktion aus diesen Quellen erfordert die Reduzierung der Chitin- Partikelgröße auf weniger als 150 μm, vorteilhaft sind weniger als 50 μm. Aufgrund der harten und eher fasrigen Natur des Chitins aus diesen Chitinquellen sind die Mahlverfahren kompliziert und kostenaufwändig. Deshalb wird die Verwendung von Pilzchitin bevorzugt. Es wurde festgestellt, dass es nicht notwendig ist, das Chitin vom Zellmaterial zu trennen. Nach einer Sterilisation durch Wärme oder Gas (beispielsweise Ethylenoxid) kann die gesamte Pilzmatte, die durch Fermentation der Pilze in einer Nährstofflösung erhalten worden ist, zur Förderung der Wundheilung eingesetzt werden. Trotzdem muss die Pilzmatte behandelt werden, um reine Chitinskelette zu erhalten. Diese Behandlung reduziert die Möglichkeit von allergischen Reaktionen und verringert mögliche Wechselwirkungen während des Heilungsprozesses mit anderen„Fremdmaterialien.
Die Extraktion von Chitin aus Pilzen liefert einen besser kontrollierbaren Weg, um reinere und konsistentere Chitin-Materialien zu erhalten, als aus Schalentierenabfall. Weiterhin sind die Verunreinigungen mit allergischen Komponenten bei der Chitinextraktion aus Pilzen weniger wahrscheinlich. Daher ist dieses so erhaltene Chitin besser anwendbar für Textilien, Lebensmittel und Pharmazeutika. Deshalb ist es von ausschlaggebendem Interesse Pilzchitinquellen aufzufinden, damit für kommerzielle Anwendungen ausreichende Mengen zur Verfügung gestellt werden können (US 5,905,035 B).
Nach der WO 86006082 ist ein Verfahren bekannt, mit dem Chitin und Astaxanthin aus Shrimps und KhII erhalten werden kann. Es beschreibt die Zersetzung von Mineralien und die Entfernung der enzymatischen Proteine.
Ein Verfahren zur Trennung von Chitin, Protein und Astaxanthin und dessen Ester ist nach der US 5,210,186 B bekannt. Das Verfahren beinhaltet die Extraktion von Krustentiergewebe mit heißen Basen, wodurch ein Basenextrakt und ein Rest erhalten werden. Während der Abkühlung bildet der Basenextrakt getrennte Schichten. Proteine, Astaxanthin, Karotenoide und Astaxanthin. Ester können auf dies Art und Weise getrennt werden. Der extrahierte Rest enthält das Chitin.
In der US 5,053,113 B wird ein Verfahren zur Chitinextraktion beschrieben, bei dem Chitin und Chitosan durch eine Basenbehandlung des Chitin-haltigen Rohmaterials einschließlich eines elektrochemischen Prozesses in einer NaOH-Lösung erhalten wird. Chitin aus Krustentierabfall wird gewonnen durch ein mechanisches Verfahren ohne chemische Zusätze (US 4,293,098 B). Dazu wird Krustentierabfall getrocknet, gemahlen und in einem Windsichter in zwei Hauptkomponenten getrennt, wobei eine Komponente hauptsächlich Chitin und die andere Komponente hauptsächlich die Proteine und Kalziumkarbonat enthält.
Ein Verfahren zur quantitativen Extraktion von natürlichem Chitin aus biologischen Strukturen der Sordaria- und /Ascar/s-Spezies basiert auf der Verwendung von Ozon und neutralisierter Wasserstoffperoxidethylendiamintetraaceticsäure. Dieses Reagenz erlaubt die Extraktion von Chitinkomponenten bei neutralem pH-Wert ohne Zellbrüche oder erhebliche Fraktionierung, bei Erhalt der Zellwandintegrität und - Struktur. Die entstehenden Produkte sind im Wesentlichen frei von Proteinen und es liegt angereichertes Chitin vor. Die Reinheit hängt von der Chitinquelle ab. Chitin wird in einer hoch acetylierten Form gewonnen.
Ein Verfahren zur Herstellung von Molluskenchitin aus deren Schalen ist nach der CN 1462756 bekannt. Das Verfahren umfasst das Eintauchen der Schneckenschalen in Salzsäurelösung und in eine NaOH- oder KOH-Lösung bei 90 - 95 0C für 3 - 4 h.
Verschiedene Veröffentlichungen beschreiben die Herstellung von Chitinfasern, Chitinröhren, Chitinbändern oder Chitinfilamenten. Gemäß der US 5,900,479 B wird ein Chitosanmatehal in einer verdünnten organischen Säure wie Ameisensäure oder Essigsäure behandelt. Die Wechselwirkung zwischen dem Chitosan- Ausgangsmaterial und der organischen Säure führt zu einem Chitosium-Ionen- Komplex. Dieser Chitosium-Ionen-Komplex ist wasserlöslich, geruchlos sowie nichttoxisch und erfordert keine spezielle Behandlung. Der Chitosium-Ionen-Komplex kann in Form eines Filmes prozessiert oder durch Extrusion zu Fasern oder Filamenten verarbeitet werden. Anschließend wird der Chitosium-Ionen-Komplex etwas aufgeheizt und es entsteht ein N-acetyl-D-glucosamin-Polymer. Wenn Essigsäure verwendet wurde, um den Chitosium-Ionen-Komplex zu bilden, wird Chitin als Endprodukt erhalten. Die Filme und Fasern, die nach diesem Verfahren hergestellt werden, sind vollständig wasserunlöslich und mechanisch stabil. Sie sind nicht-toxisch und biologisch abbaubar. Gemäß US 2,217,823 B wird ein Verfahren zur Herstellung von Chitinartikeln wie Filamente, Filme, Röhren, Bänder und Fäden angegeben. Danach wird Chitin unter Verwendung einer ätzenden Base und Kohlenstoffdisulfid in Chitinxanthat überführt. Das Chitinxanthat ist eine viskose Dispersion, welche anschließend durch Extrusion in ein Koagulationsbad aus beispielsweise Schwefelsäure und Ammoniumsulphat überführt wird. Das Chitin regeneriert sich in dem Koagulationsbad und erhält eine gelartige Konsistenz. Mittels Trocknung dieser gelartigen Substanz können verschiedene Artikel hergestellt werden. Weiterhin wird vorgeschlagen, Chitin und Zellulose zu kombinieren, jedoch weist dieses Verfahren verschiedene Schwierigkeiten auf. Einerseits müssen ätzende Basen und Kohlenstoffdisulfid verwendet werden, was zu Umweltproblemen, Gefährdungen der Gesundheit und Verfahrenssicherheit führt und die Kosten in die Höhe treibt (Die Behälter müssen harten Umgebungsbedingungen standhalten.) Weiterhin fördert das Verfahren die teilweise Umwandlung von Chitin in Chitosan, welches in verdünnten Säuren hinreichend löslich ist. Schließlich erfordert das Verfahren die Auflösung, Filtration und Regeneration, was in der Kunstseidenindustrie aufgrund von Umweltrisiken und der Prozesskomplexität als nicht vorteilhaft anzusehen ist. Daher wird die industrielle Produktion kaum über dieses Verfahren realisiert werden.
Das US 4,029,727 B beschreibt die Bildung von Chitinfilmen und -fasern mit hoher Festigkeit in einem Vier-Schritt-Verfahren. Zuerst wird Chitin aufgelöst in eine Mischung aus Dichloressigsäure und einem wasserfreien organischen Lösungsmittel. Dann wird das Chitin koaguliert unter Verwendung eines Überschusses an organischer Flüssigkeit, welche Chitin nicht löst. Anschließend wird das koagulierte Material mit einem Basenbad neutralisiert. Dies kann dazu führen, dass die Chitindeacetylisierung zur Bildung von säurelöslichem Chitosan unter sehr harten Bedingungen erfolgt. Danach wird aus dem Chitin mittels Kaltziehens eine orientierte Chitinfaser hergestellt. Das Verfahren ist im Hinblick auf die Umwelt nicht unbedenklich, da es die Anwendung von organischen Lösungsmitteln erfordert. Zusätzlich erfordert es verschiedene Schritte und unterschiedliche, weitere Reagenzien. Die Bildung von Chitinacetatfasern ist aus US 5,021 ,207 B bekannt. In US 4,029,727 ist ein ähnliches Verfahren beschrieben.
Es gibt zahlreiche Veröffentlichungen, welche die Herstellung von Chitin in Schwann mform beschreiben. Beispielsweise wird von Flores, J. Appl. Polym. Sei. 104 (2007) 3909 - 3916 beschrieben, dass ein Chitinmaterial, welches in seiner Form äußerlich an einen Schwamm erinnert, aus Shrimpsresten erhalten werden kann, wenn „grüne Chemieverfahren" angewandt werden. Das schwammähnliche Chitinmaterial hat eine Zusammensetzung von 42 % Chitin, 46 % Asche und 11 % Proteinen. Alterungs- und Bioabbautests über 30 Tage zeigten, dass das Material unter den Umweltbedingungen von Mexiko-Stadt stabil bleibt. Im Gegensatz dazu wird das Material bioabbaubar, wenn es in einer Kompostermischung zwei Wochen gelagert wurde.
Synthetische Chitinmaterialien in Schwamm-ähnlicher Form werden für die Anwendung als Gewebeersatz vorgeschlagen. Abe et al, Tissue Eng. 10, 2004 585 - 594 gibt die Produktion von bioresorbierbaren ß-Chitinmatehalien an und verwendet sie als Gerüst für eine dreidimensionale Kultur von Chondrozyten. ß-Chitin wird gewonnen aus den Armen von Loligo-Tintenfischen. Die Knorpel-Gerüst-Komposite werden hergestellt, indem knorpelartige Schichten auf die Oberfläche des ß- Chitinmatehals aufgebracht werden. Nach 4 Wochen weist die Oberfläche anhaftende Chondrozyten auf. Biochemische Analysen mit histochemischen und immunohistochemischen Verfahren sowie RT-PCR-Analysen zeigen, dass die knorpelartigen Schichten in dem Chondrozyt-ß-Chitin-Komposit einem glasartigen Knorpel ähnlich sind. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die Zellschichten auf der Oberfläche mit Chondrozyten sowie einer umfangreichen extrazellulären Matrix gefüllt sind. ß-Chitinmaterialien sind biokompatibel mit Chondrozyten. Sie sind adäquate Gerüste für dreidimensionale Chondrozytenkulturen. Seit mit diesem Verfahren säulenartige Komposite hergestellt werden konnten, wurde es möglich, diese in Gelenkgerüstdefekte einzupassen.
Die Herstellung von Chitin mit schwammähnlicher Struktur wird auch von Suziki et al, J. Mater. Sei. Med. 2008, 19, 1307-1315 beschrieben. Reines ß-Chitin, reines Chitosan (3 : 1 oder 1 : 1 ) sowie 1 : 3 ß-Chitin: Chitosan werden aus einer Mischung von ß-Chitin-Hydrogel und Chitosan-Hydrogel hergestellt. Die Hydrogele werden gefroren und 24 h vakuumgetrocknet. Daraus wird ein Material von säulenartiger Form (5 mm Durchmesser und 10 mm Länge) hergestellt.
Die Entwicklung der Herstellungsverfahren von Chitinmaterialien mit schwammähnlicher Struktur wird angetrieben durch den Bedarf an verbesserten Wundverbänden. Prudden et al, Surgery, Gynecology and Obstetics 1957, 105, 283 entwickelten einen Wundverband auf der Basis von Chitin, der unter der Marke„bas- Chitin W" bekannt wurde. Chitin aus Krabben- und Shrimpsschalen ist α-Chitin. Es weist eine höhere Stabilität als ß-Chitin auf und erfordert spezielle organische Lösungsmittel für seine Auflösung (wie beispielsweise LiCI/N,N-dimethyl-acetamide). Dieses Problem kompliziert seine Anwendung. Weiterhin kann das Lösungsmittel Probleme bezüglich der Sicherheit und des Umweltschutzes verursachen.
Gemäß JP 07-47113 ist ein poröses ß-Chitin bekannt, welches durch Hochgeschwindigkeitsmischen und Gefriertrocknen hergestellt wird. Gemäß JP 03- 41131 wird das gleiche Verfahren verwendet, um ß-Chitin mit einer höheren Zugfestigkeit herzustellen.
Nach US 6,693,180 ist ein ß-Chitinmaterial in schwammähnlicher Form als Wundverband bekannt. Hier werden Chitin und Chitosan gemeinsam als Wundverband genutzt.
Der Nachteil der bisher bekannten Verfahren besteht vor allem darin, dass bisher keine Verfahren für die Gewinnung von zwei- oder dreidimensionalen Chitingerüsten mit Schwammstruktur bekannt sind, die direkt aus natürlichen Quellen (Organismen) gewonnen werden und für die Wundheilung und Wundverbände benutzt werden kann.
Die Aufgabe der vorliegenden Lösung besteht in der Angabe eines zwei- oder dreidimensionalen gereinigten Chitingerüstes von Hornschwämmen, bei denen die Gerüststruktur der Hornschwämme in Wesentlichen erhalten ist und die eine hohe spezifische Oberfläche aufweisen, sowie ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zu seiner Herstellung und ihre Verwendung. Die Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen angegebene Erfindung gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche.
Bei dem erfindungsgemäßen zwei- oder dreidimensionalen gereinigten Chitingerüst von Hornschwämmen ist die Gerüstoberfläche direkt mit menschlichen oder tierischen Zellen besiedelt.
Vorteilhafterweise besteht das Chitingerüst aus Hornschwämmen der Gattung Aplysina, Aiolochroia und/oder Verongula, und noch vorteilhafterweise aus Hornschwämmen der Spezies Aplysina cauliformis, Aplysina fistrularis, Aplysina cavernicola, Aplysina aerophoba, Aplysina gerardogreeni, Aplysina archeri, Aplysina fulva, Aplysina insularis, Aplysina caissara, Aplysina lacunosa, Aplysina pergamentacea, Aplysina alcicornis, Aplysina cristagallus, Aplysina capensis, Aplysina lactuca sp.n., Aplysina lingua sp.n., Aplysina murcyana sp.n., Aplysina orthoreticulata sp.n., Aplysina pseudolacunosa sp.n., Aplysina solangeae sp.n., Aiolochroia crassa, Verongula gigantea, Verongula rigida und/oder Verongula reiswigi.
Ebenfalls vorteilhafterweise besteht das zweidimensionale Chitingerüst aus Hornschwämmen der Familie lanthella, und noch vorteilhafterweise aus Hornschwämmen der Spezies lanthella basta, lanthella aerophoba, lanthella concentrica, lanthella flabelliformis, lanthella homei, lanthella labirinthus, lanthella macula, lanthella quandrangulata, lanthella reticulate und/oder lanthella topsenti.
Weiterhin vorteilhafterweise stammen die Hornschwämme aus dem Meer oder sind in Farmen oder durch biotechnologische Verfahren gezüchtet worden, wobei noch vorteilhafterweise die Hornschwämme durch biotechnologische Verfahren aus Primmorphen gezüchtet worden sind.
Auch vorteilhafterweise sind die Hornschwämme frisch, getrocknet, gefroren oder gefriergetrocknet. Vorteilhaft ist es auch, wenn die Hornschwämme gereinigt und/oder sterilisiert sind und in Größe und Form für die Anwendung bearbeitet worden sind.
Ebenfalls vorteilhaft ist es, wenn als Zellen Knorpelzellen (Chondrozyten), Hautzellen, Muskelzellen (Myozyten), Fibroblasten, Leberzellen (Hepatozyten), Pankreaszellen, Knochenzellen (Osteoblasten, Osteoklasten, Osteozyten), Nervenzellen (Neuronen) und/oder embryonale und/oder adulte Stammzellen pflanzlicher und/oder tierischer, und/oder menschlicher Herkunft vorhanden sind.
Weiterhin vorteilhaft ist es, wenn künstliche Zellen vorhanden sind.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines zwei- oder dreidimensionalen gereinigten Chitingerüstes von Hornschwämmen werden von den Hornschwämmen mittels einer Base und/oder Base-Säure und/oder Base-Säure- Wasserstoffperoxid-Behandlung bei Temperaturen zwischen 20 und 50 0C alle anderen Bestandteile von Chitingerüst entfernt, und anschließend wird die Form und Größe des Chitingerüstes für den jeweiligen Anwendungsfall bearbeitet, und nachfolgend werden Zellkulturen auf die Chitingerüstoberfläche aufgebracht und das so behandelte Chitingerüst wird in steriler Umgebung den Wachstumsbedingungen der Zellen ausgesetzt.
Vorteilhafterweise wird nach der Base und/oder Base-Säure und/oder Base-Säure- Wasserperoxid-Behandlung das Chitingerüst in eine wässrige Säure eingebracht und danach gewaschen.
Ebenfalls vorteilhafterweise wird die Base und/oder Base-Säure und/oder Base- Säure-Wasserperoxid-Behandlung mehrmals hintereinander durchgeführt.
Weiterhin vorteilhafterweise werden als Basen, NaOH oder KOH eingesetzt.
Und auch vorteilhafterweise werden als Säuren HCl oder Essigsäure (Propionsäure, Bernsteinsäure) eingesetzt. Von Vorteil ist es weiterhin, wenn wässrige Basen und Säuren eingesetzt werden, wobei noch vorteilhafterweise 2 bis 4 molare wässrige Basen und 20 bis 40 %ige wässrige Säuren eingesetzt werden.
Ebenfalls von Vorteil ist es, wenn die Behandlung bei Temperaturen zwischen 0 und 100 0C durchgeführt wird.
Auch von Vorteil ist es, wenn die Wachstumsbedingungen für Zellen auf zwei- und/oder dreidimensionalen Chitingerüsten als Zellenträger mit vergrößerter Besiedlungsoberfläche realisiert werden.
Vorteilhaft ist es auch, wenn zweidimensionale Chitingerüste für flächige Anwendungen eingesetzt werden, und dreidimensionale Chitingerüste für Anwendungen eingesetzt werden, bei denen ein Volumen auszufüllen ist.
Die erfindungsgemäßen zwei- oder dreidimensionalen gereinigten Chitingerüsten von Hornschwämmen werden erfindungsgemäß in der Biologie, Medizin und Technik verwendet.
Vorteilhafterweise werden die zwei- oder dreidimensionalen, gereinigten Chitingerüsten aus Hornschwämmen Zellenträger in Gewebekonstruktionen (Tissue Engineering) oder für die Züchtung, plastischer Chirurgie, Wundheilung; als Gerüste zur Mineralisierung mittels Kalziumphosphat-, Kalziumkarbonat- und/oder Silikatphasen zur Herstellung von Knochenersatzmaterialien; als Gerüste zur Adsorption von Strukturproteinen, wie Kollagen, Keratin, Fibrin, und/oder als extrazelluläre und/oder saurere Matrixproteinen zwecks Herstellung von Knochenersatzmaterialien; als Gerüste zur Gelbildung mittels Polysaccharide, wie Alginat, Chitosan, Karragenan, Proteine, wie Gelatine, und/oder künstliche Polymere; als Gerüst zur Metallisierung; als Gerüste für Filtersysteme zur Adsorption von Schwermetallen, und/oder löslicher Abfallprodukte der Farbindustrie, Lederherstellung und Galvanik; als Gerüste zur Adsorption von Enzymen zwecks Entwicklung von Konstrukten mit vergrößerter enzymatischer Oberfläche; als Gerüste für die biotechnologische Aufzucht von Mikroorganismen, wie Bakterien, Pilze, Hefe, welche zur Produktion von Vitaminen, Hormonen und anderen pharmazeutischen Produkten geeignet sind; als Gerüst zur Ablagerung von Fischeiern für die Aufzucht von Aquarien- und industriellen Fischarten verwendet.
Ebenfalls vorteilhafterweise werden die zwei- oder dreidimensionalen, gereinigten Chitingerüsten aus Hornschwämmen als Gerüst zur Metallisierung mittels Metallionen mit katalytischer Wirkung zwecks Herstellung von zwei-und dreidimensionalen Konstrukten mit vergrößerter katalytischer Oberfläche verwendet.
Die vorliegende Lösung beschreibt die Extraktion und Reinigung von zwei- oder dreidimensionaler Chitingerüste unterschiedlicher Morphologie aus Hornschwämmen, deren Gerüststruktur im Wesentlichen durch die Struktur der Hornschwämme vorgegeben ist. Diese Gerüste weisen eine hohe spezifische Oberfläche auf, was Zellansiedlungen begünstigt. Ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Gewinnung dieser Gerüste sowie ihre Anwendungsmöglichkeiten in Medizin und Technik werden beschrieben.
Mit der erfindungsgemäßen Lösung wird es erstmals möglich, zwei- oder dreidimensionale gereinigte Chitingerüste von natürlich vorkommenden Hornschwämmen zu erhalten, deren Gerüstoberfläche mit einer sehr hohen spezifischen Oberfläche zur Ansiedlung von menschlichen oder tierischen Zellen dienen kann. Gleichzeitig kann das erfindungsgemäße Chitingerüst mit oder ohne Zellen für die Wundheilung, aber auch für viele andere Zwecke außerhalb der Biologie und Medizin zur Anwendung kommen.
Besonders vorteilhaft werden Hornschwämme der Spezies Aplysina cauliformis, Aplysina fistrularis, Aplysina cavernicola, Aplysina aerophoba, Aplysina gerardogreeni, Aplysina archeri, Aplysina fulva, Aplysina insularis, Aplysina caissara, Aplysina lacunosa, Aplysina pergamentacea, Aplysina alcicornis, Aplysina cristagallus, Aplysina capensis, Aplysina lactuca sp.n., Aplysina lingua sp.n., Aplysina murcyana sp.n., Aplysina orthoreticulata sp.n., Aplysina pseudolacunosa sp.n., Aplysina solangeae sp.n., Aiolochroia crassa, Verongula gigantea, Verongula rigida und/oder Verongula reiswigi eingesetzt. Insbesondere die Spezies Verongida umfasst zahlreiche Mitglieder, und ist durch folgendes charakterisiert.
Die Art Verongida umfasst vier Familien, die sich alle durch ihre Struktur und Zusammensetzung unterscheiden.
Aplysinidae ist die größte Verongida-Familie mit 26 Spezies von drei Gattungen (Aplysina, Verongula, Aiolochroia). Sie sind definiert durch ein anatomisches Faserskelett mit Mark und Rinde. Verongida Bergquist umfasst Schwämme mit einem fasrigen Skelett, das miteinander verbunden oder in dendritischer Form aufgebaut ist.
lanthellidae ist die zweitgrößte Verongida-Familie mit 12 Spezies von drei Gattungen (lanthella, Anomoianthella, Hexadella). Sie unterscheiden sich von anderen Verongida-Familien durch das Vorhandensein der Choanozyten-Kammern.
Aplysinellidae besteht aus 9 Spezies von drei Gattungen (Aplysinella, Porphyria, Suberea) und sie sind definiert durch ein dendritisches Faserskelett mit Mark und Rinde. Aplysina Nardo sind oft große Schwämme mit intensiver Farbe und verschiedenen Formen. Diese Schwämme weisen ein Skelett auf, welches nur durch markartige Fasern gekennzeichnet ist, die in dreidimensionalen Maschen angeordnet sind, ohne Nadeln oder fremde Trümmer. Eine Anzahl an bioaktiven Eigenschaften ist für die Aplysina-abgeleiteten bromierten Verbindungen bekannt: sie sind antibiotisch, antibakteriell, antifungal, antiviral und insbesondere cytotoxisch/antitumoral. Aplysina ist weit verbreitet im tropischen Süd-West-Atlantik, weit verbreitet vor der brasilianischen Küste. Aplysina ist eine von wenigen Schwammgattungen, die in beträchtlich größerer Menge in Atlantik als im Indischen oder Pazifischen Ozean vorkommen.
Pseudoceratinidae besteht aus 4 Spezies von einer Gattung (Pseudoceratina) und ist definiert durch ein dendritisches Faserskelett nur mit Mark.
Der besondere Vorteil der erfindungsgemäßen Chitingerüste besteht vor allem in seiner großen inneren Oberfläche. Diese Oberfläche wird geschätzte auf 25 - 34 m2 für ein Schwammskelettstück von 3 - 4 g Trockengewicht. Diese große innere Oberfläche macht es möglich, dass eine große Flüssigkeits- oder Gelmenge gespeichert werden kann.
Die große innere Oberfläche ist ausschlaggebend für die Anwendung als zwei- oder dreidimensionales Chitin-Netzwerk als Flüssigkeitsreservoir für die verschiedensten Flüssigkeiten und gelbildende Medien, wie biotechnologisch eingesetzte Zellen, Bakterien, Hefen oder elektrolytische Lösungen für nachfolgende Mineralbildungsprozesse oder für die Metallisierung der Faseroberfläche. Das faserartige Skelett von Hornschwämmen wird genutzt als biomimetisches Gerüst für die Anlagerung von menschlichen Knochenzellen, für das Wachstum und die Differenzierung von Zellen, für die Untersuchung von speziellen elastischen und bioaktiven Eigenschaften der Zellen für die biomedizinische Anwendung und für die Anwendung in den Materialwissenschaften. Das Chitingerüst von Hornschwämmen wird als faserbasierendes Naturprodukt für eine große Anzahl von praktischen Anwendungen einsetzbar sein.
Die Hornschwämme können aus der natürlichen Umgebung stammen, in Meeresfarmen oder Aquakulturen oder aus Primmorphen in Aquarien kultiviert worden sein.
Weiterhin wird durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von zwei- oder dreidimensionalen Chitingerüsten von Hornschwämmen aus dem Meer mittels der Probenvorbereitung mit deionisiertem Wasser, einer Behandlung mit Basen- und Säurelösungen, und einer abschließenden Wasserstoffperoxid-Behandlung die nahezu vollständige Entfernung von Proteinen, Lipiden, Pigmenten und Mineralkomponenten aus dem Chitingerüst erreicht.
Ein typischer Verfahrensablauf zur Reinigung und Extraktion der Hornschwämme bis zur Vorlage eines gereinigten zwei- oder dreidimensionalen Chitingerüstes erfolgt durch eine Behandlung mit 2,5 M NaOH, 20 % Essigsäure und 35 % Wasserstoffperoxid. Anschließend können die extrahierten Gerüste durch analytische Methoden (IR, Raman, Festkörper-CNMR-Spektroskopie) charakterisiert werden.
Nachfolgend werden Verfahren zur Extraktion und Reinigung von Chitin aus Meeresschwämmen der Art Verongida beschrieben.
Chitin kann von Schwammkörpern durch Anwendung einer chemischen Behandlung, die nachfolgend beschrieben wird, gewonnen werden. Um die Kontaminierung des Chitins als Endprodukt zu minimieren, werden die Proben einer Reihe von Extraktionsschritten unterworfen. Jeder Schritt dient zur Verringerung der Verunreinigungen. Der Extraktionsprozess kann eine Basenextraktion, eine Säurenextraktion, eine Wasserstoffperoxid-Behandlung und Waschschritte, beispielsweise mit deionisiertem Wasser vor und nach jedem der Behandlungsschritte enthalten. Es können aber auch noch andere Behandlungsschritte aufgenommen werden.
Das Waschen mit deionisiertem Wasser beinhaltet die Behandlung der Proben mit deionisiertem Wasser bei Raumtemperatur, oder bei 37 0C oder bei 50 0C. Dadurch werden alle wasserlöslichen Substanzen, wie Pigmente aus dem Schwamm extrahiert und es wird die Auflösung der Schwammzellen erreicht.
Die Basenextraktion bei den o.g. Temperaturen beinhaltet die Behandlung der Proben mit einer Lösung mit einem genügend hohen pH-Wert zur Zerstörung und Auflösung der Proteine, die in den Proben enthalten sind, und zur Entfernung der Reste von Silicium und Pigmenten. Dabei wird die Base für 24 h, 12 h oder 6 h gerührt, in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Probe. Das verbleibende zwei- oder dreidimensionale Gerüst, ein faserartiges Skelettmaterial, wird neutralisiert und ist bereit für die weitere Behandlung. Die Basenbehandlung wird mit NaOH oder KOH in Abhängigkeit von der Probe durchgeführt. Die Basenbehandlung kann durchgeführt werden in einer Lösung, welche eine Konzentration von 1 ,5 - 5 M NaOH oder KOH aufweist. Üblicherweise beträgt die Endkonzentration 2,5 M NaOH oder KOH. Temperaturen und Dauer der Basenbehandlung hängen von der Probe ab und können zusammen mit der Molarität der Base optimiert werden. Andere Basenbehandlungen fallen auch unter die erfindungsgemäße Lösung.
Die Extraktion mit deionisiertem Wasser kann an Meeresschwämmen bei Raumtemperatur zur Entfernung von Kontaminationen durchgeführt werden, die wasserlöslich sind.
Die Säureextraktion bei den o.g. Temperaturen schließt die Behandlung der Probe mit einer sauren Lösung bei ausreichend niedrigem pH-Wert ein, damit das Kalziumkarbonat zersetzt und Proteinreste und Pigmentreste aufgelöst werden können. Dabei wird die Säure typischerweise zwischen 6 und 24 h gerührt. Das verbleibende zwei- oder dreidimensionale Gerüst, ein faserartiges Skelettmaterial, wird neutralisiert und ist bereit für die weitere Verarbeitung oder Anwendung. Üblicherweise wird Essigsäure mit einer Konzentration von 5 - 25 % verwendet, wobei typischerweise 20 %-ige Essigsäure eingesetzt wird. Temperatur und Dauer der Behandlung hängen von der Konzentration der Säure und der Beschaffenheit der Probe ab.
Bei der Wasserstoffperoxid-Behandlung wird die Probe in eine
Wasserstoffperoxidlösung überführt, unter anderem um Pigmente zu zersetzen. Nach der Behandlung (typischerweise 15 - 60 min) wird das zwei- oder dreidimensionale Schwammgerüst neutralisiert und ist bereit für die Weiterverarbeitung oder Anwendung. Üblicherweise wird die Wasserstoffperoxid- Behandlung in einer Lösung mit einer Endkonzentration von 5 % bis 55 % durchgeführt. Typisch ist eine Endkonzentration von 35 %. Die Temperatur und Dauer der Behandlung hängen von der Konzentration des Wasserstoffperoxides und der Beschaffenheit der Probe ab.
Zusätzlich kann das so gewonnene Chitingerüst durch verschiedene Verfahren charakterisiert werden, wie enzymatischer Chitinverdau, Röntgend iffraktion, Infrarot- und Raman- oder NMR-Spektralanalyse.
Mit der erfindungsgemäßen Lösung können die erfindungsgemäßen zwei- oder dreidimensionalen gereinigten Chitingerüste direkt mit Zellen besiedelt werden.
Die Frage, ob ein Gerüst generell anwendbar ist für Wundverbände, hängt von der Fähigkeit zur schnellen und effektiven Zellbildung und Adhäsion, der Ausbreitung, der Bildung von extrazellulärer Matrix, von homogenen Zellen und der Matrixverteilung, der Formstabilität sowie der Bioabbaubarkeit in einem Zeitraum von 3 - 6 Monaten in vivo ab. Alle diese Eigenschaften werden von den erfindungsgemäßen zwei- oder dreidimensionalen gereinigten Chitingerüsten von Hornschwämmen in sehr guter Art und Weise erfüllt, so dass sie sich sehr gut als Gerüst für Wundverband-Anwendungen eignen.
Die erfindungsgemäßen Chitingerüste können zur in vivo oder in vitro Kultivierung von Zellen, insbesondere von Gewebezeiien, speziell von Hautfibroblasten verwende! werden. Grundsätzlich ist auch eine Besiedelung mit anderen Zelien möglich. Vorzugsweise dient das Material ais Transplantat für Hautwunden, wo seine Poren allmählich durch körpereigene Fibroblasten besiedelt werden und unter Entstehung einer neodermalen Hautstruktur das Maleπai allmählich enzymahsch abgebaut wird.
Die Chitingerüste können zur Immobilisierung unterschiedlicher Zeiitypen eingesetzt werden. So begünstigt das offenporige, grobstrukturierte und saugfähige Chitingerüst etwa die Besiedelung mit dermalen Fibroblasten zum Aufbau einer Dermis unά die glatte oder (z. B, rnäanderförrnig) oberflächenfeinstruktuπerte Trennschicht auf der gegenüberliegenden Seite die Besiedeiung mit Keratinozyten zur Synthese einer Epidermis. Die Chitingerüste trennen einerseits die Zeiltypen und schützen die Wunde vor Infektionen und ermöglichen femer den Austausch von Signalstoffen, Nährstoffen. Stimulanzien etc.
Nachfolgend wird die Erfindung an mehreren Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Beispiel 1
Zur Herstellung eines dreidimensionalen Chitingerüstes wird ein Stück von einem Meeresschwamm der Spezies Aplysina cauliformis mit den Abmessungen 15 cm Länge, 7 cm Breite und 4 cm Dicke getrocknet und in kleine Stücke von 1 cm Länge geschnitten. Ein Stück des getrockneten Schwammes wird in ein laugenbeständiges Plastgefäß mit einem Aufnahmevermögen von 2 I überführt. 1 I deionisiertes Wasser wird zugegeben und das Schwammstück mittels eines mechanischen Rührers mit 100 U/min für 6 h bei Raumtemperatur gerührt. Um die Verdampfung des Wassers zu verhindern, wird das Gefäß verschlossen und abgedichtet. Nach 6 h Rühren wird der Rührer entfernt. Die Hauptmenge der Lösung, welche durch Pigmente bräunlich gefärbt ist, wird abgegossen und das verbliebene Schwammstück wird solange mit deionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand farblos ist. Danach wird 1 I einer 2,5 M Natronlauge zu dem gewaschenen Schwamm gegeben und der Schwamm wiederum für 24 h bei Raumtemperatur in der Lösung gerührt. Auch hier wird das Gefäß abgedichtet, um die Verdampfung der Natronlauge zu verhindern. Danach wird wiederum die Lösung abgegossen und das Schwammstück im deionisiertem Wasser solange gewaschen bis der pH-Wert der Lösung neutral ist. Das Schwammstück wird dann in einen Behälter mit 200 ml 20%-iger Essigsäure eingebracht und wird dort für 6 h bei Raumtemperatur gerührt. Der Behälter ist zur Verhinderung der Säureabdampfung abgedichtet. Wiederum wird dann das Schwammstück mit deionisiertem Wasser gewaschen bis die Lösung farblos ist und der pH-Wert neutral bleibt.
Diese Verfahrensweise wird insgesamt dreimal wiederholt. Dabei wird ein dreidimensionales Chitinskelett erhalten, welches in einen Behälter mit 200 ml einer 35%-igen Wasserstoffperoxidlösung gegeben wird. Dort wird das Schwammstück mittels eines mechanischen Rührers mit 100 U/m für 15 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Wasserstoffperoxid lösung wird anschließend abgegossen und das Schwammstück mit deionisiertem Wasser so lange gewaschen bis der pH-Wert der Lösung neutral ist und keine Blasen mehr sichtbar sind. Das Schwammstück wird dann bei 4 C°gelagert.
Nachfolgend werden in das gereinigte dreidimensionale Chitingerüst aus einem Hornschwamm künstliche Chondrozyten in vitro kultiviert. Dazu werden die künstlichen Chondrozyten aus Schweineknieknorpeln mit Collagenase B (1 ,5 mg/ml) und Hyaluronidase (0,1 mg/ml) über Nacht bei 37 0C gehalten. Etwa eine Million frisch gewonnener Zellen werden in das Chitingerüst injiziert und in vitro kultiviert in einem chondrogenen Medium /DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) ergänzt mit 5 μg/ml Insulin, 5 μg/ml Transferrin, 5 ng/ml selenige Säure, o,1 μM Dexamethason, 0,17 mM Ascorbinsäure-2phosphat, 1 mM Natriumpyruvat, 0,35 mM Prolin, 1 ,25 mg/ml BSA) zu dem 10 ng/ml TGFß hinzugefügt wurden. Nach 6 Wochen wurden die Zellverteilung, die Zellvitalität und die knorpelähnliche Matrixsynthese untersucht. Zur histologischen Auswertung wurde das Gerüst in 4 %- igem Formalin dehydratisiert und in Paraffin eingelagert. Die Proben werden serienmäßig in Abschnitte von 5 μm aufgeteilt. Nach der Deparaffizierung werden die Proben mit alcian blue gefärbt mit Antikörpern des Collagentyps Il alcian blue (1 % chroma) nach Standardprotokoll, markiert mit Nuclear fast red (chroma), dreimal gewaschen, dehydratisiert, mit XEM gewaschen und eingebetet in Eukitt. Für die immunohistochemische Untersuchung des Collagentyps Il werden die Abschnitte inkubiert mit 2mg/ml Hyaluronidase (700 WHO-U/mg) und 1 mg/ml Pronase in PBS bei 37C für 15 und 30 min. Es folgt eine Wäsche und Blockierung mit 5% BSA. Die Abschnitte werden inkubiert mit einem ersten Maus-Antityp Il Collagen monoklonalen Antikörpern (1 ,000 in % BSA, ICN), über Nacht bei 4 0C gewaschen, inkubiert mit Biotin-SP-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus IgG (1/500 in TBS) und abschließend inkubiert mit einem Streptavidin- Biotin-Komplex/AP für 30 min bei Raumtemperatur, gewaschen und gefärbt mit fast red Substrat. Der Zellkern wird gefärbt mit Hematoxylin und die Proben wurden ständig gelagert in Aquatex. Die Chondrozyten haften gut auf dem Chitingerüst an und die Zellen synthetisieren eine knorpeltypische extrazelluläre Matrix.
Beispiel 2
Um die Verwendung von Chitingerüsten auch für vorkultivierte Zellen abschätzen zu können, werden Chondrozyten, die gemäß Beispiel 1 gewonnen wurden, zur Zellbildung mit 1 ,5 x 104/ cm2 in Niedrig-Glykose DMEM mit 10% FCS und 100 Teile/ml Penicillin, Streptomyzin gemischt und in einer feuchten Atmosphäre mit 6% CO2 bei 37 0C gehalten. Die Zellen werden geteilt am Zusammenfluss von 2 Passagen. Etwa 1 Million Zellen werden in Fibrinogen getränkt, mit Thrombin gemischt und in das Chitingerüst injiziert, und nach 6 Wochen Kultivierung in TGVß wird ein chondrogenes Medium gemäß Beispiel 1 erhalten.
Um die Zellvitalität in dem Chitin-Chondrozyten-Gerüst darzustellen, wird das Gerüst in 2% niedrigschmelzende Agarose in 1 x PBS eingebetet und in 50 μm Abschnitte geschnitten, zur Anwendung in einem Vibratom (Leica VT 1000S). Die Proben werden überführt auf einen Objektträger und mit Fluoreszin-Diazetat (100 nm) zur Darstellung der lebenden Zellen und mit Propidum iodide (5 μg/ml) zur Sichtbarmachung der toten Zellen gefärbt. Nach der Inkubation für 5 min in Dunkelheit bei Raumtemperatur werden die Proben dreimal gewaschen mit PBS um das überschüssige Färbemittel zu entfernen und in ein wässriges Medium gebettet und unverzüglich mit einem Fluoreszensmikroskop analysiert. FDA und PI werden bei 380 - 490 oder 465-550 nm stimuliert. Beispiel 3
Um die Anwendung von Chitingerüsten in einem /n-v/Vo-Modell beurteilen zu können, werden menschliche künstliche Chondrozyten verwendet. Etwa 1 Million der frisch gewonnen Chondrozyten werden in Fibrinogen, das mit Thrombin gemischt ist, getaucht und in ein Chitingerüst injiziert, nach der Polymerisation von Fibringel. Subkutane Teile werden vorbereitet aus dem Rücken kleinen SCID Mäusen (Alter 8- 10 Wochen), um Chondrozyten zu erhalten, die in Chitingerüsten zur Zellbildung implantiert werden. Die Proben werden 4 Wochen später untersucht.
Die frisch gewonnen Chondrozyten haften gut auf dem Chitingerüst an und die Zellen synthetisieren eine knorpeltypische extrazelluläre Matrix.
Beispiel 4
Zur Herstellung eines zweidimensionalen Chitingerüstes wird ein Teil eines Meeresschwammes lanthella basta mit den Abmessungen 20 cm Länge, 10 cm Breite und 0,4 cm Dicke getrocknet und in kleine Stücke von 1 cm2 Abmessungen geschnitten. Ein Stück des getrockneten Schwammes wird in ein laugenbeständiges Plastgefäß mit einem Aufnahmevermögen von 2 I gegeben. 1 I deionisiertes Wasser wird zugegeben und das Schwammstück mittels eines mechanischen Rührers mit 100 U/min für 12 h bei 37 0C gerührt. Die Hauptmenge der Lösung, welche durch Pigmente bräunlich gefärbt ist, wird abgegossen und das verbliebene Schwammstück wird solange mit deionisiertem Wasser gewaschen, bis die Lösung farblos bleibt. Danach wird 1 I einer 2,5 M Kaliumlauge zu dem gewaschenen Schwamm gegeben und der Schwamm wiederum für 6 h bei 50 0C in der Lösung gerührt. Danach wird wiederum die Lösung abgegossen und das Schwammstück im deionisiertem Wasser solange gewaschen bis der pH-Wert der Lösung neutral ist. Das Schwammstück wird dann in einen Behälter eingebracht, in dem 200 ml einer 10%-igen Salzsäure vorhanden sind, und wird dort für 12 h bei 37 0C gerührt. Wiederum wird dann das Schwammstück mit deionisierten Wasser gewaschen bis die Lösung farblos ist und der pH-Wert neutral bleibt. Diese Verfahrensweise wird insgesamt zweimal wiederholt. Danach bleibt ein zweidimensionales Chitinskelett übrig, welches in einen Behälter mit 200 ml einer 35%-igen Wasserstoffperoxid lösung gegeben wird. Dort wird das Schwammstück mittels eines mechanischen Rührers mit 100 U/m für 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Wasserstoffperoxidlösung wird anschließend abgegossen und das Schwammstück mit deionisiertem Wasser so lange gewaschen bis der pH-Wert der Lösung neutral ist und keine Blasen mehr sichtbar sind. Das Schwammstück wird dann bei 4 C°gelagert.
Nachfolgend werden in das gereinigte zweidimensionale Chitingerüst aus einem Hornschwamm künstliche Chondrozyten in vitro kultiviert. Dazu werden die künstlichen Chondrozyten aus Schweineknieknorpeln mit Collagenase B (1 ,5 mg/ml) und Hyaluronidase (0,1 mg/ml) über Nacht bei 37 0C gehalten. Etwa eine Million frisch gewonnener Zellen werden in das Chitingerüst injiziert und in vitro kultiviert in einem chondrogenen Medium /DMEM ergänzt mit 5 μg/ml Insulin, 5 μg/ml Transferrin, 5 ng/ml selenige Säure, o,1 μM Dexamethason, 0,17 mM Ascorbinsäure- 2phosphat, 1 mM Natriumpyruvat, 0,35 mM Prolin, 1 ,25 mg/ml BSA) zu dem 10 ng/ml TGFß hinzugefügt wurden. Nach 6 Wochen wurden die Zellverteilung, die Zellvitalität und die knorpelähnliche Matrixsynthese untersucht. Zur histologischen Auswertung wurde das Gerüst in 4 %-igem Formalin dehydratisiert und in Paraffin eingelagert. Die Proben werden serienmäßig in Abschnitte von 5 μm aufgeteilt. Nach der Deparaffizierung werden die Proben mit alcian blue gefärbt mit Antikörpern des Collagentyps Il alcian blue (1 % chroma) nach Standardprotokoll, markiert mit Nuclear fast red (chroma), dreimal gewaschen, dehydratisiert, mit XEM gewaschen und eingebettet in Eukitt. Für die immunohistochemische Untersuchung des Collagentyps Il werden die Abschnitte inkubiert mit 2mg/ml Hyaluronidase (700 WHO-U/mg) und 1 mg/ml Pronase in PBS bei 37C für 15 und 30 min. Es folgt eine Wäsche und Blockierung mit 5% BSA. Die Abschnitte werden inkubiert mit einem ersten Maus- Antityp Il Collagen monoklonalen Antikörpern (1 ,000 in % BSA, ICN), über Nacht bei 4 0C gewaschen, inkubiert mit Biotin-SP-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus IgG (1/500 in TBS) und abschließend inkubiert mit einem Streptavidin- Biotin-Komplex/AP für 30 min bei Raumtemperatur, gewaschen und gefärbt mit fast red Substrat. Der Zellkern wird gefärbt mit Hematoxylin und die Probe wird ständig gelagert in Aquatex. Die frisch gewonnen Chondrozyten haften gut auf dem Chitingerüst an und die Zellen synthetisieren eine knorpeltypische extrazelluläre Matrix.
Für die Anzucht einer Osteoblasten Primärkultur wurden Patienten nach deren Zustimmung Knochenbiopsien aus Ober- und Unterkiefer entnommen. Die Biopsien wurden in steriler 0,9% NaCI Lösung aufgenommen und unter einer Laminar Flow für 30 Sekunden mit 70% Ethanol desinfiziert. Je nach Größe der Probe wurden die Biopsien zwei bis viermal mit Phosphate Buffered Saline (PBS, 0,1 M, pH 7,2, Firma Biochrom, Berlin, Deutschland) gespült. Mit einem Luehr wurden die Knochen in ca. 1 χ2mm große Stücke geteilt und jeweils 3-4 Stücke in eine 25cm3-Kulturflasche (Falcon, Dickinson, NY, USA), die zuvor mit 1 ,5 ml Opti-MEM 1 Medium (Gibco Laboratories Life Technologies, NY, USA) gefüllt worden waren, platziert. Die Primärkulturen wurden für 7 Tage bei 37° C im Brutschrank bei 5 Vol.-%CO2 und wasserdampfgesättigter Luft inkubiert, um das Anwachsen der Biopsien zu ermöglichen. Um die Knochenbiopsien herum bildeten sich zuerst einzelne Osteoblasten, die später zu einem konfluenten Zellrasen auswuchsen und den Boden der Kulturflasche bedeckten. Vorsichtig wurden danach alle 3-4 Tage zweimal 1 ml und einmal 1 ,5 ml Medium zugegeben, sodass sich insgesamt 5 ml Medium in der Kulturflasche befanden. Alle 3-4 Tage wurde bei den Proben ein Mediumwechsel durchgeführt. Nach 4-5 Wochen, abhängig vom Zellwachstum, wurden die Osteoblasten aus dem Zellverband herausgelöst. Dazu wurde Trypsin mit PBS im Verhältnis 1 :3 gemischt und auf den Zellrasen pipettiert. Die Flaschen wurden für 10 Minuten bei 37° C / 5% CO2 inkubiert, um die Zellen aus dem Zellverband herauszulösen und zu isolieren. Die Zellsuspension wurde mit PBS über einen 100 μm-Cell-Strainer in ein 50 ml Tube gegeben. Bei 1120 g (g = Erdbeschleunigung) wurde die Zellsuspension 12 Minuten zentrifugiert. In eine 75cm3-Kulturflasche wurden 30 ml Medium gegeben und das entstandene Zellpellet, nachdem es in 1 ml Medium resuspendiert wurde, hinzu pipettiert. Diese erste Passage nach der Primärkultur wurde durch wöchentlichen Mediumwechsel 2-4 Wochen weiterversorgt. Um die Osteoblasten in gleicher Zellzahl auf die zwei- und oder dreidimensionalen Chitingerüste zu bringen, mussten sie abermals aus dem Zellverband herausgelöst werden. Das Medium wurde vom Rand der Kulturflasche abgesaugt und der Zellrasen mit 10 ml PBS gespült, da das Medium die Wirkung des Trypsins antagonisiert. In die Kulturflaschen wurde je 1 ml Trypsin, im Verhältnis 1 :3 mit PBS gemischt, gegeben und für 10 Minuten im Brutschrank inkubiert. Unter dem Lichtmikroskop wurde kontrolliert, ob sich die Zellen abgekugelt und vom Flaschenboden gelöst hatten. Die abgelösten Zellen wurden in 30 ml PBS aufgenommen und in einer Tube für 12 Minuten bei 1120 g zentrifugiert. Die Pufferlösung wurde abgesaugt und das entstandene Zellpellet je nach Größe in 1-3 ml Medium resuspendiert. Da auf jedes Chitingerüst (1x 2 cm) einer Suspension bestehend aus 1 χ105 Zellen, pipettiert werden sollte, musste die Zellzahl/ml in der Neubauer Zählkammer bestimmt werden. Durch die entsprechende Zugabe von Medium in die Tube konnte die gewünschte Zellkonzentration von 1 χ106 Zellen/ml erreicht werden. Dadurch ist es während des Versuchs möglich, einen direkten Vergleich des Zellwachstums unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen zu erstellen.
Die frisch gewonnen Osteoblasten haften gut auf dem Chitingerüst an und die Zellen synthetisieren eine collagenöse extrazelluläre Matrix.
Kultivierung von Keratinozyten
Als Haut-Donoren dienten Patienten, die sich einer plastisch-chirurgischen Operation unterzogen. Ausschlusskriterien waren akut oder chronisch kranke, oder unter zytotoxischer/zytostatischer Therapie stehende Patienten. Die gewonnene Haut wurde im OP-Saal unter sterilen Bedingungen in 50 ml Plastiktubes, welche ca. 15 ml kalzium- und magnesiumfreies PBS-Medium enthielten, gefüllt und umgehend ins Labor gebracht. Um weiterhin sterile Bedingungen zu gewährleisten wurden alle folgenden Arbeitsschritte an einer sterilen Werkbank mit laminar air flow (Microflow, Fa. MDH, England) durchgeführt. Für die Anlage einer Primärkultur war ein steriles Präparationsbesteck mit mindestens einer Hautschere, einem Skalpell und zwei Pinzetten notwendig. Für alle Pipettierarbeiten wurden 1 , 2, 5, 10, 25 und 50 ml Pipetten mit dem accu-jet® (Fa. Brand, Wertheim) als Aufziehhilfe verwendet. Für kleine Pipettiermengen kamen Transferpetten in 0-10 μl, 5-50 μl, 25-250 μl und 100-1.000 μl Ausführungen (Fa. Brand, Wertheim) mit entsprechenden Aufziehhülsen zum Einsatz. Zuerst wurde die Haut soweit von subkutanem Fett- und Bindegewebe befreit, bis nur noch eine sehr dünne Subkutanschicht an der Epidermis anhaftete. Dieser Arbeitsschritt wurde in einer mit PBS gefüllten Petrischale durchgeführt. Um Kontaminationen entgegenzuwirken wurde das präparierte Hautstück für eine Minute in 70%igen Alkohol getränkt und danach zweimal in PBS gewaschen. Anschließend wurde zur Trennung der Epidermis- Dermis-Verankerungen in 0,5%iger Dispase, der 10 μg/ml Gentamycin und Hepes- Buffer 2,5% beigesetzt waren, entweder für 3 bis 4 Stunden bei 37°C im Brutschrank (Fa. WTB Binder, Tuttlingen) oder über Nacht bei + 4°C im Kühlschrank (Fa. Siemens, München), inkubiert. Die Epidermis wurde dann von der Dermis mit einer Pinzette abgezogen. Die Dermis wurde später für die Anlage der Fibroblasten-Kultur benötigt. Nach einem weiteren Waschvorgang in PBS wurde die Epidermis in viele kleine Stücke zerschnitten und in mit je 5 ml Trypsin/ EDTA gefüllte 15 ml Plastiktubes (M9) portioniert. In einem Schüttelwasserbad (Fa. Haake, Karlsruhe) wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Um diesen enzymatischen Prozess der Zelldissoziation mechanisch zu unterstützen wurden die Plastiktubes alle 5 Minuten kurz manuell geschüttelt. Durch Zugabe von jeweils 7 ml NCS 10%ig (M10) wurde die Enzymreaktion abgestoppt. Die so entstandene Keratinozyten- Trypsin-NCS- Suspension wurde über einen 70 μm Filter filtriert und dann für 10 Minuten bei 1.000 U/min und 4°C zentrifugiert (Mega Fuge 3,OR. Fa. Heraeus, Osterode).
Nach Verwerfen des Überstands wurde das Zellpellet in 10,5 ml serumfreiem Keratinozyten- Medium, dem als Supplements 0,1-0,2 ng/ml EGF (epidermal growth factor), 20-30 μg/ml Rinderhypophysenextrakt und 2 μg/ml Gentamycin zugefügt waren, resuspendiert. Das Kulturmedium wurde im Kühlschrank gelagert und vor Gebrauch auf 37°C erwärmt. Zur Zellzählung wurden 0,5 ml der Suspension abgezogen. Hiervon wurden 50 μl mit 50 μl Trypanblau in einem Reaktionsgefäß vermischt und damit eine Neubauer-Zählkammer gefüllt. Beschädigte Zellen nahmen den Farbstoff auf und wurden nicht mitgezählt. Um die Anzahl der Keratinozyten pro 10 ml resuspendiertem Pellet zu erhalten, wurde bei Betrachtung unter dem Durchlichtmikroskop (Standard 20, Fa. Zeiss, Jena) die Summe aus 4 x 16 Kleinquadraten ausgezählt und mit 50.000 multipliziert. Ausgesät wurden 3 bis 4 Millionen Zellen in 13 ml Keratinozyten-Medium pro 75 cm2 Zellkulturflasche. Unter 90%iger Luftfeuchtigkeit und 5%iger CO2 Begasung wurden die Keratinozyten in einem Brutschrank bei 37°C inkubiert. Alle 2 bis 3 Tage wurde das Nährmedium gewechselt. Bei nahezu konfluenter Bewachsungssituation wurde die erste Passage durchgeführt. Nach Absaugen des Nährmediums wurde in 3 ml Trypsin/ EDTA für 5 Minuten bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Durch Beklopfen der Kulturflaschen wurden die Lösungsvorgänge mechanisch unterstützt. Die entstandene Einzelzellsuspension wurde unter dem Auflichtmikroskop (Axiovert 25, Fa. Zeiss, Jena) kontrolliert, bevor die Trypsinaktivität erneut mit 5 ml 10%igem NCS beendet wurde. Nach Zentrifugation, Resuspension und Auszählung wurden die Zellen wieder in eine 75 cm2 Zellkulturflasche ausgesät, in eine Spinnerkultur eingegeben und für die Besiedlung eines dreidimensionalen Chitingerüstes benutzt.
Die frisch gewonnen Keratinozyten haften gut auf dem Chitingerüst an und die Zellen synthetisieren eine collagenöse extrazelluläre Matrix.
Kultivierung von Fibroblasten
Das primäre Vorgehen erfolgte analog dem Anlegen einer Keratinozyten-Kultur. Die nach Dispasebehandlung erhaltene Dermis wurde in PBS gewaschen und anschließend mit einer Hautschere maximal zerkleinert. Der entstandene Dermisbrei wurde zur Auftrennung der Interzellularkontakte in einem Enzymgemisch aus jeweils 15 ml Collagenase und Hyaluronidase in einem 50 ml Plastiktube für 3 Stunden im Schüttelwasserbad bei 37°C inkubiert. Nach Zentrifugation der Fibroblasten- Einzelzellsuspension und Resuspension in Fibroblasten-Medium dem 1 % Penicillin- Steptomycin und 10% FBS als Supplements beigefügt waren, wurde ausgezählt. Anschließend wurden die Zellen in jeweils 13 ml Fibroblastenmedium pro 75 cm2 Kulturflasche ausgesät. Der Mediumwechsel erfolgte alle 2 Tage. Zum Passagieren wurde für das Ablösen der Zellen vom Kulturflaschenboden und für die Spaltung der Interzellularkontakte 5 ml Trypsin pro Kulturflasche und eine Einwirkzeit von 10 Minuten benötigt.
Die frisch gewonnen Fibroblasten haften gut auf dem dreidimensionalen Chitingerüst an und die Zellen synthetisieren eine extrazelluläre Matrix.

Claims

Patentansprüche
1. Zwei- oder dreidimensionales gereinigtes Chitingerüst von Hornschwämmen, welches direkt auf der Gerüstoberfläche mit menschlichen oder tierischen Zellen besiedelt ist.
2. Chitingerüst von Hornschwämmen nach Anspruch 1 , welches aus Hornschwämmen der Gattung Aplysina, Aiolochroia und/oder Verongula bestehen.
3. Chitingerüst von Hornschwämmen nach Anspruch 2, welches aus Hornschwämmen der Spezies Aplysina cauliformis, Aplysina fistrularis, Aplysina cavernicola, Aplysina aerophoba, Aplysina gerardogreeni, Aplysina archeri, Aplysina fulva, Aplysina insularis, Aplysina caissara, Aplysina lacunosa, Aplysina pergamentacea, Aplysina alcicornis, Aplysina cristagallus, Aplysina capensis, Aplysina lactuca sp.n., Aplysina lingua sp.n., Aplysina murcyana sp.n., Aplysina orthoreticulata sp.n., Aplysina pseudolacunosa sp.n., Aplysina solangeae sp.n., Aiolochroia crassa, Verongula gigantea, Verongula rigida und/oder Verongula reiswigi besteht.
4. Zweidimensionales Chitingerüst von Hornschwämmen nach Anspruch 1 , welches aus Hornschwämmen der Familie lanthella besteht.
5. Chitingerüst von Hornschwämmen nach Anspruch 4, welches aus Hornschwämmen der Spezies lanthella basta, lanthella aerophoba, lanthella concentrica, lanthella flabelliformis, lanthella homei, lanthella labirinthus, lanthella macula, lanthella quandrangulata, lanthella reticulate und/oder lanthella topsenti besteht.
6. Chitingerüst von Hornschwämmen nach Anspruch 1 , bei dem die Hornschwämme aus dem Meer stammen oder in Farmen oder durch biotechnologische Verfahren gezüchtet worden sind.
7. Chitingerüst von Hornschwämmen nach Anspruch 6, bei dem die Hornschwämme durch biotechnologische Verfahren aus Primmorphen gezüchtet worden sind.
8. Chitingerüst von Hornschwämmen nach Anspruch 1 , bei dem die Hornschwämme frisch, getrocknet, gefroren oder gefriergetrocknet sind.
9. Chitingerüst von Hornschwämmen nach Anspruch 1 , bei dem die Hornschwämme gereinigt und/oder sterilisiert sind und in Größe und Form für die Anwendung bearbeitet worden sind.
10. Chitingerüst von Hornschwämmen nach Anspruch 1 , bei dem als Zellen Knorpelzellen (Chondrozyten), Hautzellen, Muskelzellen (Myozyten), Fibroblasten, Leberzellen (Hepatozyten), Pankreaszellen, Knochenzellen (Osteoblasten, Osteoklasten, Osteozyten), Nervenzellen (Neuronen) und/oder embryonale und/oder adulte Stammzellen pflanzlicher und/oder tierischer, und/oder menschlicher Herkunft vorhanden sind.
11. Chitingerüst von Hornschwämmen nach Anspruch 1 , bei dem künstliche Zellen vorhanden sind.
12. Verfahren zur Herstellung eines zwei- oder dreidimensionalen gereinigten Chitingerüstes von Hornschwämmen bei dem von den Hornschwämmen mittels einer Base und/oder Base-Säure und/oder Base-Säure- Wasserstoffperoxid-Behandlung bei Temperaturen zwischen 20 und 50 0C alle anderen Bestandteile von Chitingerüst entfernt werden, und abschließend die Form und Größe des Chitingerüstes für den jeweiligen Anwendungsfall bearbeitet wird, und nachfolgend Zellkulturen auf die Chitingerüstoberfläche aufgebracht werden und das so behandelte Chitingerüst in steriler Umgebung den Wachstumsbedingungen der Zellen ausgesetzt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem nach der Base und/oder Base-Säure und/oder Base-Säure-Wasserperoxid-Behandlung das Chitingerüst in eine wässrige Säure eingebracht und danach gewaschen wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Base und/oder Base-Säure und/oder Base-Säure-Wasserperoxid-Behandlung mehrmals hintereinander durchgeführt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem als Basen, NaOH oder KOH eingesetzt werden.
16. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem als Säuren HCl oder Essigsäure (Propionsäure, Bernsteinsäure) eingesetzt werden.
17. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem wässrige Basen und Säuren eingesetzt werden.
18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem 2 bis 4 molare wässrige Basen und 20 bis 40 %ige wässrige Säuren eingesetzt werden.
19. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Behandlung bei Temperaturen zwischen 0 und 100 0C durchgeführt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Wachstumsbedingungen für Zellen auf zwei- und/oder dreidimensionalen Chitingerüsten als Zellenträger mit vergrößerter Besiedlungsoberfläche realisiert werden.
21. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem zweidimensionale Chitingerüste für flächige Anwendungen eingesetzt werden, und dreidimensionale Chitingerüste für Anwendungen eingesetzt werden, bei denen ein Volumen auszufüllen ist.
22. Verwendung von zwei- oder dreidimensionalen gereinigten Chitingerüsten von Hornschwämmen in der Biologie, Medizin und Technik.
23. Verwendung von zwei- oder dreidimensionalen, gereinigten Chitingerüsten aus Hornschwämmen nach Anspruch 22 als Zellenträger in Gewebekonstruktionen (Tissue Engineering) oder für die Züchtung, plastischer Chirurgie, Wundheilung; als Gerüste zur Mineralisierung mittels Kalziumphosphat-, Kalziumkarbonat- und/oder Silikatphasen zur Herstellung von Knochenersatzmatehalien; als Gerüste zur Adsorption von Strukturproteinen, wie Kollagen, Keratin, Fibrin, und/oder als extrazelluläre und/oder saurere Matrixproteinen zwecks Herstellung von Knochenersatzmatehalien; als Gerüste zur Gelbildung mittels Polysaccharide, wie Alginat, Chitosan, Karragenan, Proteine, wie Gelatine, und/oder künstliche Polymere; als Gerüst zur Metallisierung; als Gerüste für Filtersysteme zur Adsorption von Schwermetallen, und/oder löslicher Abfallprodukte der Farbindustrie, Lederherstellung und Galvanik; als Gerüste zur Adsorption von Enzymen zwecks Entwicklung von Konstrukten mit vergrößerter enzymatischer Oberfläche; als Gerüste für die biotechnologische Aufzucht von Mikroorganismen, wie Bakterien, Pilze, Hefe, welche zur Produktion von Vitaminen, Hormonen und anderen pharmazeutischen Produkten geeignet sind; als Gerüst zur Ablagerung von Fischeiern für die Aufzucht von Aquarien- und industriellen Fischarten.
24. Verwendung von zwei- oder dreidimensionalen, gereinigten Chitingerüsten aus Hornschwämmen nach Anspruch 23 als Gerüst zur Metallisierung mittels Metallionen mit katalytischer Wirkung zwecks Herstellung von zwei-und dreidimensionalen Konstrukten mit vergrößerter katalytischer Oberfläche.
PCT/EP2010/061595 2009-08-28 2010-08-10 Zwei- oder dreidimensionales gereinigtes chitingerüst von hornschwämmen, verfahren zu seiner herstellung und verwendung WO2011023531A2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102009028980.1 2009-08-28
DE102009028980A DE102009028980A1 (de) 2009-08-28 2009-08-28 Zwei- oder dreidimensionales gereinigtes Chitingerüst von Hornschwämmen, Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2011023531A2 true WO2011023531A2 (de) 2011-03-03
WO2011023531A3 WO2011023531A3 (de) 2011-06-23

Family

ID=43460178

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2010/061595 WO2011023531A2 (de) 2009-08-28 2010-08-10 Zwei- oder dreidimensionales gereinigtes chitingerüst von hornschwämmen, verfahren zu seiner herstellung und verwendung

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102009028980A1 (de)
WO (1) WO2011023531A2 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114867501A (zh) * 2019-12-19 2022-08-05 紫露草公司 用于骨组织工程的生物材料
CN114891551A (zh) * 2022-04-19 2022-08-12 抚顺市望花演武化工厂 一种生物细胞氢载体骨架的制备方法及其组合物

Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2217823A (en) 1936-07-09 1940-10-15 Visking Corp Process for producing articles of regenerated chitin and the resulting articles
US4029727A (en) 1975-04-16 1977-06-14 The University Of Delaware Chitin films and fibers
US4066735A (en) 1974-02-19 1978-01-03 Peniston Quintin P Process for demineralization of crustacea shells
JPS5310804A (en) 1976-03-12 1978-01-31 Mitsubishi Electric Corp Preparing slip ring
US4199496A (en) 1974-09-05 1980-04-22 Johnson Edwin L Process for the recovery of chemicals from the shells of crustacea
US4293098A (en) 1979-04-20 1981-10-06 Systems Consultants, Inc. Recovery of active chitin and enhanced protein meal
WO1986006082A1 (en) 1985-04-12 1986-10-23 MATCON RA^oDGIVENDE INGENIO^/RFIRMA A/S A process for recovering chitin from materials in which chitin occurs together with or connected to proteinaceous substances
JPH0341131A (ja) 1989-07-07 1991-02-21 Nippon Suisan Kaisha Ltd 多孔性キチン成形体の製造法
US5021207A (en) 1986-12-16 1991-06-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company High strength fibers from chitin derivatives
US5053113A (en) 1990-05-16 1991-10-01 Krepets Guennadi I Method of chitin production from chitin containing raw materials
US5210186A (en) 1988-11-18 1993-05-11 Mikalsen Gunnar Method for recovery and separation of chitin, proteins and astaxanthin and esters thereof
JPH0747113A (ja) 1993-08-06 1995-02-21 San Five Kk 治療剤
US5900479A (en) 1995-05-05 1999-05-04 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chitin-based coatings
US5905035A (en) 1997-04-15 1999-05-18 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Fungus useful for chitin production
CN1462756A (zh) 2002-05-31 2003-12-24 陈玉柱 蜗牛甲壳质的生产方法
US6693180B2 (en) 2002-04-04 2004-02-17 China Textile Institute Composite sponge wound dressing made of β-Chitin and Chitosan and method for producing the same

Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2217823A (en) 1936-07-09 1940-10-15 Visking Corp Process for producing articles of regenerated chitin and the resulting articles
US4066735A (en) 1974-02-19 1978-01-03 Peniston Quintin P Process for demineralization of crustacea shells
US4199496A (en) 1974-09-05 1980-04-22 Johnson Edwin L Process for the recovery of chemicals from the shells of crustacea
US4029727A (en) 1975-04-16 1977-06-14 The University Of Delaware Chitin films and fibers
JPS5310804A (en) 1976-03-12 1978-01-31 Mitsubishi Electric Corp Preparing slip ring
US4293098A (en) 1979-04-20 1981-10-06 Systems Consultants, Inc. Recovery of active chitin and enhanced protein meal
WO1986006082A1 (en) 1985-04-12 1986-10-23 MATCON RA^oDGIVENDE INGENIO^/RFIRMA A/S A process for recovering chitin from materials in which chitin occurs together with or connected to proteinaceous substances
US5021207A (en) 1986-12-16 1991-06-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company High strength fibers from chitin derivatives
US5210186A (en) 1988-11-18 1993-05-11 Mikalsen Gunnar Method for recovery and separation of chitin, proteins and astaxanthin and esters thereof
JPH0341131A (ja) 1989-07-07 1991-02-21 Nippon Suisan Kaisha Ltd 多孔性キチン成形体の製造法
US5053113A (en) 1990-05-16 1991-10-01 Krepets Guennadi I Method of chitin production from chitin containing raw materials
JPH0747113A (ja) 1993-08-06 1995-02-21 San Five Kk 治療剤
US5900479A (en) 1995-05-05 1999-05-04 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chitin-based coatings
US5905035A (en) 1997-04-15 1999-05-18 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Fungus useful for chitin production
US6693180B2 (en) 2002-04-04 2004-02-17 China Textile Institute Composite sponge wound dressing made of β-Chitin and Chitosan and method for producing the same
CN1462756A (zh) 2002-05-31 2003-12-24 陈玉柱 蜗牛甲壳质的生产方法

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABE ET AL., TISSUE ENG., vol. 10, 2004, pages 585 - 594
CHANG; TSAI, J.AGRIC. FOOD CHEM., vol. 45, pages 1900 - 1904
EHRLICH, H. ET AL., J. EXP. ZOOL., vol. 308B, pages 347 - 356
EHRLICH, H. ET AL., J. EXP. ZOOL., vol. 308B, pages 473 - 483
FLORES, J. APPL. POLYM. SCI., vol. 104, 2007, pages 3909 - 3916
PERCOT; VITON; DOMARD, BIOMACROMALECULES, vol. 4, 2003, pages 12 - 18
PRUDDEN ET AL., SURGERY, GYNECOLOGY AND OBSTETICS, vol. 105, 1957, pages 283
ROER; DILLAMEN, AMER. ZOOL., vol. 24, pages 893 - 909
SUZIKI ET AL., J. MATER. SCI. MED., vol. 19, 2008, pages 1307 - 1315

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114867501A (zh) * 2019-12-19 2022-08-05 紫露草公司 用于骨组织工程的生物材料
CN114891551A (zh) * 2022-04-19 2022-08-12 抚顺市望花演武化工厂 一种生物细胞氢载体骨架的制备方法及其组合物

Also Published As

Publication number Publication date
DE102009028980A1 (de) 2011-03-03
WO2011023531A3 (de) 2011-06-23
DE102009028980A8 (de) 2011-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60115271T2 (de) Verfahren zur herstellung von seidenfibroinvliesstoffen
Subhedar et al. Nanocellulose in biomedical and biosensing applications: A review
DE69634454T2 (de) Zusammensetzungen und Verfahren mit Bezug auf eine auf natürliche Weise sekretierte Matrix
DE69632313T2 (de) Desorbierbare extrazelluläre matrix für rekonstruktion eines knorpelgewebes
EP1265986A2 (de) Verfahren zur in vitro-herstellung von dreidimensionalem, vitalem knorpel- oder knochengewebe und dessen verwendung als transplantationsmaterial
DE60106056T2 (de) Kollagenmembran mit makromolekularer anordnung
EP1747264A2 (de) Multizelluläre gewebe- und organkultursysteme
JPS59164723A (ja) 再生コラーゲンフイブリルを含有する基質及びその製造方法
DE10026789B4 (de) Knorpelersatz und Verfahren zu dessen Herstellung
DE102006026591B4 (de) Verfahren zur Isolierung von Kollagen aus kollagenhaltigem Gewebe
DE102006033168A1 (de) Verwendung von Gelatine und einem Vernetzungsmittel zur Herstellung einer vernetzenden therapeutischen Zusammensetzung
DE60110801T2 (de) Verfahren zur herstellung von auf chitosan basierenden filmen mit verbessertem zellanhaftvermögen, daraus resultierendes produkt and anwendungen
DE69826119T2 (de) Heteropolysaccharid-konjugate, halbinterpenetrierende polysaccharidgele und verfahren zu deren herstellung
EP1109837B1 (de) Verfahren zur gewinnung hochgereinigter alginate
DE60107560T2 (de) Preadipozyten enthaltende biomaterialien zur regeneration von weichgewebe
EP3098305B1 (de) Kollagenhaltiger zellträger
WO2011023531A2 (de) Zwei- oder dreidimensionales gereinigtes chitingerüst von hornschwämmen, verfahren zu seiner herstellung und verwendung
Wang et al. Preparation and biological properties of silk fibroin/nano-hydroxyapatite/hyaluronic acid composite scaffold
CN115216441A (zh) 一种用于干细胞三维培养的复合支架及其制备方法
DE60015756T2 (de) Verfahren zur gewinnung eines thermostabilen mikroalgenextraktes mit oxidationshemmender- und wundheilender aktivität
EP1446441A1 (de) Verfahren zur behandlung von materialien biologischen ursprungs und kollagen-elastin-produkt
RU2791324C1 (ru) Способ получения коллагенового геля для использования в медицине и косметологии
DE112019002479B4 (de) Verfahren zur herstellung einer kollagen-laminin-matrix zur heilung von hautgeschwüren, verbrennungen und wunden beim menschen
RU2155812C1 (ru) Биотехнологический способ получения ранозаживляющего препарата
CN114558119A (zh) 一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10749822

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10749822

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2