JPS59164723A - 再生コラーゲンフイブリルを含有する基質及びその製造方法 - Google Patents
再生コラーゲンフイブリルを含有する基質及びその製造方法Info
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- JPS59164723A JPS59164723A JP58039597A JP3959783A JPS59164723A JP S59164723 A JPS59164723 A JP S59164723A JP 58039597 A JP58039597 A JP 58039597A JP 3959783 A JP3959783 A JP 3959783A JP S59164723 A JPS59164723 A JP S59164723A
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- A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
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- G—PHYSICS
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、再生コラーゲンフィブリルを含有する基質に
関し、詳細には、細胞培養用基質又は血小板の粘着能測
定用担体として有用な前記基質に関するものである。
関し、詳細には、細胞培養用基質又は血小板の粘着能測
定用担体として有用な前記基質に関するものである。
動物細胞を大量に培養し、細胞の生産する有用な物質を
大量に分離して利用するための技術は、生物工学の一分
野として注目を浴びている。また、人工臓器の学問領域
でも動物細胞を組み込んだ型の人工臓器の研究が盛んに
なりつつある。これら何れの場合にも、生体から取り出
した細胞を培養することによって、細胞を生理活性を保
持させたまま大量に増殖させることが最も重要となる。
大量に分離して利用するための技術は、生物工学の一分
野として注目を浴びている。また、人工臓器の学問領域
でも動物細胞を組み込んだ型の人工臓器の研究が盛んに
なりつつある。これら何れの場合にも、生体から取り出
した細胞を培養することによって、細胞を生理活性を保
持させたまま大量に増殖させることが最も重要となる。
コラーゲンは生体中では各臓器及び組織を構成する細胞
の支持物質即ち基質として重要な役割を果している。従
って、現存する物質のうちでは最もすぐれた細胞培養の
基質であるということができる。一般に動物細胞は基質
に粘着して成長増殖するので、有効な基質の存在が細胞
の活性維持ｔこは不可欠である。
の支持物質即ち基質として重要な役割を果している。従
って、現存する物質のうちでは最もすぐれた細胞培養の
基質であるということができる。一般に動物細胞は基質
に粘着して成長増殖するので、有効な基質の存在が細胞
の活性維持ｔこは不可欠である。
動物細胞を大量に培養増殖させる場合、巨大な基質表面
が必要となるため、基質の形状は平板状であるよりは微
粒子状である方が著しく有利である。そこで、近年、例
えば架橋デキストランを用いたビーズ状微粒子担体が大
量の細胞を培養するビーズ基質として開発され、市販さ
れている（ファルマシア・ジャパン株式会社、カタログ
Ｃｙｔｏｄｅｘ１、Ｂｅａｄｅｄ Ｍｔｃｒｏｃａｒ
ｒｉｅｒ ｆｏｒ Ｃｅ１ｌ Ｃｕ１ｔｕｒｅ参
照）。
が必要となるため、基質の形状は平板状であるよりは微
粒子状である方が著しく有利である。そこで、近年、例
えば架橋デキストランを用いたビーズ状微粒子担体が大
量の細胞を培養するビーズ基質として開発され、市販さ
れている（ファルマシア・ジャパン株式会社、カタログ
Ｃｙｔｏｄｅｘ１、Ｂｅａｄｅｄ Ｍｔｃｒｏｃａｒ
ｒｉｅｒ ｆｏｒ Ｃｅ１ｌ Ｃｕ１ｔｕｒｅ参
照）。
前記の通り生体内で各種細胞の基質の役割を果している
コラーゲンは、これまでも細胞培養の基質として利用さ
れてきた。しかしながら、従来、コラーゲンはガラスや
プラスチックの各種製品の表面に塗布された状態で基質
として用いられるか、コラーゲン酸性液を生理条件に中
和して得られるコラーゲンゲルの状態で、このゲルの表
面又は内部において細胞を培養するという方法で用いら
れてきたに過ぎない。本発明者らは、コラーゲン基質を
ビーズ状に形成して細胞が粘着する基質表面を従来の基
質に比べて著しく大きくすれば、細胞の大量培養が容易
に行なわれるようになることに着目して鋭意研究の結果
、本発明を完成するに至った。即ち、本発明によって、
不規則にからみ合った太さ１０〜５００ｍμの再生コラ
ーゲンフィブリルと、前記再生コラーゲンフィブリルの
間をこ存在する水溶液とからビーズ形状に 構成され、
前記再生コラーゲンフィブリルの含有量が２０〜０．０
１重量％であることを特徴とする再生コラーゲンフィブ
リルを含有する基質（以下、これをコラーゲンビーズと
いう）が提供される。
コラーゲンは、これまでも細胞培養の基質として利用さ
れてきた。しかしながら、従来、コラーゲンはガラスや
プラスチックの各種製品の表面に塗布された状態で基質
として用いられるか、コラーゲン酸性液を生理条件に中
和して得られるコラーゲンゲルの状態で、このゲルの表
面又は内部において細胞を培養するという方法で用いら
れてきたに過ぎない。本発明者らは、コラーゲン基質を
ビーズ状に形成して細胞が粘着する基質表面を従来の基
質に比べて著しく大きくすれば、細胞の大量培養が容易
に行なわれるようになることに着目して鋭意研究の結果
、本発明を完成するに至った。即ち、本発明によって、
不規則にからみ合った太さ１０〜５００ｍμの再生コラ
ーゲンフィブリルと、前記再生コラーゲンフィブリルの
間をこ存在する水溶液とからビーズ形状に 構成され、
前記再生コラーゲンフィブリルの含有量が２０〜０．０
１重量％であることを特徴とする再生コラーゲンフィブ
リルを含有する基質（以下、これをコラーゲンビーズと
いう）が提供される。
前記コラーゲンビーズは、本発明の方法に従つて、コラ
ーゲン水溶液を水と混和しない有機溶媒中に多数の小滴
として分散させて乳濁液を形成し、前記乳濁液に水と混
和する有機溶媒とアルカリとを加えて前記小滴を固化さ
せることによって得ることができる。
ーゲン水溶液を水と混和しない有機溶媒中に多数の小滴
として分散させて乳濁液を形成し、前記乳濁液に水と混
和する有機溶媒とアルカリとを加えて前記小滴を固化さ
せることによって得ることができる。
本発明のコラーゲンビーズは太さ１０〜５００ｍμの再
生コラーゲンフィブリルを２０〜０．０１重量％含有し
、この再生コラーゲンフィブリルは不規則にからみ合っ
ていることが走査型電子顕微鏡によって確められる。こ
の再生コラーゲンフィブリルの間には水溶液が存在し、
この水溶液は、他の、水と混和しつる液体と置換可能で
ある。例えば、生理食塩水が再生コラーゲンフィブリル
の間に存在するコラーゲンビーズの場合、このコラーゲ
ンビーズを細胞培養用の水性培地に浸漬すると、前記生
理食塩水はこの水性培地によって置換される。
生コラーゲンフィブリルを２０〜０．０１重量％含有し
、この再生コラーゲンフィブリルは不規則にからみ合っ
ていることが走査型電子顕微鏡によって確められる。こ
の再生コラーゲンフィブリルの間には水溶液が存在し、
この水溶液は、他の、水と混和しつる液体と置換可能で
ある。例えば、生理食塩水が再生コラーゲンフィブリル
の間に存在するコラーゲンビーズの場合、このコラーゲ
ンビーズを細胞培養用の水性培地に浸漬すると、前記生
理食塩水はこの水性培地によって置換される。
本発明において用いられるコラーゲンは、若い動物のコ
ラーゲン組織を、中性塩水溶液及び希酸水溶液でそれぞ
れ抽出して得られる中性塩可溶性コラーゲン及び酸可溶
性コラーゲンであってよい。
ラーゲン組織を、中性塩水溶液及び希酸水溶液でそれぞ
れ抽出して得られる中性塩可溶性コラーゲン及び酸可溶
性コラーゲンであってよい。
又、これらの抽出操作では可溶性を示さない不溶性コラ
ーゲンをペプシンのようなタンパク質加水分解酵素で処
理して可溶性とした酵素溶解コラーゲン（アテロコラー
ゲン）や、同じく不溶性コラーゲンをアルカリ処理Ｚこ
より可溶化したコラーゲンを本発明で用いられるコラー
ゲンとすることができる。ここで、アテロコラーゲン（
Ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ）とは、テロペプチドのと
れたコラーゲンに対して比較的最近つけられた名称であ
る。前記の不溶性コラーゲンは、分子末端に存在するテ
ロペプチドを介し形成されている分子間架橋によって不
溶性之なっている。タンパク質加水分解酵素であるペプ
シンを不溶性コラーゲンに作用させるとテロペプチドの
みが消化されて分子間架橋が切断されるので、この不溶
性コラーゲンは可溶化されてアテロコラーゲンが得られ
る。アテロコラーゲンは又、希酸や中性塩の水溶液で抽
出された可溶性コラーゲンをペプシン処理しても得られ
る。
ーゲンをペプシンのようなタンパク質加水分解酵素で処
理して可溶性とした酵素溶解コラーゲン（アテロコラー
ゲン）や、同じく不溶性コラーゲンをアルカリ処理Ｚこ
より可溶化したコラーゲンを本発明で用いられるコラー
ゲンとすることができる。ここで、アテロコラーゲン（
Ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ）とは、テロペプチドのと
れたコラーゲンに対して比較的最近つけられた名称であ
る。前記の不溶性コラーゲンは、分子末端に存在するテ
ロペプチドを介し形成されている分子間架橋によって不
溶性之なっている。タンパク質加水分解酵素であるペプ
シンを不溶性コラーゲンに作用させるとテロペプチドの
みが消化されて分子間架橋が切断されるので、この不溶
性コラーゲンは可溶化されてアテロコラーゲンが得られ
る。アテロコラーゲンは又、希酸や中性塩の水溶液で抽
出された可溶性コラーゲンをペプシン処理しても得られ
る。
本発明の方法に使用される、水と混和しない有機溶媒と
して、トルエン、四塩化炭素、クロロホルム、シクロヘ
キサン、エーテル、石油エーテル、ペンゾールなどが挙
げられる。これらの有機溶媒を適当に混合して、その比
重を、分散させようとするコラーゲン水溶液の比重にで
きる限り近づけて、コラーゲン水溶液が浮き上ったり、
沈降したりするのを防ぐことが、コラーゲン水溶液を小
滴に分散させるのに好ましい。；ラーゲン溶液を小滴に
分散させて乳濁液を形成するには、水と混和しない有機
溶媒にコラーゲン水溶液を入れ、攪拌又は振盪するなど
、慣用の乳濁液調製法を用いることができる。分散され
る小滴の大きさの調節は、攪拌又は振盪の程度を加減す
ることによって行なうことができる。コラーゲン溶液の
使用量は有機溶媒と等量又はそれより少ないことが望ま
しい。
して、トルエン、四塩化炭素、クロロホルム、シクロヘ
キサン、エーテル、石油エーテル、ペンゾールなどが挙
げられる。これらの有機溶媒を適当に混合して、その比
重を、分散させようとするコラーゲン水溶液の比重にで
きる限り近づけて、コラーゲン水溶液が浮き上ったり、
沈降したりするのを防ぐことが、コラーゲン水溶液を小
滴に分散させるのに好ましい。；ラーゲン溶液を小滴に
分散させて乳濁液を形成するには、水と混和しない有機
溶媒にコラーゲン水溶液を入れ、攪拌又は振盪するなど
、慣用の乳濁液調製法を用いることができる。分散され
る小滴の大きさの調節は、攪拌又は振盪の程度を加減す
ることによって行なうことができる。コラーゲン溶液の
使用量は有機溶媒と等量又はそれより少ないことが望ま
しい。
コラーゲン水溶液の濃度はコラーゲン５チ以下が望まし
く、５チを超すと粘稠になり過ぎて分散が困難となる。
く、５チを超すと粘稠になり過ぎて分散が困難となる。
又、形成された乳濁液の安定性をよくするために、界面
活性剤を少量添加することが好ましい。使用される界面
活性剤は非イオン界面活性剤が好ましく、例えばソルビ
タン脂肪酸エステルについての米国アトラス・パウダー
社の登録商標であるスパン（Ｓｐａｎ） 系のもの及
びポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステルにつ
いてのアトラス＋１ パウダー社の登録商標であるトウ
イーン（Ｔｗｅ ｅｎ ）系のものが挙げられる。界面
活性剤の使用量は、有機溶媒とコラーゲン溶液との混合
物の重量を基準にして０．１−以下が好ましい。
活性剤を少量添加することが好ましい。使用される界面
活性剤は非イオン界面活性剤が好ましく、例えばソルビ
タン脂肪酸エステルについての米国アトラス・パウダー
社の登録商標であるスパン（Ｓｐａｎ） 系のもの及
びポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステルにつ
いてのアトラス＋１ パウダー社の登録商標であるトウ
イーン（Ｔｗｅ ｅｎ ）系のものが挙げられる。界面
活性剤の使用量は、有機溶媒とコラーゲン溶液との混合
物の重量を基準にして０．１−以下が好ましい。
本発明の方法において、小滴の同化に使用されるアルカ
リとして、アンモニア、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ
２ ＨＰ Ｏａ ） 、水酸化ナトリウムなどの塩基性
物質を挙げることができる。又、小滴の同化に使用され
る、水と混和する有機溶媒として、メタノール、エタノ
ール、アセトンなどが挙げられる。これらのアルカリ及
び有機溶媒は、乳濁液にこれらを同時に加えるか、又は
有機溶媒を加えた後にアルカリを加えるようにして使用
される。
リとして、アンモニア、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ
２ ＨＰ Ｏａ ） 、水酸化ナトリウムなどの塩基性
物質を挙げることができる。又、小滴の同化に使用され
る、水と混和する有機溶媒として、メタノール、エタノ
ール、アセトンなどが挙げられる。これらのアルカリ及
び有機溶媒は、乳濁液にこれらを同時に加えるか、又は
有機溶媒を加えた後にアルカリを加えるようにして使用
される。
水と混和する有機溶媒の使用量は乳濁液の重量を基準に
して５０チ以上であることが好ましい。アルカリの使用
量は分散したコラーゲン水溶液の小滴を中和するだけの
量であればよい。水と混和する有機溶媒と塩基性物質の
水溶液との混合物を乳濁液に加えて小滴を固化させる方
法が特に好ましく、特にアンモニア水をメタノール、エ
タノール又はアセトンに加えた混合物が好ましく、アン
モニア含有量は通常１〜２％である。
して５０チ以上であることが好ましい。アルカリの使用
量は分散したコラーゲン水溶液の小滴を中和するだけの
量であればよい。水と混和する有機溶媒と塩基性物質の
水溶液との混合物を乳濁液に加えて小滴を固化させる方
法が特に好ましく、特にアンモニア水をメタノール、エ
タノール又はアセトンに加えた混合物が好ましく、アン
モニア含有量は通常１〜２％である。
アルカリと、水と混和する有機溶剤とを加えた後、乳濁
液をゆるやかに１時間以上攪拌すると、コラーゲン水溶
液の小滴が固化する。この際、用いる容器に予めシリコ
ーンオイルなどを塗布しておくと、固化したコラーゲン
ビーズが容器壁−こ粘着するのを防ぐことができるので
好都合である。
液をゆるやかに１時間以上攪拌すると、コラーゲン水溶
液の小滴が固化する。この際、用いる容器に予めシリコ
ーンオイルなどを塗布しておくと、固化したコラーゲン
ビーズが容器壁−こ粘着するのを防ぐことができるので
好都合である。
固化したコラーゲンビーズは遠心分離又は網でろ別分離
され、メタノール、エタノール、アセトンなどの、水と
混和する有機溶媒で繰り返し洗浄され、次に水でさらに
繰り返し洗浄される。
され、メタノール、エタノール、アセトンなどの、水と
混和する有機溶媒で繰り返し洗浄され、次に水でさらに
繰り返し洗浄される。
こうして得られたコラーゲンビーズはその粒度が多少不
揃いなので、ふるい分けにより各メツシュ範囲の画分、
例えば４８メツシユふるい上、４８〜１００メツシュ画
分、１００〜２００メツシユ両分及び２００メツシユふ
るい下のように粒度を揃えることができる。
揃いなので、ふるい分けにより各メツシュ範囲の画分、
例えば４８メツシユふるい上、４８〜１００メツシュ画
分、１００〜２００メツシユ両分及び２００メツシユふ
るい下のように粒度を揃えることができる。
本発明のコラーゲンぐ−ズは、前記の通り不規則にから
み合った再生コラーゲンフィブリルを含み、培養液中に
懸濁した状態で細胞培養の基質として用いると、細胞粘
着に有効な基質表面を太き（することができ、細胞の大
量培養を容易にする。
み合った再生コラーゲンフィブリルを含み、培養液中に
懸濁した状態で細胞培養の基質として用いると、細胞粘
着に有効な基質表面を太き（することができ、細胞の大
量培養を容易にする。
コラーゲン水溶液として例えば濃度１チの溶液を使用し
た場合、水洗後に最終的に得られるコラーゲンビーズの
コラーゲン含量は約１チであり、残り９９チが主として
水である。従って、このビーズが培養液中で平衡化する
と、ビーズ中の水の大部分は培養液で置換され、ビーズ
の比重は培養液の比重と殆んど一致するようになり、培
養中もゆるやかな攪拌によってビーズはゆつ（り移動し
、ビーズに粘着した細胞を損傷することがない。
た場合、水洗後に最終的に得られるコラーゲンビーズの
コラーゲン含量は約１チであり、残り９９チが主として
水である。従って、このビーズが培養液中で平衡化する
と、ビーズ中の水の大部分は培養液で置換され、ビーズ
の比重は培養液の比重と殆んど一致するようになり、培
養中もゆるやかな攪拌によってビーズはゆつ（り移動し
、ビーズに粘着した細胞を損傷することがない。
本発明のコラーゲンビーズはまた血小板の粘着能測定に
も利用することができる。血小板はコラーゲンフィブリ
ルに粘着し、さらに凝集反応を起こすことが知られてい
る。従って、本発明のコラーゲンビーズをカラムに充て
んし、このカラムに、血小板を含む試料溶液（血液；ク
エン酸ナトリウム、ＥＤＴＡなど血液凝固阻止剤を添加
した血液：又は多血小板血漿など）を通し、カラム内の
コラーゲンビーズに粘着する血小板数を数えることによ
って血小板粘着能を測定することができる。この粘着能
測定値から血液の凝固活性を知ることができ、血液が関
係する病気例えば血栓症の診断の１つとして利用するこ
とができるのである。
も利用することができる。血小板はコラーゲンフィブリ
ルに粘着し、さらに凝集反応を起こすことが知られてい
る。従って、本発明のコラーゲンビーズをカラムに充て
んし、このカラムに、血小板を含む試料溶液（血液；ク
エン酸ナトリウム、ＥＤＴＡなど血液凝固阻止剤を添加
した血液：又は多血小板血漿など）を通し、カラム内の
コラーゲンビーズに粘着する血小板数を数えることによ
って血小板粘着能を測定することができる。この粘着能
測定値から血液の凝固活性を知ることができ、血液が関
係する病気例えば血栓症の診断の１つとして利用するこ
とができるのである。
本発明のコラーゲンビーズの製造を無菌条件下で行なう
と無菌のビーズを得ることができるが、無菌条件下で製
造されなかったコラーゲンビーズは、密封容器に入れ、
ｒ線を好ましくは０，５〜１．５Ｍｒ ａｄ 照射す
ることによって無菌とすることができる。
と無菌のビーズを得ることができるが、無菌条件下で製
造されなかったコラーゲンビーズは、密封容器に入れ、
ｒ線を好ましくは０，５〜１．５Ｍｒ ａｄ 照射す
ることによって無菌とすることができる。
次に本発明を実施例について詳細に説明する。
実施例１
取り出した新鮮な仔牛の真皮をステファン（Ｓｔｅｐｈ
ａｎ）社製のミクロカッターで微細に粉砕し、この微細
粉を０．１Ｍ酢酸す） ＩＪウム水溶液でくり返し洗浄
後、水洗した。次に、水洗後の微細粉を０．５ Ｍ酢酸
水溶液を用いて抽出処理を行ない、残渣である不溶性コ
ラーゲンをガラスフィルターでろ別した。
ａｎ）社製のミクロカッターで微細に粉砕し、この微細
粉を０．１Ｍ酢酸す） ＩＪウム水溶液でくり返し洗浄
後、水洗した。次に、水洗後の微細粉を０．５ Ｍ酢酸
水溶液を用いて抽出処理を行ない、残渣である不溶性コ
ラーゲンをガラスフィルターでろ別した。
抽出された酸可溶性コラーゲンを含むろ液を０．０２Ｍ
リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ ＨＰ ０４ ）水溶
液を用いて透析を行ない、酸可溶性コラーゲンをコラー
ゲンフィブリルとして沈殿させた。このコラーゲンフィ
ブリルをくり返し水洗した後、０．０１Ｎ塩酸に溶解し
て、コラーゲン濃度を１重量％とした。この酸可溶性コ
ラーゲン濃度の比重は約１．００であった。
リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ ＨＰ ０４ ）水溶
液を用いて透析を行ない、酸可溶性コラーゲンをコラー
ゲンフィブリルとして沈殿させた。このコラーゲンフィ
ブリルをくり返し水洗した後、０．０１Ｎ塩酸に溶解し
て、コラーゲン濃度を１重量％とした。この酸可溶性コ
ラーゲン濃度の比重は約１．００であった。
一方、容器ニトルエン８００ｙｎＡ！トクロロホルム２
２０ ｍｌｌを入れて混合溶媒を調製した。この混合溶
媒の比重は前記酸可溶性コラーゲン溶液の比重とほぼ等
しかった。この混合溶媒にスパン２０（スパン（Ｓｐａ
ｎ） はソルビタンモノラウリン酸エステル系非イオ
ン界面活性剤についてのアトラス・バラタ−社の登録商
標）を混合溶媒の重量の０．１チになるように加えた後
、さらに前記１％濃度の酸可溶性コラーゲン水溶液′５
００ ｍｌｊを加えた。
２０ ｍｌｌを入れて混合溶媒を調製した。この混合溶
媒の比重は前記酸可溶性コラーゲン溶液の比重とほぼ等
しかった。この混合溶媒にスパン２０（スパン（Ｓｐａ
ｎ） はソルビタンモノラウリン酸エステル系非イオ
ン界面活性剤についてのアトラス・バラタ−社の登録商
標）を混合溶媒の重量の０．１チになるように加えた後
、さらに前記１％濃度の酸可溶性コラーゲン水溶液′５
００ ｍｌｊを加えた。
次ζこ、容器を約３０秒間激しく振盪した後、直ちに２
％のアンモニアを含有するエタノールＩＪを加え、ゆる
やかに２時間攪拌したところ、固化した分散状態の微粒
子状コラーゲンビーズが得られた。このビーズの分散液
を２００メツシユのステンレス製金網でろ過してビーズ
をろ別した。得られたビーズを５００ ｍｌのエタノー
ルに浸漬−ろ別する方法で合計６回の洗浄を行なった。
％のアンモニアを含有するエタノールＩＪを加え、ゆる
やかに２時間攪拌したところ、固化した分散状態の微粒
子状コラーゲンビーズが得られた。このビーズの分散液
を２００メツシユのステンレス製金網でろ過してビーズ
をろ別した。得られたビーズを５００ ｍｌのエタノー
ルに浸漬−ろ別する方法で合計６回の洗浄を行なった。
次ｌここのビーズに１１の蒸留水による洗浄を６回くり
返し行なった後、４８メツシユ、１００メツシユ及び２
００メツシユの各ステンレス製金網で順次ふるい分けを
行って粒度分布を測定し、次の結果を得た。
返し行なった後、４８メツシユ、１００メツシユ及び２
００メツシユの各ステンレス製金網で順次ふるい分けを
行って粒度分布を測定し、次の結果を得た。
４８メツシユふるい上 約６０チ４８〜１００
メツシユ画分 約５０チ１［）Ｏ〜２００メツシュ
画分 約１０％２００メツシユふるい下 約１
０チ第１図はこのコラーゲンビーズの走査型電子顕微鏡
写真を示している。第１図から明らかなように、再生コ
ラーゲンフィブリルが不規則にからみ合っている。
メツシユ画分 約５０チ１［）Ｏ〜２００メツシュ
画分 約１０％２００メツシユふるい下 約１
０チ第１図はこのコラーゲンビーズの走査型電子顕微鏡
写真を示している。第１図から明らかなように、再生コ
ラーゲンフィブリルが不規則にからみ合っている。
これらの各粒度のビーズを密封ガラス瓶に人へγ線を０
．７５ Ｍｒａｄ 照射して滅菌を行なった。このう
ち、４８〜１００メツシュ画分の粒度のコラーゲンビー
ズを用いてヒト真皮繊維芽細胞の培養試験を行なったと
ころ、細胞は数時間でビーズ上に粘着し、５日後にはビ
ーズの表面を完全に覆う程増殖し、このビーズは細胞の
基質としてすぐれたものであることがわかった。第２図
は、前記培養試験に使用した後のコラーゲンビーズの形
状を示す位相差顕微鏡写真である。
．７５ Ｍｒａｄ 照射して滅菌を行なった。このう
ち、４８〜１００メツシュ画分の粒度のコラーゲンビー
ズを用いてヒト真皮繊維芽細胞の培養試験を行なったと
ころ、細胞は数時間でビーズ上に粘着し、５日後にはビ
ーズの表面を完全に覆う程増殖し、このビーズは細胞の
基質としてすぐれたものであることがわかった。第２図
は、前記培養試験に使用した後のコラーゲンビーズの形
状を示す位相差顕微鏡写真である。
実施例２
実施例１で仔牛の真皮から酸可溶物を抽出した後の残渣
である不溶性コラーゲンを湿潤状態で１００？採取し、
これに０．５Ｍ酢酸１１を加え、さらにペプシン０．１
？を加えて、２０℃で３日間攪拌を行なった。この処理
によって不溶性コラーゲンは溶解して粘稠なペプシン可
溶化コラーゲン（即ちアテロコラーゲン）溶液となった
。このアテロコラーゲン溶液をガラスフィルターでろ通
抜、ろ液に苛性ソーダ水溶液を加えてｐＨ７，５に調節
したところ、繊維状の沈殿が生成した。この沈殿を遠心
分離機によって分離した後、蒸留水で３回洗浄を行ない
、次に適嶺量の０．０１ Ｎ塩酸に溶解し、コラーゲン
濃度２チの溶液（比重約１．０１）を調製した。
である不溶性コラーゲンを湿潤状態で１００？採取し、
これに０．５Ｍ酢酸１１を加え、さらにペプシン０．１
？を加えて、２０℃で３日間攪拌を行なった。この処理
によって不溶性コラーゲンは溶解して粘稠なペプシン可
溶化コラーゲン（即ちアテロコラーゲン）溶液となった
。このアテロコラーゲン溶液をガラスフィルターでろ通
抜、ろ液に苛性ソーダ水溶液を加えてｐＨ７，５に調節
したところ、繊維状の沈殿が生成した。この沈殿を遠心
分離機によって分離した後、蒸留水で３回洗浄を行ない
、次に適嶺量の０．０１ Ｎ塩酸に溶解し、コラーゲン
濃度２チの溶液（比重約１．０１）を調製した。
トルエン４００ ｍｌとクロロホルム１１５ｍ１とから
混合溶媒（比重約１．００８ ）を調製し、これに非イ
オン界面活性剤トウィーン８０（トウィーン（Ｔｗｅｅ
ｎ）はソルビタンモノオレアートのエチレンオキシド縮
合物系非イオン界面活性剤についてのアトラス・パウダ
ー社の登録商標）を混合溶媒の重量に対して０．１チ加
え、さらに前記の２チコ２−ゲン水溶液を１５０ ｍｌ
加えた。得られた溶液を高速回転のホモジナイザーを用
いて１０，０００ｒｐｍで１分間高速攪拌を行なって均
質にした後、直ちにアンモニアを２チ含有するメタノー
ル中に混合し、ゆっくり攪拌を行なったところ、微粒子
ビーズが固化した状態で得られた。
混合溶媒（比重約１．００８ ）を調製し、これに非イ
オン界面活性剤トウィーン８０（トウィーン（Ｔｗｅｅ
ｎ）はソルビタンモノオレアートのエチレンオキシド縮
合物系非イオン界面活性剤についてのアトラス・パウダ
ー社の登録商標）を混合溶媒の重量に対して０．１チ加
え、さらに前記の２チコ２−ゲン水溶液を１５０ ｍｌ
加えた。得られた溶液を高速回転のホモジナイザーを用
いて１０，０００ｒｐｍで１分間高速攪拌を行なって均
質にした後、直ちにアンモニアを２チ含有するメタノー
ル中に混合し、ゆっくり攪拌を行なったところ、微粒子
ビーズが固化した状態で得られた。
これらの微粒子ビーズを金網で分別し、メタノールで６
回洗浄し、さらに３回水洗を行なった後、実施例１と同
様にして粒度分布を測定して次の結果を得た。
回洗浄し、さらに３回水洗を行なった後、実施例１と同
様にして粒度分布を測定して次の結果を得た。
４８メツシヱふるい上 約１０９６４８〜１
００メツシユ画分 約６０９１゜１００〜２００
メツシユ画分 約２０チ２００メツシユふるい下
約１０チこれらのビーズはいずれもコラーゲン
フィシ）から構成されていることが走査型電子顕微鏡観
察によって確認された。
００メツシユ画分 約６０９１゜１００〜２００
メツシユ画分 約２０チ２００メツシユふるい下
約１０チこれらのビーズはいずれもコラーゲン
フィシ）から構成されていることが走査型電子顕微鏡観
察によって確認された。
ふるい分けた各ビーズを密封ガラス瓶ｌこ入れ、ｒ線を
Ｉ Ｍｒａｄ 照射して消毒した。このうち、４８〜
１００メツシュ画分のビーズとヒ）Ｘ皮繊維芽構胞とを
用いて懸濁培養を行なったところ、このコラーゲンビー
ズはすぐれた基質であることがわかった。
Ｉ Ｍｒａｄ 照射して消毒した。このうち、４８〜
１００メツシュ画分のビーズとヒ）Ｘ皮繊維芽構胞とを
用いて懸濁培養を行なったところ、このコラーゲンビー
ズはすぐれた基質であることがわかった。
実施例３
実施例２と同様の方法で得られたベズシン可溶化コ２−
ゲン（アテロ゛コラーゲン）を０．０１ Ｎ塩酸に溶解
し、コラーゲンの濃度が１優になるようｌこ調製した。
ゲン（アテロ゛コラーゲン）を０．０１ Ｎ塩酸に溶解
し、コラーゲンの濃度が１優になるようｌこ調製した。
この１チアテ戸＝２−ゲン溶液を、オートクレーブ消毒
した細孔径０．４５μのフィルターに通して無菌溶液と
した。
した細孔径０．４５μのフィルターに通して無菌溶液と
した。
一方、トルエン４００ ｍｌとり四ロホルム１１０ｍ１
との混合溶媒に、非イオン界面活性剤スパン２０（実施
例１参照）を０．１チ加え、この混合溶媒を、消毒した
０、２２μのミク四フィルターに通して無菌とした。得
られた無菌の混合溶媒に前記の無菌の１９６アテロコラ
ーゲン水溶液１１００ｍ加え、激しく３０秒間振盪した
。その後直ちに、この溶液に、細孔径０．２２μのフィ
ルターに通して無菌としたエタノールを５０．０ ｍｌ
加え、ゆるやかに２時間攪拌した後、２ｑ６アンモニア
水を１０ｍ１加え、ゆるやかな攪拌をさらに２時間続け
た結果、分散状態で固化した微粒子ビーズが得られた。
との混合溶媒に、非イオン界面活性剤スパン２０（実施
例１参照）を０．１チ加え、この混合溶媒を、消毒した
０、２２μのミク四フィルターに通して無菌とした。得
られた無菌の混合溶媒に前記の無菌の１９６アテロコラ
ーゲン水溶液１１００ｍ加え、激しく３０秒間振盪した
。その後直ちに、この溶液に、細孔径０．２２μのフィ
ルターに通して無菌としたエタノールを５０．０ ｍｌ
加え、ゆるやかに２時間攪拌した後、２ｑ６アンモニア
水を１０ｍ１加え、ゆるやかな攪拌をさらに２時間続け
た結果、分散状態で固化した微粒子ビーズが得られた。
このビーズを、実施例１と同様の操作で、かつ無菌下で
エタノール洗浄、水洗を行ない、さらにふるい分けを行
なった。ふるい分けの結果は次の通りであった。
エタノール洗浄、水洗を行ない、さらにふるい分けを行
なった。ふるい分けの結果は次の通りであった。
４８メツシユふるい上 約２５チ４８〜１０
０メツシユ画分 約５５チ１００〜２００メツシ
ユ画分 約１０チ２００メツシユふるい下
約１ｏｅＩｂこうして得られたコラーゲンビーズは走
査型電子顕微鏡観察の結果、再生コラーゲンフィブリル
からなっていることがわかり、又、細胞培養試験の結果
、すぐれた基質であることがわかった。
０メツシユ画分 約５５チ１００〜２００メツシ
ユ画分 約１０チ２００メツシユふるい下
約１ｏｅＩｂこうして得られたコラーゲンビーズは走
査型電子顕微鏡観察の結果、再生コラーゲンフィブリル
からなっていることがわかり、又、細胞培養試験の結果
、すぐれた基質であることがわかった。
第１図は本発明の実施例１において得られたコラーゲン
ビーズの培養試験に使用する前の走査型電子顕微鏡写真
（倍率： ｓ、ｏｏｏ ） 、第２図は、実施例１にお
いて培養試験に使用した後の、第１図に示すコラーゲン
ビーズの概略の形状を示す位相差顕微鏡写真（倍率ニア
０）である。 代理人 上屋 勝 常包芳男 ｌ 杉浦俊貴 第１図 第２図 （命令）手続補正書（方式） 昭和５８年 ７月−ツー日゛ 昭和５８′年特許願第５９５９７号 ２、発明の名称 再生コラーゲンフィブリルを含有する
基質事件との関係 特許出願人 東京都新宿区下落合３丁目５−１８ 株式会社 高 研 ６、補正により増加する発明の数 ８、補正の内容 Ｑ
枦（１）、明細書第１８頁第１０行〜第１１行の［得ら
れた・・・・・・・・・・・・・・・前の」を「得られ
た、培養試験に使用する前の；ラーゲンビーズが含有す
る再生コラーゲンフィブリルの繊維の形状の」と補正す
る。 （２）、同第１８頁第１４行目の「概略の形状」を「粒
子構造」と補正する。 一以 上− （自発）手続補正書 １、事件の表示 昭和５８年特許願第３９５９７ 号 事件との関係 特許出願人 東京都新宿区下落合３丁目５−１８ 株式会社 高 研 ５、補正命令の日付（発送日） 昭和 年 月
日６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄８、補正
の内容 明細書の特許請求の範囲を別紙の通り補正しまず０−以
上一 ２、特許請求の範囲１ １． 不規則にからみ合った太さ１０〜５００ｍμの再
生コラーゲンフィブリルと、前記再生コラーゲンフィブ
リルの間に存在する水溶液とからビーズ形状に構成され
、前記再生コラーゲンフィブリルの含有量が２０〜０．
０１重量％であるこきを特徴とする再生コラーゲンフィ
ブリルを含有する基質０ ２、 コラーゲン水溶液を水と混和しない有機溶媒中に
多数の小滴として分散させて乳濁液を形成し、前記乳濁
液に水と混和する有機溶媒とアルカリとを加えて前記小
滴を固化させ、これによって、再生コラーゲンフィブリ
ルと、この再生コラーゲンフィブリルの間に存在する水
溶液とからビーズ形状に構成された再生コラーゲンフィ
ブリルを含有する基質を製造する方法。 ６、 水と混和する有機溶媒とアルカリとを同時に加え
ることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、水と混和する有機溶媒を加えた後にアルカ、（１） すを加えることを特徴とする特許請求の範囲第ス項記載
の方法。 ５、再生コラーゲンフィブリルの含有量が２０〜０．０
１重量％である特許請求の範囲第ス項記載の方法。 （２）
ビーズの培養試験に使用する前の走査型電子顕微鏡写真
（倍率： ｓ、ｏｏｏ ） 、第２図は、実施例１にお
いて培養試験に使用した後の、第１図に示すコラーゲン
ビーズの概略の形状を示す位相差顕微鏡写真（倍率ニア
０）である。 代理人 上屋 勝 常包芳男 ｌ 杉浦俊貴 第１図 第２図 （命令）手続補正書（方式） 昭和５８年 ７月−ツー日゛ 昭和５８′年特許願第５９５９７号 ２、発明の名称 再生コラーゲンフィブリルを含有する
基質事件との関係 特許出願人 東京都新宿区下落合３丁目５−１８ 株式会社 高 研 ６、補正により増加する発明の数 ８、補正の内容 Ｑ
枦（１）、明細書第１８頁第１０行〜第１１行の［得ら
れた・・・・・・・・・・・・・・・前の」を「得られ
た、培養試験に使用する前の；ラーゲンビーズが含有す
る再生コラーゲンフィブリルの繊維の形状の」と補正す
る。 （２）、同第１８頁第１４行目の「概略の形状」を「粒
子構造」と補正する。 一以 上− （自発）手続補正書 １、事件の表示 昭和５８年特許願第３９５９７ 号 事件との関係 特許出願人 東京都新宿区下落合３丁目５−１８ 株式会社 高 研 ５、補正命令の日付（発送日） 昭和 年 月
日６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄８、補正
の内容 明細書の特許請求の範囲を別紙の通り補正しまず０−以
上一 ２、特許請求の範囲１ １． 不規則にからみ合った太さ１０〜５００ｍμの再
生コラーゲンフィブリルと、前記再生コラーゲンフィブ
リルの間に存在する水溶液とからビーズ形状に構成され
、前記再生コラーゲンフィブリルの含有量が２０〜０．
０１重量％であるこきを特徴とする再生コラーゲンフィ
ブリルを含有する基質０ ２、 コラーゲン水溶液を水と混和しない有機溶媒中に
多数の小滴として分散させて乳濁液を形成し、前記乳濁
液に水と混和する有機溶媒とアルカリとを加えて前記小
滴を固化させ、これによって、再生コラーゲンフィブリ
ルと、この再生コラーゲンフィブリルの間に存在する水
溶液とからビーズ形状に構成された再生コラーゲンフィ
ブリルを含有する基質を製造する方法。 ６、 水と混和する有機溶媒とアルカリとを同時に加え
ることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、水と混和する有機溶媒を加えた後にアルカ、（１） すを加えることを特徴とする特許請求の範囲第ス項記載
の方法。 ５、再生コラーゲンフィブリルの含有量が２０〜０．０
１重量％である特許請求の範囲第ス項記載の方法。 （２）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 不規則にからみ合った太さ１０〜５００ｍμの再
生コラーゲンフィブリルと、前記再生コラーゲンフィブ
リルの間に存在する水溶液とからビーズ形状に構成され
、前記再生コラーゲンフィブリルの含有量が２０〜０．
０１重量％であることを特徴とする再生コラーゲンフィ
ブリルを含有する基質。 ２、 コラーゲン水溶液を水と混和しない有機溶媒中に
多数の小滴として分散させて乳濁液を形成し、前記乳濁
液ｉこ水と混和する有機溶媒とアルカリとを加えて前記
小滴を固化させ、これによって、再生コラーゲンフィブ
リルと、この再生コラーゲンフィブリルの間に存在する
水溶液とからビーズ形状に構成された再生コラーゲジフ
イプリルを含有する基質を製造する方法。 ３、水と混和する有機溶媒とアルカリとを同時に加える
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、水と混和する有機溶媒を加えた後にアルカリを加え
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、Ｈ生コン−ゲンフイブリルの含有量が２０〜α０１
重量％である特許請求の範囲第１項記載の方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58039597A JPS59164723A (ja) | 1983-03-10 | 1983-03-10 | 再生コラーゲンフイブリルを含有する基質及びその製造方法 |
| US06/586,944 US4565580A (en) | 1983-03-10 | 1984-03-07 | Substrate consisting of regenerated collagen fibrils and method of manufacturing same |
| EP84301602A EP0119076B1 (en) | 1983-03-10 | 1984-03-09 | A substrate comprising regenerated collagen fibrils |
| DE8484301602T DE3478468D1 (en) | 1983-03-10 | 1984-03-09 | A substrate comprising regenerated collagen fibrils |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58039597A JPS59164723A (ja) | 1983-03-10 | 1983-03-10 | 再生コラーゲンフイブリルを含有する基質及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59164723A true JPS59164723A (ja) | 1984-09-17 |
| JPH043949B2 JPH043949B2 (ja) | 1992-01-24 |
Family
ID=12557515
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58039597A Granted JPS59164723A (ja) | 1983-03-10 | 1983-03-10 | 再生コラーゲンフイブリルを含有する基質及びその製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4565580A (ja) |
| EP (1) | EP0119076B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59164723A (ja) |
| DE (1) | DE3478468D1 (ja) |
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| JP2006291198A (ja) * | 2005-03-31 | 2006-10-26 | Ethicon Inc | 架橋型コラーゲン小球体の製造方法 |
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| JPS61122222A (ja) * | 1984-11-19 | 1986-06-10 | Koken:Kk | コラ−ゲン又はゼラチンとプロタミンとよりなる止血剤 |
| JPS61230728A (ja) * | 1985-04-06 | 1986-10-15 | Koken:Kk | アシル化コラ−ゲンまたはアシル化ゼラチンからなる界面活性剤及びその製造方法 |
| SE464816B (sv) * | 1985-10-15 | 1991-06-17 | Nilsson Kjell | Makroporoesa partiklar, foerfarande foer dess framstaellning och dess anvaendning |
| FR2597499A1 (fr) * | 1986-04-18 | 1987-10-23 | Merieux Inst | Procede de culture microbiologique sur supports de collagene, supports pour ce procede et produits obtenus |
| DE68913890T2 (de) * | 1988-04-18 | 1994-08-04 | Nitta Gelatin Kk | Verfahren zur züchtung tierischer zellen in grossem massstab und verfahren zur herstellung von trägermaterial dafür. |
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| WO1993019702A1 (en) * | 1992-04-06 | 1993-10-14 | Uroplasty, Inc. | Treatment of reflux disorder by microparticles injection |
| US5679372A (en) * | 1992-11-02 | 1997-10-21 | Yasuhiko Shimizu | Absorbable topical hemostat |
| US5656492A (en) * | 1993-02-12 | 1997-08-12 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Cell induction device |
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| US5711853A (en) * | 1993-06-16 | 1998-01-27 | Ranpak Corp. | Paper strengthened with solubilized collagen and method |
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| US9114162B2 (en) | 2004-10-25 | 2015-08-25 | Celonova Biosciences, Inc. | Loadable polymeric particles for enhanced imaging in clinical applications and methods of preparing and using the same |
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