JPH07507550A - 非繊維形成誘導性アルギン酸被覆移植体，その製造方法およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 非繊維形成誘導性アルギン酸被覆移植体、その製造方法およびその使用方法 この発明は、細胞および組織の医療用移植体、この種の移植体の製造およびその 使用の分野に向けられたちのである。特に、この発明は、移植を損う量の不純物 を含有しない新規て高度に保護性のアルギン酸（塩）　（ａｌｇｉｎａｔｅ）の 被覆により移植体を被覆すること、この被覆方法により形成した被覆した組織、 およびこのような製品を１・ξ用して作製した移植体に向けられたものである。

１マ景の説明 分泌その他の生物学的器官の機能欠陥のための従来の医療処置は、欠陥のある器 官の同定された正常な生産物を天然または合成の薬学的組成物により取替える二 とに焦点を合せてきた。例えば、タイプｌまたは幼若性初期糖尿病としても知ら れているインシュリン依存性真性糖尿病を処置するためには、膵臓中のランゲル ハンス島によるインツユリンの正常な分泌を置換えなければならない。膵臓中に は機能性の鳥体（ｉｓｌｅ＋　）か最甲、存在しないからである。この膵臓機能 は、インツユリンを投与し、血液グルコースレベルの測定に応答して注入を滴定 調整することにより疑似される。鳥体のインシュリン生産および分泌は最良の場 合でも不完全にしか近似されず、通常は近似は貧弱である。

器官の取替えも行われている。これは一般に、疾ψ、に対する免疫系の完全な保 護機能を患昔から奪い、器官の免疫学的拒絶を防止するために、免疫抑制剤を継 続的に使用することを必要とする。この手法は、限定された群の器官に対しての み永続的な苦痛の軽減を与えるものである。免疫抑制を伴うことなく遺伝的に非 類似の宿主に器官組織を移植する試みは、一般に宿主の免疫系によって失敗に終 っていた。この発明以前は、宿主の免疫系から移植体組織を隔離するための有効 な保護バリヤー被覆の適用は、多数の理由により医療的に実用性かあるとは認め られていなかった。被覆材料は宿主の系と不和合性であるか、さもなければ不適 切であった。以前に開発された封入または被覆方法は、移植された組織が宿主中 て長く有効な機能身命を有するのに必要な所望の多孔度および厚さを有する再現 可能な被覆体を生成するものではなかった。

宿主動物の免疫応答による破壊から移植体を保護するために、移植体組織または 細胞と宿主の系の免疫成分との間に保護バリヤーを生成する種々の試みがなされ ている。Ｔ、Ｍ、Ｓ、　Ｃｈａｎｇ　（Ｃｈａｎｇ、　Ｔ、Ｍ、Ｓ、、　５ｃｉ ｅｎｃｅ　＋４６：　５２４−５２５　（１９６４））はA 半透過性ポリアミド膜中への赤血球溶血物およびウレアーゼのミクロ封入を記載 している。これらのミクロカプセルは、血液流に注入した場合に長くは残存しな い。Ｍｏ５ｂａｃｋらおよびＣｈａｎｇらは、半透過性ミクロ封入微生物細胞お よび生きた赤血球細胞の調製を記載しており、後者の記事は、器官取替え療法の ために封入した細胞を使用する可能性を記述している。（Ｋ、　Ｍｏ５ｂａｃｈ 　ｅｔ　ａｌ、　Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ、　５ｃａｎｄ、　２０：　２８０７−２ ８１２　（１９６６）、Ｃｈａｎｇ、　Ｔ、Ｍ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｃａｎ、 　Ｊ、　ＰｓｙｓｉｏｌA　ａｎｄ　Ｐｈ ａｒｍａｃｏｌ、　４４：　１１５−１２８　（１９６６）　）。

Ｌｉｍらによって、生きた組織および細胞がポリリジンで被覆したアルギン酢液 滴中に固定化されている。（Ｆ、　Ｌｉｍ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、 　Ｓｃｉ、、　７０：　３５１−３５４　（１９８１））。これらの被覆した液 滴を使用して、糖尿病の動物の糖尿病状態を矯正する試みかＬｉｍらによって報 告されている。（Ｌｉｍ　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２１０：　９０８− ９０９　（１９８１’ｌ）　。米国特許第４．２５１．３８７号、第４．３２４ ．６８３号、第４．３５２．８８３号、第４．４０７゜９５７号、第４．６６３ ．２８６号および第４．８０３．１６８号はこの研究に関するものである。

しかしなから、これらの生成物は動物の糖尿病状態の長期間の矯正には成功を収 めておらず、ヒトの膵臓鳥体のような組織を移植するのに適切とは認められてい ない。

ポリリジンと反応させたアルギン酸カルシウム液滴に封入した移植体を開発すへ ＜　Ｇｏｏｓｅｎらにより実質的な努力が更に行われたが、移植に適切な保護さ れた移植体を提供するにはやはり不成功であった。（例えば、米国特許第４．６ ７３．５６６号、第４．６８９．２９３号、第４．７８９．５５０号、第４．８ ０６．３５５号、第４．７８９．５５０号）。

Ｌｉｍらは、アルギン酸−ポリリジンカプセルを使用し、ミクロ封入したラット 鳥体の異種移植片を用いて、ＮＯＤマウスの糖尿病状態の逆行が延長されること を報告している。（１，ｉｍ　ｅｔ　ａｔ、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　４０：　１５ １＋−１５１６（１９））。

米国特許第１７旧、９３３号には、相互に反応させたアルギン酸とポリアミノ酸 との外膜中に生物学的に活性な材料を含有する溶液を封入することか記載されて いる。

米国特許第１．６９６．２８６号には、移植体の表面成分に化学的に結合する多 機能性１率）の表面順ｃＬ、ｔ’ｌ結合架橋により移植体を被覆した後に、結合 架橋層に化学的に結合する重合体の半透過性で生物学的に適合性の層を施すこと により、遺伝的に非類似の個体へのｆｆ植に適切な移植体を被覆する方法か記載 されている。

ＨａｃｋｅｌらおよびＫｅｒＳｔａｎらは、微生物細胞および酵素の固定化のた めにアルギン酸カルシウムを使用することを報告している。（ＨａｃｋｅＬ　ｅ ｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｎｈｉｏｌ、Ｉ＋　２９１−２９６　 （１９７５）　、　Ｋｅｒｓｔａｎ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、ａｎｄ 　Ｂｉｏｅｎｇ、、P９： ３８７−３９７　（１９７７））。Ｎｉｇａｍらおよびこれに引用された刊行物 には、細胞含有カルシウム溶液をアルギン酸溶液に滴下し、更にカプセルをカル シウム溶液中でインキュベートすることにより、生きた細胞をアルギン酸カルシ ウムの外膜中に被覆する方法か記載されている。（Ｎｉｇａｍ　ｅｔ　ａｌ、Ｂ ｉｏｊｅｃｈ、　Ｔｅｃｈ、、　２：　２７１−２７６　（１９８８））。

Ｐｌｕｎｋｃｆｔらは、アルギン酸ビーズに補足した腫瘍細胞を使用して脈管形 成のモデルを記載している。（ＰｌｕｎｋｅＨｅｔ　ａｌ、　Ｌａｂ、Ｉｎｖｅ ｓｔ、、　９０：　６２０４−６２０５　（１９９０））。アルギン酸ナトリウ ム−細胞溶液液滴の噴霧体を塩化カルシウム水溶液と接触させ、アルギン酸カル シウムのビーズか形成された。ポンプ速度および空気圧力を使用し、噴霧過程に おける液滴の大きさか制御された。

しかしながら、アルギン酸カルシウムで被覆した移植体は、被覆した移植体が宿 主の系で残存しないため、従来は組織を移植するのに使用するのに適切とは考え られていなかった。海草から得られた形態のアルギン酸は、グルロネート（ｇｕ Ｉｕｒｏｎａｊｅ）とマヌロネート（ｍａｎｎｕｒｏｎａｔｅ　）との混合重合 体であり、種々のレベルの他の物質を含有する。

アルギン酸カルシウムのゲル化は、主として高分子グルロネート重合体のグルロ ン醜部分とのカルシウムイオン結合によって生起し、これは高い多孔度を存する しのであって、高度の架橋結合を与え、この結果として移植体のための強力な保 護バリヤーを（ｉえるものである。また、５ｋｊａｋ−Ｂｒｅａｋは、既にアル ギン酸重合体中に存在するＤ−マヌロン酸残基をＬ−グルロン酸に変換し得る酵 素であるマヌノランＣ−５ｆｆ−ビメラーゼの使用を開示している。（Ｇ、　５ ｋｊａｋ−Ｂｒｅａｋ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、　Ｔｒａｎｓ、　：　２ ０−２６　（１９９２））。

アルギン酸は食品や１剤製品を被覆するのに適用されているが、生きた細胞を被 覆して非免疫原性の被覆体を製造するためのアルギン酸の使用は、従来は達成さ れていなかった。この分野のこのような研究では、細胞被覆用途のためにはアル ギン酸をｆｔ？Ｒすることが必要であると認識されている。例えば、蛋白質およ びポリフェノールを除去する手段としてろ過が示唆されている。しかしながら、 精製さ第１たアルギン酸自体てさえ免疫原性である。Ｓｏｏｎ−３ｈｉｏｎｇら は、大型動物におけるｆｆｍしたアルギン酸マイクロカプセルの繊維性過剰生育 を観察している。

（Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　Ｔｒａｎｓ、　Ｐｒｏｃ、、　２３ ：　７５８−９．　（＋９９１））　ａこの研究により、市販のアルギン酸は、 しばしばポリフェノールおよび他の免疫原性物質で汚染されていることか見出さ れた。しかしなから、精製した場合であっても、マヌロン酸含有量か高い市販の アルギン酸は免疫原性のままであり、生体内でマクロファージを活性化すると共 に繊維性の過剰生育を生起し得るものである。同様に、Ｅｓｐｅｖｉｋらは、全 てのアルギン酸は固有に繊維形成誘導性であることを示唆している。　（Ｅｓｐ ｅｖｉｋ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｅ１ｌ　Ｔｒａｎｓ、Ｉ：　１６５　（１９９２） 、Ｔ、　Ｚｅｋｏｒｎ、　Ｃｅ１ｌ　Ｔｒａ獅刀A１ ：　１７６　（＋９９２））。他には、高マヌル−トのアルギン酸はヒト単球を 刺激してサイトカインを生成すること（Ｍ、　０Ｈｅｒｌｅｉ　ｅｔ　ａｌ、　 Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、　１０：　２８６−２９１（１９９＋））　、ま たはマクロファージの移動を増強すること（Ｍ、　ＦｕｊｉｈａｒａとＴ、　Ｎ ａｇｕｍｏ、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　２４３：　２１ １−２１６　（＋９９３））が報告されており、これらか何故生体適合性ではな いかが示唆されている。よって、従来技術においては、アルギン酸、少なくとも マヌル−トの有意な画分を有するアルギン酸は、サイトカイン生産、マクロファ ージ移動を刺激し、固有に繊維形成誘導性であることか合、！！事項であると考 えられる。精製したアルギン酸は細胞を被覆するのに使用し得る可能性かあると いうこの分野における認識かあるにも拘らず、今回に至るまで長い問罪免疫原性 の被覆体は達成されていない。

アルギン酸の組成およびアルギン酸の精製および分画方法は一般的に記載されて いる（ｌｌａｎｇ．　Ａ．　ｒアルギン酸の組成と性質Ｊ　（Ｃｏｍｐｏｓｉｔ ｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ａｌｇｉｎａｔｅｓ　）　報力 番号３０、Ｎｏｒｓｋ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｔ　ｆｏｒ　Ｔａｎｇ−ｏｇ　Ｔａｒ ｅｆｏｒｓｋｎｉｎｇ　iＮ ｏｒｗｃｇｉａｎ　ＩｎｓｔｉｌＪｔｅ　ｏｆ　Ｓｅａｗｅｅｄ　Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ）　（１９６４）；　Ｈａｕｇ，　Ａ．　Ａｃｔａ　Ｃ■■香D　Ｓｃａｎ ｄ．　１３：　６０１−６０３　（１９５９）：　Ｈａｕｇ　ｅｔ　ａｌ，　Ａ ｃｔａ　Ｃｈｅｍ．　Ｓｃａｎｄ．　１９：　１２２１−１Q２６　（１９６５ ）：　ｔｌａｕｇ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ．　Ｓｃａｎｄ．　２１ ：　６９１−７０４　（１９６７）；　Ｓｍｉｄｒｏｄ　ｅ煤@ａｌ．　Ａｃｔ ａ Ｃｈｃｍ．　Ｓｃａｎｄ．　２２＋　１９８９−１９９７　（１９６８）；およ びＳｋｊａａｋ−Ｂｒａｋ　ｅｔ　ａｌ，　ＢｉｏｔｅｃｈD　ａｎ ｄ　Ｂｉｏｅｎｇ．　３３：　９０−９４　（＋９８９））．アルギン酸ゲルビ ーズの化学的性質と物理的性質との間の相関関係も報告されている（Ｍａｒｔｉ ｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ，　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　ａｎｄ　Ｅｎｇ．　３３：　７０ −８９　（＋９８９））。

２００μｍより大きい厚さを有するアルギン酸被覆体は、宿主の系に移植した場 合に、栄養物および細胞産物が被覆した移植体の長期間の生存性のために十分な 量で被覆体を介して流れるのを可能とするのに必要な透過性を欠如することか輯 告されているａ　（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ．　Ｈａｒｍ． 　Ｍｅｔ．　Ｒｅｓ．　Ｓｕｐｐｌ．　２６：　２０９−Q １３　（＋９９０）　）。

したかって、宿主の免疫系によって実質的に拒絶されない新規な被覆移植体に対 する必要性が依然どして存在している。

発明の要旨 この発明は、移植のための被覆した生きた生理的に活性な組織または細胞に関す るしのてあり、これは宿主に対して生理的に許容し得るものであって、移植した 組織細胞の、宿主の免疫系による破壊からの長期間に渡る保護を効果的に提供す るものである。

またこの発明は、移植の後の健康、長い寿命および有効な機能に必要な量の栄養 物および池の物質の移植した細胞または組織への拡散を可能とする厚さ、および 移植した組織または細胞の産物の宿主の系への存効な拡散および放出を可能とす る透過性を有する被覆カプセルに封入した組織細胞に関する。

更にこの発明は、有効な移植組織被覆材料に関するものであり、これは生理的に 許容し得て非繊維形成誘導性であると共に宿主に対して非毒性であって、前記し た特性を存する被覆体を提供するのに使用し得るものである。

更にこの発明の一部は、生理的に許容し得て非繊維形成誘導性であると共に宿主 に対して非毒性である完全なバリャー被覆体を用いて移植体組織および他の生物 学的な物質を有効に被覆するための製造方法であり、これは中間的な大きさの蛋 白質に対して制御された厚さおよび透過性を有する完全なバリャー被覆体を与え るものである。

この被覆体は、繊維形成誘導濃度のフコース（ｆｕｃｏｓｅ）　、ポリフェノー ルおよび蛋白質を実質的に含有しない。被覆体中のフコース基の量は、一般にア ルギン酸ナトリウムのミリグラム当り約０．２マイクログラム未満であり（なお 約０．０２重量％未満）、ポリフェノール基の量は、一般にアルギン酸ナトリウ ムのミリグラム当り約２．０マイクログラムのタンニン等量未満（なお約０．　 ２重量％未満）である。

好適な態様の詳細な説明 この発明は、組織移植体のための従来技術の被覆体を改良すると共に、組織に対 して被覆して絹織移植体を提供する際に、繊維形成誘導および／または宿主の拒 絶のような宿主への移植の際の有害な反応を実質的に惹起しない組成物を提供し ようという発明音の望むところに起因するものである。

本発明者は、従来技術の移植体の欠点は、移植体を囲繞する宿主組織に対して繊 維形成誘導性である、市販のアルギン酸調製物に存在するある種の天然の物質の ような幾つかの因子の結果てあることを突き止めた。翻ってこの繊維形成誘導性 は、移植体の壊死および機能不全を生起する廠痕組織の不浸透性で貧弱に管化さ れた暦における移植体の封入を導くものである。本発明者は、従来技術は、繊維 形成を発現する際の手段となるフコース、ポリフェノールおよび蛋白質を含有す る十分な量の物質をアルギン酸から除去するのに失敗していたことも突き止めた 。本発明以前には、移植した膵臓細胞はインシュリンを生産すると言われていた が、移植された被覆細胞を検査すると、常に有意な繊維形成の存在が明らかにな っていた。これに対して、この発明の精製したアルギン酸を用いて被覆した細胞 の移値体は、実質的に繊維形成を生成しない。

本発明者は、約２００μｍ未満の厚さを有するアルギン酸被覆体を有する移植体 の大隈生産のための効率的な手順を開発してここに提供するものであり、これら は、移植に際して、例えば膵臓島体の機能を無期限に回復させるのに使用できる ことを突き止めた。

この発明以前は、アルギン酸被覆体の外側表面をポリリジンと反応させることが 、アルギン酸；皮Ｉ移ｍ体には必要であると報告されていた。本発明者は、完璧 な透過性を有し、外側被覆とポリリジンとの二次反応を必要としない完全に機能 性で非繊維形成誘導性の被覆体を開発した。

よってこの発明の１つの観点は、実質的に非繊維形成誘導性である新規なアルギ シ酸組成物である。この絹成物は、その二価金属イオンアルギン酸ゲル生成物で 被覆した移植体の宿主による受容性を損い得る物質を実質的に含有しないものと して提供される。

本発明では、初発の繊維形成誘導性アルギン酸調製物を精製して、非繊維形成誘 導性被覆体により細胞を被覆するのに適切な非繊維形成誘導性アルギン酸を生成 する。適切な初発のアルギン酸調製物は、好ましくは茶色藻類がらアルギン酸を 甲離することにより得られ、市販されているものである。この発明では、初発の アルギン酸調製物を二価金属イオンキレート剤と接触させて二価金属イオンを除 去し、その後に大きな表面積の漂白した活性化炭素と接触させる。炭素は、随住 する蛋白質およびフコース部分と共にポリフェノールを吸着する。蛋白質、ポリ フェノールおよびフコース部分を含有する組成物を、この分野では総じて「フカ ン（　ｆｃａｎｓ）　Ｊ　と呼ぶ。炭素による処理の後に、アルギン酸を溶液か ら沈殿させて洗浄し、その後にろ過して付加的な不純物を除去し、本発明の非繊 維形成誘導性アルギン醇を提供する。

ここで使用するように［非繊維形成誘導性（ｎｏｎ−ｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃ）　 Ｊとは、５００ミクロン以下の直径を有する移植体を製造するために使用する際 に、宿主ＢＡＬＢ／ｃマウスまたは雑種イヌへのアルギン酸被覆移植体の腹膜内 注射後、少なくとし６０日、好ましくは少なくとも６か月、更に好ましくは少な くとも１２か月、最も好ましくは少なくとも１８か月の間、繊維形成およびマク ロファージ過剰牛ａの過程を介する宿主の免疫系による生物学的隔離およびこの 結果としての移植体の絹織死を誘導しない組成物を意味する。生物学的隔離およ び組織死は、例えば膵臓島体組織移殖体からのインシュリン生産をモニターする ことにより、または糖尿病の宿主における正常血糖（ｅＢｌｙｃｅｍｉｃ）の維 持をモニターすることにより決定することかできる。この発明の非繊維形成誘導 性アルギン酸は、公知の被覆技術を１・ξ用する組織または甲．細胞を被覆する のに適切である。

この発明の被覆した移植体組織および細胞は、組織被覆を損うことなくそれを介 して被覆した細胞の！濁物の通過を許容するのに十分な針直径を有する皮下注射 針を介する単純な注射による宿主動物中への移植に有効である。移植のためには 、藁学的に許容し得るキャリャーと共に、被覆した移植体組織を薬学的組成物と して処方する。この種の組成物は、移植の際に十分な数の移植体力ブセルを与え るために、動物に有効に注入することのできる最大数の被覆した移植体カプセル を含有するものとすへきてある。

ここで使用するように「移植Ｊという用語は、宿主動物の体内に移植することを 意図する全ての生きた組織、細胞および生物学的に活性な物質、並びにこれらの 組織および細胞を移植する行為を包含するよう定義する。これらの組織および細 胞は、限定することなく、供与体動物から除去された組織および細胞、供与体組 織および細胞のインキュベートまたは培養により得られた組織および細胞、生き た細胞系統から得られた細胞、細胞および組織の生物学的に活性な産物等を含む 。移植を所望するいずれかの形態の組織または細胞を、この発明に従って被覆し て移植することかできる。移植のために最も重要な組織は分泌器官組織であり、 この場合、供与体器官から宿主動物への移植は、宿主の系において供与体器官の 作用を少なくとも部分的に複製するのが望ましい。好適な供与体組織は、膵臓島 体、肝臓細胞、神経細胞、腎臓皮質細胞、管内皮細胞、甲状腺細胞、副腎細胞、 胸腺細胞および卵巣細胞細胞である。しかしながら、他の種類の細胞も利用する ことかできる。

例として、説明を明瞭にする目的で、限定するようにではなく、膵臓島体および 島体細胞の調製および移植について、この発明の方法を以下に記載する。この方 法は、当業者に容易に明らかとなるように、異なる組織のいずれかの特に異なる 要件を洩含するのに必要な従来の自明の改変を用いて、他の器官組織に対しても 同等に十分に適用することかできる。移植に適切な全ての組織および細胞に対す るこの方法の適用は、この発明の範囲内であることを意図する。

ｊｒ’＃された胛城島体（または移植に適切な他の細胞または組織）は、これら を異質の組織およびＩｔ、与体物質から分離するための従来の手順によって調製 することかできる。

この発明の男繊維形成誘導性アルギン酸を調製するためには、好ましくは特にエ チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような二価金属イオンキレート化合物を含 有する水または緩衝液に初発のアルギン酸調製物を溶解し、その後に大表面積の 活性化炭素と接触させ、存在する全ゆるフカンおよび他の汚染物質を吸着により 除去する。約５０グラムのアルギン酸を、通常は約１−１０、更に好ましくは約 ３〜８リツトルの水に溶解する。適切な活性化炭素には、約１００メツシユまた はそれより微細な粒度を有する、いずれかの大表面積活性化炭素が含まれる。

好ましくは、少なくとも約１．０００、好ましくは少なくとも１．５００ｍ２／ ｇの表面積を有する非常に微細な活性化炭素粉末を使用することができる。適切 な活性化炭素が市販されている。

活性化炭素は、好ましくは使用する前に漂白し、有機汚染物質を酸化して除去す る。活性化１３２１Ａは、次亜塩素酸ナトリウム等のような公知の漂白剤を使用 して漂白することかできる。この炭素は、全ゆる汚染物質を炭素の表面から除去 するのに十分な時間の間、漂白剤の希釈溶液を用いてこれを撹拌することにより 漂白することがてきる。一般に、約０．００５〜０．５０Ｍ、更に好ましくは約 ０゜０８〜Ｏ，ＩＯＭの次亜塩素酸ナトリウム溶液を用いて約５〜３０分間、好 ましくは約１０〜２０分間活性化炭素を撹拌するか、これは活性化炭素を酸化す るのに十分なしのである。酸化の後に、遠心分離またはろ過によって希釈した漂 白溶液から活性化炭素を除去することかでき、水またはエタノールで洗浄し、乾 燥する。活性化炭素に対する初発のアルギン酸の比率（Ｗ／Ｗ）は、通常は約ｌ ：ｌ〜ｌ・２０、更に好ましくは約ｌ：２〜１：８とする。明らかに、この発明 により許容される最小量を達成するために十分な汚染物質の除去を確実にするの に必要であるよう、活性化炭素の量を調整することができる。

アルギン酸溶液と漂白した炭素とは単純な混合、振盪または転勤によって接触さ せることかでき、その後に従来の遠心分離およびろ過によって漂白した炭素を除 去することかできる。好ましくは、順次に微細なサブミクロンのフィルターを使 用してろ過を行う。

その後に箱釈した一価陽イオン塩溶液を、アルギン酸の金属イオン結合部位を交 換するのに十分な量で、ろ過したアルギン酸溶液に添加する。全ゆる可溶性の一 価陽イオン塩を使用することができる。ただし約０．０１〜１．０Ｍの塩化ナト リウムまたはカリウム溶液が好適である。

その後に撹拌しながらエタノールを添加することにより、結果的に得られた溶液 からアルギン酸を沈殿させることがてきる。一般に、アルギン酸溶液に対するエ タノールの比率（ｖ／ｖ）は、約０．２５〜２．０、好ましくは約０．５〜１． ５とする。その後に沈殿させたアルギン酸をろ過により回収し、エタノールで洗 浄し、乾燥して痕跡量のエタノールを除去することができる。

前記したようにして得られたアルギン酸は、ホモポリ（アミノ酸）、例えばポリ リジンまたはポリアスパラギン酸のような付加的な被覆化合物を使用することな く、移植体組織または細胞を被覆するのにそのままで適切である。しかしながら 、アルギン酸の性質を化学的に改変して特定の用途にアルギン酸被覆を適合させ るのか場合によっては望ましい。アルギン酸被覆材料の重要な性質には、例えば 十分に特定され調節された細孔寸法、被覆厚さ、被覆溶液の粘度、機械的強度等 か含まれる。

平均分子量および全体的なグルコネートに対するマヌル−トの分子比は、最初は 実質的に材料の由来によって決定されるが、物理的および化学的な方法によって 更に調整することもできる。分子量は、例えば部分的酸加水分解、熱分解または 超音波処理によって低減することかてきる。随伴するアルギン酸組成の変更を用 いる調節された沈殿方法により、または透析、分子ろ過またはゲル排除クロマト グラフィにより高分子量を得ることができる。グルコネートに対するマヌル−ト の比率および配列分布は、−価および二価金属陽イオン、有機溶剤または酸によ る選択的沈殿または可溶化によって増加または減少させることができる。

これらの特性の調整によって、異なる組織移植体を用いて最適の結果か与えられ る。

溶液中のアルギン酸の濃度は、アルギン酸の物理的性質の関数である。非常に低 い濃度では、被覆形態か貧弱となる結果、有効でない被覆体が与えられる。非常 に高い濃度では、粘度か高すぎて良好な被覆体を形成できない。好ましくは、ア ルギン酸の分子量（キロダルトン）は、約２〜３００、更に好ましくは約４〜２ ５０、更に好圭しくは約６〜＋２０の範囲とする。初発の分子量が高い場合は、 アルギン酸の温和な酸加水分解によってこれを低減することができる。初発また は精製したアルギン酸を希釈醜溶液に溶解し、所望の分子量が得られるまで穏や かに加熱することができる。約０．１〜０．５Ｍの濃度を有するＨＣＩ等のよう な鉱酸の希釈溶液を使用することかできる。加水分解の程度は、アルギン酸の分 子−量をモニターし、所望の分子量か得られたときに加水分解反応を中和するこ とにより調節することかできる。明らかに、より高い酸濃度により、結果的によ ｌ）速い＋１０水分解か与えられる。代替的に、適切な加水分解条件を決定する ために幾つかの初期試験反応を行えば通常は十分である。

被覆体の多孔度および機械的強度も、アルギン酸重合体中のマヌロレート（Ｍ） およびグルコネート（Ｇ）の相対的な量の関数である。好ましくは、アルギン酸 中のＭ／（Ｎｉ＋Ｇ）として計算したＭの量は、約０．１〜０．９５、更に好ま しくは約０．１５〜０８５、更にｆｌＴましくは約０．２５〜０．７５の範囲で ある。アルギン酸中のＭおよびＧの相対的な量は、希釈した（例えは約０．０５ 〜０．５０Ｍ）塩化カリウム溶液に沈殿させたアルギン酸を溶解し、Ｍに富む画 分を沈殿物中に残したままＧに富む両分を再溶解させることにより調整すること ができる。不溶性の物質は遠心分離によって補集することができる。その後に再 溶解したＧに富むＭ料をエタノールの添加によって再沈殿させる。この過程を繰 返すことにより、アルギン酸中の全ゆる所望の相対割合のＭおよびＧを得ること ができる。

ホモ重合体アルギン酸配列（ポリグル０ネートおよびポリグル０ネート）は一般 に酸不溶性であるか、交替するマヌル−トーグルロネート配列は大半の部分か酸 可溶性である。約１．５〜２．５のｐＨ１好ましくは約２．０のｐＨの酸溶液を 用いてアルギン酸を抽出することにより、ホモ重合体に富むアルギン酸を選択的 に可溶化することかできる。更に、Ｍに富むアルギン酸は、Ｇに富むアルギン酸 に灯して優先的に可溶化される。したかって、酸性溶液を用いるアルギン酸の処 理により、Ｇに富むアルギン酸が優先的に沈殿し、Ｍに富むアルギン酸は溶液中 に残る。よって、溶液からの沈殿物の分離により、アルギン酸のＧに富む両分お よびＮ４に富む両分か与えられる。溶液中に存在するＧに富むアルギン酸は、カ ルシウムイオンまたはエタノールの添加によって沈殿させることができる。代替 的に、Ｇに富むアルギン酸は、Ｍに富む両分を溶液中に残しつつカルシウムイオ ンを用いてＧに富む両分を沈殿させることにより得ることができる。溶液から沈 殿物を分離した後に、酸またはエタノールの添加によってＭに富むアルギン酸画 分を溶液から沈殿させることができる。酸および／またはカルシウムで沈殿させ た物質の割合は、それぞれｐＨおよびカルシウム濃度を調整することにより調節 することかできる。

前記したようにして得た異なるＭに富む画分およびＧに富む画分を混合すること により、アルギン酸被覆体中の特定のＭおよびＧの相対量を得ることもできる。

Ｍに富む材料に対して小部分のＧに富む材料を順次に添加することにより、全体 的なアルギン酸組成物中のＧの量を徐々に増加させ、これにより全体的な被覆体 中の二価金属イオン結合部位の数を増加させ、被覆体の構造的剛性を増加させる と共に、より大きい細孔寸法を与えることができる。Ｍに富む画分およびＧに富 む両分の全ゆる特定の混合物について、アルギン酸中のＭまたはＧの相対的な量 は、ＮＭＲ分光技術によって容易に決定することができる。”Ｃ−ＮＭＲ分光技 術はＭ／Ｇ比率および二種類配列頻度を決定するための迅速で安価な方法である か、’　Ｈ−ＮＭＲを使用してＭ／Ｇ比率を決定することもできる。アルギン酸 被覆体の平均分子量および多孔度は、Ｍに富む両分およびＧに富む画分を異なる 割合で混合することにより調整することかできる。

本発明のアルギン酸は非繊維形成誘導性であり、ミリグラムのアルギン酸ナトリ ウム当り約０．２マイクログラム以下（なお約０．０２重量％以下）、好ましく はミリグラムのアルギン酸ナトリウム当り約０゜１マイクログラム未満（なお約 ０．０１重量％未満）、更に好ましくはミリグラムのアルギン酸ナトリウム当り 約０．０５マイクログラム未満（なお約０．００５重量％未満）の加水分解性フ コース糖含有量を有する。アルギン酸中のフコース糖レベルは、以下の実施例４ に記載するような従来の中性糖の分析によって決定することができる。

本発明のアルギン酸は、非繊維形成誘導性の量のポリフェノール、例えばタンニ ンまたはフロログルンノールを含有する。本発明のアルギン酸中のポリフェノー ルのレベルを決定するために、本発明者は、水中のタンニンレベルの測定のため のｆｆ準的な方法に基いて新規な検定を開発した。（Ｍ、Ｂ、　Ｋｌｏｓｔｅｒ 、　Ｊｏｕｒａｌ　ｏｆｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｗａｔｅｒ　Ｗｏｒｋｓ　 Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　６６：　４４　（＋９７４）から適用されたＨａｃｈ の水分析ハントブック（ｌｌａｃｈ’　ｓ　Ｗａｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｈ ａｎｄｂｏｏｋ）　、第２版（１９９２）　、方法ｅ＋９３参照）。タンニンは ポリフェノールであり、ポリフェノールのためのこの発明の新規なアルギン酸検 定は、標準的な既知濃度のタンニン酸溶液に基いたタンニン酸または「タンニン 等量」に関するポリフェノール含有量を与えるものである。

アルギン酸中のポリフェノールのための本検定では、水中で約１重量％の濃度で アルギン酸サンプルを調製する。アルギン酸サンプルの両分を試験官に入れ、等 しい容量の水を対照の試験官に入れる。同様な量の炭酸ナトリウム溶液およびタ ンニバ−（ＴＡＮＮＩＶＥＲ）　（商標名）３試薬（タングステン酸ナトリウム 、リン酸、塩酸、無水モリブデン酸ナトリウム、硫酸リチウムおよび水プラス１ ％の他の試薬）をサンプルおよび対照の両昔に添加し、その後に溶液を混合し、 室温で杓３０分間インキュベートする。その後に約７００ｎｍでサンプルおよび 対照の吸光度を測定する。

タンニン酸の適切な標準曲線は、約０．　１〜１０μｇ／ｍＩの範囲に渡って変 動するタンニン酸標準濃度を使用して作成することができる。対照の吸光度を差 引くことにより全ゆるサンプルの吸光度を較正した後、標準タンニン酸溶液から 作成した標準曲線に対してアルギン酸サンプルの吸光度をプロットし、アルギン 酸サンプルのミリグラム当りに存在するタンニン酸のマイクログラム数、または ミリグラムのアルギン酸当りの「タンニン等量」のマイクロダラムを決定するこ とかできる。前記したポリフェノール／タンニン検定を用いて試験した場合、本 発明のアルギン酸は、ミリグラムのアルギン酸ナトリウム当り約２．０マイクロ グラム以下のタンニン等量（なお約０．２重量％以下）を含有することが示され る。好ましくは、アルギン酸は、ミリグラムのアルギン酸ナトリウム当り、約１ ．０マイクログラム以下のタンニン等ｌ（なお約０．１重量％以下）、更に好ま しくは約０７５マイクログラム以下のタンニン等量（なお約０．０７５重量％以 下）を含有する。

本発明の方法により、宿主の免疫系の免疫学的に有効な濃度の構成員が組織と相 関するのを（シ［除する保護バリヤーとして適切であって、栄養素および他の物 質の十分な拡散を可能としてこれらがその長い寿命および生存性のために必要な 移植体と接触するに至るのに必要な透過性を有するアルギン酸ゲル被覆体の調製 が可能となる。

約０．７〜２．５重量％のアルギン酸の濃度を有するアルギン酸の被覆溶液の粘 度は、２５°Ｃて約１０〜２５０センチポアズ、好ましくは約２０−１００セン チポアズの粘度を存するべきである。

この発明の方法の第１の工程では、単離した膵臓鳥体（または他の細胞または組 織）を等張の塩類溶液で洗浄し、精製したアルギン酸の溶液に懸濁する。必要に 応して、ただし必ずしも必要なものではないが、洗浄した細胞をポリーＬ−リン ンの水溶液でＴ−備処理して細胞とアルギン酸との結合を増加させることができ 、その後に塩類溶液で濯ぐ。

アルギン酸中の細胞懸濁物を液滴に形成し、液滴と二価金属、好ましくはアルカ リ土類金属の塩溶液と接触させてアルギン酸をゲル化させる。液滴はいずれかの 従来の手順によって形成することかできる。例えば、細胞材料を含有するアルギ ン酸ナトリウムの溶液を乳化してアルギン酸ナトリウムおよび細胞の液滴を形成 し、塩化カルシウムを用いて液滴をゲル化させることによりアルギン酸小滴を形 成することかできる（米国特許第４．３５２．８８３号）。液滴を針から強制的 に出すシリンジおよびポンプを用い、層流エアナイフを使用して先端から液滴を 分離し、塩化カルシウム溶液中で補集することにより液滴をゲル化させてアルギ ン酸小滴を形成することもてきる（米国特許第４．４０７．９５７号）。皮下注 射針から押出し、その後に液滴か塩化カルシウム溶液中に落下するようにするこ とによりアルギン酸小滴を形成することもてきる（Ｎｉｇａｍ　ｅｔ　ａｔ、　 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２：２７＋−２７６（＋ ９８８））。更に、塩化カルシウムを含有する向流の流れに液滴を注入すること もてきる（米国特許第３．９６２．３８３号）。噴霧ノズルを介してアルギン酸 溶液を噴霧して液滴のミストを形成し、これを塩化カルシウム溶液中で補集する ことも利用することがてきる（Ｐｌｕｎｋｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、　６２５１０−５１７　（＋９９０’ ｌ）。

針とパルスをかけた電気的静電電圧との組合せを使用して均一な液滴を形成する ことによってもアルギン酸液滴を形成することができる（Ｈｏｍｍｅｌらに対す る米国特許第４．７８９．５５０号）。アルギン酸溶液を強制的に針の先端を通 過させて液滴を形成し、釘の先端と針の先端の下方に配置した塩化カルシウム溶 液との間で静電場を変化させることにより、針から液滴を引張るようにすること かできる。液滴は針から１つの極性の荷電を受取るか、これは塩化カルシウム溶 液中の荷電とは反対のものである。液滴と反対に荷電した塩化カルシウム溶液と の間の電圧差か、液滴の溶液による誘引か針の先端上に液滴を保持する界面張力 の力を越える閾値に達した場合、液滴は引張られて遊離し、塩化カルシウム溶液 中に落下する。平方波形態を使用して静電場を波動させ、閾値と交差する一連の 電圧を発生させ、これにより平方波サイクル当り１つの一連の液滴を生成する。

この方法は、有効な移植に必要な小さい液滴および薄い被覆体を与えないと考え られる。

ここで使用するために好適な液滴形成およびゲル化手順は、１９９２年５月２９ ０に出願された米国出願番号第０７／８９０．９８２号に記載されており、この 出願の明細書および図面全体、更に詳しくは液滴形成およびゲル化手順を説明す る部分を、この方法の更に完全な説明のために参考としてここに援用する。

膵臓鳥体細胞のような生きた生理的に活性な組繊細胞を含有する組織は、約ｌＯ 〜２００μｍの厚さを有する被覆体を備えるものとする。この被覆体は、二価金 属アルギン酸ゲル、好ましくはアルギン酸カルシウム、アルギン酸マグネシウム またはこれらの混合物を含み、金属アルギン酸は、アルギン酸で被覆した組織ｌ Ｖｉ体の生存性および長い寿命を損ない得る不純物を含有しないアルギン酸から 形成したものである。被覆体カプセルは、好ましくは移植の後に組繊細胞を宿主 の免疫構成員から保護するのに十分に低い透過性および十分に大きい厚さを有し 、被覆体は、細胞の生存に必要な十分な細胞栄養物および細胞産物か被覆体を介 して拡散するのを可能とするよう十分に透過性で薄いものでもある。被覆体は、 好ましくは少なくとも約１０μｍかつ約５０μｍ未満の厚さを有する。最も好ま しくは、単一の細胞または１〜２の細胞が単一のカプセル内に存在するものとす る。所望に応して、複数のアルギン酸被覆体を細胞に施し、多層カプセルを生成 することかできる。

分子透過性の更なる低減を所望する場合、またはアルギン酸被覆体の膨潤の低減 が必要な場合は、必要に応して、ただし必ずしも必要なものではないが、被覆し た組織をポリ陽イオン重合体の溶液に浸漬することによって、ポリーＬ−リジン または他の生理的に受容し得て非毒性のポリ陽イオン重合体を用いてアルギン酸 ゲル被覆体を架橋することかてきる。透過性の低減は、ポリ陽イオンの重合の程 度、ポリ陽イオンとアルギン酸被覆体との反応、溶液中のポリ陽・ｒオンの濃度 、およびインキュベート時間の関数である。最適のポリ陽イオンおよび反応条件 の選択は従来のらのであり、完全に従来技術の範囲内である。溶液から重合体を 枯渇させることによって、または洗浄の希釈によって反応を停止させることがで きる。

ポリリンンおよびポリ陽イオンは、一般に繊維形成を誘導するものであり、被覆 した生成物の生体適合性を改良するためには、アルギン酸−ポリ陽イオン複合体 の更なる処理か望ましい。ポリ陽イオン反応生成物をアルギン酸ナトリウムの溶 液に浸漬して被覆体表面の遊離のε−アミノ基を反応させるとイオン交換反応か 導かれ、その際に金属アルギン酸コアか、これからの二価金属陽イオンの枯渇に よって部分的にまたは完全に可溶化される。しかしながら、痕跡量の可溶性のア ルギン酸かこのような処理の後に残存すると、液化した材料のカプセルからの遅 い拡散により、特にアルギン酸はその可溶性の形態で繊維形成を誘導すると知ら れていることから、繊維形成反応に至り得る。アルギン酸の完全な可溶化および そのコアからの除去の前にアルギン酸処理した生成物を二価金属イオンで処理す ると、金属イオンはアルギン酸ナトリウムと反応し得て被覆層を横切って外側に 移動し、これにより膜の個別性か損なわれ、被覆体表面に対する繊維芽細胞付着 の可能性か増大する。

したかって、アルギン酸を外側被覆で使用する場合は、例えばクエン酸ナトリウ ムまたはＥＤＴＡを用いて、カルシウムイオンのイオン交換またはキレート化に よってコアゲルを完全に溶解させるよう反応を実施すべきである。その後に洗浄 媒体を数回取替えるかまたはろ過・浸透によって生成物を徹底的に洗浄すること かてき、可溶性のアルギン酸が十分な時間をかけて被覆体から完全に拡散するの を可能とする。アルギン酸か被覆体を介して外側に拡散すると共に、ポリ陽イオ ンの遊離の残余のアミノ基かこれと反応することができる。

好士しくは、ポリアスパラギン酸と反応させることにより、ポリ陽イオン複合ア ルギン酸被覆組織移植体に陰性の荷電を施す。その低い結合親和力のために、ポ リアスパラギン酸が金属イオンを複合して一次アルギン酸ゲル被覆体から枯渇さ せる可能性は小さい。これは−次アルギン酸被覆体を溶解させることなくポリ陽 イオンと反応する。最終反応体としてポリアスパラギン酸を使用すると、アルギ ン酸最終複合体を使用する場合に対して幾つかの利点が与えられる。これにより 、付加的な架礪および圧縮した被覆体の容量の低減のために、より大きい機械的 強度、より小さい被覆生成物の直径および低い透過性が与えられる。

以下の具体的な、ただし限定するものではない実施例によってこの発明を更に説 明する。特に明記しない限り、％は重量％て与えるものとし、温度は摂氏とする 。これらの実施例では、実験室で実施するよう限定した手順は過去形で表現し、 この出願において構成的に限定した手順は現在形て表現するものとする。

マクロンステイス・ビリフェラ（Ｍａｃｒｏｓｙｓｔｉｓ　ｐｙｒｉｆｅｒａ） がら単離した５０ｇの低粘度アルギン酸ナトリウム（ＬＶアルギン酸、メルク社 のケルコ部（ＫＥＬＣＯＤｉｖ、　ｏｆ　Ｍｅｒｋ　＆　Ｃｏ、）　）を５リツ トルの水に溶解し、５０ミクロンのメツシュを介してろ過して粒子を除去した。

１８．６ｇのＥＤＴＡニナトリウムを溶液に添加して溶解させた。溶液をローラ ーミル上で２００ｇの次亜塩素酸て漂白した活性化炭素（マリンクロット（Ｍａ ｌ　ｌ　１ｎｃｋｒｏｄｔ）活性化炭素粉末）と３０分間混合し、ポリフェノー ルおよびフコース糖残渣のような有機汚染物質を除去した。その後３０分間の遠 心分離によって活性化炭素を除去した。この結果得られた溶液を順次にろ紙（０ ４５ミクロンのフィルター、０．２２ミクロンのフィルターおよびＯ１ミクロン のフィルター）を介してろ過した。その後にろ過した溶液に３０ｇの塩化ナトリ ウムを添加し、ローラーミル上で揺動させることにより溶解させた。５１の１味 のエタノールを添加することにより、アルギン酸を溶液がら沈殿させた。サンプ ルを３０分間遠心分離してアルギン酸ペレットを取得し、アルギン酸ペレットを エタノールに懸濁した後にピンセットを用いて細く切り、サンプルの完全な洗浄 を確実なものとした。過剰のエタノールを搾って除去し、沈殿物を押圧しｔコ。

結束的に得られた沈殿物を真空下に６０’Ｃてオーブン内で乾燥８０ｇのプロタ ンアルギン酸（ｐｒｏｔａｎ　ａｌｇｉｎａｔｅ　）をローラーミル上て揺動さ せることにより８９１の水に溶解させた。溶液を５０ミクロンのメツシュを介し てろ過して粒子を除去し、その後にローラーミル上で３０分間連続的に混合しつ つ３２０ｇの漂白した活性化炭素と混合した。その後に３０分間遠心分離するこ とによ１月＾性化１に素を除去した。この結果得られた溶液を順次にろ紙（０， ４５ミクロンのフィルター、０２２ミクロンのフィルターおよび０．１ミクロン のフィルター）を介してろ過した。その後に１６３ｇの塩化マグネシウムを溶液 に添加し、ローラーミル上で揺動させることにより溶解させた。その後に２１０ ｍ１の１．７％塩化カルシウム溶液を添加し、ローラーミル上で３０分間揺動さ せることにより混合した。この結果得られた溶液を３０分間遠心分離してアルギ ン酸ペレットを生成した。ローラーミル上で揺動させることにより、アルギン酸 ペレットを３．　０リツトルのｏ、＋ＭＥＤＴＡ　（１）Ｈ７，ｏ）に溶解させ た。必要に応じて溶液の［）　Ｆ−ＴをｐＨ７，０に調整した。その後にこの溶 液に２０ｇの塩化ナトリウムを添加して溶解させた。

５１の正味のエタノールを添加することにより溶液からアルギン酸を沈殿させ、 その後に３０分間遠心分離してアルギン酸ペレットを得た。その後にアルギン酸 ペレットをエタノールに懸濁し、ピンセットを用いて細く切り、サンプルの完全 な洗浄を確実なものとした。過剰のエタノールを搾って除去し、沈殿物を押圧し た。その後にアルギン酸沈殿物を真空下に６ｏ″Ｃてオーブン内て乾燥させた。

実施例３−フコースおよびタンニン等量含有量の決定新たに調製したタンニン酸 溶液（０，１ｍｇ／ｍｌ）を希釈し、１０．　０．５０．３０．１．　Ｏｌｏ、 ４および０．１ｇｇ／ｍｌの濃度を有する標準溶液を取（Ｉ７することにより、 標準タンニン酸溶液を調製した。その後に分光光度計内て７００ｎｍで読取った それぞれのサンプルの吸光度に対してタンニン酸の濃度をプロｔ　ｌ・すること により、タンニン酸の標準曲線を作成した。

実施例１および２のアルギン酸のサンプル溶液をＩＩ量％て調製した。それぞれ のサンプルの２ｍｌの両分を５ｍｌの試験官に入れた。２ｍｌの水を対照として 試験官に入第１た。その後に炭酸ナトリウム溶液（ハツチ・カド（ｔｌａｃｈ　 Ｃａｔ、　）６７５−４９の０．４ｍ１）を、対照を含むそれぞれの試験官に入 れた。タンニバー（ＴＡＮＮ　ｌ〜’ＰＲ）　（商は名）３試薬（０，０４ｍ１ ）をそれぞれの試験官に添加し、完全に混合した。その後に試験官を室温て３０ 分間インキュベートした。サンプルを石英の↑−ユヘットに移し、分光光度計内 て７ｏｏｎｍて吸光度を読取った。サンプルブランクのキュベツトの吸光度につ いて較正した後、それぞれのアルギン酸溶液の吸光度をタンニン酸の標準曲線に 対してプロントし、アルギン酸ナトリウムサンプルのミリグラム当りのタンニン 酸等量のマイクログラム数を決定した。実施例１のアルギン酸は、アルギン酸ナ トリウムのミリグラム当り１．　ＯマイクロダラＩ、のタンニン酸等量を含有す ることか分った（０．１重量％）。実施例２のアルギン酸は、アルギン酸ナトリ ウムのミリグラム当り０．７マイクログラムのタンニ〉酸Ｔｔｔを含有すること か分った（００７重量％）。

比較のために、実施例１および実施例２のアルギン酸を調製するのに使用した初 発のアルギン酸を、前記したポリフェノール／タンニン酸検定を使用してポリフ ェノールα有事について検定した。実施例１および２の精製したアルギン酸を調 製ずろのに使用した初発のアルギン酸のそれぞれは、ミリグラムのアルギン酸当 り約２０マイクログラムのタンニン酸等量を含有することか分った。初発のアル ギニ・酸絹成物と比較して、実施例ｊの精製方法により、約９０％を越えるタレ ニジ酸等量の低減か与えられ、実施例２の方法により、約９０％を越えるタンニ ン酸専１の低減か与えられた。本定明の方法は、初発のアルギン酸中のポリフェ ノ−＋（のしヘルを実質的に低減させるのに有効である。

計（ＧＣ−ＭＳ）分析によって決定することができる。ＧＣ−ＭＳ分析のための サンプルを調製するために、１〜３ｍｇのそれぞれのサンプルを秤量し、スクリ ュー頂部（Ｉ　ＯＯｍｍｘｌ　３ｍｍ）の試験官に入れた。内部標準として５０ ｇｇのイノシ１〜−ルを含有するＨ２　Ｓｏ、（ＩＮで０．５ｍ１）をその後に それぞれの試験官に添加した。その後に１Ｏ００，１，Ｏｌｏ、１および００１ ｇｇのフコースを含有する標準試験官を同様の様式で調製した。

全ての試験官を１２１”Ｃて１時間（または３時間）加熱した。加熱の後、試験 官を冷却し、化学ｌ論量の塩化バリウムを添加した。中和した試験官を遠心分離 しく１０分、１５００Ｘｇ）、生成した硫酸バリウムを除去した。サンプル中に 残留する水は空気流下で蒸発させた。

その後にサンプルをホウ化水素ナトリウムを用いて還元した（ＩＮＮＨ，０Ｈ１ １月ｍｇ／ｍ１ＮａＢ）Ｌ　、０．５ｍｌ溶液、室温で１時間）。還元の後、２ ００マイクロリットルの氷酢酸を添加することにより過剰のホウ化水素物を分解 し、空気流下で蒸発させた。

２００マイクロリツトルの無水酢酸および２０マイクロリツトルの１−メチルイ ミダゾールを使用し、還元したサンプルをアセチル化した（室温で１０分）。

その後にサンプルを２ｍｌの水と２ｍｌの塩化メチレンとの間で分配した。水相 を除去し、残る有機相を蒸発させた。その後にそれぞれのサンプルに５０マイク ロリツトルのアセトンを添加し、５９７０ＨＰ質量選択検出器に接続した５８９ ０１ｉＰガスクロマトグラフにサンプルの画分を注入した。ＧＣによる分離は、 ３０／分で１６０〜２１０°Ｃとなる温度勾配を使用し、Ｊ＆ＷＤＢ−２３カラ ム（３０メーター、０．２５ｍｍ１．Ｄ、）により行った。ＭＳ分析は、反応時 間の比較および真正の標ｆ物とスペクトルを比較することにより行った。

初発のアルギン酸および実施例１および２の精製したアルギン酸についてのフコ ース分析の結果を以下の表に示す。

表・フコース分析結果 サンプル　フコース（μｇフコース／ｍｇサンプル）実施例！　（初発）　２． ９１　（０，２９１重量％）実施例１　（精製）　＜、０１　（＜０．００１重 量％）実施例２（初発＞　０．　７０　（０，０７重量％）実施例２（精製）　 ０．０９　（０，００９重量％）実施例１　（精製）のフコースレベルは、実施 例１（初発）のフコースレベルと比較して３００を越えるＩＳ率で低減する。ア ルギン酸の実施例２（ｖ４製）のフコースレベルは、実施例２（初発）と比較し て８の倍率で低減する。

実施例５−肝臓鳥体懸濁物の調製 ラットからＩｌ離した肝臓鳥体を等張塩類溶液で洗浄し、実施例１および実施例 ２の手順により調製したアルギン酸を溶解することにより調製したアルギン酸溶 液に、笠浸透圧（約０．８１ｔ！、％）のために必要な十分な塩化ナトリウムを 含有するＩ　Ｏｍｔ’ＪＩＥＰＥＳ、Ｏ，Ｏ１Ｍクエン酸ナトリウム中の１．９ 重量％の精製したアルギン酸中にてｍｌ当り１０，０００島体の濃度で懸濁し、 最終溶液か３２°Ｃて約５０センチポアズの粘度を有するものとした。鳥体は１ ５０μｍのおよその平均直径を有していた。イヌの鳥体を用いてこの手順を繰返 した。

実施例６−肝臓鳥体の被覆 釧の先端と接地した０、１１７Ｍの塩化カルシウム水溶液との間で周囲温度でフ ァン・デ・グラフ（〜ａｎ　ｄｅ　Ｇｒａｆｆ）発１０により生成した８ＫＶの ＤＣｔａ電電圧全電圧し、実施例５の手順により調製した膵臓鳥体の懸濁物（μ Ｌ当り２５の鳥体）を、約２００μｍ／分の流速て２０ゲージの針を通過させた 。細い減衰した流オ］として針から出た懸濁物は液滴へと転換し、この液滴を塩 化カルシウム溶液中て補隼した。溶液中のカルシウムイオンとの反応により液滴 をゲル化させた。島＋４にのアルギン酸カルシウム被覆は平滑かつ均一であり、 約１３０μｍのおよその１７さを有していた。全体の被覆した粒子は、約３６０ μｍの平均直径を有していた。

実施例５の手順によって調製したイヌの鳥体を用いてこの方法を繰返した。

実施例７−糖摩病マウスへの肝臓鳥体移植（ＩＰ）移植の数日前に、Ｏ，１Ｍク エン酸緩衝液（ｐＨ４，５）中の５０ｍｇ／ｍＬのストレブトゾシン（ｓｔｒｅ ｐｔｏｚｏｃｉｎ）　（２５０ｍｇ／ｋｇ）をＩＰ注射することにより、宿主１ ３ａｌｂ／Ｃマウスを糖尿病状態とした。

￥施例６の手順により調製した被覆したイヌのランゲルハンス島を、１つの群の マウスにマウス当り２０００〜３０００島体でＩＰ注射した。マウスは正常血糖 となり、７２週間（１８か月）に渡ってこれを維持した。移植の数週間後に、数 匹のマウスは糖尿病状態に戻った。これらのマウスを層殺し、被覆した鳥体を検 査した。アルギン酸で被覆した鳥体は生きており、繊維形成はなく、マクロファ ージの過剰生育はないことが分った（被覆した鳥体カプセル当り２〜１０のマク ロファージのみ）。

同じアルギン酸から形成した球体（細胞を含まない）を、対照群のＢａ１ｂ／Ｃ マウスにＩＰ注射した。数日乃至数週間の期間で間隔を置いてマウスを層殺した 。アルギン酸球体を組織学的に検査したところ、繊維形成はなく、マクロファー ジの過剰生育は実質的にないことが分った。

明らかに、前記した教示に照らして、本発明の多数の改変および変更が可能であ る。したがって、添付する請求の範囲の範囲内て、ここに具体的に記載した以外 に、この発明を実施し得ることを理解すべきである。

フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、 ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、　ＰＬ 、　ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ。

ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ （７２）発明者　コチラム、ケント　シー。

アメリカ合衆国　９５６１６　カリフォルニア州　デイヴイス　イエローストー ン　アベニュ　３５７１５ （７２）発明者　ブリーランド、ヴアレリーアメリカ合衆国　９４７０５　カリ フォルニア州　パークレー　ニブイス　ストリート

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．非繊維形成誘導性のアルギン酸組成物であって、（ａ）アルギン酸と二価金 属イオンキレート剤とを含むアルギン酸水溶液を調製し、 （ｂ）前記アルギン酸溶液と漂白した活性化炭素とを、前記アルギン酸中に存在 する全ゆるフカンおよび他の汚染物質を吸着するのに十分な量および時間で接触 させて非繊維形成誘導性のアルギン酸を製造し、その後に前記活性化炭素を前記 アルギン酸溶液から除去し、 （ｃ）前記アルギン酸溶液から前記アルギン酸を沈殿させるのに有効な量で前記 アルギン酸溶液にエタノールを添加し、かつ（ｄ）前記沈殿したアルギン酸を単 離することを含む方法により調製される非繊維形成誘導性のアルギン酸組成物。 ２．方法が、 （ｅ）前記沈殿したアルギン酸を用いて生きた生理的に活性な組織または細胞を 被覆し、これに二価金属イオンを添加することにより前記被覆したアルギン酸を ゲル化させる ことを更に含む請求項１記載の組成物。 ３．フカンがフコース、ポリフェノールおよび蛋白質を含み、組成物中に残留す るフコースの量が約０．０２重量％未満であり、かつポリフェノールの量がタン ニン酸に関して約０．２重量％未満である請求項１記載の組成物。 ４．組成物中に残留するフコースの量が約０．０１重量％未満である請求項３記 載の組成物。 ５．組成物中に残留するフコースの量が約０．００５重量％未満である請求項３ 記載の組成物。 ６．組成物中に残留するポリフェノールの量が、タンニン酸に関して約０．１重 量％未満である請求項３記載の組成物。 ７．組成物中に残留するポリフェノールの量が、タンニン酸に関して約０．０７ ５重量％未満である請求項３記載の組成物。 ８．前記アルギン酸中のマヌノレート／（マヌノレート＋グルロネート）の重量 比率が約０．１〜０．９５である請求項１記載の組成物。 ９．前記比率が約０．１５〜０．８５である請求項８記載の組成物。 １０．前記比率が約０．２５〜０．７５である請求項８記載の組成物。 １１．前記アルギン酸の分子量が約２〜３５０キロダルトンである請求項１記載 の組成物。 １２．前記アルギン酸の分子量が約４〜２５０キロダルトンである請求項１１記 載の組成物。 １３．前記アルギン酸の分子量が約６〜１２０キロダルトンである請求項１１記 載の組成物。 １４．二価金属イオンと約２〜３５０ｋＤの分子量および約０．１〜０．９５の マヌノレート／（マヌノレート＋クルコネート）の重量比率を有するアルギン酸 とを含む非繊維形成誘導性の二価金属イオン−アルギン酸ゲルであって、フコー スの量が０．０２重量％未満であり、ポリフェノールの量がタンニン酸に関して ０．２重量％未満であり、かつ前記アルギン酸ゲルで被覆した細胞をＢＡＬＢ／ Ｃマウスに移植した場合に、これが移植後に少なくとも６０日の間繊維形成を実 質的に誘導しない非繊維形成誘導性の二価金属イオン−アルギン酸ゲル。 １５．前記ゲルが、移植後に少なくとも６か月の間繊維形成を実質的に生起しな い請求項１４記載のアルギン酸ゲル。 １６．前記ゲルが、移植後に少なくとも１２か月の間繊維形成を実質的に生起し ない請求項１４記載のアルギン酸ゲル。 １７．前記ゲルが、移植後に少なくとも１８か月の間繊維形成を実質的に生起し ない請求項１４記載のアルギン酸ゲル。 １８．請求項１記載の組成物で被覆した、生きた生理的に活性な組織を含むアル ギン酸ゲルカプセル。 １９．請求項２記載の組成物て被覆した、生きた生理的に活性な組織を含むアル ギン酸ゲルカプセル。 ２０．請求項１４記載のアルギン酸ゲルで被覆した、生きた生理的に活性な組織 を含むアルギン酸ゲルカプセル。 ２１．生理的に活性な組織が生きた生理的に活性なイヌまたはラットのランゲル ハンス島を含み、有効な量の前記カプセルを糖尿病状態のマウスに移植した場合 に、これにより前記マウスが、移植後に少なくとも６０日の間、正常血糖を維持 することが可能である請求項２０記載のカプセル。 ２２．前記糖尿病状態のマウスが、移植後に少なくとも６か月の間、正常血糖を 維持することが可能である請求項２１記載のカプセル。 ２３．前記糖尿病状態のマウスが、移植後に少なくとも１２か月の間、正常血糖 を維持することが可能である請求項２１記載のカプセル。 ２４．前記糖尿病状態のマウスが、移植後に少なくとも１８か月の間、正常血糖 を維持することが可能である請求項２１記載のカプセル。 ２５．被覆体が、 移植後に組織を宿主の免疫学的構成員から保護するのに十分に低い透過性と十分 に大きい厚さとを有し、かつ 被覆体を介して細胞の生存に必要な十分な細胞栄養物および細胞産物の拡散を可 能とするよう十分な透過性と十分な小さい厚さとを有する請求項２０記載のカプ セル。 ２６．被覆体が、少なくとも約１０μｍかつ約２００μｍ未満の厚さを有する請 求項２０記載のカプセル。 ２７．組織が、膵臓島体細胞、神経細胞、賢臓皮質細胞、管内皮細胞、甲状腺細 胞、副賢細胞、胸腺細胞、卵巣細胞および肝臓細胞よりなる群から選択される少 なくとも１以上の細胞形態を含む請求項２０記載のカプセル。 ２８．組織細胞が膵臓島体細胞である請求項２７記載のカプセル。 ２９．二値金属イオンがカルシウムイオンを含む請求項２０記載のカプセル。 ３０．請求項２０記載のカプセルと薬学的に許容し得るキャリナーとを含む薬学 的組成物。 ３１．組織細胞が膵臓島体細胞である請求項３０記載の薬学的組成物。 ３２．組織を被覆する方法てあって、 （ａ）アルギン酸と二価金属イオンキレート剤とを含むアルギン酸水溶液を調製 し、 （ｂ）前記アルギン酸溶液と漂白した活性化炭素とを、前記アルギン酸中に存在 するフカンを吸着するのに十分な量および時間て接触させて非繊維形成誘導性の アルギン酸を製造し、その後に前記漂白した活性化炭素を前記アルギン酸溶液か ら除去し、 （ｃ）前記アルギン酸溶液から前記アルギン酸を沈殿させるのに有効な量で前記 アルギン酸溶液にエタノールを添加し、（ｄ）前記沈殿したアルギン酸を単離し 、かつ（ｅ）前記沈殿したアルギン酸を用いて生きた生理的に活性な組織を被覆 することを含む組織を被覆する方法。 ３３．非繊維形成誘導性のアルギン酸ゲルを製造する方法であって、アルギン酸 と二価金属イオンキレート剤を取得し、請求項３２記載の方法の工程（ａ）〜（ ｅ）を実施し、かつ前記被覆したアルギン酸をこれに二価金属イオンを添加する ことによりゲル化させる ことを含む非繊維形成誘導性のアルギン酸ゲルを製造する方法。 ３４．約１００メツシュまたはそれより微細な粒度を有する活性化木炭と約００ ０５〜０．５０Ｍの次亜塩素酸ナトリウム溶液とを約５〜３０分間接触させるこ とにより、前記漂白した活性化炭素を取得する請求項３２記載の方法。 ３５．前記アルギン酸溶液中のアルギン酸に対する漂白した活性化炭素の比率を 約０．５：１〜１：１０（ｗ：ｗ）とする請求項３４記載の方法。