CN105454221B - 一种利用微通道低温冻存大鼠胰岛细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种利用微通道低温冻存大鼠胰岛细胞的方法，其利用微通道的受限空间使超分子凝胶的三维结构发生改变，以更好地保护大鼠胰岛细胞，具体是：将低分子量的凝胶因子溶于细胞培养基中，待其溶解后制备得到含有凝胶因子的大鼠胰岛细胞悬浮液；再将此悬浮液导入微通道中，并置于3～5℃冰水浴中使其发生凝胶化，随后将冻存保护剂导入微通道中，使之缓慢渗透到细胞中，最后将微通道装置置于程序降温盒中放入‑75～‑85℃冰箱中冻存。本发明为大鼠胰岛细胞的冻存提供了一种新方法，其降低了冻存体系的冰点，减少了大鼠胰岛细胞在冻存过程中受到的冷冻损伤，提高了大鼠胰岛细胞的存活率，并且维持了复温后大鼠胰岛细胞的活性和功能，具有广阔的应用前景。

Description

一种利用微通道低温冻存大鼠胰岛细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞低温冻存技术领域，具体是一种利用微通道低温冻存大鼠胰岛细胞的方法，该方法是将含有氨基酸类凝胶因子的大鼠胰岛细胞悬浮液导入微通道中，使其在微通道受限空间中自组装形成具有纤维状三维网络结构的超分子凝胶，进而在低温冻存过程中保护大鼠胰岛细胞，减小细胞冷存损伤。
背景技术
糖尿病是常见的内分泌疾病，据国际糖尿病联盟公布数据显示，全球糖尿病患者目前已达3.82亿人，而我国糖尿病患病人数居全球之首，占全球患者总数的三分之一。细胞移植是治疗糖尿病的有效手段。但是由于每一次分离得到的活体细胞数量很难满足一次临床移植的需要，因此胰岛细胞的保存是胰岛移植需要研究的重要课题。
低温冻存是目前保存细胞或组织最普遍的方法，即往含有活细胞或组织的培养液中加入一定量的冻存保护剂，然后以一定的速率降至某一温度，并将活细胞或组织保存在该温度下一定时间。在冻存过程中，细胞内的新陈代谢被抑制，细胞或组织的活性“暂停”，所以细胞或组织得以长期保存，待需要使用时再将其复温，细胞或组织的活性和功能可恢复正常。关于胰岛的冷冻保存国内外已有相关的文献报道(如：文献[1]Carlos A.Agudelo,Hiroo Iwata.The development of alternative vitrification solutions formicroencapsulated islets[J].Biomaterials,2008,29:1167-1176；文献[2]StephanSchneider,Harald H.Klein.Long-term graft function of cryostored alginateencapsulated rat islets[J].Eur J Med Res,2011,16:396-400.；文献[3]Liu F.,TianW.C.,Yang Y.A.,Zhang Q.,Zhu M.M.,Yang L.,Yang L.,Li J.,Liu J.,Wu P..Optimalmethod for short-term or long-term islet preservation:comparison of isletculture,cold preservation and cryopreservation[J].Journal of ArtificialOrgans,2014,17(4):337-343.)，目前的方法主要有玻璃化冷冻保存和慢速冷冻保存两种。在低温冻存过程中，细胞内外形成的冰晶会对大鼠胰岛细胞造成损伤，而且在冻存保护剂添加过程细胞内外渗透压的变化也会对细胞造成伤害。虽然这两种方法能在一定程度上降低细胞受到的冰晶损伤，但是在冻存过程中细胞直接或间接地暴露在冻存保护剂中，所以细胞毒性较大，细胞的存活率和功能受到了一定的影响。
由软刻蚀法制得的微通道装置由于具有成本低廉、形状可塑以及生物相容性好等优点而在生物材料等领域的应用越来越广泛(如：文献[4]Chandran R.B.,Reinhart J.,Lemke E.,Hubel A..Influence of buoyancy-driven flow on mass transfer in atwo-stream microfluidic channel:Introduction of cryoprotective agents intocell suspensions[J].Biomicrofluidics,2012,6(4):221-228；文献[5]Tseng H.Y.,SunS.,Shu Z.,Ding W.,Reems J.A.,Gao D..Amicrofluidic study of megakary Cytesmembrane transport properties to water and dimethyl sulfoxide at suprazeroand subzero temperatures[J].Biopreservation&Biobanking,2011,9(4):355-362)。Utkan Demirci等在微通道中，利用微流控技术精密控制了冻存保护剂的用量和流速，使冻存保护剂缓慢地渗入到细胞中，从而减少了冻存保护剂的用量，降低了低温冻存体系的毒性，提高了细胞存活率(见文献[6]Young S.Song,SangJun Moon,Leon Hulli,SyedK.Hasan,Emre Kayaalp,Utkan Demirci.Microfluidics for cryopreservation[J].LabChip.2009,9(13):1874-1881.)。微流控技术不仅可以控制微通道中流体的流量、形状、体积和成份，而且提供尺寸可控的受限空间。由PDMS(polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷的英文缩写)制作的微通道因其透光性好，故通常与显微镜技术相结合用来实时观测和记录尺度在微米或纳米级物质的形貌。
超分子凝胶是一类由低分子量的凝胶因子聚集而形成的软物质，它是低分子量凝胶因子在一定环境条件下自组装形成的超分子化合物。凝胶因子自组装形成超分子凝胶的驱动力包括氢键、π-π堆积、亲疏水相互作用、静电相互作用等非共价相互作用。当外界刺激(如pH变化、环境温度、磁信号)发生变化时，超分子凝胶能够快速且自发地对外界刺激做出响应，由于这些非共价相互作用具有可逆性，所以超分子凝胶对外界刺激的响应变化通常都是可逆的。而且，生物体中的凝胶体系多由弱相互作用构成，所以与聚合物凝胶相比，超分子凝胶的结构更接近于生物体，具有更好的生物相容性，因而被广泛用于生物医用材料、生物传感器等领域。由文献[7]Vineetha Jayawarna,Murtza Ali,Thomas A.Jowitt,AlineF.Miller,Alberto Saiani,Julie E.Gough,Rein V.Ulijn.Nanostructured hydrogelsfor three-dimensional cell culture through self-assembly offluorenylmethoxycarbonyl-dipeptides[J].Adv.Mater.2006,18:611-614，文献[8]Hongzhou Huang,Ying Ding,Xiuzhi S.Sun,Thu A.Nguyen.Peptide hydrogelation andcell encapsulation for 3D culture of MCF-7breast cancer cells[J].Plos One,2013,8(3),|e59482.和文献[9]Rohan A.Hule,Radhika P.Nagarkar,Aysegul Altunbas,Hassna R.Ramay,Monica C.Branco,Joel P.Schneider,Darrin J.P℃han.Propertiesand bioproperties in self-assembledβ-hairpin peptide hydrogels[J].FaradayDiscuss.,2008,139:251-264可知，最近，基于低分子量的凝胶因子形成的超分子凝胶鲜见冷冻体系的报道。
本发明基于低分子量的氨基酸类凝胶因子利用其在微通道受限空间中自组装形成的超分子凝胶包埋大鼠胰岛细胞，然后进行低温冻存，而关于该方面的文献还未见报道。
发明内容
本发明所需要解决的技术问题是：提供一种利用微通道低温冻存大鼠胰岛细胞的方法。利用成本低廉、简单可行的方法制备微通道装置，在微通道内构建一种生物相容性好的超分子凝胶冻存体系，该体系能减小被包埋的大鼠胰岛细胞在冻存过程中受到的损伤，提高其复苏后的存活率并维持细胞功能，从而起到有效的冷冻保护作用。
本发明解决其技术问题采用以下的方案：
本发明提供的利用微通道低温冻存大鼠胰岛细胞的方法是利用微通道的受限空间使超分子凝胶的三维结构发生改变，以更好地保护大鼠胰岛细胞，具体是：将低分子量的凝胶因子溶于细胞培养基中，待其溶解后制备得到含有一定量凝胶因子的大鼠胰岛细胞悬浮液；然后将此大鼠胰岛细胞悬浮液导入微通道中，并置于3～5℃冰水浴中使其发生凝胶化，随后再将第一冻存保护剂或第二冻存保护剂导入微通道中，使第一冻存保护剂或第二冻存保护剂缓慢渗透到细胞中，并将微通道装置置于程序降温盒中放入-75～-85℃冰箱中冻存。
所述的微通道装置由微通道和载玻片组成，微通道管道宽为200～280μm，深度为115～225μm。
所述的微通道装置由软刻蚀法制备得到，具体是：将聚二甲基硅氧烷前聚体与固化剂按质量比例10:1混合均匀后倒在刻有微通道图形的硅晶片上，抽真空除去聚二甲基硅氧烷中的气泡后放入恒温60℃加热2～3h至微通道完全形成；随后，将刻有微通道图形的聚二甲基硅氧烷与硅晶片分离，并将微通道的入口和出口打通，随后将其与干净的载玻片一起用等离子表面处理机进行处理；处理完成后，迅速将载玻片和聚二甲基硅氧烷粘在一起；将粘结好的聚二甲基硅氧烷和载玻片放置恒温60℃固化2h，微通道装置制作完成。
所述的低分子量凝胶因子为氨基酸类凝胶因子。
所述的细胞培养基为RPMI1640培养基。
所述的冻存保护剂可以为渗透性冻存保护剂，例如可以采用二甲基亚砜。
所述的冻存保护剂是由渗透性冻存保护剂和非渗透性冻存保护剂组成的混合液，其中：渗透性冻存保护剂为二甲基亚砜，非渗透性冻存保护剂为海藻糖，二者质量配比为1：0.16。
本发明将冻存有大鼠胰岛细胞的微通道装置从冰箱中取出在37℃进行复温，当温度高于超分子凝胶相转变温度时，超分子凝胶转变为液态，然后将大鼠胰岛细胞从微通道中导出，用于测试其的活性和功能。
本发明与现有技术相比，具有以下的主要的优点：
1.超分子凝胶由低分子量的氨基酸类凝胶因子通过非共价键自组装形成，能够对温度、pH值等环境变化做出快速响应，而且这些变化通常是可逆的，复温过程凝胶膜转变为液态，不妨碍细胞从微通道中导出，保证了大鼠胰岛细胞的完整性，细胞的形态和活性与新鲜细胞相差甚小；此外，该低分子量的凝胶因子为氨基酸类凝胶因子，具有良好的生物相容性。
2.与传统的方法相比，微通道具有微米或纳米尺寸，在体外培养条件下可以精确地控制微通道中流体的行为进而为细胞提供生存所需的微环境。
3.通过微流控技术调节受限空间的形状和尺寸，调控超分子凝胶的微观结构，得到具有紧密缠绕纤维状三维网络结构的超分子凝胶，从而降低大鼠胰岛细胞在冻存过程中受到的损伤，提高了大鼠胰岛细胞的存活率。在添加冻存保护剂过程中，不仅能减少具有细胞毒性的冻存保护剂的用量，降低冻存体系的毒性，而且由于微流控技术能精准地控制冻存保护剂的流速，使之缓慢有效地渗入细胞中，从而减缓细胞内外渗透压的剧烈变化，减少细胞的渗透损伤。另外，在降温过程中，超分子凝胶紧密的三维网络结构限制了冰晶的生长，降低冻存体系的冰点，减少大鼠胰岛细胞的冻存损伤。
附图说明
图1为微通道装置的示意图；
图2是图1中沿A1-A2线的剖视图；
图3为超分子凝胶在载玻片上的微观形貌图；
图4为超分子凝胶在微通道中的微观形貌图；
图5为在微通道中冻存1天和7天复苏后的大鼠胰岛细胞的ATP(adenosinetriphosphate，三磷酸腺苷的英文缩写)值。
图6为低糖条件下(葡萄糖摩尔浓度为3mmol/L)在微通道中冻存1天和7天复苏后大鼠胰岛细胞的胰岛素释放。
图7为高糖条件下(葡萄糖摩尔浓度为20mmol/L)在微通道中冻存1天和7天复苏后大鼠胰岛细胞的胰岛素释放。
图中：1.微通道入口；2.微通道入口；3.微通道管道；4.微通道出口；5.微通道；6.载玻片。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明进行详细的描述。下面的实施例只是对本发明作进一步的解释说明，但并非穷举，不对本发明做任何限制。
本发明提供的一种利用微通道低温冻存大鼠胰岛细胞的方法，是利用微通道中超分子凝胶的三维网络结构冻存大鼠胰岛细胞，该方法包含以下步骤：
实施例1：微通道装置的制备
如图1和图2所示，所述微通道装置由微通道5和载玻片6组成，微通道5粘在载玻片6之上，微通道装置的长、宽和高分别为75mm、25mm和5mm。微通道5包括四个部分：微通道入口1、微通道入口2、微通道管道3、微通道出口4。微通道管道3为微通道5的主体部分，位于微通道5的下表面，与载玻片6的上表面接触，微通道管道3与微通道入口1、微通道入口2与微通道出口4连通，微通道管道3宽为280μm，深度为220μm。
微通道入口1位于微通道装置左侧，与微通道管道3连通，用于将冻存保护剂Ⅰ或冻存保护剂Ⅱ导入微通道管道3中；微通道入口2位于微通道入口1与微通道出口4之间，与微通道管道3连通，用于：1)冷冻过程中将含有凝胶因子G的大鼠胰岛细胞悬浮液导入微通道管道3中，2)解冻之后，将含有胎牛血清的RPMI1640培养基(胎牛血清与RPMI1640培养基体积比为1:9)导入微通道管道3中冲洗大鼠胰岛细胞；微通道管道3位于微通道5的下表面，与载玻片6的上表面接触，与微通道入口1、微通道入口2与微通道出口4连通，用于：1)冷冻过程中储存含有凝胶因子G的大鼠胰岛细胞悬浮液，2)为冻存保护剂Ⅰ或冻存保护剂Ⅱ渗透进入已凝胶化的大鼠胰岛细胞悬浮液的过程提供场所；微通道出口4位于微通道装置右侧，与微通道管道3连通，用于解冻之后收集大鼠胰岛细胞冲洗液。
微通道装置使用时需要在微通道入口1、微通道入口2和微通道出口4处连接聚乙烯管。所述聚乙烯管购买于美国BD公司，无色透明，聚乙烯管内径为0.38mm，外径为1.09mm。使用时各流体在微通道装置中的流动路径如下：含有凝胶因子G的大鼠胰岛细胞悬浮液由微通道入口2导入，随后进入微通道管道3中；冻存保护剂Ⅰ或冻存保护剂Ⅱ由微通道入口1导入微通道管道3中，使之缓慢渗透进入微通道管道3中的已发生凝胶化的含有凝胶因子G的大鼠胰岛细胞悬浮液；解冻后将含有胎牛血清的RPMI1640培养基(胎牛血清与RPMI1640培养基体积比为1:9)由微通道入口2导入微通道管道3中，将微通道管道3中的大鼠胰岛细胞冲洗出来，并在微通道出口4处收集冲洗液。
所述微通道装置的制备方法是：将抛光过的硅晶片(购于哈尔滨特博科技有限公司，直径100.2±0.2mm)用无水乙醇清洗后置于100℃的热板上加热5min，待乙醇除去后用氮气吹洗表面3次。将硅晶片置于匀胶机托盘正中间，匀胶加速时间设置为18s，打开真空泵，使硅晶片紧紧吸附在托盘中间，将市售光刻胶SU-8(购于瑞士Gersteltec公司)涂抹在硅晶片上，匀胶结束后，采用智能电热板缓慢升温至65℃，烘烤6min之后升温至95℃，在95℃下保持30min，然后自然冷却至室温。随后将光掩膜(购于深圳市路维光电股份有限公司)平整地覆盖在上述硅晶片上，用紫外透射增强玻璃板紧贴光掩膜使之能够与光刻胶紧密接触，尽量减少狭缝，免去狭缝发生衍射对光刻产生影响。使用紫外光对其照射30min，曝光位置光刻胶发生光固化反应形成微通道模板。将微通道模板在显影液(质量百分比为0.5％的氢氧化钠溶液)中浸泡15min，随后用乙醇洗去显影液，再用去离子水清洗4次。显影之后将上述硅晶片置于65℃的热板上烘烤5min，然后在95℃温度下保持15min，则得到刻有微通道图案的硅晶片。将市售184有机硅弹性体∶双组分(购于美国道康宁公司)按质量比10:1(即PDMS前聚体与其固化剂质量比为10:1)的比例混合，搅拌5min后倒在刻有微通道图形的硅晶片上，抽真空除去PDMS中的气泡，随后在60℃下加热3h至PDMS固化完全。随后将固化好的PDMS与硅晶片分离，并将微通道的入口和出口打通，然后将其与干净的载玻片一起用等离子表面处理机处理1min。处理完成后，迅速将载玻片和PDMS刻有图案的一面粘在一起，同时施加压力将其中的气泡挤出。随后将粘结好的PDMS和载玻片于60℃固化2h，则微通道装置制作完成。
实施例2：超分子凝胶的制备及其性能
1.根据文献[10](马小单.酪氨酸衍生物的合成及其凝胶性能研究[D].西安科技大学,2012.)所述方法合成凝胶因子G。该凝胶因子G能在微通道的受限空间内自组装形成紧密的纤维状三维网络结构，一方面这种三维网络结构能限制冰晶的生长，减小冰晶的形成对细胞造成的机械损伤；另一方面超分子凝胶紧密的三维网络结构能够起到缓渗作用，大大地降低了冻存保护剂的渗透速率，减轻了因细胞膜内外渗透压差骤变带来的伤害。
2.将凝胶因子G加入到RPMI1640培养基中，在50℃条件下超声6min使其完全溶解，制得含有凝胶因子G的溶液S1(凝胶因子G质量浓度为1.5g/L)。室温下将上述溶液S1分别滴在载玻片上和由微通道入口2导入微通道5中，并用光学显微镜观察超分子凝胶的自组装形貌。图3和图4分别为凝胶因子G在载玻片上和微通道中形成超分子凝胶的微观形貌图。
3.测试超分子凝胶冻存体系(凝胶因子G的质量浓度为1.5g/L)和未添加凝胶因子G的冻存体系的热学性能，研究冻存体系的冰点变化。通过调控超分子凝胶在受限空间的微观形貌影响冻存体系的低温性能，进而达到降低超分子凝胶冻存体系冰点的目的。
测试结果表明，超分子凝胶的相转变温度为7.1℃，而超分子凝胶冻存体系的冰点为-18.2℃，未添加凝胶因子G的冻存体系的冰点为-15.6℃(高于超分子凝胶冻存体系的冰点2.6℃)，这表明超分子凝胶具有降低冻存体系冰点的作用。
实施例3：大鼠胰岛细胞的冷存过程
1.大鼠胰岛细胞的获得：从湖北省疾病预防控制中心购买的大鼠采集获得大鼠胰岛细胞并放入含有胎牛血清的RPMI1640培养基(胎牛血清与RPMI1640培养基体积比为1:9)中，然后置于37℃、CO2体积分数为5％的培养箱中培养。
2.制备含凝胶因子G的大鼠胰岛细胞悬浮液S2：
①取上述培养后的大鼠胰岛细胞，用体积分数为0.1％胰蛋白酶溶液消化并吹打成单个细胞悬液，把细胞悬浮在含有胎牛血清的RPMI1640培养基(胎牛血清与RPMI1640培养基体积比为1:9)中备用。
②将凝胶因子G加入到RPMI1640培养基中，在50℃条件下超声6min使其完全溶解，制得含有凝胶因子G的溶液，然后加入到上述步骤①中的细胞悬液中，得到含凝胶因子G的大鼠胰岛细胞悬浮液S2。该悬浮液S2中，凝胶因子G的最终质量浓度为1.5g/L，大鼠胰岛细胞的密度为2400个/mL。
3.大鼠胰岛细胞的冷冻保存：
①将二甲基亚砜与RPMI1640培养基按体积比1:9混合得到冻存保护剂Ⅰ。将二甲基亚砜、海藻糖溶于RPMI1640培养基中配制得到冻存保护剂Ⅱ，其中二甲基亚砜的体积分数为10％，海藻糖的摩尔浓度为50mmol/L。
②分别在微通道入口1、微通道入口2以及微通道出口4处连接聚乙烯管(内径为0.38mm，外径为1.09mm)。在4℃冰水浴中，将上述含有凝胶因子G的大鼠胰岛细胞悬浮液S2由微通道入口2导入微通道5中，于4℃冰水浴中平衡5min。
③将上述步骤①中所述的冻存保护剂Ⅰ或冻存保护剂Ⅱ由微通道入口1导入微通道5中，并在4℃冰水浴中平衡15min。
④将微通道装置置于程序降温盒中，以1℃/min的降温速率降至-80℃保存1天和7天。对照组为从购买的大鼠采集得到的新鲜大鼠胰岛细胞，加入含有胎牛血清的RPMI1640培养基(胎牛血清与RPMI1640培养基体积比为1:9)，置于37℃、CO2体积分数为5％的培养箱中培养1天和7天，测试大鼠胰岛细胞的活性和功能。
实施例4：大鼠胰岛细胞的复温过程：
将冻存有大鼠胰岛细胞的微通道装置从-80℃冰箱中取出，立即放入37℃水浴中解冻，解冻时间2min。解冻后将含有胎牛血清的RPMI1640培养基(胎牛血清与RPMI1640培养基体积比为1:9)由微通道入口2导入微通道5中，将微通道5中的大鼠胰岛细胞冲洗出来，冲洗5次，并在微通道出口4处收集冲洗液，用1000r/min速率离心弃去上清液，加入含有胎牛血清的RPMI1640培养基(胎牛血清与RPMI1640培养基体积比为1:9)，置于37℃、CO2体积分数为5％的培养箱中培养，准备进一步测试大鼠胰岛细胞的功能。
实施例5：大鼠胰岛细胞的检测：
①测试复温后大鼠胰岛细胞的ATP含量：
本发明使用ATP检测试剂盒测试大鼠胰岛细胞中的ATP含量。取复温后的大鼠胰岛细胞10个，并制备大鼠胰岛细胞悬浮液。向上述细胞悬浮液中加入4mL含有葡萄糖(葡萄糖的摩尔浓度为20mmol/L)的KRB溶液(Krebs-Ringer buffer，Krebs-Ringer缓冲液英文缩写)，并置于37℃、CO2体积分数为5％的培养箱中培养1h。培养结束后，将该大鼠胰岛细胞悬浮液置于黑色的孔板中测量ATP值，基于荧光强度和胰岛中ATP含量之间的关系可获得ATP值。图5为在微通道中冻存1天和7天复苏后的大鼠胰岛细胞的ATP值。
②胰岛素释放试验：
取复温后的大鼠胰岛细胞100个置于培养皿中培养，分别置于低糖(葡萄糖摩尔浓度为3mmol/L)与高糖(葡萄糖摩尔浓度为20mmol/L)的含有体积分数为0.1％牛血清白蛋白的KRB溶液中，于37℃、CO2体积分数为5％的条件下培养1h，用放射免疫法测定胰岛素释放量。图6和图7为在微通道中冻存1天和7天后大鼠胰岛细胞胰岛素释放。
实验数据显示，采用本发明所提供的方法冷冻大鼠胰岛细胞后，在冻存过程中不仅减少了冻存保护剂的使用，降低了有毒试剂对细胞的毒害，而且超分子凝胶的形成导致冻存体系冰点的降低，减少了大鼠胰岛细胞受到的冷冻损伤；在复温过程中，由于超分子凝胶的热可逆性，超分子凝胶转变为液态，有利于将大鼠胰岛细胞从微通道中导出，保证了大鼠胰岛细胞的完整性。该方法冻存的大鼠胰岛细胞的形态与新鲜的大鼠胰岛细胞基本无差别，其功能也与新鲜的大鼠胰岛细胞接近，证明利用微通道低温冻存的大鼠胰岛细胞能够保持其原有的生物学特性。

Claims (8)

1.一种利用微通道低温冻存大鼠胰岛细胞的方法，其特征在于该方法是利用微通道的受限空间使超分子凝胶的三维结构发生改变，以更好地保护大鼠胰岛细胞，具体是：将低分子量的凝胶因子溶于细胞培养基中，待其溶解后制备得到含有一定量凝胶因子的大鼠胰岛细胞悬浮液；然后将此大鼠胰岛细胞悬浮液导入微通道中，并置于3～5℃冰水浴中使其发生凝胶化，随后再将冻存保护剂导入微通道中，使冻存保护剂缓慢渗透到细胞中，并将冻存有大鼠胰岛细胞的微通道装置置于程序降温盒中放入-75～-85℃冰箱中冻存；
所述的微通道装置由微通道(5)和载玻片(6)组成，微通道管道宽为200～280μm，深度为115～225μm；
所述的低分子量凝胶因子为氨基酸类凝胶因子。
2.根据权利要求1所述的利用微通道低温冻存大鼠胰岛细胞的方法，其特征在于所述的微通道装置由软刻蚀法制备得到，具体是：将聚二甲基硅氧烷前聚体与固化剂按质量比例10:1混合均匀后倒在刻有微通道图形的硅晶片上，抽真空除去聚二甲基硅氧烷中的气泡后放入恒温60℃加热2～3h至微通道完全形成；随后，将刻有微通道图形的聚二甲基硅氧烷与硅晶片分离，并将微通道的入口和出口打通，随后将其与干净的载玻片一起用等离子表面处理机进行处理；处理完成后，迅速将载玻片和聚二甲基硅氧烷粘在一起；将粘结好的聚二甲基硅氧烷和载玻片放置恒温60℃固化2h，微通道装置制作完成。
3.根据权利要求1所述的利用微通道低温冻存大鼠胰岛细胞的方法，其特征在于所述的细胞培养基为RPMI1640培养基。
4.根据权利要求1所述的利用微通道低温冻存大鼠胰岛细胞的方法，其特征在于所述的冻存保护剂为渗透性冻存保护剂。
5.根据权利要求4所述的利用微通道低温冻存大鼠胰岛细胞的方法，其特征在于所述的渗透性冻存保护剂，采用二甲基亚砜。
6.根据权利要求1所述的利用微通道低温冻存大鼠胰岛细胞的方法，其特征在于所述的冻存保护剂是由渗透性冻存保护剂和非渗透性冻存保护剂组成的混合液，二者质量配比为1：0.16。
7.根据权利要求6所述的利用微通道低温冻存大鼠胰岛细胞的方法，其特征在于所述的渗透性冻存保护剂为二甲基亚砜，非渗透性冻存保护剂为海藻糖。
8.根据权利要求1所述的利用微通道低温冻存大鼠胰岛细胞的方法，其特征在于：将冻存有大鼠胰岛细胞的微通道装置从冰箱中取出在37℃进行复温，当温度高于超分子凝胶相转变温度时，超分子凝胶转变为液态，然后将大鼠胰岛细胞从微通道中导出，用于测试其的活性和功能。
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