WO2017020365A1 - 大规模培养动物细胞的系统 - Google Patents

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WO2017020365A1
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bioreactor
sub
animal cells
interface
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高毅
傅超毅
李阳
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南方医科大学珠江医院
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/34—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of gas

Definitions

  • the present invention relates to an animal cell culture technique, and more particularly to a system for large-scale cultivation of animal cells.
  • liver transplantation a chronic liver failure in China is very common. According to statistics, there are 300,000 such patients in China every year. The mortality rate is as high as 80%.
  • the main methods for treating liver failure are: (1) Medical treatment. (2) Liver transplantation treatment. (3) Artificial liver treatment. The medical treatment is not effective. The liver transplantation in surgical treatment is currently recognized as the most effective treatment. However, due to lack of donors and high technical difficulty, it has greatly limited the extensive development of liver transplantation. He died while waiting for a liver transplant.
  • Bioartificial liver has functions such as detoxification, transformation and synthesis of hepatocytes, which can replace most functions of the liver.
  • the bioreactor is the core part of the entire bioartificial liver, and its performance will directly affect the support of bioartificial liver.
  • the ideal bioartificial liver bioreactor should meet the following criteria: (1) The cell density can reach 1 X108-10 cells/ml level; (2) The reaction device can be arbitrarily increased according to the needs, and the cell culture can reach several liters; 3) Realize effective two-way substance transport of nutrients, oxygen and metabolites, and simulate the microenvironment of hepatocytes in vivo as much as possible; (4) Detect and adjust functions of automated online cell state, culture pH, oxygen concentration, etc. To facilitate the supervision and operation of medical personnel; (5) The level of hepatocyte metabolism is at least as high as that of monolayer culture, and is maintained for at least 2 weeks; (6) It is convenient for cryopreservation, transportation and assembly.
  • bioartificial liver development is to design the best new bioreactor, to realize the large-scale culture of hepatocytes in vitro and the effective maintenance of hepatocyte function and viability during the culture process, and to meet the clinical application. Need.
  • the structure of bioreactors at home and abroad can be divided into the following four categories:
  • Hollow fiber bioreactor At present, the research of the reactor has also made the following progress: 1) Integrating independent pipeline oxygen supply systems, such as hybrid LSS-MELS system; 2) Finding new membranes Materials or improvements to existing membrane materials; 3) Integration of increased activated carbon and other substances to understand toxic treatments based on hepatocellular biotherapy, such as the LIVERaid system; 4) Using new culture models, such as the LSS system to improve by co-culture The activity and function of hepatocytes.
  • the reactor still has the following problems: (1) The volume is limited, the cell loading is small, and the exchange area between the culture medium and the hepatocytes is limited, which is not conducive to large-scale expansion in vitro;
  • perfusion bed / stent bioreactor the reactor is stirred to bring the cells and scaffold materials to a suspension state, the bioreactor mechanical agitation will produce a certain shear force, easy to cause a greater degree of cells The damage above limits its further use.
  • the bioreactor is a hepatocyte wrapped with a semi-permeable membrane material, made into porous microcapsules, and then perfusion culture.
  • the disadvantage is due to the presence of semi-permeable membrane and Mutual aggregation between hepatocytes leads to limited exchange of material energy inside and outside the capsule.
  • Hepatocytes are anchorage-dependent cells, such as the loss of attachment to the scaffold material, which can trigger cell apoptosis.
  • a system for large-scale cultivation of animal cells comprising a cell factory bioreactor for providing a growth site for animal cells, an oxygen supply device for supplying oxygen to the cell factory bioreactor, and a storage medium for storing medium a peristaltic pump for driving the medium to flow in the system, and a circulation line for electrically connecting the cell factory bioreactor, the oxygen supply device, the liquid storage bottle, and the peristaltic pump;
  • the utility model comprises: a first sub-pipe and a second sub-pipe, which are respectively provided with two pinch valves and are disposed on the two pinch valves a first interface and a second interface; the left ends of the two sub-pipes are connected to each other to form a third interface; the right ends of the two sub-pipes are connected to each other to form a fourth interface; and the third sub-pipes have left and right ends respectively Connected to the first interface and the second interface, and the third sub-line connects the oxygen supply, the liquid storage bottle and the peristaltic pump in series; the first
  • the cell factory bioreactor is provided with a first port and a second port respectively connected to the fourth branch line and the fifth branch line.
  • the cell factory bioreactor is a microcarrier bioreactor.
  • the system further includes an in-line detector; the circulation line further includes a sixth sub-line connected to the third sub-line by a three-way valve and connected in series with the online monitor.
  • the system further includes a heating plate serially connected between the peristaltic pump and the liquid storage bottle by means of the third partial pipe.
  • the oxygen donor is a membrane oxygenator.
  • the system also includes a general controller that regulates the control parameters of the various components of the system that affect cell culture conditions.
  • the present invention has the following advantages:
  • the system for large-scale cultivation of animal cells of the present invention which provides circulation power by a peristaltic pump, and controls liquid (medium) entry by rationally designing a circulation line and alternately opening and closing with two pairs of pinch valves.
  • the direction of the reactor tank, the periodic bidirectional perfusion of the medium can prevent the cell metabolites in the reactor tank from accumulating in one place, and avoid the situation that the perfusion inlet cells have good oxygen supply and the tank outlet cells are deprived of oxygen and nutrients. Effectively eliminate the formation of dead cells in culture;
  • the system for large-scale cultivation of animal cells of the present invention uses a membrane oxygenator widely used in surgery as an oxygen donor, which effectively improves gas exchange during animal cell culture, and Help to improve the quality of animal cell culture;
  • the system for large-scale cultivation of animal cells of the present invention is provided with an on-line detector for detecting the pH and dissolved oxygen content of the culture medium, and the microenvironment in the bioreactor can be understood, and According to The monitored values adjust the reactor parameters to improve the microenvironment in the reactor tank, and can also avoid contamination due to sampling detection;
  • the system for large-scale cultivation of animal cells of the present invention uses microcarrier culture technology for animal cells to fuse suspension culture and adherent culture, and has both advantages.
  • FIG. 1 is a schematic structural view of a system for large-scale cultivation of animal cells according to the present invention, showing that when the first pinch valve and the fourth pinch valve are snoring, the second pinch valve, and the third pinch valve are closed, Flow direction of the medium in the system
  • FIG. 2 is a schematic structural diagram of a system for large-scale cultivation of animal cells according to the present invention, showing that the first pinch valve and the fourth pinch valve are closed, the second pinch valve and the third pinch valve are smashed. The flow direction of the medium.
  • FIG. 3 is a graph showing the growth of human hepatocytes cultured by the system for large-scale cultivation of animal cells of the present invention.
  • a system for large-scale cultivation of animal cells of the present invention includes a cell factory bioreactor 1, a liquid storage bottle 2, a heating plate 3, a peristaltic pump 4, an oxygen supply device 5, an in-line detector 6, and the like
  • the various components are sequentially connected to the circulating line 7 of the connection.
  • the connection order of the above components is sequentially a cell factory bioreactor 1 - a liquid storage bottle 2 - a heating plate 3 - a peristaltic pump 4 - an oxygen supply device 5 - a cell factory bioreactor 1, and the above connection forms the system
  • the main circulation line; further, the in-line detector 6 is connected in parallel between the cell factory bioreactor 1 and the liquid storage bottle 2.
  • the cell factory bioreactor 1 is a growth site of animal cells from which the target metabolites of animal cells or animal cells can be harvested after the culture process is completed.
  • the cell factory bioreactor 1 preferably employs a microcarrier bioreactor for the growth characteristics of animal cells. Further, for the culture of human hepatocyte C3A, Cytode X 3 microcarriers can be used.
  • the first port 11 and the second port 12 for perfusing the culture medium are respectively disposed on the upper and lower sides of the can body of the cell factory bioreactor 1.
  • the liquid storage bottle 2 is used for storing fresh liquid medium, and the bottle mouth of the liquid storage bottle 2 is provided with a double-hole stopper, and the two holes of the bottle stopper are respectively connected for flowing in or out of the liquid medium. Pipeline.
  • the heating plate 3 is an electrothermal heating device that heats the liquid medium flowing through the heating plate 3 to meet the temperature requirements of the animal cells for in vitro expansion.
  • the peristaltic pump 4 provides a driving force for the flow of the liquid medium flowing in the system for culturing the animal cells, and the flow rate of the peristaltic pump 4 and the like affecting the circulation of the liquid medium can be adjusted by using a corresponding control device. .
  • the oxygenator 5 provides the cell factory cell reactor 1 with oxygen required for in vitro expansion of animal cells, the "oxygen” is not pure oxygen, but 5% carbon dioxide and 95% oxygen. According to this, a membrane oxygenator widely used in surgery is used as the oxygenator 5, and the gas exchange process of the liquid medium can be optimized to ensure that the oxygen content of the liquid medium satisfies the in vitro expansion of the animal cells. Increased requirements.
  • the in-line detector 6 is connected in parallel with the main circulation line of the system through a three-way valve 761, and is used for detecting the pH value and dissolved oxygen content of the medium on-line as needed, and detecting the obtained actual data. Modulation of parameters of other devices of the system for culturing the animal cells.
  • the circulation line 7 includes a first sub-line 71, a second sub-line 72, a third sub-line 73, a fourth sub-line 74, a fifth sub-line 75 and a sixth sub-line 76.
  • the first sub-pipe 71 is provided with a first pinch valve 712 and a second pinch valve 713, and a first interface 7 11 is disposed on the pipeline between the two pinch valves;
  • a second pinch valve 722 and a fourth pinch valve 723 are disposed on the second branch line 72, and a second interface 721 is disposed on the pipeline between the two pinch valves;
  • the first The left end of the sub-line 71 and the left end of the second sub-line 72 are connected to each other to form a third interface 731, and the right end of the first sub-line 71 and the right end of the second sub-line 72 are connected to each other to form a fourth interface 732;
  • the left end of the sub-line 73 is connected to the third port 731, the right end of the
  • the ⁇ , closed states of the first pinch valve 712, the second pinch valve 713, the third pinch valve 722, and the fourth pinch valve 723 affect the liquid in the system for cultivating animal cells.
  • the flow direction of the medium is as follows:
  • the system can also be set to adjust the effects in the system.
  • the overall controller should include at least a heating control unit that adjusts the heating temperature of the heating plate 3, a flow rate control unit that adjusts the flow rate of the peristaltic pump 4, and an oxygen supply control unit that monitors the degree of gas exchange of the aerator 5.
  • An impeller control unit that controls the rotational speed of the agitating impeller in the cell factory bioreactor 1 and a detection unit that controls and displays the detected data of the in-line detector 6.
  • Cytode X 3 microcarriers All glasswares such as straws and culture dishes which are in contact with the microcarriers outside the culture flask are silicidated with 2% dichlorodimethylsilane. Weigh 2.5g of Cytode X 3 microcarriers into 100ml glass jars, add 5% hydration with 100ml fresh PBS buffer or overnight, wash 3 times with PBS, and then soak overnight in fresh PBS buffer 100ml, 120 Sterilize at 20 °C for 20 min, add 10% fetal bovine serum (FBS) complete medium and lmg/ml fibronectin solution 0.5ML soaked, and store in a refrigerator at 4 °C for use.
  • FBS fetal bovine serum
  • the reactor piping needs to be washed with a cleaning agent (20ML syringe water injection pipe) 1-2 times before use, then rinsed with distilled water (20ML syringe water injection pipe) 1-2 times, soaked in distilled water overnight Drain the water and let it dry in the oven.
  • a cleaning agent (20ML syringe water injection pipe) 1-2 times before use
  • distilled water (20ML syringe water injection pipe) 1-2 times
  • C3A cells required for cell plant bioreactor inoculation Resuscitation and expansion of C3A cells with square flasks, the inoculum required for the reactor is 2x108. It was confirmed under phase contrast microscopy that the cells had grown to about 80%, in good condition and without contamination. Digestion of collected cells in a clean bench at a clean bench, blood cell counting plate The total number of cells counted was approximately 2x 108, and the viability of trypan blue stained cells was greater than 95%.
  • the micro-gravity culture ⁇ is rotated, the rotation speed of the reactor tank is 10 rpm, the flow rate of the peristaltic pump is 60 ml/min, and the commutation period is 90 s. From the next day, the reactor tank rotation speed can be gradually increased to just allow the cells and microcarriers to be suspended in the reactor tank. Generally, the rotation speed is 15 rpm on the next day, 20 rpm on the third day, and 30 rpm on the fourth to seventh days. The flow rate starts at 60 ml/min and can be maintained until the third day, and the fourth to seventh days can be set to 80 ml/min.
  • 10.1 cell count 0.5 ml of the extracted cell microcarrier sample was placed in 1.5 ml in an EP tube, and allowed to stand for 5 mi n. After the microcarriers to be adhered to the cell were sunk, the culture solution was aspirated as much as possible, and 0.1 M was added. Sodium citrate and 0.1% crystal violet were added to 1 ml, and incubated overnight at 37 ° C. The nuclei were counted on a hemocytometer plate, and a growth curve was drawn.
  • human hepatocyte C3A cultured using the system of the present invention is sufficiently attached to the Cytode X 3 microcarrier and maintains the specific function of the cell.
  • the system of the large-scale cultured animal cells of the present invention has a simple structure, effectively increases the exchange efficiency of the reactor material, and improves the quality of animal cell culture.

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Abstract

提供了一种大规模培养动物细胞的系统，其包括细胞工厂生物反应器、供氧器、储液瓶、蠕动泵，及将上述部件连接的循环管路。

Description

大规模培养动物细胞的系统 技术领域
[0001] 本发明涉及一种动物细胞培养技术， 尤其涉及一种大规模培养动物细胞的系统 背景技术
[0002] 根据 WHO统计： 全球有 6.5亿感染各种肝病患者， 最新统计每年约有 200万人死 于各种肝病。 我国急慢性肝功能衰竭十分常见， 据统计国内每年此类患者达 30 万。 病死率高达 80%。 目前治疗肝衰竭方法主要有： （1) 内科治疗。 （2) 肝脏 移植治疗。 （3) 人工肝治疗。 而内科治疗效果不佳， 外科治疗中肝脏移植手术 是目前公认的最为有效的治疗方法， 但由于供体缺乏、 技术难度高等原因， 极 大地限制了肝移植手术的广泛幵展， 绝大部分病人在等待肝移植的过程中死亡 。 生物人工肝具有肝细胞解毒、 转化、 合成等功能， 可代替肝脏大部分功能。 生物反应器是整个生物人工肝的核心部分， 其性能将直接关系到生物人工肝的 支持效果。 理想的生物人工肝生物反应器应达到如下标准： （1) 细胞密度达 1 X108-10个细胞 / ml水平； （2) 反应装置能根据需要任意增容,细胞培养量可达数 升； （3) 实现有效的营养物质、 氧气及代谢产物双向物质传输， 尽可能模拟肝 细胞在体内的微环境； （4) 可进行自动化在线细胞状态、 培养液 pH值、 氧浓度 等方面检测和调节功能， 以便于医护人员的监督和操作； （5) 肝细胞代谢功能 至少达单层培养的水平， 并至少保持 2周以上； （6) 便于冻存、 运输和装配。
[0003] 目前生物人工肝发展的核心问题是设计最佳的新型生物反应器， 实现体外肝细 胞的大规模培养及其培养过程中肝细胞功能与活率的有效维持， 同吋能够满足 临床应用的需要。 目前国内外在生物反应器的结构上， 至今为止可以分为以下 4 大类：
[0004] 1、 单层培养 /平板式的生物反应器： 该类反应器是将肝细胞直接种植于平板上
， 使得表面积与体积之比下降， 反应器细胞为单层培养， 不能长期有效存活并 保持功能与活性， 且不易放大， 无法达到临床要求。 [0005] 2、 中空纤维型生物反应器： 目前该反应器的研究上也取得了如下一些进展： 1 ) 整合独立的管道氧供系统， 如混合型 LSS-MELS系统； 2) 寻找新的膜材料或 对现有的膜材料进行改进； 3) 在进行肝细胞生物治疗的基础上整合增加活性炭 等物理解毒治疗， 如 LIVERaid系统； 4) 运用新的培养模式， 如 LSS系统通过共 培养方式提高肝细胞的活性与功能。 但该反应器仍存在以下问题： （1 ) 容积有 限， 细胞装载量小， 培养液与肝细胞交换面积有限， 不利于体外规模化扩增；
(2) 半透膜的侧孔易被细胞团堵塞， 影响交换效率， 亦不利于肝细胞的功能与 活力的长期有效维持。
[0006] 3、 灌注床 /支架生物反应器： 该反应器是通过搅拌来使细胞及支架材料达到悬 浮状态， 这种生物反应器机械搅拌会产生一定剪切力， 容易对细胞造成较大程 度上的损伤， 因而限制了其进一步的运用。
[0007] 4、 包被悬浮生物反应器： 该生物反应器是将肝细胞用一种半透膜材料包裹， 制成多孔微囊， 然后进行灌注培养. 其缺点是由于半透膜的存在以及肝细胞间 的相互聚集， 导致囊内外物质能量的交换受限。 肝细胞为贴壁依赖性细胞， 如 失去对支架材料的贴附， 可促发细胞发生凋亡。
[0008] 纵观以上现有技术， 其一般存在反应器物质交换效率低下以及管路结构繁杂等 技术问题。
技术问题
[0009] 本发明的目的是提供一种增加反应器物质交换效率的、 管路结构简洁的大规模 培养动物细胞的系统。
问题的解决方案
技术解决方案
[0010] 为达到以上技术目的， 本发明采用的技术方案如下：
[0011] 一种大规模培养动物细胞的系统， 其包括为动物细胞提供生长场所的细胞工厂 生物反应器、 为所述细胞工厂生物反应器提供氧气的供氧器、 储存培养基的储 液瓶、 用于驱动所述培养基在该系统内流动的蠕动泵， 以及将所述细胞工厂生 物反应器、 供氧器、 储液瓶、 蠕动泵导通连接的循环管路； 所述循环管路包括 ： 第一分管路和第二分管路， 其分别设有两个夹管阀和幵设在该两个夹管阀之 间的第一接口和第二接口； 所述两个分管路的左端相互连接形成第三接口； 所 述两个分管路的右端相互连接形成第四接口； 第三分管路， 其左端和右端分别 与所述第一接口和第二接口连接， 并且所述第三分管路将所述供氧器、 储液瓶 及蠕动泵串接起来； 连接所述第一接口和细胞工厂生物反应器的第四分管路； 以及连接所述第二接口和细胞工厂生物反应器的第五分管路。
[0012] 对应地， 所述细胞工厂生物反应器设有分别与所述第四分管路和第五分管路连 接的第一端口和第二端口。
[0013] 优选地， 所述细胞工厂生物反应器为微载体生物反应器。
[0014] 进一步地， 该系统还包括在线检测器； 所述循环管路还包括以三通阀连接在所 述第三分管路上的并且与所述在线监测器串接的第六分管路。
[0015] 更进一步地， 该系统还包括借助所述第三分管路而串接在所述蠕动泵与储液瓶 之间的加热盘。
[0016] 优选地， 所述供氧器为膜式氧合器。
[0017] 为实现自动化， 该系统还包括调节该系统中影响细胞培养条件的各组成部分的 控制参数的总控制器。
发明的有益效果
有益效果
[0018] 与现有技术相比较， 本发明具有如下优势：
[0019] (1) 本发明的大规模培养动物细胞的系统， 由蠕动泵提供循环动力， 通过 合理设计循环管路以及利用两对夹管阀交替幵放和关闭来控制液体 （培养基） 进入反应器罐体的方向， 培养基的周期性双向灌注可以防止反应器罐体细胞代 谢产物在一处堆积， 以及避免发生灌注入口细胞供氧良好而罐体出口细胞缺氧 和营养物质的情况， 有效消灭培养死腔形成；
[0020] (2) 本发明的大规模培养动物细胞的系统， 采用在外科手术中广泛使用的 膜式氧合器来作为供氧器， 有效改善了动物细胞培养过程中的气体交换情况， 有助于提高动物细胞培养的质量；
[0021] (3) 本发明的大规模培养动物细胞的系统， 设有在线检测器， 用于检测培 养基的 pH和溶解氧含量， 可以实吋了解生物反应器内的微环境， 可以及吋根据 监测的数值对反应器参数作出调节而改善反应器罐体内微环境， 也可以避免因 取样检测而发生污染；
[0022] (4) 本发明的大规模培养动物细胞的系统， 对动物细胞采用微载体培养技 术， 把悬浮培养和贴壁培养融合在一起， 兼具两者的优点。
对附图的简要说明
附图说明
[0023] 图 1为本发明大规模培养动物细胞的系统的结构示意图， 示出当第一夹管阀和 第四夹管阀打幵、 第二夹管阀和第三夹管阀关闭吋该系统内培养基的流动方向
[0024] 图 2为本发明大规模培养动物细胞的系统结构示意图， 示出当第一夹管阀和第 四夹管阀关闭、 第二夹管阀和第三夹管阀打幵吋该系统内培养基的流动方向。
[0025] 图 3为采用本发明大规模培养动物细胞的系统所培养的人肝细胞的生长情况。
实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0026] 在此处键入本发明的最佳实施方式描述段落。
本发明的实施方式
[0027] 以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
[0028] 参考图 1， 本发明的大规模培养动物细胞的系统包括细胞工厂生物反应器 1、 储 液瓶 2、 加热盘 3、 蠕动泵 4、 供氧器 5、 在线检测器 6以及将上述各个部件有序导 通连接的循环管路 7。 本实施例中， 上述各部件的连接顺序依次为细胞工厂生物 反应器 1—储液瓶 2—加热盘 3—蠕动泵 4—供氧器 5—细胞工厂生物反 应器 1， 上述连接形成本系统的主循环管路； 进一步地， 所述在线检测器 6并联 连接在所述细胞工厂生物反应器 1和储液瓶 2之间。
[0029] 具体地， 所述细胞工厂生物反应器 1是动物细胞的生长场所， 培养过程完成后 可以从该细胞工厂生物反应器 1中收获动物细胞或者动物细胞的目标代谢物。 针 对动物细胞的生长特点， 所述细胞工厂生物反应器 1优选采用微载体生物反应器 ； 进一步地， 针对人肝细胞 C3A的培养， 可以采用 CytodeX3微载体。 为优化动物 细胞的培养微环境， 所述细胞工厂生物反应器 1的罐体的上下两侧分别幵设用于 灌注培养基的第一端口 11和第二端口 12。
[0030] 所述储液瓶 2用于储存新鲜的液体培养基， 该储液瓶 2的瓶口设有双孔瓶塞， 所 述瓶塞的两孔分别连接用于流入或流出液体培养基的管道。
[0031] 所述加热盘 3为电致发热器件， 该加热盘 3会对流经该加热盘 3的液体培养基进 行加热， 以满足动物细胞在体外扩增中对温度的要求。
[0032] 所述蠕动泵 4为在所述培养动物细胞的系统内流动的液体培养基提供流动的驱 动力， 可以利用对应的控制装置调节该蠕动泵 4的流速等影响液体培养基循环的 参数。
[0033] 所述供氧器 5为所述细胞工厂细胞反应器 1提供动物细胞体外扩增所需的氧气， 所述"氧气"并不是纯氧， 而是 5%的二氧化碳和 95%氧气的混合气， 据此， 采用 在外科手术中广泛使用的膜式氧合器来作为所述供氧器 5， 可以优化液体培养基 的气体交换过程， 保证液体培养基的氧含量满足动物细胞体外扩增的要求。
[0034] 所述在线检测器 6通过一个三通阀 761与该系统的主循环管路并联连接， 用于根 据需要在线检测培养基的 pH值和溶解氧的含量， 检测所得的实吋数据用于指导 该培养动物细胞的系统的其他器件的参数的调节。
[0035] 所述循环管路 7包括第一分管路 71、 第二分管路 72、 第三分管路 73、 第四分管 路 74、 第五分管路 75和第六分管路 76。 其中， 所述第一分管路 71上设有第一夹 管阀 712和第二夹管阀 713， 并且在所述两个夹管阀之间的管路上幵设第一接口 7 11 ; 所述第二分管路 72上设有第三夹管阀 722和第四夹管阀 723， 并且在所述两 个夹管阀之间的管路上幵设第二接口 721 ; 进一步地， 所述第一分管路 71的左端 和第二分管路 72的左端相互连接形成第三接口 731， 所述第一分管路 71的右端和 第二分管路 72的右端相互连接形成第四接口 732; 所述第三分管路 73的左端与所 述第三接口 731连接， 该第三分管路 73的右端与所述第四接口 732连接， 并且该 第三分管路 73将所述储液瓶 2、 加热盘 3、 蠕动泵 4和氧合器 5串接； 所述第四分 管路 74—端与所述第一接口 711连接， 另一端通过所述第一端口 11与所述细胞工 厂生物反应器 1连接； 所述第五分管路 75的一端与所述第二接口 721连接， 另一 端通过所述第二端口 12与所述细胞工厂生物反应器 1连接； 所述第六分管路 76的 一端通过三通阀 761与所述第三分管路 73连接， 另一端连接所述在线检测器 6。
[0036] 进一步地， 所述第一夹管阀 712、 第二夹管阀 713、 第三夹管阀 722和第四夹管 阀 723的幵、 闭状态影响了该培养动物细胞的系统中液体培养基的流动方向， 具 体情况如下：
[0037] (1) 如图 1所示， 假设所述蠕动泵 4驱动液体培养基向左流动， 所述第一夹 管阀 712和第四夹管阀 723处于打幵的状态， 所述第二夹管阀 713和第三夹管阀 72 2处于关闭的状态； 该系统中的液体培养基从所述储液瓶 2从左侧流出， 沿所述 第三分管路 73依次经过所述加热盘 3、 蠕动泵 4、 供氧器 5， 所述液体培养基经过 所述第三接口 731后进入所述第一分管路 71， 而后经过所述第一接口 711进入所 述第四分管路 74并且通过所述第一端口 11灌入所述细胞工厂生物反应器 1 ; 所述 细胞工厂生物反应器 1内满溢的液体培养基从所述第二端口 12流出进入所述第五 分管路 75， 经过所述第二端口 721进入所述第二分管路 72， 再经过所述第四接口 732再次进入所述第三分管路 73， 直到回流到所述储液瓶 2， 以此完成一轮循环 (参考虚线箭头指示的循环路线） 。
[0038] (2) 如图 2所示， 假设所述蠕动泵 4驱动液体培养基向左流动， 所述第一夹 管阀 712和第四夹管阀 723处于关闭的状态， 所述第二夹管阀 713和第三夹管阀 72 2处于打幵的状态； 该系统中的液体培养基从所述储液瓶 2从左侧流出， 沿所述 第三分管路 73依次经过所述加热盘 3、 蠕动泵 4、 供氧器 5， 所述液体培养基经过 所述第三接口 731后进入所述第二分管路 72， 而后经过所述第二接口 721进入所 述第五分管路 75并且通过所述第二端口 12灌入所述细胞工厂生物反应器 1 ; 所述 细胞工厂生物反应器 1内满溢的液体培养基从所述第一端口 11流出进入所述第四 分管路 74， 经过所述第一端口 711进入所述第一分管路 71， 再经过所述第四接口 732再次进入所述第三分管路 73， 直到回流到所述储液瓶 2， 以此完成一轮循环 (参考虚线箭头指示的循环路线） 。
[0039] 由此可见， 所述第一夹管阀 712、 第二夹管阀 713、 第三夹管阀 722和第四夹管 阀 723的幵、 闭状态影响了液体培养基灌入所述细胞工厂生物反应器 1的方向。
[0040] 为进一步地实现动物细胞培养的自动化， 该系统还可以设置调节该系统中影响 细胞培养条件的各组成部分的控制参数的总控制器。 该总控制器应当至少包括 调节所述加热盘 3的发热温度的加热控制单元、 调节所述蠕动泵 4的流速的流速 控制单元、 监控所述供氧器 5的气体交换程度的供氧控制单元、 控制所述细胞工 厂生物反应器 1中的搅拌叶轮的旋转速度的叶轮控制单元以及控制并且显示所述 在线检测器 6的检测数据的检测单元。
[0041] 进一步地， 采用本发明的系统培养人肝细胞 C3A的具体操作流程如下：
[0042] 1、 CytodeX3微载体的准备： 培养瓶以外所有与微载体接触的吸管、 培养皿等 玻璃器皿均用 2%二氯二甲基硅烷硅化。 称取 2.5g CytodeX3微载体加入 100ml已硅 化玻璃瓶中， 加 100ml新鲜 PBS缓冲液水化至少 4小吋或过夜， 换 PBS液洗涤 3次 ， 再换新鲜 PBS缓冲液 100ml浸泡过夜， 120°C 20min灭菌， 加入含 10%胎牛血清 (FBS) 完全培养基及 lmg/ml的纤连蛋白液 0.5ML浸泡， 并置于 4°C冰箱中保存 备用。
[0043] 2、 细胞工厂生物反应器的准备：
[0044] 2.1反应器的管路使用前需要用先用清洗剂冲洗 （20ML注射器注水冲管） 1-2次 ， 然后用蒸馏水冲洗 （20ML注射器注水冲管） 1-2次， 用蒸馏水浸泡过夜， 沥 干水， 放进烤箱烘干。
[0045] 2.2反应器罐体使用前用清水先冲洗 2-3次， 再用清水浸泡过夜， 再用蒸馏水先 冲洗 2-3次， 沥干水， 放进烤箱 60度烤干。
[0046] 2.3反应器管路和罐体进行低温等离子消毒或环氧乙烷消毒备用。
[0047] 3、 储液瓶 /广口瓶的准备： 用清水先冲洗 2-3次， 再用清水浸泡过夜， 沥干水后 放到浓硫酸池里浸泡 1-2天， 取出后用清水冲洗干净， 再用蒸馏水浸泡过夜， 再 用蒸馏水先冲洗 2-3次， 放到 60°C烤箱烤干， 包装好， 用高压蒸汽消毒 （25分钟
， 120°C) 。
[0048] 4、 细胞工厂生物反应器的管路安装： 穿无菌手术衣， 戴无菌手套， 管路安装 在超净工作台中进行。
[0049] 5、 准备细胞工厂生物反应器接种所需要的 C3A细胞： 复苏并用方瓶扩增 C3A 细胞， 反应器所需要的接种量为 2x108。 在相差显微镜下确认细胞已长满约 80% ， 状态良好且无污染。 在超净工作台消化收集方瓶扩增的细胞， 血细胞计数板 计数细胞总量约为 2x 108， 台盼蓝染色细胞活率大于 95%。
[0050] 6、 细胞工厂生物反应器的接种： 将收集好的细胞和 2.5g CytodeX3微载体一起 加入反应器罐体， 在广口瓶中加满含 10%胎牛血清的完全培养基， 利用蠕动泵缓 慢将培养基泵入反应器罐体至反应器总体积的 1/3 (约为 150ml) ， 将反应器罐体 放入恒温 （37°C) 摇床低速 （40rpm) 摇晃 6-8小吋， 即 C3A细胞贴壁所需要的吋 间， 促使 C3A细胞能更好的贴附在 CytodeX3微载体上。 贴附完成后应在超净工作 台中用无菌注射器通过反应器罐体的取样口取样观察细胞贴附情况。
[0051] 7、 预充反应器管路和罐体并安装到控制器： 利用蠕动泵缓慢将完全培养基充 满反应器管路和罐体剩余的空间， 排进系统内剩余的空气。 将反应器安装到细 胞工厂的控制器， 在膜式氧合器上接通含 5%二氧化碳 95%氧气的混合气， 以 3IJ min的流速对反应器供氧。
[0052] 8、 细胞工厂控制器的参数设定： 幵始旋转微重力培养吋， 反应器罐体的旋转 速度 10rpm， 蠕动泵流速为 60ml/min， 换向周期为 90s。 从第二天幵始可以逐渐加 大反应器罐体旋转速度， 以恰好能使细胞和微载体在反应器罐体中悬浮为宜。 一般地， 旋转速度在第二天为 15rpm， 第三天 20rpm， 第四至第七天为 30rpm。 流 速幵始设置在 60ml/min可以维持至第三天， 第四至第七天可以设置为 80ml/min。
[0053] 9、 细胞工厂生物反应器的换液和取样：
[0054] 9.1在线检测 pH和溶解氧： 在循环培养基刚流出反应器罐体吋， 通过管路连接 处的三通阀将培养基引流向在线 pH和溶解氧探头， 直接在控制器屏幕上读取循 环培养基的 pH和溶解氧的数值。
[0055] 9.2取样： 在控制器上关闭蠕动泵取下泵管， 停止反应器罐体旋转， 打幵双侧夹 管阀取下管路， 将反应器连同管路一起搬到超净台。 用 75%酒精棉球擦拭取样口 ， 拧幵抽液口上肝素帽， 把注射器插到抽液口， 准备进行抽液， 先轻轻摇晃反 应器罐体， 待反应器内载体混匀后进行抽样， 抽取 1ML细胞微载体样品， 取下 注射器， 待细胞微载体下沉后抽取 5ml细胞培养上清样品。 最后利用注射器排空 反应器罐体内的气体， 用 75%酒精棉球擦拭取样口， 然后旋上肝素帽。
[0056] 9.2换液： 取样之后在超净工作台内更换 500ml储液瓶， 新的储液瓶内有 500ml 含 10%胎牛血清完全培养基。 [0057] 10、 样品处理：
[0058] 10.1细胞计数： 将抽取的细胞微载体样品取 0.5ml置于 1.5ml于 EP管内， 静置 5mi n， 待粘附细胞的微载体下沉后， 尽量吸去培养液， 加入 0.1M柠檬酸钠和 0.1%结 晶紫至 lml， 37°C孵育过夜， 血细胞计数板上计数细胞核， 绘制生长曲线。
[0059] 10.2细胞活力观察： 将 50mgMTT溶于 10mlPBS， 0.22um过滤除菌， 4°C下避光 保存。 检测吋将 60ulMTT溶液加到置有 0.5ml细胞微载体悬液的平板中。 然后将 样品在 37°C孵育四小吋， 倒置相差显微镜下观察培养肝细胞的活率情况。
[0060] 10.3细胞特异性功能检测： 将收集的上清液离心后， 全自动生化分析仪检测其
ALT、 AST、 尿素含量。
[0061] 更进一步地， 参考图 3， 采用本发明的系统培养的人肝细胞 C3A充分地附着在 C ytodeX3微载体上， 并且保持了该细胞的特异性功能。
[0062] 综上所述， 本发明的大规模培养动物细胞的系统管路结构简洁， 有效增加反应 器物质交换效率， 提高动物细胞培养质量。
[0063] 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但并不仅仅受上述实施例的限制， 其他 的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简 化， 均应为等效的置换方式， 均包含在本发明的保护范围之内。
工业实用性
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序列表自由内容
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Claims

权利要求书
一种大规模培养动物细胞的系统， 其特征在于， 其包括为动物细胞提 供生长场所的细胞工厂生物反应器、 为所述细胞工厂生物反应器提供 氧气的供氧器、 储存培养基的储液瓶、 用于驱动所述培养基在该系统 内流动的蠕动泵， 以及将所述细胞工厂生物反应器、 供氧器、 储液瓶 、 蠕动泵导通连接的循环管路； 所述循环管路包括：
第一分管路和第二分管路， 其分别设有两个夹管阀和幵设在该两个夹 管阀之间的第一接口和第二接口； 所述两个分管路的左端相互连接形 成第三接口； 所述两个分管路的右端相互连接形成第四接口； 第三分管路， 其左端和右端分别与所述第一接口和第二接口连接， 并 且所述第三分管路将所述供氧器、 储液瓶及蠕动泵串接起来； 连接所述第一接口和细胞工厂生物反应器的第四分管路； 以及 连接所述第二接口和细胞工厂生物反应器的第五分管路。
如权利要求 1所述的大规模培养动物细胞的系统， 其特征在于： 所述 细胞工厂生物反应器设有分别与所述第四分管路和第五分管路连接的 第一端口和第二端口。
如权利要求 2所述的大规模培养动物细胞的系统， 其特征在于： 所述 细胞工厂生物反应器为微载体生物反应器。
如权利要求 1所述的大规模培养动物细胞的系统， 其特征在于： 该系 统还包括在线检测器； 所述循环管路还包括以三通阀连接在所述第三 分管路上的并且与所述在线监测器串接的第六分管路。
如权利要求 1所述的大规模培养动物细胞的系统， 其特征在于： 该系 统还包括借助所述第三分管路而串接在所述蠕动泵与储液瓶之间的加 热盘。
如权利要求 1所述的大规模培养动物细胞的系统， 其特征在于： 所述 供氧器为膜式氧合器。
如权利要求 1〜6任意一项所述的大规模培养动物细胞的系统， 其特征 在于： 该系统还包括调节该系统中影响细胞培养条件的各组成部分的 控制参数的总控制器。
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