CN102197802A - 一种胰岛冻存保护剂及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种胰岛冻存保护剂及其使用方法。所述胰岛冻存保护剂包括A液、B液、C液和D液，其中A液为基础冻存培养基，组成为M-199培养基50%～70%,AB血清30%～50%，1MHepes1～3%，乌司他丁100～200IU/ml；B液为2MDMSO冻存培养基，含DMSO14.2%，基础冻存培养基85.8%；C液为3MDMSO冻存培养基，含DMSO21.3%，基础冻存培养基78.7%；D液为异丙醇；上述百分比均表示体积百分比。通过用高浓度血清的基础培养基重悬胰岛，然后逐步递增式的加入不同浓度的DMSO冻存液，使DMSO渗透到胰岛细胞团内。并用异丙醇做冻存介质，起到缓慢降温的作用。本发明提供的胰岛冻存保护剂用于有效地保存分离获得的胰岛细胞，避免其受冷冻损伤，以供临床应用。

Description

一种胰岛冻存保护剂及其使用方法

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种胰岛冻存保护剂及其使用方法。

背景技术

糖尿病严重影响人们的身体健康，糖尿病分为I型和II型两种。I型糖尿病是胰岛素依赖型，大约10％的糖尿病患者为I型糖尿病。约30％的II型糖尿病患者至中、晚期（病程20年以上）也会发展成为胰岛素依赖型。注射胰岛素是目前控制糖尿病患者血糖的有效手段，但外源性胰岛素不能达到生理性调节血糖的目的，因此不能制止糖尿病并发症如肾病、神经系统疾病、视网膜病变以及心血管病等的发生和发展，从而大大降低患者生活质量，最终导致死亡。

有研究发现胰岛细胞移植的患者比注射胰岛素的患者糖尿病和视网膜病变的发生率下降，出现时间延迟，尤其是在移植后的前6年差别更为显著。这说明胰岛细胞移植可以使糖尿病慢性并发症延缓6年以上。这对于提高糖尿病患者的生活质量非常重要。因此，胰岛细胞移植治疗糖尿病如同肾移植治疗终末期肾功能衰竭一样，将成为糖尿病的最有效治疗手段。2000年Edmonton治疗方案的成功，推动了世界成人胰岛细胞移植治疗1型糖尿病的迅速发展。在胰岛细胞移植的实施过程中,最关键的就是获得足够量的胰岛细胞。然而胰岛细胞分离纯化是一个复杂的、技术性强的过程，往往需要2个以上供体胰腺才够满足一个病人的使用。要同时满足2个以上血型相符的供体才能进行该移植，使得胰岛细胞的保存显得尤为重要，甚至影响到胰岛细胞移植技术的实际应用及推广。

常规的细胞冻存保存剂为DMSO10%+FBS10-20%+细胞培养液（主要有DMEM,PRIM1640等），它主要是适用于单细胞悬液的冻存保护剂。但胰岛细胞不同于普通的细胞，它是由β、α、γ、θ等细胞组成的细胞团，共同发挥调节血糖水平的作用。用常规单细胞悬液的冻存保护剂及其冻存方法并不能有效的保护胰岛细胞团。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种用于有效地保存分离获得的胰岛细胞，避免其受冷冻损伤，以供临床应用的胰岛冻存保护剂及其使用方法。

本发明的胰岛冻存保护剂，包括A液、B液、C液和D液，组成如下：

A液为基础冻存培养基，组成为M-199培养基50%～70%, AB血清30%～50%，1M Hepes 1～3%，乌司他丁100～200IU/ml；B液为2M DMSO冻存培养基，含DMSO14.2%，基础冻存培养基85.8%；C液为3M DMSO冻存培养基，含DMSO 21.3%，基础冻存培养基78.7%；D液为异丙醇；上述百分比均表示体积百分比。

所述的胰岛冻存保护剂的使用方法，具体步骤如下：

1)        胰岛细胞的准备：按常规方法分离胰岛细胞；

2)        将胰岛细胞装入离心管中，在280×g的离心力下离心1分钟；

3)        吸弃上清液；

4)        在离心管内加入10~20ml的A液，在280×g的离心力下离心1分钟，吸弃上清，再加入A液10~15ml重悬细胞，转移入细胞冻存袋；

5)        在细胞冻存袋中加入B液5~10ml；

6)        室温下预孵育细胞3~5分钟；

7)        再次加入5~10ml B液；

8)        室温下孵育5~10分钟；

9)        加入20~30ml C液，室温下孵育5~10分钟；

10)    将细胞冻存袋置于D液中，放入4℃冰箱5~15分钟；

11)    将细胞冻存袋移出4℃冰箱，连同D液一起放入-80℃超低温冰箱中12～16小时；

12)    取出细胞冻存袋，将细胞冻存袋置入液氮中长期保存。

本发明的显著优点：

1）在冻存保护剂中添加高浓度AB血清，替代胎牛血清，可用于临床治疗应用，同时可以抑制消化胰岛时残留的消化酶作用。

2）加入的乌司他丁是一种蛋白酶抑制剂，可以抑制残留的胰蛋白酶对胰岛的降解作用。

3）加入的Hepes是一种缓冲体系，可以提供一个稳定的pH缓冲环境。

4）本发明冻存保护剂的使用方法主要是通过用高浓度血清的基础培养基重悬胰岛，然后逐步递增式的加入不同浓度的DMSO冻存液，使DMSO渗透到胰岛细胞团内。并用异丙醇做冻存介质，起到缓慢降温的作用。

附图说明

图1为使用本发明的胰岛冻存保护剂冻存的胰岛复苏AO/PI活性染色，荧光显微镜下：活性胰岛发绿色荧光(白色箭头所示),红色为凋亡胰岛（黑色箭头所示）。

图2为使用传统单细胞冻存保护剂冻存的胰岛复苏AO/PI活性染色，荧光显微镜下：活性胰岛发绿色荧光(白色箭头所示),红色为凋亡胰岛（黑色箭头所示）。

图3为高糖刺激胰岛细胞释放胰岛素试验图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

试剂来源：

M-199培养基为商品化产品购自HYCLONE； AB血清来自血库健康人血清；1M Hepes为商品化产品，购自美国Mediatech Cellgro公司；乌司他丁为临床所用药品注射用乌司他丁；DMSO为临床使用级商品，购自美国Sigma；异丙醇为分析纯级化学商品，购自上海化学试剂厂。

试剂配制：

本发明的胰岛冻存保护剂，包括A液、B液、C液和D液，组成如下：

A液：基础冻存培养基（500ml）：

最终浓度          体积

M-199培养基                       -             337.5ml

AB血清                          30%             150ml

Hepes （1M）                    25mM           12.5ml

乌司他丁                       200IU/ml          10万IU

B液：2M DMSO 培养基（100ml）：

最终浓度           体积

DMSO                           2M              14.2ml

A液                             -                85.8ml

C液：3M DMSO 培养基（100ml）：

最终浓度          体积

DMSO                        3M             21.3ml

A液                           -              78.7ml

D液：异丙醇（分析纯）200ml

使用方法：

本发明的胰岛冻存保护剂的使用方法，具体操作步骤如下：

1)        胰岛细胞的准备：按常规方法分离胰岛细胞。

2)        将胰岛细胞装入离心管中，在280×g的离心力下离心1分钟。

3)        吸弃上清液。

4)        在离心管内加入10ml的上述冻存A液，洗涤1次，在280×g的离心力下离心1分钟，吸弃上清。再加入上述冻存A液12.5ml重悬细胞。转移入细胞冻存袋。

5)        加入冻存B液6.25ml。

6)        室温下预孵育细胞5分钟。

7)        再次加入6.25ml冻存B液。

8)        室温下孵育10分钟。

9)        加入25ml冻存C液，室温下孵育10分钟。

10)    将细胞冻存袋放入D液中，放入4℃冰箱10分钟。

11)    放入-80℃超低温冰箱中过夜。

12)    将细胞冻存袋置入液氮中长期保存。

传统细胞冻存操作步骤：

1.        将胰岛细胞装入离心管中，在280×g的离心力下离心1分钟。

2.        吸弃上清液。

3.        加入70%RPMI1640+20%FBS+10%DMSO配成的冻存保护剂。转移入细胞冻存袋。

4.        放入-20℃ 30分钟。

5.        放入-80℃超低温冰箱过夜。

6.        将细胞转移入液氮中长期保存。

冻存胰岛复苏：

迅速将液氮中的细胞冻存袋置入38℃水浴中，迅速复温。280×g的离心力下离心1分钟，吸弃上清，加A液，洗涤一次，280×g的离心力下离心1分钟去上清，加新鲜培养基（RPMI1066, 10% 人白蛋白）重悬细胞，备用。

胰岛细胞活性的鉴定：

取复苏的胰岛细胞悬液,采用吖啶橙（acridin orange, AO）与碘丙啶(propidium iodide,PI)荧光染色，荧光显微镜下计数红绿染色的细胞数，活的胰岛呈绿色荧光，凋亡的胰岛呈红色荧光，计算细胞的活性。经AO-PI染色在荧光显微镜下用490 nm激发光滤光片，510 nm光栅滤光片观察,如图1所示，可见使用本发明的冻存保护剂和冻存方法的复苏胰岛呈现较多绿色荧光，而用传统冻存细胞的方法冻存的胰岛，复苏的结果大部分的胰岛呈红色荧光(图2)。显示经过本发明的冻存保护剂冻存复苏的胰岛细胞可以保持70%的活率。

胰岛细胞功能鉴定：

   采用高糖刺激胰岛细胞释放胰岛素试验，取复苏的胰岛细胞悬液在1640无糖培养基中于37℃、CO2浓度5﹪环境下孵育24  h，分别加入含有2.8mmol/L葡萄糖的培养基和含有20 mmol/L 葡萄糖的培养基2 ml进行培养各2 h，收集上清液,检测胰岛素含量。胰岛素释放实验结果显示传统的冻存保护剂冻存的胰岛细胞在低糖刺激释放胰岛素平均为（99.6±10.9）IU/L，在20 mmol/L高糖刺激下释放胰岛素平均为（123.1±14.1）IU/L。而使用本发明的胰岛细胞冻存保护剂及冻存方法冻存的胰岛细胞在低糖低糖刺激释放胰岛素平均为（98.9±15.6）IU/L，在20 mmol/L高糖刺激下释放胰岛素平均为（292.9±35.6）IU/L。如图3所示，使用本发明的冻存保护剂冻存复苏的胰岛细胞还具有良好的胰岛素分泌功能。

Claims (2)

1.一种胰岛冻存保护剂，其特征在于：所述胰岛冻存保护剂包括A液、B液、C液和D液，组成如下：

A液为基础冻存培养基，组成为M-199培养基50%～70%, AB血清30%～50%，1M Hepes 1～3%，乌司他丁100～200IU/ml；B液为2M DMSO冻存培养基，含DMSO14.2%，基础冻存培养基85.8%；C液为3M DMSO冻存培养基，含DMSO 21.3%，基础冻存培养基78.7%；D液为异丙醇；上述百分比均表示体积百分比。

2.一种如权利要求1所述的胰岛冻存保护剂的使用方法，其特征在于：所述使用方法的具体步骤如下：

1)      胰岛细胞的准备：按常规方法分离胰岛细胞；

2)      将胰岛细胞装入离心管中，在280×g的离心力下离心1分钟；

3)      吸弃上清液；

4)      在离心管内加入10～20ml的A液，在280×g的离心力下离心1分钟，吸弃上清，再加入A液10～15ml重悬细胞，转移入细胞冻存袋；

5)      在细胞冻存袋中加入B液5～10ml； 

6)      室温下预孵育细胞3～5分钟；

7)      再次加入5～10ml B液；

8)      室温下孵育5～10分钟；

9)      加入20～30ml C液，室温下孵育5～10分钟；

10)  将细胞冻存袋置于D液中，放入4℃冰箱5～15分钟；

11)  将细胞冻存袋移出4℃冰箱，连同D液一起放入-80℃超低温冰箱中12～16小时；

12)  取出细胞冻存袋，将细胞冻存袋置入液氮中长期保存。

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