CN101070534A - 一种冷冻保存神经干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

一种冷冻保存神经干细胞的方法，属于细胞生物技术领域。其特征是直接将细胞包埋固定于一定浓度的胶原培养基中，冻存管中成胶；通过实验确定冷冻保护剂DMSO在胶原－细胞复合物中的最佳导入时间；将15％2×DMSO导入胶原－细胞复合物中，室温平衡15分钟；将冻存管转入控速降温冻存盒中，并将冻存盒放置于－85℃冰箱，确保降温速率为－1℃/min，4小时后转入－196℃液氮保存。本发明的效果和益处是该方法减轻了DMSO渗透过程中对细胞膜两侧造成压差损伤。复苏后细胞－胶原复合物保持良好的完整性，细胞形态和活性好，可直接用于体内移植。

Description

一种冷冻保存神经干细胞的方法

技术领域

本发明属于生物技术与组织工程领域，涉及一种冷冻保存细胞的方法。

背景技术

组织工程技术是将体外培养扩增的正常组织细胞接种于一种具有优良细胞相容性，并可被机体降解吸收的生物材料中形成复合物，然后将细胞与生物材料复合物植入人体组织、器官的病损部位，在逐渐被机体降解吸收的同时，细胞不断增殖、分化，形成新的、且形态和功能与相应组织、器官一致的组织，从而达到修复创伤和重建功能的目的。

胶原蛋白因其具有无抗原性、生物相容性好的特点，不仅可以促进细胞生长代谢，参与组织愈合、诱导组织再生，而且，植入体内后能在体液、酶、细胞等的作用下发生降解，变成小分子物质被肌体吸收或通过新陈代谢排出体外。因此成为组织再生工程的首选的生物材料。

随着以胶原为主要支架材料的组织工程产品，在临床上逐渐得以应用，长期冷冻保存是一个需要解决的问题。Dixit等人将肝细胞包埋于含有胶原的三明治结构的微胶囊中进行冷冻保存，解冻后的细胞保持较高活率，并且保持正常的分泌功能。Wu等人用甲基化胶原和半乳糖胶原替代了天然胶原制备三明治结构的微胶囊包裹肝细胞进行玻璃化冷冻，进一步证明胶原这种细胞-生物材料复合物在冷冻的过程中对细胞的形态和功能均有一定的保护作用。

低温保存技术主要分为两种形式：一种是慢速冷冻法；另一种是快速冷却非晶态固化，即玻璃化法。在组织细胞低温保存的过程中，细胞外结构损伤是低温下细胞、组织和器官长期保存的主要障碍。如果要保持其结构和功能的完整性，就应该避免降温和复温过程中冰晶的形成，以及冷冻保护剂导入和导出过程中由于细胞膜两侧渗透压不平衡所造成的“渗透休克”。其中避免和减轻“渗透休克”的方法是冷冻保护剂的浓度变化应渐升或渐降，以避免较大的浓度梯度出现。I型胶原由300nm，三股螺旋原纤维组成，凝固成胶后形成非取向的网络，其空隙的大小由胶原的浓度决定。因此，当冷冻保护剂加入细胞-胶原复合物时，其具有复杂的孔道结构，大大降低了冷冻保护剂的渗透速率，起到了一种“缓渗”作用，从而减轻细胞膜两侧渗透压差骤变带来的伤害。另外，胶原的基本化学特征是含有羟赖氨酸糖类，羟基与水分子中的氢作用，干扰了水分子冷冻结晶的排布规则，因此，可能减少冰晶形成对细胞的机械损伤，也起到保护细胞的作用。

神经干细胞(neural stem cells)是一类多能干细胞，能够长期自我更新(复制)，同时具有分化形成神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞的多潜能特性。它们是中枢神经系统内长期提供新细胞(神经元和胶质细胞)的源泉。目前已在多种动物模型及人体中尝试过将神经干细胞移植到纹状体等脑神经病变区及受损伤的脊髓中，并获得一定疗效，但要广泛地应用于临床治疗领域，其来源和数量仍远远不能满足需求。而且还存在移植细胞源于待移植患者在时间和空间上的匹配问题。因此神经干细胞的体外大规模扩增，以及将扩增后的细胞进行冷冻保存，建立资源丰富的“神经干细胞库”，就成为一个重要的研究课题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新的冷冻保存神经干细胞的方法。

本发明的技术方案如下：

1)确定冷冻保护剂DMSO在室温15℃下，加入到胶原-神经球复合物中的平

衡时间为15min；

2)制备15％2×DMSO的冷冻培养液；

3)离心收集“神经球”(神经干细胞聚球增殖生长)，计每10ul体积的神经球数。准备冷冻保存的“神经球”的直径不要超过100μm，否则影响冷冻效果；

4)制备胶原-神经球的混合液，胶原的终浓度为1.75mg/ml，神经球的密度为1×104个/ml；

5)将胶原-神经球混合液转移到2ml的冻存管中，每管250μl，在37℃，2小时胶原凝固成胶；

6)将制备好的冷冻培养液加入到胶原-神经球凝胶中，每管250μl，室温平衡20分钟。

7)将冻存管转入控速降温冻存盒(Nalgene，Rochester，NY)中，并将冻存盒放置于-85℃冰箱，4小时后，将冻存管转入-196℃液氮中长期保存。

8)37℃水浴，快速复温，吸出弃掉胶原-细胞复合物上层的冷冻保护液。加入新鲜培养基500μl，室温平衡5分钟，吸收弃掉；重复该步骤3次；

9)将胶原-细胞复合物从冻存管中转移到培养板中继续培养，准备进一步的生物学特性的检测。

本发明的效果和益处是直接将细胞包埋固定于一定浓度的胶原培养基中成胶，省去了制备微胶囊的复杂过程；利用胶原“屏障”的缓渗作用以及富含羟基的特性，以减轻冷冻保护剂DMSO导入过程中由于细胞膜两侧渗透压不平衡所造成的“渗透休克”，同时减少冰晶的形成对细胞造成的损伤。在冷冻保护剂DMSO洗脱的过程中，可省去离心的步骤，从而避免了离心力对解冻后脆弱的细胞造成的机械伤害。复苏后细胞-胶原复合物保持良好的完整性，细胞形态和活性好，可直接用于体内移植。

具体实施方式

以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例。

实施例1：神经干细胞在胶原中的固定

I型鼠尾胶原购自Upstate公司，该胶原溶于0.2％(v∶v)无菌乙酸溶液中，浓度为100mg/28.1ml，pH 3-4。首先，用0.5 N NaOH将胶原的pH调整为7.4；然后，离心收集的神经球(用于冷冻保存的“神经球”直径不宜超过100μm)，显微镜计神经球数，并用2X的细胞培养液(DMEM∶F12∶1640/1∶1∶1；N2；bFGF；EGF)重新悬浮。取神经球悬液与胶原等体积混合，使胶原-神经球混合液的密度为1×10⁴个/ml。含有胶原的所有溶液均置于冰浴中，以防止胶原的凝固。将胶原-神经球的混合液转移到2ml的冻存管中，每管250μl(凝胶厚度约为3mm)，37℃，2小时胶原凝固成胶。

实施例2：绘制冷冻保护剂DMSO导入过程中浓度变化的标准曲线

DMSO的浓度可根据测定其渗透压值获得。首先，配制冷冻保护剂溶液：冷冻保护剂为DMSO，溶剂为神经干细胞培养液(DMEM∶F12∶1640/1∶1∶1；N2；bFGF；EGF)，DMSO浓度从0％到20％(v/v)，间隔为2.5％(v/v)，用渗透压仪测量所配制的所有冷冻保护剂溶液的渗透压，每个数据点重复测量3次，计算平均值以及方差，求得回归方程，绘制出标准曲线。

实施例3：冷冻保护剂DMSO在神经球-胶原凝胶中的渗透平衡时间测定

在冻存管中加入250μl神经球-胶原混合液(凝胶厚度为约3mm)，神经球的密度为1×10⁴个/ml；待37℃，2小时胶原凝固成胶后，将250μl的15％DMSO溶液一次性快速加入其中，同时开始计时。分别在0min，3min，5min，10min，15min，20min，40min，60min取样10μl，室温(15℃)下，用渗透压仪测量其渗透压。再根据测量结果绘制渗透压的变化曲线。当渗透压变化极小，几乎不再变化时，视为渗透平衡，渗透平衡开始点的时间点为渗透平衡时间。实验设立对照组，对照组为神经球的密度为1×10⁴个/ml的悬液(无胶原)，方案同实验组。实验结果显示15％DMSO在1.75mg/ml的神经球-胶原凝胶中需45min达到渗透平衡，平衡时胶原上层DMSO的浓度为6.2％；而对照组15％DMSO的渗透平衡时间为12min，平衡时DMSO的浓度为7.0％。

本实施例证明胶原体系对冷冻保护剂DMSO有明显的缓渗作用。

实施例4：冷冻过程中冷冻保护剂DMSO最佳导入时间的确定

首先，测定15％DMSO的凝固点。取15％的DMSO溶液50μl，放置于低温冷台的坩埚中，以-1℃/min的降温速率降温，并观察其变化，有明显冰晶产生时的温度即为凝固点。实验测得的15％DMSO凝固点为-15℃。即由室温(15℃)到DMSO凝固点(-15℃)，按程序进行降温(-1℃/min)。需要30min。根据实施例3测得的15％DMSO渗透平衡时间45min。本实验确定神经球-胶原复合物在室温(15℃)下平衡15min后，转入冻存盒(Nalgene，Rochester，NY)中，进入程序化降温过程。

实施例5：胶原-神经球的冷冻

取制备好的2X DMSO(20％)的冷冻培养液250μl，加入到等体积的胶原-神经球凝胶中，使DMSO的终浓度为10％。室温平衡15分钟后，将冻存管转入预先装满异丙醇的控速降温冻存盒中，并将冻存盒放置于-85℃冰箱，使整个冷冻过程以-1℃/分钟降温，4小时后，将冻存管转入液氮中保存。

实施例6：复苏后的神经球活性的鉴定

两周后，37℃水浴，快速复温解冻，将凝胶上层的冷冻培养液吸出弃掉，加入新鲜的细胞培养液，室温平衡5分钟，吸出弃掉；重复上一步骤3次，以达到稀释并置换出培养体系中的DMSO的目的，从而减少DMSO对细胞的毒性伤害。保证在无菌操作条件下，将冻存管中的胶原-神经球凝胶转移到24孔板中，每孔加入500μl的新鲜培养基。37℃，5％CO2，培养24h后，取部分胶原-神经球样品进行Calcium-AM/EthD-1双染，在镜下取不同的10个视野，通过IPP6.5软件分析，计算细胞活率，结果显示，采用本项技术冷冻保存的神经干细胞球，解冻后活率可达到87％，说明冷冻效果良好。同时，对解冻7天后的神经干细胞进行免疫荧光染色，其干细胞的标记蛋白nestin的阳性表达率为40％；经诱导分化，神经干细胞具有分化为神经元(β-IIItubulin阳性)、星型胶质细胞(GFAP)和少突胶质细胞(RIP)的能力。证明，采用此种方法冷冻保藏的神经干细胞能够保持其原有生物学特性。

Claims (1)

1.一种冷冻保存神经干细胞的方法，其特征在于如下步聚：

1)确定冷冻保护剂DMSO在室温15℃下，加入到胶原-神经球复合物中的平衡时间为15min；

2)制备15％2×DMSO的冷冻培养液；

3)离心收集“神经球”，计每10ul体积的神经球数；

4)制备胶原-神经球的混合液，胶原的终浓度为1.75mg/ml，神经球的密度为1×10⁴个/ml；

5)将胶原-神经球的混合液转移到2ml的冻存管中，每管250μl，在37℃，2小时胶原凝固成胶；

6)将制备好的冷冻培养液加入到胶原-神经球凝胶中，每管250μl，室温平衡15分钟；

7)将冻存管转入控速降温冻存盒中，并将冻存盒放置于-85℃冰箱，确保降温速率为-1℃/min，4小时后转入-196℃液氮保存；

8)37℃水浴，快速复温，吸出弃掉胶原-细胞复合物上层的冷冻保护液；加入新鲜培养基500μl，室温平衡5分钟后，吸出弃掉；该步骤重复3次；

9)将胶原-细胞复合物从冻存管中转移到培养板中继续培养，准备进一步的生物学特性的检测。