CN107027743B

CN107027743B - 细胞冻存液及细胞冻存方法

Info

Publication number: CN107027743B
Application number: CN201710448188.XA
Authority: CN
Inventors: 王旭; 林洁璇; 李陶; 林词雄; 朱刚
Original assignee: Woxin Biotechnology Shenzhen Co ltd
Current assignee: WoXin Biotechnology (Shenzhen) Co., Ltd
Priority date: 2017-06-14
Filing date: 2017-06-14
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2037-06-14
Also published as: CN107027743A

Abstract

本发明属于细胞冻存领域，尤其涉及细胞冻存液及细胞冻存方法。本发明提供了一种细胞冻存液，包括基础培养基、血小板裂解物、bFGF和L‑谷氨酰胺，该细胞冻存液不含动物血清和不含DMSO，消除动物血清可能引入外源性病毒的可能性和消除DMSO对脂肪干细胞的不良影响；而且，本发明还提供了细胞冻存方法，该方法无需复杂的程序性降温，操作简单。采用本发明公开的细胞培养基和本发明公开的冻存法冻存脂肪干细胞一年后，细胞存活率能达到93％，且不影响脂肪干细胞分化能力。

Description

细胞冻存液及细胞冻存方法

技术领域

本发明属于细胞冻存领域，尤其涉及细胞冻存液及细胞冻存方法。

背景技术

脂肪干细胞即脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，是近年来从脂肪组织中分离得到的一种尚不成熟的具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官的潜在功能。

脂肪干细胞在无菌条件下从人体自身组织中取出，经分离、纯化后在模拟的体内生理条件下，通过核心的优化技术将其在体外进行培养，使未完全分化的细胞不断地分化生长,大量增殖，并使细胞保持良好的生长状态，以及旺盛的增殖活力，然后注射回自身，从而提高人体整个器官功能，改善机能老化状态，满足各种治疗需要。因此，脂肪干细胞目前已广泛地应用于衰老医学和再生组织工程。

但是，脂肪干细胞分离培养的周期比较长，多次传代后容易分化或失去多向分化的潜能。而科研研究以及临床应用中对脂肪干细胞的需求非常强烈，需要随时提供大批量的脂肪干细胞，因此，有必要将生产好的脂肪干细胞进行冷冻保存，待到有使用需求时再复苏使用。然而，目前常见的脂肪干细胞冻存液往往含有动物血清和DMSO。动物血清容易给细胞引入外源性病毒，给脂肪干细胞的临床应用带来潜在风险。DMSO对脂肪干细胞具有毒性，容易对细胞造成损伤。而且传统的细胞冻存过程需要程序降温，操作繁琐。

因此，寻找一种无毒、冻存效果好的细胞冻存液和操作简单的冻存方法是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了细胞冻存液及细胞冻存方法能有效解决现有技术的冻存液冻存效果差和现有冻存方法操作繁琐的技术缺陷。

本发明提供了一种细胞冻存液，包括基础培养基、血小板裂解物、bFGF和L-谷氨酰胺。

作为优选，所述血小板裂解物在所述细胞冻存液的体积百分比为5％。

作为优选，所述bFGF在所述细胞冻存液的浓度为50ng/ml。

作为优选，所述L-谷氨酰胺在所述细胞冻存液的浓度为4mmol/L。

其中，所述细胞冻存液包括基础培养基、血小板裂解物、bFGF和L-谷氨酰胺；所述血小板裂解物在所述细胞冻存液的体积百分比为5％；所述bFGF在所述细胞冻存液的浓度为50ng/ml；所述L-谷氨酰胺在所述细胞冻存液的浓度为4mmol/L。

作为优选，所述细胞冻存液还包括羟乙基淀粉、海藻糖、羧甲基纤维素钠和甘油中的至少一种。

作为优选，所述羟乙基淀粉在所述细胞冻存液体积百分比为0％～5％；所述海藻糖在所述细胞冻存液体积百分比为0％～5％；所述羧甲基纤维素钠在所述细胞冻存液体积百分比为0％～0.1％；所述甘油在所述细胞冻存液体积百分比为0％～20％。

次优选的，所述细胞冻存液所述细胞冻存液包括基础培养基、血小板裂解物、bFGF、L-谷氨酰胺、羟乙基淀粉、海藻糖、羧甲基纤维素钠和甘油；所述血小板裂解物在所述细胞冻存液的体积百分比为5％；所述bFGF在所述细胞冻存液的浓度为50ng/ml；所述L-谷氨酰胺在所述细胞冻存液的浓度为4mmol/L；所述羟乙基淀粉在所述细胞冻存液体积百分比为1％～5％，所述海藻糖在所述细胞冻存液体积百分比为1％～5％，所述羧甲基纤维素钠在所述细胞冻存液体积百分比为0.05％～0.1％，所述甘油在所述细胞冻存液体积百分比为5％～20％。

更为优选，所述细胞冻存液所述细胞冻存液包括基础培养基、血小板裂解物、bFGF、L-谷氨酰胺、羟乙基淀粉、海藻糖、羧甲基纤维素钠和甘油；所述血小板裂解物在所述细胞冻存液的体积百分比为5％；所述bFGF在所述细胞冻存液的浓度为50ng/ml；所述L-谷氨酰胺在所述细胞冻存液的浓度为4mmol/L；所述羟乙基淀粉在所述细胞冻存液体积百分比为5％，所述海藻糖在所述细胞冻存液体积百分比为5％，所述羧甲基纤维素钠在所述细胞冻存液体积百分比为0.1％，所述甘油在所述细胞冻存液体积百分比为20％。

作为优选，所述基础培养基为DMEM/F12。

本发明还公开了一种细胞冻存方法，包括：

1)配置细胞冻存液；

2)将干细胞与步骤1)的冻存液按照5×10⁶个/ml～1×10⁷个/ml的密度混合，得到混合物；

3)将步骤2)的混合物直接置于-80℃冻存8-24h后转存于液氮保存；

或，将步骤2)的混合物置于4℃冻存40min，然后放入-20℃冻存2h，再放入-80℃冻存3h，最后转入液氮中保存。

其中，所述步骤1)的细胞冻存液为上述制备得到的细胞冻存液。

本发明所公开的细胞冻存液和细胞冻存方法在冻存脂肪干细胞中的应用。

其中，所述血小板裂解物可以降低溶液中电解质的浓度，减少阳离子进入细胞的数量；所述羟乙基淀粉和所述海藻糖优先与溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤；所述甘油，能在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，使细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；所述羧甲基纤维素钠，能分散和乳化细胞悬液，减小细胞在冻存中聚集成团。

本发明的目的针对现有冻存液往往含有动物血清和DMSO，其中，动物血清容易给细胞引入外源性病毒，给脂肪干细胞的临床应用带来潜在风险；DMSO对脂肪干细胞具有毒性，容易对细胞造成损伤；此外，传统的细胞冻存方法过程需要程序降温，操作繁琐中。本发明提供的细胞冻存液，包括：基础培养基、血小板裂解物、bFGF、L-谷氨酰胺、羟乙基淀粉、海藻糖、羧甲基纤维素钠和甘油，该细胞冻存液不含动物血清和不含DMSO，消除动物血清可能引入外源性病毒的可能性和消除DMSO对脂肪干细胞的不良影响；本发明公开的细胞冻存液与细胞混合后能采用-80℃冻存后转存液氮，无需复杂的程序性降温，操作简单。采用本发明公开的细胞冻存液和冻存法冻存脂肪干细胞一年后，细胞存活率能达到93％，且不影响脂肪干细胞分化能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是采用实施例3冻存复苏的P6代细胞的成脂分化图。

具体实施方式

本发明提供了细胞冻存液及其细胞冻存方法，用于解决现有技术的冻存液冻存效果差和现有冻存方法操作繁琐的技术缺陷。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

其中，以下实施例所用的试剂均为市售。

实施例1

以DMEM/F12为基础溶液，加入血小板裂解物、bFGF、L-谷氨酰胺、羟乙基淀粉、海藻糖、羧甲基纤维素钠、甘油、DMSO和FBS，使血小板裂解物、bFGF、L-谷氨酰胺、羟乙基淀粉、海藻糖、羧甲基纤维素钠、甘油、DMSO和FBS在细胞冻存液的终浓度/体积百分比分别对应为5％(V/V)、50ng/ml、4mmol/L、0％～5％(V/V)、0％～5％(V/V)、0％～0.1％(V/V)、0％～20％(V/V)、5％(V/V)和10％(V/V)。其中，在细胞冻存液添加的具体体积百分比/浓度如表1所示。

表1试验组1～11与对比例1～2的细胞冻存液的配方

实施例2

脂肪干细胞冻存、复苏，步骤如下：

细胞冻存：取培养至P6代的脂肪干细胞，消化、离心收集后，用实施例1配置的试验组1～11和对比例1～2的冻存液分别重悬细胞，脂肪干细胞在冻存液中的密度为1×10⁷个/ml。

冻存方法一：先将细胞在4℃冻存40min，然后放入-20℃冻存2h，再放入-80℃冻存3h。最后转入液氮中保存。分别冻存1周、1个月、6个月和1年。

冻存方法二：直接将细胞放入-80℃冻存12小时后转存于液氮中保存。分别冻存1周、1个月、6个月和1年。

复苏：从液氮罐中取出冻存管，快速置于38℃水浴锅中，轻轻震荡冻存管，直至细胞悬液完全融化。

实施例3

将实施例2采用两种方法冻存的脂肪干细胞进行复苏后检测细胞存活率，步骤如下：

活率检测：细胞复苏后，用DMEM/F12培养基稀释，于1200rpm/min，离心3min，弃上清后，用DMEM/F12培养基重悬细胞，计算脂肪干细胞进行复苏后的细胞存活率，结果见表2和表3。

其中，冻存方法一为先将复苏的细胞在4℃冻存40min，然后放入-20℃冻存2h，再放入-80℃冻存3h。最后转入液氮中保存。分别冻存1周、1个月、6个月和1年；冻存方法二为直接将细胞放入-80℃冻存12小时后转存于液氮中保存。分别冻存1周、1个月、6个月和1年。

表2冻存方法一冻存的细胞复苏后细胞存活率统计表

表3冻存方法二冻存的细胞复苏后细胞存活率统计表

如表2和表3所示，采用本发明提供的冻存液，程序性降温(冻存方法一)，试验组1～11之间冻存的细胞在液氮中保存一年后，细胞存活率均大于94％，而对比例1～2冻存一年后细胞存活只达到90％，直接将细胞放入-80℃冻存12h后转存于液氮中保存(冻存方法二)中试验组1～7冻存一年后细胞存活率均大于93％，试验组8～11冻存一年后细胞存活率均有所下降，这是因为试验组8～11冻存液缺少羟乙基淀粉，海藻糖、羧甲基纤维素钠或甘油中的某一成分，实验说明这些成分对于采用冻存方法二时起到重要的保护作用，复苏后存活率才大大提高；而比较例1～2为直接将细胞放入-80℃冻存12h后转存于液氮中保存时，复苏后大部分死亡，冻存一年后细胞存活率只有6％。

实施例4

成脂诱导分化能力检测，步骤如下：

采用

Adipogenesis Differentiation Kit(GIBCO)试剂盒对所获取的脂肪干细胞进行成脂诱导分化实验。

取采用试验组3的冻存液放入-80℃冻存12h后转存于液氮中保存的P6脂肪干细胞，以2×10⁴个/孔接种于12孔板，37℃，5％CO₂培养箱中培养。24h后细胞融合度达到约80％时，将所有脂肪干细胞平均分成两半，一半的脂肪干细胞将细胞培养液更换成诱导培养基继续培养，标记为试验组，每3天换新鲜诱导液；另一半的脂肪干细胞将细胞培养液更换普通培养基，标记为对照组，每3天更换新鲜普通培养基，持续培养14-21天。诱导14-21天后，油红0染色鉴定，将试验组和对照组造染色前与染色后进行分化能力检测。

结果如图1所示，采用试验组3直接冻存到-80℃，12h再转存于液氮中保存6个月的P6代脂肪干细胞的仍然具有成脂分化能力，表明采用试验组3所配置的冻存液在不经过常规的程序性降温的情况下，对脂肪干细胞的成脂分化能力没有影响。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种脂肪干细胞冻存液，其特征在于，包括基础培养基、血小板裂解物、bFGF和L-谷氨酰胺；所述血小板裂解物在所述脂肪干细胞冻存液的体积百分比为5%；所述bFGF在所述脂肪干细胞冻存液的浓度为50ng/ml；所述L-谷氨酰胺在所述脂肪干细胞冻存液的浓度为4mmol/L；所述脂肪干细胞冻存液还包括羟乙基淀粉、海藻糖、羧甲基纤维素钠和甘油；所述羟乙基淀粉在所述脂肪干细胞冻存液的体积百分比为1%~5%，所述海藻糖在所述脂肪干细胞冻存液的体积百分比为1%~5%，所述羧甲基纤维素钠在所述脂肪干细胞冻存液的体积百分比为0.05%~0.1%，所述甘油在所述脂肪干细胞冻存液的体积百分比为5%~20%；所述基础培养基为DMEM/F12。

2.一种脂肪干细胞冻存方法，其特征在于，包括：

1）配置如权利要求1所述的脂肪干细胞冻存液；

2）将脂肪干细胞与步骤1）的冻存液按照5×10⁶个/ml~1×10⁷个/ml的密度混合，得到混合物；

3）将步骤2）的混合物置于-80℃冻存8-24h后转存于液氮保存；

或，将步骤2）的混合物置于4℃冻存40min，然后放入-20℃冻存2h，再放入-80℃冻存3h，最后转入液氮中保存。