WO2014051173A1 - 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결보존용 조성물 - Google Patents

식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결보존용 조성물 Download PDF

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WO2014051173A1
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cells
stem cells
plant
serum albumin
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이순례
이진엽
모현정
박현숙
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(주)세포바이오
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]

Definitions

  • the present invention relates to a composition for cryopreservation of stem cells or primary cultured cells comprising plant-derived recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates as an active ingredient, and more particularly, to stem cells or primary cultured cells.
  • Stem cell refers to a cell that can proliferate indefinitely while maintaining an undifferentiated state and that can be differentiated to have a specific function and shape given a certain environment and conditions.
  • Human embryonic stem cells are capable of sustained self-renewal under appropriate in vitro culture conditions, and due to their pluripotency, which can differentiate into all kinds of cells in the human body, the development, differentiation and
  • the scope of use of the results is expanding.
  • primary cells are cells cultured directly from animal tissues or organs and are normal cells directly obtained from living organisms. When cultured, these cells grow to some extent with cell division, but they have ageing limitations if passage is continued. Despite these limitations, primary cultured cells are used in the production of biopharmaceuticals because they have the advantage of being similar to the actual reactions of living organisms. However, there is a need to cryopreserve cells due to the above limitations.
  • Cold storage and cryopreservation methods are typical of methods for preserving stem cells while maintaining the characteristics and viability of stem cells themselves such as pluripotency or pluripotency.
  • the cold preservation method is a method of storing stem cells at low temperature and was developed for short-term transportation and storage.
  • refrigeration preservation method is limited to long-term storage in accordance with the demand of stem cells and primary cultured cells can be stored only within a week, more precisely 1-3 days at low temperature (4 °C) state.
  • cryopreservation is a method of semi-permanently storing desired stem cells by storing cells, tissues, and organs at -70 ° C to -196 ° C to stop all metabolic reactions within cells. This method is ideal for semi-permanent storage of stem cells and primary cultured cells for research and treatment purposes, and is used for the storage of stem cells and primary cultured cells in all cell banks for non-profit or commercial purposes.
  • a cryoprotectant is used, and mainly DMSO (dimethyl sulfoxide) or glycerol is used.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • glycerol acts as a salt-buffer to bind metal ions and to dehydrate the cells themselves, thereby protecting the cells by reducing the volume of the entire ice crystal during freezing of the cells.
  • DMSO it partially dissolves the cell membrane to prevent the formation of punctures and prevents the hydrogen bonds between water molecules to inhibit cell damage by ice crystals.
  • DMSO and glycerol are toxic to cells, and ionic and osmotic imbalances occur during freezing and thawing, and free radicals are generated, resulting in inevitable cell damage. This exists.
  • a method using a combination of a cryoprotectant and a vehicle which minimizes the generation of ionic and osmotic imbalance and free radicals is widely used. I use it.
  • Fetal Bovine Serum (FBS) or Human Serum (Human Serum) which is a component of commonly used refrigerants, is difficult to control due to lot to lot variation.
  • Prion or virus that causes mad cow disease) or human-derived primary cultured cells and stem cells intended to be stored in infectious agents transmitted by human serum, etc. may still be exposed and cause some immune responses.
  • the type and composition ratio of the components contained in the cryopreservation composition may vary according to the type of cells to be cryopreserved, to develop a composition that can bring about effective cryopreservation of stem cells and primary cultured cells stem cells and Components suitable for primary cultured cells and appropriate composition ratios of these components should be identified. Therefore, in order to develop a composition for cryopreservation of stem cells or primary cultured cells having both safety and stability, components that can effectively bring about cryopreservation of stem cells and primary cultured cells without being heterogeneous and non-animal, and between each component An appropriate composition ratio should be developed.
  • cryopreservation compositions containing serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates are used, stem cells and primary cultured cells can be safely cryopreserved without contamination of heterologous proteins, and thawing damage can be prevented. It was confirmed that the cell survival rate was improved after thawing rather than using a cryopreservative containing minimal human serum albumin derived from bovine serum proteins or microorganisms, and completed the present invention.
  • One object of the present invention is the freezing of stem cells or primary cells, including plant-derived recombinant human serum albumin, lipid and plant protein hydrolysate as an active ingredient. It is to provide a composition for preservation.
  • Another object of the present invention to provide a method for lyophilizing stem cells or primary culture cells using the composition.
  • composition and method of the present invention it is possible to maintain a high level of cell viability of stem cells and primary cultured cells without the use of fetal bovine serum (FBS) or animal-derived factors can be stable cryopreservation and to animal-derived infectious agents Since the exposure is inherently blocked and is safe in biological application, it can be usefully used in the related pharmaceutical and medical industries where animal-free and xeno-free are required.
  • FBS fetal bovine serum
  • HSA cryopreservative
  • HSA + Lipid cryopreservative
  • FIG. 2 shows the cryopreservation effect of the cryopreservative (HSA) containing recombinant human serum albumin and the cryopreservative (HSA + Lipid) added with the lipid concentrate containing cholesterol thereto.
  • HSA cryopreservative
  • HSA + Lipid cryopreservative
  • Figure 3 is to confirm the effect of the composition of the present invention according to whether or not to include the plant protein hydrolyzate in order to confirm the effect of the plant protein hydrolyzate used in the composition of the present invention, the freezing and storage method used a gentle freezing method.
  • the cord-derived stem cells frozen using the above method were stored for 2 weeks, and then thawed to confirm cell viability through propidium iodide (PI) staining, and the results are shown in a graph.
  • PI propidium iodide
  • cryopreservatives containing fetal bovine serum (FBS), cryopreservatives (HSA) comprising recombinant human serum albumin derived from microorganisms and recombinant human serum albumin, lipid and plant proteins derived from plants, respectively.
  • FBS fetal bovine serum
  • HSA cryopreservatives
  • the upper part is taken at 50x magnification, and the lower part is taken at 100x magnification.
  • a healthy cell state is shown as compared with the case of using a cryopreservative comprising a serum protein or recombinant human serum albumin derived from microorganisms.
  • FIG. 5 shows cryopreservatives including fetal preservatives (FBS) containing fetal calf serum, cryopreservatives (HSA) comprising recombinant human serum albumin derived from microorganisms, and recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates derived from plants.
  • FBS fetal preservatives
  • HSA cryopreservatives
  • Plant protein / Lipid is frozen and stored for 2 weeks, thawed and confirmed the cell viability of bone marrow-derived mesenchymal stem cells through propidium iodide staining and reanalyzed the graph.
  • FIG. 6 shows a cryopreservative (FBS) containing fetal bovine serum, a cryopreservative (HSA) comprising recombinant human serum albumin derived from microorganisms, respectively, and a freeze containing recombinant human serum albumin, lipid and plant protein hydrolysates derived from plants.
  • FBS cryopreservative
  • HSA cryopreservative
  • the upper part is taken at 50x magnification, and the lower picture shows the picture taken at 100x magnification.
  • FIG. 7 shows cryopreservation agents (FBS) each containing fetal bovine serum, cryopreservation agents (HSA) containing recombinant human serum albumin derived from microorganisms, and freezing including plant-derived recombinant human serum albumin, lipid and plant protein hydrolysates.
  • FBS cryopreservation agents
  • HSA cryopreservation agents
  • freezing including plant-derived recombinant human serum albumin, lipid and plant protein hydrolysates.
  • FIG. 8 shows a cryopreservative (FBS) containing fetal bovine serum, a cryopreservative (HSA) comprising recombinant human serum albumin derived from microorganisms, respectively, and a freeze comprising recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates derived from plants.
  • FBS cryopreservative
  • HSA cryopreservative
  • Umbilical cord-derived stem cells were frozen by vitrification and freezing using CRF equipment using preservatives (Plant protein / Lipid), immediately transferred to LN2 Tank, stored for 2 weeks, and thawed to store cell viability by propidium iodide (PI). The graph shown after checking through dyeing.
  • cryopreservative 9 is a cryopreservative comprising fetal calf serum (FBS), a cryopreservative comprising microbial recombinant human serum albumin (HSA) and a plant derived recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates, respectively.
  • FBS fetal calf serum
  • HSA microbial recombinant human serum albumin
  • plant derived recombinant human serum albumin lipids and plant protein hydrolysates
  • the present invention comprises a recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates derived from plants as an active ingredient, for cryopreservation of stem cells or primary cells (primary cells) To provide a composition.
  • Cryopreservation compositions of the present invention including plant-derived recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates, do not use animal factors to maintain Xeno-free so that stem cells or primary cultured cells In terms of preservation, there is less risk of infection such as prion protein, so it can be used safely.
  • by including components that have a great effect on the cryopreservation of stem cells or primary cultured cells effectively reduce the death of cells due to freezing, and maintain the characteristics of the primary cultured cells or stem cells stably Very useful for long term storage.
  • cryopreservation compositions and their composition ratios containing all of the plant-derived recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates having such an effect are not known and were first identified by the present inventors.
  • the cryopreservation composition consisting of a combination of the plant-derived recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates not only maintains the function of the preserved cells, but also the cell viability when thawed, compared to conventional cryopreservation compositions. It can be usefully used for cryopreservation of stem cells or primary cultured cells that need to be preserved for self-treatment and the like due to the dramatically increasing superiority.
  • cryopreservation refers to keeping cells stable over a long period of time through freezing.
  • Cells are usually mutated at a rate of about 10,000 out of 10,000 in culture, and if they continue passage of cells over a long period of time, they change into a different cell population than the original cell population. It may be lost by subculture. It may also be infected with mycoplasma or the like during subculture. Due to this problem, the cells are frozen and preserved before the inherent properties of the cells are lost, and cryopreservation of the cells is carried out so that they can be taken out and used when necessary.
  • cryopreservation may be carried out through conventional methods of the art for freezing and preserving cells, which may include, but are not limited to, vitrification method, slow freezing method, or bulk cryopreservation. Do not.
  • the cryopreservation method includes without limitation any method capable of effectively preserving stem cells or primary cultured cells.
  • the vitrification freezing method and the slow freezing method were used (Example 3).
  • Cryopreservation of the cells is carried out by treating the cells to be cryoprotected (cryoprotectant), and may further comprise several components to prevent cell damage by the cryoprotectant.
  • cryopreservation composition of the present invention including recombinant human serum albumin (hHSA) derived from plants, lipid and plant protein hydrolysate, the cryopreservation of stem cells or primary cultured cells There is improved safety and stability.
  • hHSA human serum albumin
  • the term “recombinant human serum albumin derived from a plant” refers to a protein obtained by transforming a plant cell using an amino acid sequence of a portion of human serum albumin having the whole or biological activity of human serum albumin.
  • the human serum albumin may be used as an animal-free alternative equivalent to or better than serum in cryopreservation, and added to the cryopreservation composition to stabilize cells.
  • the recombinant human serum albumin of the present invention is produced from plant transformants, which has the advantage of minimizing the risk of animal or viral infectious agents, and therefore, in the use of stem cells or primary cultured cells, in particular as a therapeutic agent. Useful.
  • plant-derived recombinant human serum albumin included in the composition of the present invention unlike human serum albumin derived from animal cells or serum, there is almost no lot to lot variation between products.
  • the recombinant human serum albumin derived from the plant may be included in an amount of 5 parts by weight to 50 parts by weight, and preferably 10 parts by weight to 40 parts by weight based on 100 parts by weight of the total composition.
  • the present invention is not limited thereto.
  • human serum albumin that can be used in the present invention can be obtained using a known database such as the National Institutes of Health (NCBI) GenBank, for example, may be a protein having an Accession Number of NP_000468 (NM_000477), but is not limited thereto. Do not.
  • the human serum albumin may be a protein defined by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably not only the protein but also the sequence.
  • any amino acid sequence exhibiting at least 95%, most preferably at least 98%, similarity is included in the composition of the present invention substantially any protein having biological activity that inhibits cell damage upon cell freezing.
  • the polynucleotide encoding the human serum albumin is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95% of the sequence as well as the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. It is apparent that polynucleotides encoding a protein having a biological activity that most preferably inhibits cell damage upon cell freezing as a nucleotide sequence that exhibits at least 98% similarity are obviously included in the scope of the present invention.
  • the plant-derived recombinant human serum albumin may be obtained by transformation using an expression vector comprising a polynucleotide encoding human serum albumin, or may be obtained by using a recombinant plant serum albumin derived from a commercially available plant.
  • the term "vector” is an expression vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell, wherein the expression vector comprising a polynucleotide encoding human serum albumin is a polynucleotide encoding human serum albumin and works with it.
  • Recombinant polynucleotide molecules comprising a regulatory sequence that is possibly linked to refers to a vector capable of transforming a plant and expressing a target protein in the plant for the purposes of the present invention.
  • the plant expression vector is not particularly limited as long as it is an expression vector containing a polynucleotide encoding the human serum albumin.
  • the term "transformation” refers to the introduction of DNA into the host cell so that the DNA can be reproduced as a factor of the chromosome or by completion of chromosome integration, thereby introducing an artificial genetic change by introducing external DNA into the cell. It means the phenomenon that causes.
  • any transformation method may be used, and may be easily performed according to conventional methods in the art.
  • the type of plant transformant producing recombinant human serum albumin of the present invention is not particularly limited as long as it can express human serum albumin, but may be, for example, tobacco, rice or soybean transformants.
  • rAlbumin ACF a plant-derived recombinant human serum albumin from Sheffield
  • a recombinant human serum albumin produced in rice and Cellastim, a plant-derived recombinant human serum albumin from InVitria, were used.
  • lipid refers to an organic substance including fat, wax, sterol, fat soluble vitamin, monoglyceride, diglyceride, triglyceride, phospholipid, and the like, and is insoluble in water. Soluble in organic solvents.
  • the lipid is a lipid molecule which plays a role of inhibiting damage to cells during cryopreservation of stem cells or primary cultured cells, including, without limitation, the type thereof, for example, vegetable lecithin (soy lecithin) , Cholesterol, arachidonic acid, DL-alpha-tocopherol acetate, linoleic acid, linolenic acid, myristic acid, oleic acid , Palmitoleic acid, palmitic acid or stearic acid.
  • the lipid may preferably include cholesterol, which is a type of sterol, but is not limited thereto.
  • the lipids enter the cell membrane and reduce membrane damage when the cell membrane is weakened during cryopreservation, for example, when the cell membrane is dissolved and weakened by a cryoprotectant such as DMSO.
  • a cryoprotectant such as DMSO.
  • cholesterol when cholesterol is included, the damage of the cell membrane can be significantly reduced by increasing the ratio of cholesterol / phospholipid.
  • the lipid may be included in 0.1 parts by weight to 5.0 parts by weight based on 100 parts by weight of the total composition of the present invention, preferably 0.1 parts by weight to 1.0 part by weight based on 100 parts by weight of the total composition, but is not limited thereto.
  • a lipid concentrate containing cholesterol was used as a representative lipid, and the survival rate of cryopreserved cells was remarkably increased when the cryopreservation composition further included lipids in addition to human serum albumin. (Example 4).
  • plant protein hydrolysate is a substance containing amino acids or / and peptides, and is a substance containing amino acids or / and peptides prepared by hydrolyzing plant proteins.
  • the plant protein hydrolyzate may be prepared by hydrolyzing the plant protein using a specific enzyme, but is not limited thereto.
  • the plant protein hydrolyzate is not particularly limited as long as it contains an amino acid capable of reducing damage to cells in cryopreservation of stem cells or primary cultured cells.
  • tobacco, rice or Soy protein hydrolyzate may be used by directly hydrolyzing the plant protein using an enzyme or the like, or may use a commercially available plant protein hydrolyzate.
  • hydrolyzed soy protein was used as a plant protein hydrolyzate, and ULTRAPEP SOY or ULTRAPEP YE of Sheffield was purchased and used.
  • the plant protein hydrolyzate may be in the form of directly hydrolyzed using an enzyme or the like, or further purified form.
  • the plant protein hydrolyzate is preferably valine, leucine, isoleucine, methionine, threonine, threonine, lysine, phenylalanine, or tryptophan.
  • Essential amino acids such as Arginine, Asparagine, Glutamine, Glycine, Histidine, Serine, Tyrosine, or Proline Including but not limited to.
  • the plant protein hydrolyzate contains essential amino acids and / or non-essential amino acids that can be used as basic energy sources of the cells to supply cells with nutrients and increase their activity during freezing and thawing, thereby helping the cells recover quickly and improving cell viability. Contributes to height.
  • the plant protein hydrolyzate is further added to the composition of the present invention comprising plant-derived recombinant human serum albumin and lipids When included, it was confirmed that the survival rate of the stem cells was significantly increased, and when the plant protein hydrolyzate was further included, it was confirmed that the cryopreservation efficiency could be increased (Example 5).
  • the plant protein hydrolyzate or preferably 1 to 20 parts by weight, more preferably 1 to 10 parts by weight, based on 100 parts by weight of the total composition of the present invention. If included, the cryopreservation efficiency can be maximized.
  • the composition of the present invention is 10 to 40 parts by weight of plant-derived recombinant human serum albumin, 0.1 to 1 part by weight of lipid and 1 to 10 parts by weight of plant protein hydrolyzate, based on 100 parts by weight of the total composition. It may include, but is not limited thereto.
  • composition may further comprise a cryoprotectant.
  • freezezing inhibitor refers to the formation of ice crystals and the formation of ions and osmotic pressure inevitably accompanied by freezing and thawing in the storage of cells, tissues, organs, etc. at an extremely low temperature of -80 ° C to -200 ° C. Means the material used to minimize the damage of cells due to imbalance.
  • the cryoprotectant includes any material that can reduce cell damage in freezing, including, for example, permeability freezing inhibitors such as dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol, propylene glycol, ethylene glycol and sucrose , Carboxymethyl cellulose salt, carboxymethyl cellulose (CMC), polysaccharides, disaccharides and the like can be a non-permeable cryoprotectant, but is not limited thereto.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • the freezing inhibitor may be included in 1 to 15 parts by weight, preferably 5 to 10 parts by weight based on 100 parts by weight of the total composition of the present invention.
  • composition of the present invention further comprises a buffer selected from the group consisting of citrate, phosphate, succinate, tartrate, fumarate, gluconate, oxalate, lactate, acetate, histidine and Tris
  • a buffer selected from the group consisting of citrate, phosphate, succinate, tartrate, fumarate, gluconate, oxalate, lactate, acetate, histidine and Tris
  • Tris Can be selected from the group consisting of sodium chloride, potassium chloride, boric acid, sodium borate, mannitol, glycerin, propylene glycol, polyethylene, glycols, maltose, sucrose, erythritol, arabitol, xylitol, sorbitol trihalose and glucose It may further comprise one or more isotonic agents.
  • apoptosis inhibitors may include Rho associated kinase inhibitors, catalase, zVAD-fmk.
  • composition of the present invention comprising the plant-derived recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates may be very useful for cryopreservation of cells, in particular stem cells or primary cultured cells.
  • stem cell refers to an undifferentiated cell having self replication and differentiation capacity.
  • Stem cells include subpopulations such as pluripotent stem cells, multipotent stem cells, and unipotent stem cells, depending on their differentiation capacity.
  • the pluripotent stem cell refers to a cell having the ability to differentiate into all tissues or cells constituting the living body, multipotent stem cells are not all kinds, but the ability to differentiate into a plurality of tissues or cells It means a cell having.
  • Unipotent stem cells refer to cells that have the ability to differentiate into specific tissues or cells.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES Cell), undifferentiated germ cell (EG Cell), and iPS cells.
  • Multipotent stem cells include mesenchymal stem cells (fat-derived, Adult stem cells such as bone marrow-derived, umbilical cord blood or umbilical cord-derived), hematopoietic stem cells (derived from bone marrow or peripheral blood, etc.), neural stem cells, reproductive stem cells, and the like.
  • Committed stem cells which exist in a low state and make only hepatocytes after vigorous division after activation.
  • using the bone marrow-derived mesenchymal stem cells and umbilical cord-derived stem cells representatively confirmed that the composition of the present invention can be used safely and stably in cryopreservation of stem cells.
  • primary cell is a cell isolated from a tissue extracted from an individual without manipulation of a gene, and is a cell representing the function of a living organ / tissue.
  • Primary cultured cells are isolated from the skin, vascular endothelium, bone marrow, fat, cartilage, etc., and are used as cell therapy to study the function of the tissues and cells or to recover lost tissues.
  • the composition of the present invention can be used safely and stably in cryopreservation of stem cells (Fig. 9).
  • the stem cells and primary cultured cells are not particularly limited if they are cells that can be stably cryopreserved by the composition of the present invention, for example, humans, monkeys, pigs, horses, cattle, sheep, dogs, cats, mice There are cells derived from rabbits.
  • the stem cells or primary cultured cells are preferably human stem cells or primary cultured cells, but is not limited thereto.
  • bone marrow-derived mesenchymal stem cells and umbilical cord-derived stem cells were used as stem cells, and human dermal fibroblasts were used as primary cultured cells.
  • This was suspended and frozen in a cryopreservation composition of the present invention containing all of the plant-derived recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates, and thawed to confirm cell viability and cell morphology.
  • the composition of the present invention exhibits high cell viability and a healthy form compared to other compositions including recombinant human serum albumin derived from fetal bovine serum or microorganisms conventionally used (FIGS. 4 to 7).
  • the composition of the present invention when freezing cells using slow freezing, when the composition of the present invention further comprises plant protein hydrolysates in the recombinant human serum albumin and lipids, the cell survival rate is higher than in the case of containing only recombinant human serum albumin and lipids.
  • This further improved results showed that the use of recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates can be used very stably upon freezing of stem cells and primary cultured cells (FIG. 3).
  • human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates derived from plants included in the composition of the present invention are all plant-derived and have the characteristics of non-animal and non-heterologous, and thus can be transmitted from animals such as mad cow disease. The risk to and the like can be reduced, so that the compositions of the present invention have safety as well as stability.
  • the present invention provides a cryopreservation method of stem cells or primary culture cells using the composition.
  • composition, stem cells, primary cultured cells and cryopreservation are as described above.
  • the cryopreservation method specifically includes, but is not limited to, freezing stem cells or primary cultured cells treated with the composition.
  • Cooling of the stem cells or primary cultured cells treated with the cryopreservation composition of the present invention can be carried out through a conventional method of cooling the stem cells or primary cultured cells, for example vitrification freezing (Vitrification method), Slow freezing method, but is not limited thereto.
  • the vitrification freezing method may be carried out by freezing by dropping the temperature by 1 ° C. per minute using equipment such as a controlled-rate freezer (CRF), and it is preferable to store it in a nitrogen tank as soon as it reaches -80 ° C. .
  • Slow freezing can be performed by placing a vial containing a cryopreservation suspension containing cells into a freezing container box containing isopropyl alcohol and cooling it at a constant temperature drop for 12-24 hours in an ultra-low temperature freezer at -70 ° C or lower.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the cooled cells can be stored in a liquid nitrogen tank, taken out if necessary, and used again.
  • the stem cells and primary cultured cells suspended in the composition of the present invention was frozen using vitrification freezing and slow freezing, and then stored in liquid nitrogen.
  • the cells were cultured in an incubator at 37 ° C., 5% CO 2 , and maintained at 3 days of exchange.
  • Example 2 Preparation of cryopreservation composition comprising plant-derived recombinant human serum albumin, lipid and plant protein hydrolysate
  • the present inventors used plant-derived recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates as active ingredients in order to prepare a cryopreservation composition capable of safely and stably preserving stem cells and primary cultured cells.
  • the plant-derived recombinant human serum albumin which is a plant-derived recombinant human serum albumin from Sheffield, a plant-derived recombinant human serum albumin, rAlbumin ACF or InVitria, a plant-derived recombinant human serum albumin, Cellastim.
  • a lipid cholesterol lipid concentrate (Cholesterol lipid concentrate, Invitrogen) was used, and as plant protein hydrolysate, UltraPep Soy (Sheffield) was used. G) was used.
  • MS-GM CEFO., Korea
  • CB-HDF-GM CEFO., Seoul, Korea
  • Plant-derived recombinant human serum albumin protein was mainly used in this experiment 10 to 40%, especially when containing 40% showed the highest effect.
  • the composition of the present invention contains 20% of plant-derived recombinant human serum albumin protein, the plant protein hydrolyzate is mainly included at 5%, and when it contains 10% of plant-derived recombinant human serum albumin protein, the plant protein hydrolyzate. 10% is included.
  • composition of the cryopreservative of the present invention prepared using the active ingredient was as shown in Table 1 below.
  • Table 1 Main composition of the cryopreservation composition of the present invention Basal Medium Cryoprotectant Serum and Nutrients Other MS-GM (CEFO., Korea) or CB-HDF-GM (CEFO., Seoul, Korea) DMSO5-15% FBS 10-50% - HAS 10-50% - Plant-derived recombinant human serum albumin and lipids 10-50% Plant Protein Hydrolyzate
  • Example 3 freezing / thawing treatment of stem cells
  • Bone marrow mesenchymal stem cells, umbilical cord stem stem cells and fibroblasts cultured through the method of Example 1 were recovered and PBS (Phosphate-buffered saline) After washing with, recovered and stained with propidium iodide (PI) to count the number of cells.
  • PBS Phosphate-buffered saline
  • the stem cells or fibroblasts were 1 ⁇ 10 6 cells / ml, respectively, cryopreservatives composed mainly of fetal calf serum (FBS); Cryopreservatives based on microbial recombinant human serum albumin (HAS); The plant-derived recombinant human serum albumin (Plant Protein, rhAlbumin) and lipids of Example 2 were suspended in a cryopreservative.
  • FBS fetal calf serum
  • HAS microbial recombinant human serum albumin
  • Plant-derived recombinant human serum albumin Plant Protein, rhAlbumin
  • lipids of Example 2 were suspended in a cryopreservative.
  • a vitrification method using a slow freezing method and a controlled-rate freezer (CRF) device was used, respectively.
  • a vial containing cells suspended in a cryopreservative is placed in a freezing container containing isopropyl alcohol, and then at least 12 hours in a cryogenic refrigerator of -70 ° C. or lower so that the temperature gradually decreases at a constant speed. After storing above, it was carried out by transferring to a liquid nitrogen tank.
  • the vial containing the cryopreservative was put in the CRF equipment, and the program was performed so as to reach -180 ° C by dropping the internal temperature of the vial by 1 ° C per minute. Immediately after reaching -80 ° C, the vial was taken out and stored in a liquid nitrogen tank, LN2 tank.
  • cryopreserved stem cells and primary cultured cells were removed and thawed as quickly as possible in a constant temperature water bath at 37 ° C., followed by wiping the vial containing cells with 70% ethanol to remove contaminants. After washing the cells with a basal medium (Basal Medium), the cells were inoculated in a culture dish and incubated for 24 hours to confirm the effect of the cryopreservation composition of the present invention.
  • Basal Medium Basal Medium
  • composition of the lipid concentrate was as shown in Table 3.
  • Cryopreservation was made according to the composition of Table 2 above, 1 ⁇ 10 6 cells / mL of umbilical cord-derived stem cells (UCMSC) were suspended therein and frozen by gentle freezing. Then, cell viability was measured by thawing in a LN2 tank for 7 days and the results are shown in FIG. 1. In addition, the thawed cells were inoculated in a 100 mm culture dish and cultured for 3 days to count the cells, and cell growth rate was confirmed. The results are shown in FIG. 2.
  • UMSC umbilical cord-derived stem cells
  • the survival rate of the cells significantly increased from about 70% to more than 80%.
  • the cryopreservation composition further including lipids showed cell growth rate of 130 or more.
  • cryopreservation contains lipids as an active ingredient
  • the survival rate of the cells can be significantly increased, especially when the lipid concentrate containing cholesterol is further included, especially 0.1% to 1%.
  • the ratio of the result suggests that can significantly increase the cryopreservation effect of stem cells.
  • cryopreservation solution In addition to the plant-derived recombinant human serum albumin protein and lipid in addition to plant protein hydrolyzate, in order to determine whether the damage caused by cold / thaw of umbilical cord-derived stem cells can be further reduced, the composition of the cryopreservation solution is shown in Table 4 below. Composed with.
  • amino acid composition of the plant protein hydrolyzate used is shown in Table 5 below, and the cord-derived stem cells were used as cells.
  • Table 4 Composition of Main Active Ingredients of Cryopreservatives to Determine the Effect of Plant Protein Hydrolysates Basal medium Cryoprotectant Serum & Nutrients Other MS-GM (CEFO., Korea) DMSO (dimethyl sulfoxide) 5-15% rhAlbumin and lipid 5-50% - rhAlbumin and lipid 5-50% Plant protein hydrolyzate (Plant peptide I & II) 1-20%
  • the umbilical cord-derived stem cells frozen by the slow freezing method of Example 3 were thawed, stained with propidium iodide solution, and the number of living cells was measured using a cell counter. The effect on cell cryopreservation was confirmed. The results are shown in FIG.
  • composition for cryopreservation of the present invention further comprising plant protein hydrolyzate may be usefully used for lyophilization of cells.
  • the present inventors prepared a cryopreservation composition including lipid and plant protein hydrolyzate in addition to plant-derived recombinant human serum albumin protein, and its cryopreservation effect in stem cells and primary cultured cells. was confirmed in the following examples.
  • the bone marrow-derived mesenchymal stem cells (Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells) frozen and thawed by the slow freezing method of 3 were observed by using a microscope, and the results are shown in FIG. 4.
  • the survival rate of the stem cells also when cryopreserved using the cryopreservative of the present invention containing plant-derived recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates, and then thawed, the survival rate of other experimental groups
  • the highest survival rate was about 80%.
  • cryopreservation composition comprising all of the plant-derived recombinant human serum albumin, lipid and plant protein hydrolyzate of the present invention
  • cryopreservation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells without the use of animal-derived factors Not only is it safe, but also suggests that preservation of fetal calf serum or microorganism-derived recombinant human serum albumin can be more stable.
  • the cold / thawed umbilical cord-derived stem cells were stained with propidium iodide solution (Sigma, USA), and the number of living cells was measured using a C-Chip Disposable Hemocytometer (Digital Bio., Korea). Measured using a counter (Adam cell counter; Digital Bio., Korea), the results are shown in FIG.
  • cryopreservative of the present invention comprising plant-derived recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates, fetal bovine serum or microorganism-derived recombinant human serum albumin It was confirmed morphologically that healthy stem cells were cultured at the highest density when cultured in a culture dish immediately after thawing, as compared with the case of using a cryopreservative containing.
  • the survival rate of stem cells also when cryopreserved and thawed using the cryopreservation agent of the present invention, including plant-derived recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates, fetal calf serum or microorganisms It was confirmed that a high survival rate of about 80% compared to other experimental groups containing the derived recombinant human serum albumin.
  • cryopreservatives of the present invention comprising plant-derived recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates have a survival rate of at least 92% compared to other cryopreservatives containing fetal bovine serum or microbial human serum albumin. Results showing high survival rate were confirmed (FIG. 8).
  • the cryopreservation composition comprising the plant-derived recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates of the present invention
  • the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells can be cryopreserved without the use of animal-derived factors. Therefore, it is not only safe, but suggests that preservation of fetal calf serum or microorganism-derived recombinant human serum albumin can be more stable.
  • the composition comprising the plant-derived human serum albumin protein, lipids and plant protein hydrolysates of the present invention cryopreservation of stem cells regardless of the origin of stem cells This suggests that stem cells can be safely and stably cryopreserved in a Xeno-free and animal-free state for a long time.
  • lipids and plant protein hydrolysates contained in the composition of the present invention on the damage caused by freezing / thawing of human foreskin-derived fibroblasts. After thawing, the thawed human foreskin-derived fibroblasts were stained with propidium iodide solution (Sigma, USA) to count the number of viable cells with a C-Chip Disposable Hemocytometer (Digital Bio., Korea). After measurement using a counter (Adam cell counter; Digital Bio., Korea), the results are shown in FIG. 9.
  • human foreskin-derived fibroblasts are fetal calf serum Or the highest survival rate of about 93.8% compared to other experimental groups containing microbial derived human serum albumin protein.
  • cryopreservation composition comprising the plant-derived recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates of the present invention, primary cells such as human foreskin-derived fibroblasts are used without the use of animal-derived factors. ) Can be safely cryopreserved, as well as more stable cryopreservation compared to cryopreservation compositions comprising fetal calf serum or microbial derived human serum albumin.
  • composition of the present invention comprising plant-derived recombinant human serum albumin, lipids and plant protein hydrolysates may be useful for cryopreservation of stem cells as well as primary cultured cells. It is shown that the stem cells and primary cultured cells can be cryopreserved for a long time in a pure Xeno-free and animal-free state.

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Abstract

본 발명은 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결보존용 조성물 및 그 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 줄기세포 또는 일차배양세포의 장기보존에 있어 무동물성(Animal-Free) 및 무이종성(Xeno-Free)을 유지시키면서 동결로 인한 세포의 사멸을 감소시키기에 충분한 양의 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결보존용 조성물 및; 이를 이용한 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결보존방법에 관한 것이다.

Description

식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결보존용 조성물
본 발명은 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결보존용 조성물 및 그 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 줄기세포 또는 일차배양세포의 장기보존에 있어 무동물성(Animal-Free) 및 무이종성(Xeno-Free)을 유지시키면서 동결로 인한 세포의 사멸을 감소시키기에 충분한 양의 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결보존용 조성물 및; 이를 이용한 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결보존방법에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)란, 미분화 상태를 유지하면서 무한히 증식할 수 있으며 일정한 환경과 조건이 주어질 경우 특정 기능과 형태를 갖도록 분화할 수 있는 세포를 말한다. 인간 배아줄기세포는 적당한 체외 배양조건에서 자가 증식(self-renewal)을 지속적으로 할 수 있고, 인체를 이루고 있는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전분화능(pluripotency)으로 인해 인체의 발생, 분화 및 성장에 대한 기초 지식을 이해하기 위해서뿐만 아니라 인체의 손상 또는 다양한 질환의 근본적인 치료 방법인 세포 치료제 개발 및 다양한 신약 후보물질의 약효 검색, 질환의 원인 규명, 치료법 개발 등 다양한 측면에서 이를 대상으로 한 연구결과의 활용범위가 확대되고 있다. 성체줄기세포 및 인간배아줄기세포 이용에 대한 수요가 급증하고 있음에도 불구하고 미분화 상태의 성체 및 인간배아줄기세포를 유지하고 장기간 동안 보관하기 위한 기술 및 방법이 여전히 부족하다는 점 때문에 관련 기술 개발의 장애요소로 작용하고 있다.
또한, 일차배양세포(primary cell)는 동물 조직이나 기관으로부터 직접 일차 배양한 세포로서 살아있는 생물에게서 곧장 얻은 정상적인 세포를 말한다. 이 세포들은 배양을 하면 어느 정도까지는 세포분열을 하면서 자라게 되지만 계대가 계속되는 경우에는 노화되는 제한성을 지닌다. 이러한 제한성에도 불구하고 일차배양세포는 생물의 실제적인 반응과 유사하다는 장점을 지니기 때문에 생물의약품 생산 등에 있어 사용되고 있다. 다만, 상기와 같은 제한성으로 인하여 세포를 동결보존해야할 필요성이 있다.
따라서, 상기 줄기세포 또는 일차배양세포를 임상 실험 및 세포치료제 등에 이용하기 위해서는 동물유래 인자를 사용하지 않은 보존액의 개발과 각각의 일차배양세포와 줄기세포에 적합한 보존 방법의 개발이 매우 중요하다.
전분화능이나 다능성과 같은 줄기세포 자체의 특성과 생존율을 잘 유지하면서 줄기세포를 보존할 수 있는 방법에는 대표적으로 냉장보존법과 동결보존법이 있다. 냉장보존법은 줄기세포를 저온에서 보관하는 방법으로 단기간의 운송과 보관을 위한 목적으로 개발되었다. 하지만, 냉장보존법은 저온(4℃)상태에서 1주일 이내, 더 정확하게는 1 내지 3일 동안의 단기간 보존만 가능하여 줄기세포 및 일차배양세포의 수요에 따른 장기간 보관에는 한계가 있었다. 이에 반하여, 동결보존법은 세포, 조직 및 장기를 -70℃ 내지 -196℃의 초저온 상태에서 보관하여 세포 내 모든 대사반응을 정지시켜 원하는 줄기세포를 반영구적으로 보관하는 방법이다. 이 방법은 연구 및 치료목적으로 줄기세포 및 일차배양세포를 반영구적으로 보관하기 위한 가장 이상적인 방법이며, 비영리 혹은 상업적 목적의 모든 세포은행에서 줄기세포 및 일차배양세포를 보관하기 위하여 사용하는 방법이다.
그러나, 동결과 해동과정에서 필연적으로 동반되는 얼음결정의 형성과 이온 및 삼투압의 불균형에 따른 세포의 손상을 피할 수가 없어 동결과 해동과정으로 인한 손상이 증대된다. 이러한 손상을 최소화하고 동결 및 해동 후 생존율과 줄기세포능을 극대화하기 위하여 해당 세포의 생화학적, 물리적 특성에 따라 동결 및 해동과정에서 동반되는 손상을 최소화하기 위한 동결보존제의 개발과 동결방법의 개발은 매우 중요하다.
일반적으로 동물세포의 동결보존 시 나타나는 세포 내 얼음 결정화(intracellular ice crystallization)가 세포 손상의 가장 큰 원인으로 작용한다. 따라서 이를 막기 위하여 동결 억제제를 사용하며, 주로 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 또는 글리세롤을 사용하고 있다. 이들은 세포막 투과성 동결억제제(permeating-type cryoprotectant)로 이는 동결과 해동 과정에서 얼음결정의 형성을 효과적으로 감소시킨다. 구체적으로, 글리세롤은 염 완충(salt-buffer) 작용을 하여 금속 이온에 결합하고 세포 자체를 탈수(dehydration)시키는 작용을 함으로써 세포 내 수분이 어는 동안 전체 얼음 결정의 부피가 커지는 것을 줄여 세포를 보호하는 작용을 하며, DMSO의 경우 세포막을 부분적으로 용해시켜 구멍(puncture)이 생기는 것을 막으며, 물 분자 간의 수소 결합을 방해하여 얼음 결정에 의하여 세포가 손상되는 것을 저해시키는 작용을 한다. 다만, DMSO 및 글리세롤은 세포에 독성을 가지며, 동결과 해동과정에서 이온과 삼투압 불균형(ionic and osmotic imbalance)이 발생하고 또한 활성산소유리기(free radical)가 생성되어 이로 인한 세포 손상은 피할 수 없다는 문제점이 존재한다.
따라서, 이러한 문제점을 어느 정도 해소하기 위해 동결억제제와 함께 이온과 삼투압 불균형(ionic and osmotic imbalance) 및 활성산소유리기(free radical)의 생성을 최소화 할 수 있는 담체(vehicle)를 조합하여 이용하는 방법을 널리 사용하고 있다. 하지만, 일반적으로 사용되는 냉매제의 성분인 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이나 인간혈청(Human Serum)은 제품 간의 차이(lot to lot variation)로 인해 품질관리가 어려우며, 동물에서부터 전파되는 감염원(광우병의 원인이 되는 프라이온 혹은 바이러스 등)이나 인간혈청에 의해 전염되는 감염원등에 보관하고자 하는 인간 유래 일차배양세포 및 줄기세포가 노출될 수 있고 일부 면역반응을 일으킬 수 있다는 문제점을 여전히 갖는다. 상기와 같은 냉매제 성분의 품질관리 및 감염원에 따른 문제점을 배제하기 위해 최근 미생물 또는 동물 세포로부터 생산된 재조합 인간 혈청 알부민을 사용하는 기술이 보고되고 있다. 하지만, 이러한 재조합 인간 혈청 알부민(recombinant human serum albumin)의 사용 또한 냉매제 성분의 품질관리의 문제점을 일부 가지고 있으며, 여전히 동물에게 감염될 수 있는 감염원의 노출 가능성이 남아있어 이를 해결하기 위한 새로운 냉매제의 개발이 필요하다.
또한, 동결보존하고자 하는 세포의 종류에 따라 동결보존용 조성물에 포함되는 성분의 종류 및 조성비가 달라질 수 있어, 줄기세포 및 일차배양세포의 효과적인 동결보존을 가져올 수 있는 조성물을 개발하기 위해서는 줄기세포 및 일차배양세포에 적합한 성분 및 상기 성분들의 적절한 조성비는 규명되어야 한다. 따라서, 안전성 및 안정성을 모두 가진 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결보존용 조성물을 개발하기 위해서는, 무이종 및 무동물성이면서도 줄기세포 및 일차배양세포의 동결보존을 효과적으로 가져올 수 있는 성분, 및 각 성분 간의 적절한 조성비를 개발해야한다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결보존에 사용할 수 있는 무동물성 및 무이종성의 물질, 및 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 식물 형질전환체로부터 수득한 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 동결보존용 조성물을 사용하는 경우에 이종 단백질의 오염없이 줄기세포 및 일차배양세포를 안전적으로 동결보존할 수 있으며, 또한 해동하여도 동결로 인한 손상이 최소화되며 오히려 기존의 우혈청단백질 또는 미생물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 동결보존제를 사용하는 경우보다 해동 후 세포생존율이 향상되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민(Human serum albumin), 지질 및 식물 단백질 가수분해물(Plant protein hydrolysate)을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 또는 일차배양세포(Primary cell)의 동결보존용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 줄기세포 또는 일차배양세포를 동결건조시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 조성물 및 방법을 이용하는 경우, 우태아혈청(FBS) 또는 동물유래 인자의 사용 없이도 줄기세포 및 일차배양세포의 세포생존율을 높은 수준으로 유지할 수 있어 안정적으로 동결보존 할 수 있고 동물유래 감염원에 대한 노출이 원천적으로 차단되어 생체 적용시 안전적이어서, 무동물성(Animal-Free) 및 무이종성(Xeno-Free)이 요구되는 관련 제약 및 의료산업분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은, 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 동결 보존제(HSA) 및 이에 콜레스테롤을 포함하는 지질 농축액을 추가한 동결 보존제(HSA+Lipid)의 동결 보존 효과를 확인한 것으로, 상기 동결 보존제를 각각 이용하여 제대 유래 간엽줄기세포를 7일간 동결시킨 후, 해동하여 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 2는, 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 동결 보존제(HSA) 및 이에 콜레스테롤을 포함하는 지질 농축액을 추가한 동결 보존제(HSA+Lipid)의 동결 보존 효과를 확인한 것으로, 상기 동결 보존제를 각각 이용하여 제대 유래 간엽줄기세포를 7일간 동결시킨 후, 해동한 후 3일 동안 배양하여 세포 생장율을 확인한 결과이다.
도 3은, 본 발명의 조성물에 사용된 식물 단백질 가수분해물의 효과를 확인하기 위하여 식물 단백질 가수분해물의 포함 여부에 따른 본 발명의 조성물의 효과를 확인한 것으로, 동결 보관 방법은 완만 동결법을 이용하였다. 상기 방법을 이용하여 동결시킨 제대 유래 줄기세포를 2주간 보관한 다음, 해동하여 세포의 생존율을 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide; PI) 염색을 통하여 확인하고, 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는, 각각 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함하는 동결보존제(FBS), 미생물 유래 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 동결보존제(HSA) 및 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 본 발명의 동결보존제(Plant protein/Lipid)를 사용하여 2주간 냉동처리한 후 해동하여 배양접시에 접종하고 만 1일이 지난 후, 골수 유래 간엽줄기세포(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell)의 상태를 현미경을 통해 관찰한 사진이다. 상부는 50x 배율로 촬영한 것이고, 하부는 100x의 배율로 촬영한 사진을 나타낸다. 본 발명의 조성물(Plant protein/Lipid)을 사용한 경우, 우혈청 단백질 또는 미생물 유래 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 동결보존제를 사용한 경우에 비하여 건강한 세포상태를 나타낸다.
도 5는, 각각 우태아혈청을 포함하는 동결보존제(FBS), 미생물 유래 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 동결보존제(HSA) 및 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 동결보존제(Plant protein/Lipid)를 사용하여 2주간 냉동 보관한 후 해동하여 골수 유래 간엽줄기세포의 세포생존률을 프로피디움 아이오다이드 염색을 통하여 확인하고 이를 재분석하여 나타낸 그래프이다.
도 6은, 각각 우태아혈청을 포함하는 동결보존제(FBS), 미생물 유래 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 동결보존제(HSA), 및 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 동결보존제(Plant protein/Lipid)를 사용하여 2주간 냉동 보관한 후 해동하여 배양접시에 접종한 다음, 만 1일 후 제대유래 줄기세포(Umbilical Cord Matrix Stem Cell)의 상태를 현미경을 통해 관찰한 사진이다. 상부는 50x 배율로 촬영한 것이고, 하부의 사진은 100x의 배율로 촬영한 사진을 나타낸다.
도 7은, 각각 우태아혈청을 포함하는 동결보존제(FBS), 미생물 유래 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 동결보존제(HSA), 및 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 동결보존제(Plant protein/Lipid)를 사용하여 골수유래 간엽줄기세포의 경우와 마찬가지로 2주간 냉동보관한 후 해동하여 제대유래 줄기세포의 세포생존률을 프로피디움 아이오다이드 염색을 통하여 확인한 후 나타낸 그래프이다.
도 8은, 각각 우태아혈청을 포함하는 동결 보존제(FBS), 미생물 유래 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 동결보존제(HSA), 및 식물유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 동결보존제(Plant protein/Lipid)를 사용하여 제대유래 줄기세포를 CRF 장비를 이용하여 유리화 동결법 방식으로 냉동한 후, LN2 Tank에 즉시 옮겨 2주간 보관한 후 해동하여 세포생존율을 프로피디움 아이오다이드(PI)염색을 통하여 확인한 후 나타낸 그래프이다.
도 9는, 각각 우태아혈청을 포함하는 동결보존제(FBS), 미생물 유래 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 동결보존제(HSA) 및 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 동결보존제(Plant protein/Lipid)를 사용하여 인간 포피유래 섬유아세포를 2주간 냉동보관한 후 해동하여, 세포 생존율을 프로피디움 아이오다이드 염색을 통하여 확인하고, 그 결과를 나타낸 그래프이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 또는 일차배양세포(Primary cell)의 동결보존용 조성물을 제공한다.
본 발명의 동결보존용 조성물은 식물에서 유래한 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하여, 동물성 인자를 사용하지 않아 무이종성(Xeno-Free)을 유지하므로 줄기세포 또는 일차배양세포의 보존에 있어 프리온 단백질 등의 감염 위험이 적어 안전하게 사용할 수 있다. 또한, 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결보존에 큰 효과를 가져오는 성분들을 포함하여 동결로 인한 세포의 사멸을 효과적으로 감소시킬 뿐만 아니라, 일차배양세포 또는 줄기세포의 특성을 안정적으로 유지시키므로 상기 세포들의 장기보관에 있어 매우 유용하다. 이와 같은 효과를 지니는 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 모두 포함하는 동결보존용 조성물 및 이의 조성비는 알려진 바 없으며, 본 발명자들에 의해 최초로 규명되었다. 아울러, 상기 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물의 조합으로 이루어진 동결보존용 조성물은, 보존된 세포의 기능을 유지시킬 뿐만 아니라, 해동하였을 때 세포 생존율이 기존의 동결 보존용 조성물보다 획기적으로 증가하는 우수성을 지녀서 자가치료 등을 위하여 보존 필요가 있는 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결보존에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "동결보존(cryopreservation)"은 동결을 통해 장기간에 걸쳐 세포를 안정하게 유지시키는 것을 의미한다. 세포는 일반적으로 배양에서 일만 개 중에 한 개 정도의 비율로 돌연변이가 일어나고 있으며, 장기간에 걸쳐 세포의 계대를 계속하면, 본래의 세포집단과는 다른 세포집단으로 변하고, 심하게는 세포가 가진 특정 기능이 계대 배양에 의해 소실되는 경우도 있다. 또한, 계대배양 중 마이코플라스마 등에 감염될 수도 있다. 이러한 문제점으로 인하여 세포의 고유한 특성이 소실되기 전에 세포를 동결시키고 이를 보존하고, 필요 시에 꺼내어 사용할 수 있도록 세포의 동결 보존을 수행한다. 특히, 줄기세포의 경우 치료제로 이용하기 위해서는 필요한 상황에 건강한 줄기세포를 즉시 사용할 수 있어야 하므로, 효과적인 동결보존은 줄기세포에서 더욱 중요하게 여겨지고 있다. 동결 보존은 세포를 동결시켜 보존하는 당업계의 통상적인 방법을 통하여 수행될 수 있으며, 그 예로 유리화 동결(Vitrification method), 완만동결(Slow freezing method) 또는 대량 동결보존이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 상기 동결 보존 방법은 줄기세포 또는 일차배양세포를 효과적으로 보존할 수 있는 방법이라면 제한없이 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서는 유리화 동결법 및 완만동결법을 사용하였다(실시예 3).
세포의 동결보존은 동결시키고자 하는 세포에 동결억제제(cryoprotectant)를 처리함으로써 수행되며, 동결억제제에 의한 세포 손상을 막기 위하여 여러 성분들을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 동결보존용 조성물의 경우에는 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민(Human recombinant albumin, hHSA), 지질 및 식물 단백질 가수분해물(Plant protein hydrolysate)을 포함하여, 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결 보존에 있어 안전성 및 안정성을 향상시켰다.
본 발명에서 용어, "식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민"은 인간 혈청 알부민의 전체 또는 생물학적 활성이 있는 인간 혈청 알부민의 일부분의 아미노산 서열을 이용하여 식물 세포에 형질전환하여 수득한 단백질을 의미한다. 상기 인간 혈청 알부민은 동결 보존에 있어 혈청과 동등하거나 더 우수한 무동물성 대체제(animal-free alternative)로서 사용될 수 있으며, 동결 보존용 조성물에 첨가되어 세포를 안정화시키는 역할을 수행한다. 특히, 본 발명의 재조합 인간 혈청 알부민은 식물 형질전환체로부터 생산되어 동물성 또는 바이러스성 감염성 인자의 위험을 최소화할 수 있는 이점을 지니므로, 줄기세포 또는 일차배양세포의 이용, 특히 치료제로서의 이용에 있어 유용성을 지닌다. 또한, 본 발명의 조성물에 포함된 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민의 경우, 동물 세포 또는 혈청에서 유래한 인간 혈청 알부민과 다르게 제품 간의 편차(lot to lot variation)가 거의 없다는 장점을 가진다.
본 발명의 조성물에 있어 상기 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민은 총 조성물 100 중량부에 대해 5중량부 내지 50중량부로 포함될 수 있고, 바람직하게는 조성물 총 중량에 대하여 10중량부 내지 40중량부로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용될 수 있는 인간 혈청 알부민에 대한 정보는 미국 국립 보건원(NCBI) GenBank와 같은 공지의 데이터베이스를 이용하여 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession Number가 NP_000468인 단백질(NM_000477)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 인간 혈청 알부민은 서열번호 1의 아미노산 서열로 정의되는 단백질일 수 있으며, 상기 단백질뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 본 발명의 조성물에 포함되어 세포 동결시 세포 손상을 억제하는 생물학적 활성을 가지는 단백질이라면 모두 포함한다. 또한, 인간 혈청 알부민과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 또한, 상기 인간 혈청 알부민을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 뉴클레오티드 서열로서 실질적으로 세포 동결시 세포 손상을 억제하는 생물학적 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.
상기 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 이용하여 형질전환시킨 다음 이로부터 수득하거나, 상용화된 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민을 구입하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현벡터로서, 상기 인간 혈청 알부민을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 인간 혈청 알부민을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 이와 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 분자를 하며, 본 발명의 목적상 식물에 형질전환이 가능하고 식물에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터를 의미한다. 상기 식물 발현 벡터는 상기 인간 혈청 알부민을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터라면 특별히 그 종류가 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서 용어, "형질전환"은 DNA를 숙주 세포로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다.
본 발명의 재조합 인간 혈청 알부민을 생산하는 식물 형질전환체의 종류는 인간 혈청 알부민을 발현할 수 있다면 특별히 그 종류가 제한되지 않나, 그 예로 담배, 벼 또는 콩 형질전환체일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 벼에서 생산된 재조합 인간 혈청 알부민인 쉐필드 사(Sheffield)의 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민인 rAlbumin ACF 및 인비트리아(InVitria) 사의 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민인 Cellastim을 사용하였다.
본 발명에서 용어, "지질(lipid)"은 지방(fat), 왁스(wax), 스테롤, 지용성 비타민, 모노글리세라이드, 다이글리세라이드, 트리글리세라이드, 인지질 등을 포함하는 유기물로서, 물에는 녹지 않고 유기용매에 잘 녹는 성질을 지닌다. 본 발명의 목적상 상기 지질은 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결 보존시 세포의 손상을 억제시키는 역할을 수행하는 지질 분자라면 그 종류에 제한없이 포함하며, 그 예로 식물성 인지질인 쏘이 레시틴(soy lecithin), 콜레스테롤, 아라키돈산(Arachidonic acid), DL-알파-초산 토코페롤(DL-a-Tocopherol acetate), 리놀레산(Linoleic acid), 리놀렌산(Linolenic acid), 미리스트산(Myristic acid), 올레산(Oleic acid), 팔미톨레산(Palmitoleic acid), 팔미트산(Palmitic acid) 또는 스테아르산(Stearic acid)이 있다. 상기 지질은 바람직하게는 스테롤의 일종인 콜레스테롤(cholesterol)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 콜레스테롤, 아라키돈산(Arachidonic acid), DL-알파-초산 토코페롤(DL-a-Tocopherol acetate), 리놀렌산(Linolenic acid), 리놀레산(Linoleic acid), 미리스트산(Myristic acid), 올레산(Oleic acid), 팔미톨레산(Palmitoleic acid), 팔미트산(Palmitic acid), 스테아르산(Stearic acid), Tween80을 포함하는 지질 농축물(Lipid concentrate)를 이용하였다.
상기 지질은 동결보존시 세포막이 약화되는 경우, 예컨대 DMSO와 같은 동결억제제에 의하여 세포막이 용해되어 약화되는 경우에 있어서 세포막에 들어가서 막손상을 감소시키는 역할을 수행한다. 특히, 콜레스테롤을 포함하는 경우, 콜레스테롤/인지질의 비율을 높여 세포막의 손상을 현저히 감소시킬 수 있다. 상기 지질은 본 발명의 총 조성물 100 중량부에 대하여 0.1중량부 내지 5.0중량부로 포함될 수 있고, 바람직하게는 총 조성물 100 중량부에 대하여 0.1중량부 내지 1.0중량부로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 대표적인 지질로서 콜레스테롤을 포함하는 지질 농축물을 사용하였으며, 동결보존용 조성물에 인간 혈청 알부민 외에 지질을 추가로 포함하는 경우 동결보존한 세포의 생존율이 현저하게 증가함을 확인하였다(실시예 4).
본 발명에서 용어, "식물 단백질 가수분해물"은 아미노산 또는/및 펩타이드를 포함하는 물질로서, 식물 단백질을 가수분해하여 제조한 아미노산 또는/및 펩타이드를 포함하는 물질이다. 상기 식물 단백질 가수분해물은 식물 단백질을 특정 효소 등을 이용하여 가수분해하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 상기 식물 단백질 가수분해물은 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결 보존에 있어 세포의 손상을 감소시킬 수 있는 아미노산을 포함하는 물질이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로 담배, 벼 또는 콩 단백질 가수분해물일 수 있다. 상기 식물 단백질 가수분해물은 식물 단백질을 효소 등을 이용하여 직접 가수분해하여 사용하거나 상업적으로 판매되는 식물 단백질 가수분해물을 이용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 가수분해된 콩 단백질을 식물 단백질 가수분해물로 이용하였고, Sheffield사의 ULTRAPEP SOY 혹은 ULTRAPEP YE를 구입하여 사용하였다.
또한, 상기 식물 단백질 가수분해물은 효소 등을 이용하여 직접 가수분해된 형태이거나 추가로 정제된 형태일 수 있다. 상기 식물 단백질 가수분해물은 바람직하게는 발린(valine), 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 메티오닌(methionine), 트레오닌(threonine), 라이신(lysine), 페닐알라닌(phenylalanine) 또는 트립토판(tryptophan)과 같은 필수 아미노산, 알지닌(Arginine), 아스파라긴(Asparagine), 글루타민(Glutamine), 글리신(Glycine), 히스티딘(Histidine), 세린(Serine), 타이로신(Tyrosine) 또는 프롤린(Proline)과 같은 비필수 아미노산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 식물 단백질 가수분해물은 세포의 기본 에너지원으로 사용될 수 있는 필수아미노산 또는/및 비필수아미노산을 포함하여 냉동 및 해동시 세포에 영양성분을 공급하고 활성을 높여 세포가 빠르게 회복되는 것을 도와 세포 생존율을 높이는 데 기여한다. 본 발명의 일 실시예에서는 대표적으로 콩 단백질 가수분해물을 이용하여 식물 단백질 가수분해물의 효과를 확인한 결과, 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민 및 지질을 포함하는 본 발명의 조성물에, 식물 단백질 가수분해물을 추가로 포함하는 경우 줄기세포의 생존율이 현저하게 증가하는 것을 확인하여, 식물 단백질 가수분해물을 추가로 포함하는 경우, 동결보존 효율을 상승시킬 수 있음을 확인하였다(실시예 5).
특히, 본 발명의 총 조성물 100 중량부에 대해 상기 식물 단백질 가수분해물을 1중량부 내지 40중량부 포함하거나, 바람직하게는 1중량부 내지 20중량부, 더욱 바람직하게는 1중량부 내지 10중량부 포함하는 경우, 동결보존 효율을 극대화할 수 있다.
더욱 바람직하게, 본 발명의 조성물은 총 조성물 100중량부에 대해 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민 10중량부 내지 40중량부, 지질 0.1중량부 내지 1중량부 및 식물 단백질 가수분해물 1중량부 내지 10중량부를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 조성물은 추가로 동결 억제제를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "동결 억제제"는 세포, 조직 또는 장기 등을 -80℃ 내지 -200℃의 초저온 상태에서 보관하는데 있어서, 동결과 해동과정에서 필연적으로 동반되는 얼음결정의 형성과 이온 및 삼투압의 불균형에 따른 세포의 손상을 최소화하기 위하여 사용하는 물질을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 동결억제제는 동결에 있어 세포의 손상을 감소시킬 수 있는 물질이라면 제한없이 포함하며, 그 예로 디메틸설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜 등의 투과성 동결 억제제와 자당, 카르복시메틸셀룰로스염, 카르복시메틸셀룰로스(CMC), 다당류, 2당류 등의 비투과성 동결억제제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 동결 억제제의 대표적인 예로 디메틸설폭사이드(DMSO)를 사용하였다. 상기 동결 억제제는 본 발명의 총 조성물 100 중량부에 대해 1중량부 내지 15중량부로 포함될 수 있고, 바람직하게는 5중량부 내지 10중량부로 포함될 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 시트레이트, 포스페이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트, 히스티딘 및 트리스(Tris)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 완충제를 추가로 포함할 수 있고, 염화나트륨, 염화칼륨, 붕산, 붕산나트륨, 만니톨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌, 글리콜, 말토스, 자당, 에리쓰리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 트리할로즈 및 포도당으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 등장화제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 세포사멸 억제제인 Rho associated kinase 억제제나, catalase, zVAD-fmk를 포함할 수 있다.
상기 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 본 발명의 조성물은 세포, 특히 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결 보존에 있어 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "줄기세포"는 자기 복제능 및 분화증식능을 갖는 미분화 세포를 의미한다. 줄기세포에는, 분화 능력에 따라서, 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell), 단분화능 줄기세포(unipotent stem cell)등의 아집단이 포함된다. 상기 전분화능 줄기세포는 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 다분화능 줄기세포는 모든 종류는 아니지만, 복수 종의 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 단분화능 줄기세포는 특정한 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다.
전분화능 줄기세포로서는, 배아 줄기세포(ES Cell), 미분화생식선세포(EG Cell), 역분화줄기세포(iPS cell) 등을 들 수 있으며, 다분화능 줄기세포로서는, 간엽계 줄기세포(지방유래, 골수유래, 제대혈 또는 제대 유래 등), 조혈계 줄기세포(골수 또는 말초 혈액등에서 유래), 신경계 줄기세포, 생식 줄기세포 등의 성체 줄기세포 등을 들 수 있으며 단분화능 줄기세포로는 평소에는 분열능이 낮은 상태로 존재하다가 활성화 이후 왕성한 분열로 오직 간세포들만을 만드는 간세포(Committed stem cell) 등을 들 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 대표적으로 골수유래 간엽 줄기세포 및 제대 유래 줄기세포를 사용하여 본 발명의 조성물이 줄기세포의 동결 보존에 있어 안전적, 안정적으로 사용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "일차배양세포(Primary cell)"는 개체에서 추출한 조직에서 유전자 등의 조작 없이 분리한 세포로 생체 장기/조직의 기능을 대변하는 세포이다. 피부나 혈관내피, 골수, 지방, 연골 등에서 일차배양세포가 분리되어 해당 조직 및 세포의 기능을 연구하거나 잃어버린 조직을 복구하기 위한 세포치료제로 이용되고 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 대표적인 일차배양세포로서 포피 유래 섬유아세포를 이용하여 본 발명의 조성물이 줄기세포의 동결 보존에 있어 안전적, 안정적으로 사용될 수 있음을 확인하였다(도 9).
상기 줄기세포 및 일차배양세포는 본 발명의 조성물에 의하여 안정적으로 동결보존될 수 있는 세포라면 특별히 그 유래에 제한되지 않으며, 그 예로 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 유래의 세포가 있다. 상기 줄기세포 또는 일차배양세포는 바람직하게는 인간 유래의 줄기세포 또는 일차배양세포이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 줄기세포로서 골수 유래 간엽 줄기세포 및 제대 유래 줄기세포를 사용하고, 일차배양세포로서 인간 진피 섬유 아세포를 사용하였다. 이를 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 모두 포함하는 본 발명의 동결보존용 조성물에 현탁하여 동결시킨 후, 해동하여 세포 생존율 및 세포 형태(cell morphology)를 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 조성물은 기존에 사용되는 우태아혈청 또는 미생물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 다른 조성물에 비하여 높은 세포 생존율 및 건강한 형태를 나타내는 것을 확인하였다(도 4 내지 도 7). 특히, 완만동결법을 사용하여 세포를 동결시키는 경우, 본 발명의 조성물이 재조합 인간 혈청 알부민 및 지질에 식물 단백질 가수분해물을 추가로 더 포함하는 경우, 재조합 인간 혈청 알부민 및 지질만을 포함하는 경우보다 세포 생존율이 더욱 향상되는 결과를 보여 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 모두 포함하는 경우 줄기세포 및 일차배양세포의 동결시 매우 안정적으로 사용할 수 있음을 나타내었다(도 3). 특히, 본 발명의 조성물에 포함되는 식물 유래의 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물은 모두 식물에서 유래한 것으로 무동물성 및 무이종성의 특성을 가지므로, 광우병과 같은 동물에서 전파될 수 있는 질병 등에 대한 위험을 감소시킬 수 있어, 본 발명의 조성물은 안정성뿐만 아니라 안전성을 지닌다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 이용하는 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결보존 방법을 제공한다.
상기 조성물, 줄기세포, 일차배양세포 및 동결 보존에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 동결보존 방법은 구체적으로 상기 조성물을 처리한 줄기세포 또는 일차배양세포를 동결시키는 단계를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 동결보존용 조성물을 처리한 줄기세포 또는 일차배양세포의 냉각은 줄기세포 또는 일차배양세포를 냉각시키는 당업계의 통상적인 방법을 통하여 수행될 수 있으며, 그 예로 유리화 동결(Vitrification method), 완만 동결(Slow freezing method)이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 유리화 동결법은 CRF(Controlled-Rate Freezer)와 같은 장비를 이용하여 1분당 1℃씩 온도를 일정하게 떨어뜨려 동결시킴으로써 수행될 수 있고, -80℃에 도달하면 바로 질소 탱크에 보관하는 것이 바람직하다. 완만 동결은 세포가 포함된 동결 보존액 현탁액이 담긴 바이알을 이소프로필 알코올이 담긴 냉동용 컨테이너 박스에 넣고 -70℃ 이하의 초저온 냉동고에서 12시간 내지 24시간 동안 온도를 일정하게 떨어뜨려 냉각시킴으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 냉각된 세포는 액체 질소 탱크에 보관하여, 필요시에 꺼내어 다시 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 조성물에 현탁한 줄기세포 및 일차배양세포를 유리화 동결 및 완만 동결법을 사용하여 동결시킨 다음, 액체 질소에 보관하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 줄기세포 및 일차배양세포의 준비
환자로부터 기증받은 골수(Bone marrow), 제대(Umbilical cord) 및 포피(Foreskin)로부터 각각 골수 유래 간엽줄기세포(Bone marrow mesenchymal stem cell), 제대 유래 줄기세포(Umbilical Cord Matrix Stem Cell) 및 섬유아세포(Fibroblast)를 직접 추출하였다. 상기 줄기세포들의 배양액으로는 CB-MS-GM(CEFO., Seoul, Korea) 배양액을 사용하였고 섬유아세포의 배양액으로는 CB-HDF-GM(CEFO., Seoul, Korea) 배양액을 사용하였다. 상기 세포들은 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 배양액을 교환하며 유지하였다.
본 발명의 모든 실험은 ㈜세포바이오의 기관생명윤리심의위원회의 승인을 받아 생명윤리 및 안전에 관한 법률에 따른 절차 및 방법을 통해 진행되었다.
실시예 2: 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 동결보존용 조성물의 제조
본 발명자들은 줄기세포 및 일차배양세포를 안전적 및 안정적으로 보존할 수 있는 동결보존용 조성물을 제조하기 위하여, 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 유효성분으로 이용하였다. 이때, 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민으로, 벼에서 생산된 재조합 인간 혈청 알부민인 쉐필드 사(Sheffield)의 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민인 rAlbumin ACF 또는 인비트리아(InVitria) 사의 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민인 Cellastim을 이용하였고, 지질로는 콜레스테롤 지질 농축물(Cholesterol lipid concentrate, Invitrogen)을 이용하였고, 식물 단백질 가수분해물로는 UltraPep Soy(Sheffield 사)를 이용하였다.
기저 배지로는, 줄기세포의 경우 MS-GM(CEFO., Korea)을 사용하였고, 일차배양세포의 경우 CB-HDF-GM(CEFO., Seoul, Korea)을 사용하였다. 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민 단백질은 본 실험에서 10 내지 40%를 주로 사용하였고, 특히 40%를 포함하는 경우 가장 높은 효과를 보였다. 본 발명의 조성물에서 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민 단백질 20%를 포함하는 경우, 식물 단백질 가수분해물은 주로 5%로 포함되도록 하였으며, 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민 단백질을 10% 포함하는 경우, 식물 단백질 가수분해물은 10% 포함되도록 하였다.
상기 유효성분을 이용하여 제조한 본 발명의 동결보존제의 조성은 하기 표 1과 같았다.
표 1
본 발명의 동결 보존용 조성물의 주요 조성
기저 배지(Basal Medium) 동결 억제제(Cryoprotectant) 세럼 및 영양분 기타
MS-GM(CEFO., Korea) 또는 CB-HDF-GM(CEFO., Seoul, Korea) DMSO5-15% FBS 10-50% -
HAS 10-50% -
식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민 및 지질10-50% 식물 단백질 가수분해물1-20%
실시예 3: 줄기세포의 냉/해동 처리
상기 실시예 1의 방법을 통해 배양되어진 골수 유래 간엽줄기세포(Bone marrow mesenchymal stem cell), 제대 유래 줄기세포(Umbilical cord matrix stem cell) 및 섬유아세포(Fibroblast)를 회수하여 PBS(Phosphate-buffered saline)로 세척한 후, 회수하여 프로피디움 아이오다이드(PI)로 염색하여 세포수를 계수하였다. 그 다음, 줄기세포 또는 섬유아세포가 1x106 세포수/㎖가 되도록 하여, 각각 우태아혈청(FBS)을 주성분으로 하는 동결보존제; 미생물 유래 재조합 인간혈청 알부민(HAS)을 주성분으로 하는 동결보존제; 상기 실시예 2의 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민(Plant Protein, rhAlbumin) 및 지질을 주성분으로 하는 동결보존제에 현탁하였다.
세포의 동결 방법으로는 완만동결법(Slow Freezing Method) 및 CRF(Controlled-Rate Freezer) 장비를 이용한 유리화 동결법(Vitrification Method)을 각각 사용하였으며, 하기와 같이 수행하였다.
상기 완만동결법은 동결보존제에 현탁한 세포를 포함하는 바이얼을 아이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol)이 담겨진 냉동 컨테이너에 담은 다음, -70℃ 이하의 초저온냉장고에서 서서히 일정속도로 온도가 떨어지도록 최소 12시간 이상 보관한 다음, 액체질소탱크로 옮김으로써 수행하였다. 상기 CRF 장비를 이용한 유리화 동결법은 동결보존제가 현탁된 바이얼을 CRF 장비에 넣고 바이얼의 내부 온도를 분당 1℃씩 온도를 떨어뜨려 -180℃에 도달하도록 프로그램을 수행하였고, 바이얼의 온도가 -80℃에 도달하면 즉시 바이얼을 꺼내 액체질소 탱크인 LN2 탱크로 옮겨 보관하였다.
상기 동결된 세포의 해동은 하기와 같이 수행하였다.
동결한 지 2주가 지난 다음, 냉동보존된 줄기세포 및 일차배양세포들을 꺼내 37℃의 항온 수조에서 가급적 빠르게 해동시킨 후, 70% 에탄올을 이용하여 세포가 담긴 바이알을 깨끗이 닦아 오염원을 제거하여 PBS 또는 기본 배양액(Basal Medium)으로 세포를 세척한 후, 배양접시에 세포를 접종하여 24시간 동안 배양하여, 본 발명의 동결 보존용 조성물의 효과를 확인하였다.
실시예 4: 지질의 동결보존 효과 확인
동결보존액에 있어 지질을 유효성분으로 포함하는 경우, 줄기세포의 냉/해동시 손상을 감소시킬 수 있는지 확인하기 위하여 지질을 인위적으로 많이 포함시키지 않은 인간 세럼 알부민 단백질 및 지질 농축액을 이용하여 하기 표 2와 같은 조성으로 동결 보존제를 제조하였다.
표 2
지질의 효과를 확인하기 위한 동결보존액의 주요 유효성분의 조성
기저 배지(Basal medium) 동결억제제(Cryoprotectant) 세럼 및 영양분(Serum&Nutrients) 기타(Other)
MS-GM(CEFO., Korea) DMSO(dimethyl sulfoxide)5-15% Human Serum Albumin 5-50% -
Human Serum Albumin 5-50% 콜레스테롤 지질 농축액(Cholesterol Lipid Concentrate)0.1%-1%
또한, 상기 지질 농축액의 조성은 하기 표 3과 같았다.
표 3
지질농축액의 조성
Component Arachidonic acid Cholesterol DL-α-Tocopherol acetate Linoleic acid Linolenic acid Myristic acid Oleic acid Palmitoleic acid Palmitic acid Pluronic® F-68 Steraric acid Tween® 80
㎎/L 2 220 70 10 10 10 10 10 10 100,000 10 2,200
상기 표 2의 조성대로 동결보존액을 만들어, 1x106 세포수/mL의 제대 유래 줄기세포(UCMSC)를 이에 현탁시키고 완만 동결법으로 동결시켰다. 그 다음, 7일간 LN2 탱크에 보관하고 해동하여 세포 생존율을 측정하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 또한, 해동한 세포를 100mm 배양 접시에 접종하고 3일 동안 배양하여 세포를 계수하여 세포 생장율을 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 알부민을 포함하는 동결 보존용 조성물에 지질을 추가로 포함하는 경우, 세포의 생존율이 약 70%에서 80% 이상으로 현저하게 상승하였다. 또한, 도 2에 나타난 바와 같이 인간 혈청 알부민만을 포함하는 동결 보존용 조성물을 사용한 경우의 세포 생장율을 100으로 보았을 때, 지질을 추가로 포함한 동결보존용 조성물의 경우, 130 이상의 세포 생장율을 나타내었다.
이와 같은 결과는 동결보존액에 지질을 유효성분으로 포함하는 경우, 세포의 생존율을 현저하게 상승시킬 수 있음을 나타내는 것으로, 콜레스테롤을 포함하는 지질 농축물을 추가로 포함하는 경우, 특히 0.1% 내지 1%의 비율로 포함하는 경우 줄기세포의 동결 보존 효과를 현저하게 상승시킬 수 있음을 시사하는 결과이다.
실시예 5: 식물 단백질 가수분해물의 동결보존 효과 확인
식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민 단백질 및 지질 이외에 식물 단백질 가수분해물을 추가로 포함하는 경우, 제대 유래 줄기세포의 냉/해동에 의한 손상을 더욱 감소시킬 수 있는지를 알아보기 위하여, 동결보존액의 조성을 하기 표 4와 구성하였다.
이때 사용된 상기 식물 단백질 가수분해물의 아미노산 조성은 하기 표 5와 같으며, 세포로는 제대 유래 줄기세포를 이용하였다.
표 4
식물 단백질 가수분해물의 효과를 확인하기 위한 동결보존액의 주요 유효성분의 조성
기저 배지(Basal medium) 동결억제제(Cryoprotectant) 세럼 및 영양분(Serum&Nutrients) 기타(Other)
MS-GM(CEFO., Korea) DMSO(dimethyl sulfoxide)5-15% rhAlbumin 및 지질 5-50% -
rhAlbumin 및 지질 5-50% 식물 단백질 가수분해물(Plant peptide I&II)1-20%
표 5
Figure PCTKR2012007820-appb-T000001
상기 실시예 3의 완만동결법에 의하여 냉동 처리된 제대 유래 줄기세포를 각각 해동하여, 프로피디움 아이오다이드 용액으로 염색한 다음, 살아 있는 세포 수를 세포계수기를 사용하여 측정하여, 식물 단백질 가수분해물의 세포 동결 보존에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 일반적으로 실험실에서 많이 사용되는 방법인 완만동결법을 이용하여 동결시킨 후 각각 해동시킨 결과, 식물 유래 단백질 및 지질 외에 식물 단백질 가수분해물을 추가로 더 포함하는 경우 7 내지 10% 정도 더 높은 생존율을 나타내는 것을 확인하여, 특히 식물 단백질 가수분해물을 추가로 포함하는 본 발명의 조성물을 완만동결법에 사용하는 경우 동결보존 효과를 더욱 상승시킬 수 있음을 나타내었다.
이와 같은 결과는, 식물 단백질 가수분해물을 추가로 더 포함하는 본 발명의 동결보존용 조성물은 세포의 동결건조에 있어 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다. 이와 같은 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민 단백질 외에도 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 추가로 포함하여 동결보존용 조성물을 제조하였고, 이의 줄기세포 및 일차 배양 세포에 있어서의 동결 보존 효과를 하기 실시예에서 확인하였다.
실시예 6: 골수 유래 간엽줄기세포의 냉동보존에 미치는 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물의 효과 확인
본 발명의 조성물에 포함된 식물유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물이 골수 유래 간엽줄기세포(Bone marrow mesenchymal stem cell)의 냉/해동에 의한 손상에 미치는 영향을 조사하기 위해 상기 실시예 3의 완만 동결법 방법을 통해 냉동되고, 해동 처리된 골수유래 간엽줄기세포(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell)를 현미경을 사용하여 줄기세포의 상태를 관찰하여 도 4에 그 결과를 나타내었다.
또한, 프로피디움 아이오다이드 용액(Pripidium Iodide solution; Sigma, USA)으로 염색하여 살아 있는 세포 수를 C-Chip Disposable Hemocytometer(Digital Bio., Korea)와 세포계수기 (Adam cell counter ; Digital Bio., Korea)를 사용하여 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 식물유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 모두 포함하는 동결보존제를 사용하여 동결보존하는 경우, 보존되었던 세포를 해동 직후 배양 접시에 접종하여 배양하였을 때 우태아혈청 또는 미생물 유래의 재조합 인간혈청알부민을 포함하는 동결보존제를 사용하여 동결하는 경우보다 건강한 줄기세포가 높은 밀도로 배양되어 존재하는 것을 형태적으로 관찰 확인할 수 있었다. 또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 줄기세포의 생존율 역시 식물유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 본 발명의 동결보존제를 사용하여 동결보존한 다음 해동하였을 때, 다른 실험군의 생존율보다 더 높은 약 80%의 가장 높은 생존율을 나타내었다.
상기와 같은 결과는, 본 발명의 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 모두 포함하는 동결보존용 조성물을 사용하는 경우, 동물유래 인자의 사용 없이도 골수 유래 간엽줄기세포를 냉동보존할 수 있으므로 안전적일 뿐만 아니라, 종래에 사용되던 우태아혈청 또는 미생물 유래의 재조합 인간혈청알부민을 사용하는 경우보다 더욱 안정적으로 보존할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 7: 제대유래 줄기세포(Umbilical cord matrix stem cell)의 냉동보존에 미치는 식물유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물의 효과 확인
식물유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물이 제대 유래 줄기세포의 냉/해동에 의한 손상에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 상기 실시예 3의 방법을 통해 냉/해동 처리된 제대 유래 줄기세포의 상태를 현미경을 사용하여 관찰하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
또한, 상기 냉/해동된 제대 유래 줄기세포를 프로피디움 아이오다이드 용액(Propidium Iodide solution; Sigma, USA)으로 염색하여, 살아 있는 세포 수를 C-Chip Disposable Hemocytometer(Digital Bio., Korea)와 세포계수기(Adam cell counter ; Digital Bio., Korea)를 사용하여 측정하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
그 결과, 상기 도 6에 나타난 바와 같이, 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 본 발명의 동결보존제를 사용하여 동결보존하였을 때, 우태아혈청 또는 미생물 유래 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 동결보존제를 사용하는 경우에 비하여 해동 직후 건강한 줄기세포가 배양 접시에 배양 시 가장 높은 밀도로 배양되는 것을 형태학적으로 확인하였다. 또한, 도 7에 나타난 바와 같이, 줄기세포의 생존율 역시 식물유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 본 발명의 동결보존제를 사용하여 동결보존하고 해동하였을 때, 우태아혈청 또는 미생물 유래 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 다른 실험군에 비하여 약 80%의 높은 생존율을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 완만 동결법이 아닌 유리화 동결법에 의하여 동결시킨 세포를 해동시킨 다음, 제대 유래 줄기세포의 생존율을 확인하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
그 결과, 식물유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 본 발명의 동결보존제의 경우 생존율이 92% 이상으로 우태아혈청 또는 미생물 유래의 인간 혈청 알부민을 포함하는 다른 동결보존제보다 더 높은 생존율을 나타내는 결과를 확인하였다(도 8).
상기와 같은 결과는, 본 발명의 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 동결보존용 조성물을 사용하는 경우, 동물유래 인자의 사용 없이도 제대 유래 간엽줄기세포를 냉동보존할 수 있으므로 안전적일 뿐만 아니라, 종래에 사용되던 우태아혈청 또는 미생물 유래의 재조합 인간혈청알부민을 사용하는 경우보다 더욱 안정적으로 보존할 수 있음을 시사하는 것이다.
아울러, 상기 실시예 6의 결과 및 본 결과를 종합하여볼 때, 본 발명의 식물 유래 인간 혈청 알부민 단백질, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 조성물은 줄기세포의 기원에 관계없이 줄기세포의 냉동보존에 있어 무이종성(Xeno-Free) 및 무동물성(Animal-Free) 상태로 줄기세포를 안전적 및 안정적으로 장기간 냉동보존할 수 있음을 시사한다.
실시예 8: 인간 포피 유래 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast)의 냉동보존에 미치는 식물유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물의 효과 확인
본 발명의 조성물에 포함된 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물이 인간 포피 유래 섬유아세포의 냉/해동에 의한 손상에 미치는 영향을 조사하기 위해 상기 실시예 3의 완만 동결 방법을 통해 냉동된 다음, 해동 처리된 인간 포피 유래 섬유아세포를 프로피디움 아이오다이드 용액(Propidium Iodide solution; Sigma, USA)으로 염색하여 살아 있는 세포 수를 C-Chip Disposable Hemocytometer(Digital Bio., Korea)와 세포계수기(Adam cell counter; Digital Bio., Korea)를 사용하여 측정한 다음, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 식물유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 본 발명의 동결보존제를 사용하여 동결보존하는 경우 해동하였을 때 인간 포피 유래 섬유아세포가 우태아혈청 또는 미생물 유래 인간 혈청 알부민 단백질을 포함하는 다른 실험군에 비하여 약 93.8%의 가장 높은 생존율을 나타내었다.
이러한 결과는 본 발명의 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 동결보존용 조성물을 사용하는 경우, 동물 유래 인자의 사용없이도 인간 포피 유래 섬유 아세포와 같은 일차배양세포(Primary cell)을 안전적으로 동결보존할 수 있을 뿐만 아니라, 우태아혈청 또는 미생물 유래 인간 혈청 알부민을 포함하는 동결보존용 조성물에 비하여 더욱 안정적으로 동결보존할 수 있음을 시사하는 결과이다.
실시예 6 및 7의 결과와 본 결과를 종합하면, 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 포함하는 본 발명의 조성물은 줄기세포뿐만 아니라 일차배양세포의 냉동보존에 유용하게 사용될 수 있으며, 순수한 무이종성(Xeno-Free) 및 무동물성(Animal-Free) 상태로 줄기세포 및 일차배양세포를 장기간 냉동보존할 수 있음을 나타낸다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민(Human serum albumin), 지질 및 식물 단백질 가수분해물(Plant protein hydrolysate)을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 또는 일차배양세포(Primary cell)의 동결보존용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 총 조성물 100 중량부에 대하여 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민 10 중량부 내지 40 중량부, 지질 0.1 중량부 내지 1 중량부 및 식물 단백질 가수분해물 1 중량부 내지 10 중량부를 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 지질은 콜레스테롤을 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민을 총 조성물 100 중량부에 대하여 5 중량부 내지 50 중량부로 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 지질을 총 조성물 100 중량부에 대하여 0.1중량부 내지 5 중량부의 양으로 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 식물 단백질 가수분해물을 총 조성물 100 중량부에 대하여 1 중량부 내지 40 중량부의 양으로 포함하는 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 골수 유래 간엽줄기세포 또는 제대 유래 간엽줄기세포이고, 상기 일차배양세포는 섬유아세포(fibroblast)인 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 동결억제제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 동결억제제는 디메틸설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜, 자당, 카르복시메틸셀룰로스염, 카르복시메틸셀룰로스(CMC), 다당류 및 이당류로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물을 처리한 줄기세포 또는 일차배양세포를 동결시키는 단계를 포함하는, 줄기세포 또는 일차배양세포를 동결보존시키는 방법.
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