KR20120117209A

KR20120117209A - 줄기세포 동결보존액 및 이를 이용하는 줄기세포 동결보존방법

Info

Publication number: KR20120117209A
Application number: KR1020110034820A
Authority: KR
Inventors: 이효종; 안명수
Original assignee: 이효종
Priority date: 2011-04-14
Filing date: 2011-04-14
Publication date: 2012-10-24
Also published as: KR101321144B1

Abstract

본 발명은 줄기세포(stem cell)의 동결보존(cryopreservation)에 사용되는 조성물 및 상기 조성물을 이용하는 줄기세포의 동결보존방법에 관한 것이다. 본 발명의 줄기세포 동결보존액 및 이를 이용한 동결보존방법에 따르면, 줄기세포를 장기간 보존이 가능하고, 해동 후 생존율이 높을 뿐만 아니라, 해동 후 별도의 처리 없이도 바로 생체에 적용할 수 있는 우수한 효과가 있다.

Description

줄기세포 동결보존액 및 이를 이용하는 줄기세포 동결보존방법{CRYOPRESERVATION MEDIUM FOR STEM CELLS AND CRYOPRESERVATION METHOD FOR STEM CELLS USING THE SAME}

본 발명은 줄기세포(stem cell)의 동결보존(cryopreservation)에 사용되는 조성물 및 상기 조성물을 이용하는 줄기세포의 동결보존방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)는 신체 내의 모든 장기와 조직의 근간이 되는 세포로서 자기 재생이 가능하고, 적절한 환경 아래 각종 혈구세포와 조직세포뿐만 아니라 특정한 기관이나 조직으로 분화할 수 있는 능력을 지닌 세포이다. 1998년 Dr. Thomson이 처음으로 사람의 배아세포로부터 줄기세포를 분리하는데 성공한 이래, 이 줄기세포를 이용하여 많은 희귀병이나 난치병들을 치료하려는 연구와 시도가 활발하게 일어나고 있고, 특히 재생불량성 빈혈, 암종, 관절염, 뇌졸중, 백혈병, 악성 자가면역성 질환 등에서도 좋은 치료 결과를 보고하고 있으며, 일부 난치병에서는 상용화 단계에 이르고 있다.

줄기세포는 크게 배아줄기세포(embryonic stem cells) 및 성체줄기세포(adult stem cells)로 나눌 수 있다.

배아줄기세포는 배아로부터 줄기세포를 획득하여 이를 여러 가지의 세포로 분화시켜 각종 장기와 조직을 형성시키고자 하나, 아직까지 이의 단계적 발생과 분화하는 기전을 명확히 알고 있지 못하므로 적용에 문제점이 있다. 또한, 배아줄기세포로부터 줄기세포를 획득하는 방법은 다른 조직에서 획득한 줄기세포보다 분화능이 뛰어나서 활용도가 월등하게 높은 장점을 가지는 방법이기는 하지만, 생명윤리적, 정치사회적, 생물학적 규제 면에서 제한적이며 임상에 적용하기에는 재현성 및 부작용 등 아직 풀어야할 과제가 많다.

이에 비하여, 성체줄기세포는 사람과 동물의 태아시기부터 태반, 제대혈, 혈액, 폐, 간, 또는 골수로부터 발생되어 나오는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)로 대표되는 것으로서 골아세포, 근육, 연골, 건, 및 지방조직으로 발전할 수 있는 능력을 가지고 있음이 입증되었고, 이의 분리와 활용에 관하여 많은 연구가 수행되어 왔다. 또한, 이들 중간엽줄기세포는 혈액, 심장근육세포, 간세포 및 신경세포로도 분화가 가능함이 주장되고 있다. 현재까지는 주로 골수나 지방조직으로부터 줄기세포를 확보하는 기술이 개발되어 왔으나, 이 방법은 수술적(침습적)으로 채취하여야 하므로 고통이 수반되며 채취과정이 어려운 문제점이 있다. 한편, 다능성을 가지고 있는 줄기세포는 제대혈로부터도 다량 획득이 가능하다. 제대혈 유래 줄기세포는 재생능력이 우수하여 증식배양이 잘 되며, 제대혈 속의 림프구는 골수나 혈액보다 덜 성숙되어 있어 면역학적 부적합 확률이 낮아 거부반응이나 감염 위험성이 매우 적은 편이어서 골수기증자를 찾지 못한 환자에게 골수이식 대안으로 떠오르고 있다. 또한, 제대혈 이용의 장점은 폐기되는 탯줄에서 중간엽줄기세포와 조혈모세포를 채취하면 되므로 기증자에게 아무런 신체상 고통이 없다는 점이다.

제대혈뿐만 아니라 체지방 등 각종 신체 조직으로부터 분리된 조혈줄기세포, 중간엽줄기세포 및 분화된 줄기세포의 장기보존을 위하여서는 냉동기법의 활용이 필수적이며, 유사시를 대비한 장기보관뿐만 아니라, 제대혈로부터 다량의 줄기세포를 증식하여 확보하고, 필요한 조직 재생을 위한 각종 세포로의 분화 및 치료를 위한 이식 등에서 매우 유용한 것이다. 그러나, 아직까지 채취할 수 있는 제대혈이 한정적이며, 또한 채취된 제대혈에 포함되어 있는 줄기세포의 양이 한정적이다. 그리고, 인체에 무해하며 재현성이 우수한 동결보존 기술의 개발이 매우 요구되는 실정이다.

종전에는 줄기세포를 포함한 각종의 체세포와 수정란, 난자 및 정자와 같은 생식세포, 혈액 등의 냉동보존을 위하여 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 같은 물질이 항동제로 널리 사용되어 왔다. DMSO는 5~20% 범위의 농도로서 사용되어 왔으며, 이는 세포 포면에서 초자화함으로서 세포막과 단백질을 안정화시킨다. 이와 더불어 글리세롤(glycerol), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 하이드록시셀룰로오스(hydroxycellulose), 디사카라이드(disaccharides) 수크로오스(sucrose), 말토오스(maltose), 트레할로오스(trehalose)와 같은 물질이 생존율 향상을 위하여 DMSO와 혼합하여 사용되기도 하였다.

그러나, DMSO는 냉동-융해 후 세포의 생존과 성장을 방해하여 배양액에 혼입되는 것이 바람직하지 않으며, 동결된 줄기세포를 직접 이식하고자 할 경우 생체에 주입되면 세포 독성이 강하여 직접 주입이 회피된다. 그러므로 줄기세포에 독성이 적고 환자의 생체 내에 직접 주입이 가능한 항동제의 개발이 필요하다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 줄기세포를 안전하게 장기간 보존할 수 있으며, 해동후 바로 생체에 적응할 수 있는 동결보존액 및 이를 이용한 중기세포의 동결보존방법을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 PBS(phosphate buffered saline) 용액 중 0.2~0.4M의 수크로오스(sucrose), 40부피% 이상의 에틸렌글리콜(ethylene glycol) 및 10~30부피%의 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)을 포함하는 줄기세포(stem cell) 동결보존액을 제공하는 것을 특징으로 한다.

상기 줄기세포는 성체줄기세포(adult stem cell)인 것이 바람직하다.

상기 성체줄기세포는 골수(bone marrow), 말초혈액, 제대혈 또는 체지방 유래인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 배양된 줄기세포를 원심분리하여 세포침전물을 얻고, 상기 세포침전물에 상기 본 발명의 동결보존액을 첨가한 후, 액체질소탱크에 보관하는 줄기세포 동결보존방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.

상기 방법에 있어서, 세포침전물에 동결보존액을 첨가하기 전, 상기 세포침전물에 40부피% 이상의 에틸렌글리콜(ethylene glycol)을 포함하는 PBS(phosphate buffered saline) 용액을 첨가하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 줄기세포 동결보존액 및 이를 이용한 동결보존방법에 따르면, 줄기세포를 장기간 보존이 가능하고, 해동 후 생존율이 높을 뿐만 아니라, 해동 후 별도의 처리 없이도 바로 생체에 적용할 수 있는 우수한 효과가 있다.

도 1은 제대혈 유래의 단핵세포구로부터 발달된 성체줄기세포를 나타낸 사진이다. A는 제대혈 유래 단핵세포구로부터 발달된 성체줄기세포를 50 배율로 사진 촬영한 것이고, B는 제대혈로부터 분리된 단핵세포구로부터 발달된 성체줄기세포를 PAS 염색하여 50 배율로 사진 촬영한 것이다.
도 2는 제대혈 유래 단핵세포구로부터 발달된 성체줄기세포를 연골세포로 분화시킨 것을 위상차 현미경으로 50 배율로 사진 촬영한 것이다.
도 3은 제대혈 유래 단핵세포구로부터 발달된 성체줄기세포를 배양접시에서 특수배양액으로 배양하여 연골세포로 분화시킨 것을 사프라닌-O(Safranin-O)로 염색하여 위상차 현미경으로 100 배율로 사진 촬영한 것이다. 붉은 색으로 염색된 세포가 연골세포로 분화된 것이다.
도 4는 제대혈 유래 단핵세포구로부터 발달된 성체줄기세포를 배양접시에서 특수배양액으로 배양하여 연골세포로 발달시킨 것을 면역항체반응법으로 염색하여 타입-II 콜라겐(Type-II collagen)의 발현을 형광현미경으로 50 배율로 사진 촬영한 것이다. 녹색으로 염색된 세포가 연골세포로 분화된 것임을 나타내는 것이다.
도 5는 초자화동결법(vitrification)으로 초급속으로 냉동보존된 제대혈 유래 줄기세포를 융해 후, 생존을 확인하기 위하여 트리판 블루(Trypan blue)로 염색하여 위상차현미경으로 100 배율로 사진 촬영한 것이다. 밝고 투명한 세포가 살아있는 세포이며, 어두운 청색으로 염색된 세포가 죽은 세포이다.
도 6은 초자화동결법으로 초급속으로 냉동보존된 사람 제대혈 유래 줄기세포를 융해한 다음 7일간 배양하여 정상으로 발달된 것을 50 배율로 사진 촬영한 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 PBS(phosphate buffered saline) 용액 중 0.2~0.4M의 수크로오스(sucrose), 40부피% 이상의 에틸렌글리콜(ethylene glycol) 및 10~30부피%의 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)을 포함하는 줄기세포(stem cell) 동결보존액을 제공하는 것을 특징으로 한다.

상기 줄기세포는 성체줄기세포(adult stem cell)일 수 있으며, 골수(bone marrow), 말초혈액, 제대혈 또는 체지방 유래일 수 있다.

DMSO 등을 이용한 완만동결(slow freezing)에 비하여 초자화동결(vitrification) 에 의한 급속냉동기법은 생체 세포를 동결보존제에 넣어 초급속으로 동결시킴으로서 세포 내에 얼음 결정의 형성을 방지하여 생존성을 향상시킬 수 있다. 이 기법으로 사람과 동물의 생식세포나 줄기세포의 장기보존에 효과적으로 사용되어 오고 있다. 초자화동결에 의한 급속냉동기법은 완만동결기법에 비하여 다음과 같은 장점이 있어 사람과 동물의 생식세포나 줄기세포의 장기보존에 효과적으로 사용되어 오고 있다.

(1) 세포 손상이 적다.

(2) 안전하고 간편하며 급속도로 냉동보존이 가능하다.

(3) 프로그램화된 냉각장치가 필요하지 않다.

(4) 세포의 생존율이 높다.

(5) 독성이 적어 생체 내 직접 주입이 가능하다.

세포의 동결과정에서 일어나는 세포내 수분의 결빙현상은 세포의 구조 손상의 주요한 요인이다. 근래에는 항동제로 널리 사용되어 오던 DMSO, 글리세롤(glycerol), 에틸렌글리콜(ethylene glycol)과 같은 세포투과성 동결방지제에 수크로오스(sucrose), 말토오스(maltose), 트레할로오스(trehalose) 등과 같은 이탄당 물질이나 덱스트란(dextran), 혈청, 알부민 등의 비투과성 동결방지제를 혼합하여 수정란이나 줄기세포를 장기간 보존하려는 기술이 개발되고 있다. 세포 투과성 동결방지제는 세포 내로 침투하여 세포내 수분량을 감소시켜 동결시 세포 내 빙정형성을 억제하여 세포를 보호하지만, 비투과성 동결방지제는 동결직전 세포 내 수분의 유출을 조장하여 세포 내외의 삼투평형을 초래하여 세포막의 손상을 방지한다.

상기 PBS(phosphate buffered saline) 용액에는 10부피%의 FBS(fetal bovine serum)를 더 포함할 수 있다.

상기 수크로오스는 다양한 생물체에 높은 농도로 발견되며 생물체가 건조되더라도 생존하게 하는 기능을 가지고 있다. 이 물질은 세포가 동결되거나 건조될 때에 안정되게 하는 기능을 가지고 있어서 이를 혼합한 용액은 세포의 초자화를 형성하여 냉동보존이나 건조과정에서 단백질을 보호하며 인지질의 파괴를 방지함으로서 세포막을 보호한다. 수크로오스의 농도가 0.2M 미만인 경우에는 세포의 해동 후 생존율이 급격이 감소하게 되며, 0.4M을 초과하는 경우에는 세포 독성이 나타나는 문제점이 있다.

상기 에틸렌글리콜은 비교적 세포 독성이 적으며, 세포막 내에 빠르게 확산 침투하여 신속하게 평형을 이루는 장점이 있다. 에틸렌글리콜의 함량은 용액 중 40부피% 이상, 바람직하게는 40~60부피%인 것이 바람직하다. 상기 함량이 40부피% 미만인 경우에는 세포의 해동 후 생존율이 급격히 감소하는 문제점이 있으며, 60부피%를 초과하는 경우에는 세포 독성이 나타나는 문제점이 있다.

상기 폴리비닐피롤리돈은 세포 독성이 적고 용해성이 좋으며 낮은 점도를 가지고 있으며 냉동보존제에 의한 거대분자 물질의 침투를 증진시키는 작용을 한다. 또한 줄기세포의 동결과정에서 세포막을 보호하는 작용을 한다. 폴리비닐피롤리돈의 함량은 용액 중 10~30부피%이며, 상기 함량이 10부피% 미만이 경우에는 해동 후 생존율이 급격히 감소하는 문제점이 있고, 30부피%를 초과하는 경우에는 세포 독성이 나타나는 문제점이 있다.

또한, 본 발명은 배양된 줄기세포를 원심분리하여 세포침전물을 얻고, 상기 세포침전물에 본 발명의 상기 동결보존액을 첨가한 후, 액체질소탱크에 보관하는 줄기세포 동결보존방법을 제공한다.

상기 방법은 세포침전물에 동결보존액을 첨가하기 전, 상기 세포침전물에 40부피% 이상의 에틸렌글리콜(ethylene glycol)을 포함하는 PBS(phosphate buffered saline) 용액을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

아래에서는 바람직한 본 발명의 바람직한 구체예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다.

1. 제대혈 유래 단핵세포구의 획득

본 발명에서 전구세포는 골수, 말초혈액, 제대혈, 체지방, 등으로부터 분리 가능하다. 본 발명에서 사용하는 제대혈은 인간을 포함한 포유동물에서 태반과 태아를 연결하는 제대정맥으로부터 채취된 혈액으로 정의되며, 본 발명의 조혈모세포 또는 전구세포 배양 및 증식 방법에서는 인간의 제대혈을 사용하는 것이 바람직하다. 제대혈은 분만 후 태반이 박리되기 전에 채취하며, 제대혈로부터 단핵세포를 분리하기 위해서는 피콜-하이팩 밀도구배 분리법(Ficoll-Hypaque density gradient method)과 같은 공지의 방법을 사용할 수 있다.

구체적으로, 제대혈을 인산염 완충용액(phosphate buffered saline, PBS)과 혼합하여 희석한 후, 희석된 제대혈과 동량의 피콜-하이팩 용액(Ficoll-Hypaque, 밀도; 1.077 g/㎖)에 중첩시킨다. 이를 원심분리하여 적혈구층, 단핵세포층 및 혈청층을 분리한다. 파스퇴르 피펫(pasteur pipette) 등을 이용하여 단핵세포층만을 새로운 튜브로 옮기고, PBS 등으로 세척하여 단핵세포층 채취시 혼입된 피콜-하이팩 용액이나 오염된 혈소판을 제거한다. 이와 같이 분리된 단핵세포는 다분화능 전구/줄기세포의 분리 및 배양에 바로 이용하거나 초저온 냉동시켜 장기간 보관 후 사용할 수 있다.

2. 체지방 유래 단핵세포구의 획득

체지방조직은 항생제가 포함된 PBS 용액으로 잘 세척하고 0.075% collagenase 로 15 분간 처리한 다음 glucose 및 10% FBS가 함유된 DMEM 용액으로 중화시킨다. 원심분리로 세포들을 획득하여 배양에 사용한다.

3. 전구세포의 배양 및 증식 확인

제대혈과 체지방으로부터 분리 배양된 단핵세포구를 10% FBS, L-glutamine 및 antibiotics가 첨가된 low-glucose DMEM 배양액으로 37℃에서 5% CO₂ 배양조건에서 배양으로 증식시킨다. 이틀이 지난 후 배양용기 바닥에 붙지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, 배지를 2~3일마다 교체하면서 배양하여 전구세포를 수득한다.

4. 단핵세포구로부터 중간엽줄기세포의 배양

단핵세포구를 10% FBS, L-glutamine 및 antibiotics가 첨가된 줄기세포 배양액으로 37℃에서 5% CO₂ 배양조건에서 배양으로 증식시킨다. 배지를 일주일에 2회 이상 교체하면서 배양하여 전구세포를 수득한다. 이 배양된 세포들은 위상차현미경으로 발달과 형태학적 특성을 확인한 다음, PAS 염색으로 줄기세포임을 확인한다.

5. 줄기세포의 확인

발달된 세포가 줄기세포임을 확인하기 위하여 Periodic acid-Schiff's staining system(Sigma)을 이용하여 염색을 실시한다. 먼저, dish에서 media를 깨끗이 제거하고 공기 중에서 건조시킨 다음 formaline-ethanol fixative solution (formaline을 ethanol에 10%로 희석함)으로 1분간 고정한 후 증류수로 수회 수세하여 고정액을 제거한다. 고정 후, periodic acid solution으로 실온에서 5분간 반응시킨 후 증류수로 수세한다. 다음 Schiff's reagent로 실온에서 15분간 반응시켰고 증류수로 수세한다. 대조염색은 hematoxylin solution으로 90초간 실시하였고 증류수로 수세 한 후 dish를 공기 중에서 완전히 건조시킨다.

증식된 세포의 갯수 및 유형은 유동 세포측정, 세포 분류, 면역세포화학(예를 들어, 조직 특이성 또는 세포-표지 특이적 항체로 염색시킴), 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting, FACS), 자기 활성화 세포 분류(magnetic activated cell sorting, MACS)와 같은 표준 세포 검출 기술을 사용하는 형태 및 세포의 표면 표지에서의 변화를 측정하거나, 광학 현미경 또는 공초점(confocal) 현미경을 사용하여 세포의 형태를 검사하거나, 또는 PCR 및 유전자 발현 프로파일링(profiling)과 같이 당해 분야에 잘 공지된 기술을 사용하여 유전자 발현에서의 변화를 측정함으로써 쉽게 모니터링 될 수 있다.

6. 줄기세포의 분화과정에 대한 세포화학적 관찰

분화가 진행되는 중간엽줄기세포를 기간별로 조직을 채취하여 위상차현미경(phase contrast microscope)으로 형태학적 조사를 실시하고, Safranin-O 및 type II collagen 을 immunostaining 하여 chondroblast 생성 특이 물질의 발현을 확인한다.

7. Safranin-O 염색에 의한 분화 확인

배지를 깨끗이 제거하고 공기 중에서 건조시킨 다음 formaline-ethanol fixative solution (formaline을 ethanol에 10%로 희석함)으로 1분간 고정한 후 증류수로 수세하여 고정액을 제거한다. 고정된 세포는 0.1% safranin-O solution으로 1분간 염색하였고 증류수로 수세한 다음 공기 중에서 자연 건조시킨다.

8. 면역세포화학염색(Immunocytochemical staining)에 의한 분화 확인

배지를 깨끗이 제거하고 공기 중에서 자연 건조한다. formaline-ethanol fixative solution (formaline을 ethanol에 10%로 희석함)으로 1분간 고정한 후 증류수로 수회 수세하여 고정액을 완전히 제거한다. 1% normal goat serum (in PBS)으로 1시간 동안 실온에서 blocking을 실시한다. 1차 항체인 Human-collagen type II (Millipore)를 1% normal goat serum에 1:20 희석배율로 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨다. PBS로 5분간 2회 수세한다. 2차 항체인 FITC-conjugated anti-rabbit IgG는 PBS에 1:100 희석배율로 희석하여 실온 상태인 암소에서 2시간 동안 반응시킨다. 다음 PBS로 5분간 3회 수세하여 결합하지 않은 2차 항체는 제거하였고 형광현미경에서 관찰하여 확인한다.

9. DMSO를 이용한 줄기세포의 완만냉동법

분리 배양한 줄기세포를 10% DMSO가 함유된 DMEM 용액에 줄기세포를 1 x 10⁵cells/㎖ 농도로 1 ㎖ 씩 cryotube 에 담은 다음 freezing chamber ( Nalgene Cryo freezing container)에 넣고 -80℃ freezer 에 넣어 분당 1℃씩 냉각시켜 냉동시킨다. 다음 날 cryotube 를 꺼내어 액체질소탱크에 이동 보관시킨다. 동결보존된 줄기세포의 해동은 cryovial 용기로부터 꺼내어 37℃ 수조에서 녹힌 다음, 이를 DMEM 배양액에 넣고 500 x g에서 5분간 2번 원심분리하여 냉동제를 세척한다. 줄기세포 수를 혈구계산기로 계산한 다음 Keratinocyte 배양액에 1 x 10⁵cells/㎖ 로 60 mm dish에 접종하고 5% CO₂ 배양기에 넣어 배양한다.

10. 초자화동결(vitrification) 방법에 의한 줄기세포의 급속냉동법

1) 완충용액의 준비: 우태아 혈청이 20% 함유된 DPBS 용액에 에틸렌 글리콜을 20% 혼합하고 멸균 여과시킨다.

2) 초자화동결용액의 준비: 우태아 혈청이 20% 함유된 DPBS 용액에 에틸렌글리콜 40%, 폴리바이닐피로리돈 20% 및 슈크로스 0.3 mol을 혼합하고 멸균 여과시킨다.

3) 분리배양한 줄기세포를 conical tube 에 넣고 원심분리하여(400 x g, 5min) 세포 침전물 약 10 ul 만 남기고 상층액을 버린다.

4) 완충용액 50 ㎕를 넣고 혼합하고 5 분간 정치한다

5) 초자화동결용액 500 ㎕를 넣고 40 초간 혼합한다.

6) 즉시 번호를 매긴 cryobial 에 옮겨 담은 다음 즉시 액체질소 통에 넣어 보관한다.

11. 동결된 줄기세포의 해동

동결보존된 줄기세포의 해동은 액체질소통에 보존된 cryovial 용기로부터 꺼내어 37 ℃ 수조에서 녹힌 다음, 이를 0.5 M sucrose /DPBS+20% FBS 배양액 4.5 ㎖을 넣고 혼합시킨 다음 동량(5 ㎖)의 DPBS+20% FBS 를 넣어 혼합시키고 (0.25 M sucrose/DPBS+FBS) 400 x g에서 5 분간 원심분리하여 상층액을 버린다.

12. 동결된 줄기세포의 해동 후 생존율 확인

줄기세포 수를 혈구계산기로 계산한 다음, 줄기세포 배양액에 1 x 10⁵/㎖ 의 세포 밀도로 배양접시에 접종하고 5% CO₂ 배양기에 넣어 37℃에 배양하여 생존율과 증식을 확인한다. 줄기세포의 냉동보존 후 생존율은 Trypan blue 염색법으로 확인한다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

[ 실시예 ]

1. 제대혈 및 체지방 유래 줄기세포의 분리 배양과 확인

제대혈은 위원회지침서(IRB)에 따라 대학병원에서 수집한다. 혈액은 시트르산-인산-덱스트로즈 항응혈제 (citrate-phosphate-dextrose anticoagulant, CPDA)가 포함되어 있는 250 ㎖ 표준혈액수집백에 수집되었다.

냉동 보관되어 있던 제대혈을 37℃ 항온조에 놓어 천천히 흔들면서 해동시킨 후 50 ㎖ 튜브로 옮겨, 400 x g, 10 min의 조건하에서 원심 분리한다. 원심분리 후 침천물로부터 적혈구를 제거하기 위하여 적혈구 용해완충용액을 이용하여 적혈구를 용혈 시킨 후 위와 동일한 조건으로 다시 한 번 원심분리를 실시한다. 최종 침전물을 단핵세포구로 실험에 이용한다.

Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation 방법으로 제대혈로부터 분리 배양된 단핵세포구를 10% FBS, L-glutamine 및 antibiotics가 첨가된 low-glucose DMEM 배양액으로 37℃ 5% CO₂ 배양조건에서 배양으로 증식시킨다. 이틀이 지난 후 디쉬 바닥에 붙지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, 배지를 2~3일마다 교체하면서 배양하여 전구세포를 수득한다. 이 배양된 세포들은 phase contrast microscope로 발달과 형태학적 특징을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 중간엽줄기세포의 모양은 방추형으로 가늘고 길게 뻗은 전형적인 모양으로 관찰되었다(도 1의 A). 또한, 중간엽줄기세포에서 PAS염색을 실시하여 붉은색을 나타내는 PAS 양성반응세포를 확인하였다(도 1의 B).

2. 줄기세포로 부터 연골세포 분화

제대혈로부터 분리된 중간엽줄기세포를 chondrogenic differentiation medium으로 배양하면서 연골세포로 분화를 유도한다. 이들의 colony를 위상차 현미경으로 관찰하여 특이한 연골세포로 분화하는 과정을 관찰하였다(도 2).

3. 줄기세포의 분화과정에 대한 세포화학적 관찰

분화가 진행되는 중간엽줄기세포를 기간별로 조직을 채취하여 위상차현미경으로 형태학적 조사를 실시하고, Safranin-O 염색을 하여 다음과 같은 결과를 얻었다. Phase contrast microscope로 확인한 colony 부위가 Safranin-O 염색으로 붉게 염색된 양성반응을 보여 chondroblast 생성 특이 물질의 나타남을 확인하였다(도 3).

4. 줄기세포의 분화과정에 대한 면역세포화학적 관찰

분화가 진행되는 중간엽줄기세포를 기간별로 조직을 채취하여 phase contrast microscope로 형태학적 조사를 실시하고, type II collagen을 immunocytochemical staining하여 chondroblast 생성 특이 물질의 발현을 확인하였고, 다음과 같은 결과를 얻었다. Type II collagen 단백질이 명확하게 염색됨을 확인한다. Green색의 형광염료로 염색된 부위가 type II collagen이 발현되는 부위로 확인되었다(도 4).

5. DMSO 및 초자화동결법(vitrification)으로 동결보존된 줄기세포의 융해후 생존율과 증식율 비교

분리 배양한 줄기세포를 DMSO를 사용한 완만동결법과 본 발명에서 조성한 동결용액을 사용한 초자화동결법(vitrification)으로 급속냉동 시킨 다음 이들을 융해시키고 줄기세포 수를 혈구계산기로 계산한 다음 Trypan blue 염색법으로 생존율을 확인하였다(도 5).

또한, 융해된 줄기세포를 배양액에 1 x 10⁵/㎖의 세포 밀도로 접종하고 5% CO₂ 배양기에 넣어 37℃에 7일간 배양하여 증식된 줄기세포를 확인하였다(도 6).

줄기세포의 생존율과 증식율을 아래 표 1에 나타내었으며, 표 1 에 나타난 바와 같이 DMSO에 의한 완만동결법에서는 81.7% 의 생존율을 보였으며, 초자화동결법(vitrification)에 의한 급속냉동법에서 동결용액 A는 82.5%의 생존율을 보였고, 동결용액 B는 83.3%의 생존율을, 동결용액 C는 80.7%의 생존율을, 그리고 동결용액 D는 84.5%의 생존율을 보였다. 초자화동결법(vitrification)에 의한 급속냉동법은 완만동결법과 상응하는 우수한 생존율을 보여 활용이 가능할 것으로 본다.

또한, 액체질소에서 동결보존된 후 융해된 세포를 low glucose DMEM 배양액에서 7일간 배양하여 증식능력을 확인한 결과, 냉동하지 않았던 줄기세포에서는 3.49 배의 증식율을 보인 반면, DMSO에 의한 완만동결법에서는 3.43 배로 증식이 되었고, 초자화동결법(vitrification)에 의한 초급속냉동법에서는 동결용액 A는 3.41 배의 증식율을 보였고, 동결용액 B는 4.81 배의, 동결용액 C는 3.38 배의, 그리고 동결용액 D는 3.62 배 증식율을 보여 냉동하지 않은 대조군에서의 3.49 배의 증식율에 뒤떨어지지 않아 냉동 후에도 발달이 잘 일어나는 것이 관찰되었다.

Moon 등(Successful vitrification of human amnion-derived mesenchymal stem cells. Human Reproduction. 2008; 23(8): 1760~70)이 조사한 바에 의하면, 냉동하지 않은 양막 유래 줄기세포의 doubling time은 3.3 일이었고, 냉동보존 후 융해한 다음 3~14 대까지 계대 배양하였을 때에 doubling time 이 3.4 일이라고 보고한 것보다 높은 발달 성적을 나타내고 있다고 사료된다. 초자화동결(vitrification)에 의한 급속냉동기법에 관하여는 앞으로 더 기술을 발전시키면 생존율을 더욱 향상시킬 수 있을 것으로 본다.

냉동 방법	동결 용액	융해 후 생존율(%)	7일배양후 증식 배율
완만동결법	DMSO 용액	81.7	3.43
초급속동결법	초자화동결용액 A	82.5	3.41
초급속동결법	초자화동결용액 B	83.3	4.81
초급속동결법	초자화동결용액 C	80.7	3.38
초급속동결법	초자화동결용액 D	84.5	3.62
대조군	냉동하지 않음	-	3.49

주)

DMSO 용액: DMEM 용액에 DMSO가 10% 함유된 용액

초자화동결용액 A: PBS 용액에 에틸렌글리콜 40%, 폴리비닐피롤리돈 10% 및 수크로오스 0.3M로 조성된 용액

초자화동결용액 B: PBS 용액에 에틸렌글리콜 40%, 폴리비닐피롤리돈 20% 및 수크로오스 0.3M로 조성된 용액

초자화동결용액 C: PBS 용액에 에틸렌글리콜 40%, 폴리비닐피롤리돈 30% 및 수크로오스 0.3M로 조성된 용액

초자화동결용액 D: PBS 용액에 에틸렌글리콜 40%, 폴리비닐피롤리돈 20% 및 수크로오스 0.4M로 조성된 용액

8. 초자화동결법(vitrification)으로 동결보존된 줄기세포의 융해후 줄기세포 특이 표지인자 발현 확인

동결 후 융해후 줄기세포로서의 기능을 유지하는 지 확인하기 위하여 간엽줄기세포에서 PAS염색을 실시하여 붉은색을 나타내는 PAS 양성반응세포를 확인하였다. 또한 형광 활성

화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting, FACS) 기술을 사용하여 줄기세포 특이 표지인자의 발현을 확인하였던 바, CD29, CD44, CD90 및 CD105 에 양성 반응을 보였고, CD14, CD31, CD34, CD45, CD133 및 HLA-DR 인자에 관하여는 음성반응을 보였다.

본 발명에 따르면, 다음과 같은 분야에서의 이용이 가능하다.

1. 본 발명의 제대혈로부터 줄기세포 전구세포를 분리하고 이들로부터 발달한 줄기세포를 안전하게 장기간 보존할 수 있는 냉동기법을 개발함으로서 줄기세포에 관한 연구 및 이를 이용한 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

2. 줄기세포는 계대배양으로 증식을 시킬 수 있으나, 장기간 배양하면 특성의 변화와 오염 및 발달 능력의 저하 등으로 인하여 필요로 하는 시기에 적합한 줄기세포를 원활하게 공급하는데 장애가 된다. 이를 개선하기 위하여 줄기세포의 장기간 보존을 위한 냉동기법이 유용하다.

3. 본 냉동보존기법은 초자화동결용액(vitrification solution)을 이용한 초급속동결기법으로서 세포의 냉동보존성이 우수하고 효율적이어서 줄기세포의 안정적이며 장기간 보존에 활용할 수 있을 것으로 본다.

4. 본 기술을 활용하여 연골조직 재생을 위한 아가로오스(agarose), 알기닌(alginine), 히알루론산(hyaluronic acid), 젤라틴(gelatin), 피브린 글루(fibrin glue), 세포외 연골 기질(acellular cartilage matrix), 합성폴리머(synthetic polymers) 등과 혼합하여 생활성 스캐폴더(bioactive scaffold)를 제조하는 기술에 활용될 수 있다.

5. 본 초자화동결법에 사용한 냉동액의 성분이 줄기세포에 세포독성이 적고 인체에 무해하여 직접 이식이 가능한 장점이 있다.

6. 성체줄기세포에 관한 연구는 급속도로 발전하고 있으며, 치료에 적용하는 단계에 이르렀으므로 국제적으로 경쟁력을 확보하고 해외에 특허료를 지불하지 않기 위하여서는 세포의 보존 방법에 대한 연구가 필요하다.

7. 제대혈로부터 간엽줄기세로를 분리하고 분화시키는 기술을 개발함으로서 사람과 동물의 희귀병과 난치병의 치료기술을 발전시키는데 활용될 것이다.

8. 본 기술은 대체장기 생산과 이식기술의 개발에 유용하게 활용될 수 있다.

9. 현재 인공관절 개발에 사용되고 있는 대체물질(collagen/GAG matrix, synthetic biodegradable matrix) 등과 병용되고 있는 피브로블라스트(fibroblast)보다는 줄기세포를 사용하면 인공관절 제조기술이 더욱 향상될 수 있을 것으로 기대된다.

10. 제대혈 유래 줄기세포 분리와 분화기술이 확립되고 이러한 기술로 생산된 특수한 줄기세포를 장기간 효율적으로 보관함으로서 안정적이며 원활한 공급이 가능하고, 이를 복제기술과 융합시켜 인간질환 모델동물의 생산, 희귀하거나 멸종위기의 동물 보존, 세포 치료, 대체장기 생산 등에 있어서 아주 효율적이며 유용한 기술로 발전시킬 수 있다.

Claims

PBS(phosphate buffered saline) 용액 중 0.2~0.4M의 수크로오스(sucrose), 40부피% 이상의 에틸렌글리콜(ethylene glycol) 및 10~30부피%의 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)을 포함하는 줄기세포(stem cell) 동결보존액.
제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 성체줄기세포(adult stem cell)인 것을 특징으로 하는 줄기세포 동결보존액.
제 2항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 골수(bone marrow), 말초혈액, 제대혈 또는 체지방 유래인 것을 특징으로 하는 줄기세포 동결보존액.
배양된 줄기세포를 원심분리하여 세포침전물을 얻고, 상기 세포침전물에 제 1항의 동결보존액을 첨가한 후, 액체질소탱크에 보관하는 줄기세포 동결보존방법.
제 4항에 있어서, 세포침전물에 동결보존액을 첨가하기 전, 상기 세포침전물에 40부피% 이상의 에틸렌글리콜(ethylene glycol)을 포함하는 PBS(phosphate buffered saline) 용액을 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 동결보존방법.
제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 줄기세포는 성체줄기세포(adult stem cell)인 것을 특징으로 하는 줄기세포 동결보존방법.
제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 골수(bone marrow), 말초혈액, 제대혈 또는 체지방 유래인 것을 특징으로 하는 줄기세포 동결보존방법.