KR20140059990A - 조혈줄기세포의 냉동보존용 배지 및 이를 이용한 조혈줄기세포의 냉동보존방법 - Google Patents

조혈줄기세포의 냉동보존용 배지 및 이를 이용한 조혈줄기세포의 냉동보존방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특정 얼음-결합 단백질(ice-binding protein)을 함유함으로써 해동 후 세포의 생존율을 증가시킬 수 있는 조혈줄기세포의 냉동보존용 배지 및 이를 이용한 조혈줄기세포의 냉동보존방법을 제공한다.

Description

조혈줄기세포의 냉동보존용 배지 및 이를 이용한 조혈줄기세포의 냉동보존방법{Cryopreservation medium for hematopoietic stem cells and cryopreservation method for hematopoietic stem cells using the same}
본 발명은 조혈줄기세포의 냉동보존용 배지 및 이를 이용한 간엽줄기세포의 냉동보존방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 특정 얼음-결합 단백질(ice-binding protein)을 함유함으로써 해동 후 세포의 생존율을 증가시킬 수 있는 조혈줄기세포의 냉동보존용 배지 및 이를 이용한 조혈줄기세포의 냉동보존방법에 관한 것이다.
줄기세포를 이용한 난치성 질환의 치료에 대한 가능성으로 많은 임상적 시도가 이루어지고 있다. 줄기세포 중, 조혈줄기세포(hematopoietic stem cells)는 골수, 제대혈, 말초혈액 등으로부터 유래된 줄기세포를 말한다. 조혈줄기세포는 기존의 골수이식을 대체할 수 있는 세포치료제의 원료로서 많은 연구가 수행되고 있다.
한편, 조혈줄기세포는 분리 직후에 확보할 수 있는 순도 높은 세포의 수가 제한적이다. 특히, 생체로부터 분리된 순수한 조혈줄기세포를 기능의 저하 없이 적절한 조건에서 보관하는 것은 매우 중요하다. 부적절한 보관에 따른 세포 고유능의 변질은 직접적인 치료 효능이나 고유 분화능에 영향을 주어 원활한 치료제 제조를 곤란하게 하거나, 세포 기능 저하에 따른 부작용 등을 야기할 수 있다.
줄기세포 등을 포함한 세포의 보관을 위해서는 냉동보존(cryopreservation) 방법이 통상적으로 이용된다. 세포는 기원, 채취 조직 및 체내 미세환경에 따라 생리학적 특성이 다르기 때문에, 각각의 세포를 냉동보존 할 때에도 대상 세포에 적합한 냉동보존방법이 적용되어야 한다. 특히 줄기세포의 경우는 고유의 특이적 분열 능력과 분화능력을 유지하기 위해 최적화된 냉동보존 조건이 요구되며, 높은 효율, 예를 들어 높은 생존율을 확보할 수 있는 보존액을 사용하는 것이 필수적이다.
줄기세포의 냉동보존용 배지는 세포배양용 배지 중에 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등과 같은 동결보존제(cryoprotectant)를 포함하며, 줄기세포의 특성에 따라 혈청, 혈장(덱스트란과 같은 대용혈장), 이당류(sucrose, trehalose 등)나 PVP(Polyvinylpyrrolidone) 등 독성과 자극성을 감소시키는 물질 등을 추가로 포함하기도 한다. 현재, 조혈줄기세포의 냉동보존을 위해서는 디메틸 설폭사이드 등의 동결보존제 약 10 w/v% 및 덱스트란 등의 혈장 약 10 w/v%를 함유한 냉동보존용 배지가 사용되고 있다.
본 발명자들은 줄기세포, 특히 조혈줄기세포의 냉동보존에 있어서 높은 냉동보존 효율을 달성할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 최근 학계에 보고되고 있는 얼음-결합 단백질(ice-binding proteins, IBPs)의 활용가능성을 주목하였으며, 특정 얼음-결합 단백질을 사용할 경우 높은 냉동보존 효율을 달성할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 상기 특정 얼음-결합 단백질을 포함하는 조혈줄기세포의 냉동보존용 배지를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 배지를 이용한 조혈줄기세포의 냉동보존방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질; 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 동결보존제; 및 덱스트란을 포함하는 조혈줄기세포의 냉동보존용 배지가 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질; 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 동결보존제; 및 덱스트란을 포함하는 배지 중에 조혈줄기세포를 가하는 단계, 및 얻어진 배양액을 냉동시키는 단계를 포함하는 조혈줄기세포의 냉동보존방법이 제공된다.
본 발명에 의해, 특정 얼음-결합 단백질 즉, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질을 사용할 경우 높은 냉동보존 효율, 즉, 해동 후 높은 세포 생존율을 달성할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따른 냉동보존용 배지 및 이를 이용한 냉동보존방법은 조혈줄기세포를 높은 효율로 얻는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 서열번호 1의 단백질(LeIBP)을 이용한 냉동보존시 냉동보관 효율을 평가한 결과이다 (*, p<0.05).
도 2는 서열번호 1의 단백질(LeIBP)을 포함하는 냉동배지를 사용한 조혈줄기세포의 해동 후 CFU 시험의 결과를 나탄낸다.
도 3은 조혈줄기세포의 냉동배지에 따른 회수율 변화를 측정한 결과이다. 서열번호 1의 단백질(LeIBP)을 첨가한 실험군의 동결 전의 CFU 형성능과 비교시 통계적 유의성은 관찰되지 않으나, 비첨가군에 비해 CFU 형성능이 높아지는 경향을 보여준다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질; 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 동결보존제; 및 덱스트란을 포함하는 조혈줄기세포의 냉동보존용 배지를 제공한다.
상기 조혈줄기세포는 골수 유래의 조혈줄기세포, 제대혈 유래의 조혈줄기세포, 말초혈 유래의 조혈줄기세포 등을 제한 없이 포함한다. 상기 조혈줄기세포의 분리방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질은 루코스포리듐 속 극지 효모 즉, 류코스포디듐 종(Leucosporidium sp .) AY30에서 단리된 단백질로서, 결빙방지 단백질(antifreeze protein)로서의 성질을 갖는다(Lee et al., Cryobiology. 2010. 60: 222-228). 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질은 다른 결빙방지 단백질과 달리 단 하나의 시스테인(cysteine) 아미노산 잔기도 가지고 있지 않은 구조적 특성을 가지고 있다. 본 발명자들은 결빙방지 단백질(혹은 '얼음-결합 단백질'로 칭해진다)의 특성에 주목하여, 조혈줄기세포의 냉동보존에 있어서의 활용가능성을 시험하였다. 특히, 다양한 결빙방지 단백질들을 대상으로 시험한 결과, 종래의 동결보존제 및 혈장을 사용한 경우에 비하여 세포의 생존율(viability)이 더 낮아 부적합하였다. 그러나, 놀랍게도, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질을 사용한 경우에는 특이하게 세포의 생존율을 현저하게 높일 수 있음을 발견하였다. 이는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질의 구조적 특성 및 조혈줄기세포와의 적합성에 기인하는 것으로 추정된다.
본 발명의 조혈줄기세포의 냉동보존용 배지에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질의 농도는 0.0003 내지 0.3 w/v%, 바람직하게는 0.003 내지 0.03 w/v%의 범위일 수 있다. 또한, 상기 동결보존제 및 덱스트란의 농도는 조혈줄기세포의 냉동보존에 통상적으로 사용되는 양으로 사용될 수 있으며, 예를 들어, 각각 약 10 w/v%의 농도로 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질 0.0003 내지 0.3 w/v%; 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 동결보존제 약 10 w/v%; 및 덱스트란 약 10 w/v%를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질 0.003 내지 0.03 w/v%; 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 동결보존제 약 10 w/v%; 및 덱스트란 약 10 w/v%를 포함할 수 있다.
본 발명의 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지는 인산완충식염수(phosphate buffed saline, PBS) 등의 생리학적으로 양립가능한 완충액(physiologically compatible buffer solution)이나 혹은 세포 배양에 통상적으로 사용되는 기본 배지(basal medium)일 수 있다. 상기 기본 배지는 예를 들어, DPBS, HBSS, DMEM, IMDM, RPMI, MEM 등의 배지를 제한 없이 포함한다. 일 구현예에서, 상기 기본 배지는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 일 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질; 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 동결보존제; 및 덱스트란을 포함하는 배지 중에 조혈줄기세포를 가하는 단계, 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 배양액을 냉동시키는 단계를 포함하는 조혈줄기세포의 냉동보존방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조혈줄기세포의 냉동보존방법에 있어서, 단계(a)에 사용되는 배지는 상기에서 설명한 바와 같다. 단계(a)에서 배지에 가해지는 조혈줄기세포의 수는 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 배지 1 ml 당 1 x 105 내지 2 x 107 cells의 범위일 수 있다.
단계(b)의 상기 냉동은 냉동보존 분야에서 사용되는 통상의 동결방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 냉동은 수작업(manual method), 자동동결기 사용법(automatic controlled rate freezing method), 급/완속 냉동법(rapid/slow freezing method), 유리화동결법(vitrification method) 등을 사용하여 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
하기 시험에서 사용된 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질은 한국극지연구소로부터 공급받았다.
1. 시험방법
(1) 조혈줄기세포의 분리 및 배양
제대혈에서 유래한 조혈줄기세포는 출산전 연구동의 의사를 밝힌 건강한 지원자의 분만 시 태반 반출전 제대정맥에서 채취하였다. CPDA (citrate/phosphate/dextrose/adenine) 항응고제가 들어있는 전용이송 용기를 이용하여 실험실로 시료를 옮겼으며 Rubinstein 등에 의한 방법 (Rubinstein et al., 1995)을 이용하여 조혈줄기세포를 분리하였다. 조혈줄기세포의 계수를 위해서 세포층을 DPBS에 부유시킨 후 hoechst 염색, trypanblue 염색, CD34 표지 염색을 위해 세포를 나누고 현미경하에서 관찰하였다.
(2) 줄기세포의 냉동 및 해동 과정
DMEM에 서열번호 1의 단백질을 소정의 농도로 가하고, 동결보존제(디메틸 설폭사이드) 및 덱스트란을 소정의 농도로 가하여 냉동보존용 배지를 준비하였다. 얻어진 냉동보존용 배지를 1 ml씩 냉동바이알에 넣고, 냉동바이알 당 1 X 106 cells의 조혈줄기세포를 가하여 부유시켰다. 얻어진 혼합물을 자동동결기(Ice cube, SY Lab.)를 사용하여 동결시켰다. 동결 후, 냉동바이알은 분석할 때까지 액화질소 탱크에 보관하였다.
냉동바이알의 해동은 37℃ 온수조를 이용하여 수행하였으며, 해동된 냉동바이알은 2% 우태아혈청(FBS)가 함유된 DPBS로 신속하게 세척하였다. 상기 세척은 3회 수행하였으며, 300 x g 10분간 원심분리 후 새로운 세척액에 세포층을 부유시켜 세포계수와 분석을 수행하였다.
(3) 해동 후 세포의 생존율
10 w/v% DMSO 및 10 w/v% 덱스트란을 사용한 군을 제1군(대조군); 10 w/v% DMSO 및 10 w/v% 덱스트란에 서열번호 1의 단백질을 0.003 w/v% 또는 0.03 w/v% 함유하는 시험군(각각, 제2군 및 제3군)의 냉동보존 수율의 비교를 위해 생존율을 평가하였다. 모든 실험군은 자동동결기를 이용하여 동결하고 액화질소통에 보관하였다. 해동 시험은 7일 이상 액화질소통에 보관된 후에 수행하였으며, 해동 직후 세포계수를 통해 실험군별 세포생존율을 확인하였다.
(4) 해동 후 줄기세포의 분화능 조사
조혈줄기세포의 해동 후 분화능을 colony-forming unit (CFU) 방법을 이용하여 수행하였다. Hoechst 염색 후 단핵세포총수 계수 결과를 기준으로 일정 세포를 취하여 메틸 셀룰로오즈를 이용한 CFU　배지(Miltenyi Biotec)에 혼합한 후, 비-코팅된 웰 플레이트에 접종하여 고르게 펼쳤다. CO2 배양기에서 2주간 배양한 후에 도립현미경하에서 분화 종류별 콜로니를 구분하고(CFU-erythrocyte, burst forming unit-erythrocyte, CFU-granulocyte, CFU-macrophage, CFU-granulocyte 및 macrophage, CFU-granulocyte, erythrocyte, monocyte, and megakaryocyte), 계수하였다. 분화 후 콜로니를 구분하고 계수하는 기준은 Miltenyi Biotec 의 제조사 지침에 따라 수행하였다.
(5) 통계 분석
냉동 배지 조성별 증식효과를 확인하기 위해 실험 결과는 각 실험별 대조군 결과와의 유의성 분석을 수행하였다. 분석방법은 Paired t' test를 수행하였으며 P값이 0.05 보다 낮은 경우를 통계학적으로 유의하게 분리하고 결과에 별표(*)로 표시하였다.
2. 시험결과 및 고찰
10 w/v% DMSO 및 10 w/v% 덱스트란을 사용한 제1군(대조군); 10 w/v% DMSO 및 10 w/v% 덱스트란에 서열번호 1의 단백질을 0.003 w/v% 또는 0.03 w/v% 함유하는 시험군(각각, 제2군 및 제3군)에 대하여 해동 후 세포 생존율(cell viability)을 측정하였으며, 그 결과는 도 1과 같다. 도 1의 결과는 대조군의 생존율을 100%로 하여, 환산한 결과이다. 도 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, DMSO와 덱스트란 만을 처리한 경우보다 서열번호 1의 단백질을 처리했을 경우 통계적으로 유의하게 증가된 조혈줄기세포의 생존율을 확인할 수 있다. 이는 서열번호 1의 단백질에 의해 안정성 있는 세포보관이 가능함을 보여준다.
서열번호 1의 단백질을 사용하여 냉동보존된 조혈줄기세포가 냉동 보관 후에 조혈분화능력에 차이를 보이는가를 확인하기 위해 해동 후 CFU assay를 수행하였다 (도 2). 분석을 위해 조혈분화능 검정용 colony 중 BFU-E, CFU-G, CFU-M, CFU-GM을 분화배양 종료 후 계수하여 총콜로니수를 확인하여 대조군과 비교하였다(도 3). 콜로니 형성의 속도 및 계수 결과 비동결 조혈줄기세포와 비교시 유사한 조혈분화능을 확인하였으며, 서열번호 1의 단백질 농도가 상승할 때 CFU 형성에 대한 회복능이 증가하는 경향이 관찰되었으나 통계적 유의성은 없었다.
3. 결론
서열번호 1의 단백질을 냉동보존에 사용할 경우, 해동 후 조혈줄기세포의 생존율을 현저하게 높일 수 있다는 것이 본 연구를 통해 밝혀졌다. 즉, 서열번호 1의 단백질을 포함하는 냉동보존용 배지를 이용할 경우, 세포의 분화능에 대한 영향없이, 조혈줄기세포의 고효율의 냉동보관이 가능하다.
<110> HURIMBIOCELL CO. LTD. Korea Institute of Ocean Science and Technology <120> Cryopreservation medium for hematopoietic stem cells and cryopreservation method for hematopoietic stem cells using the same <130> PN0606 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 261 <212> PRT <213> Leucosporidium sp. AY30 <400> 1 Met Ser Leu Leu Ser Ile Ile Thr Ile Gly Leu Ala Gly Leu Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Asn Gly Gln Arg Asp Leu Ser Val Glu Leu Gly Val Ala Ser 20 25 30 Asn Phe Ala Ile Leu Ala Lys Ala Gly Ile Ser Ser Val Pro Asp Ser 35 40 45 Ala Ile Leu Gly Asp Ile Gly Val Ser Pro Ala Ala Ala Thr Tyr Ile 50 55 60 Thr Gly Phe Gly Leu Thr Gln Asp Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Thr Ser 65 70 75 80 Pro Gln Val Thr Gly Leu Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Ser Thr Pro Thr 85 90 95 Pro Asn Tyr Leu Ala Ala Ala Val Ala Asn Ala Glu Thr Ala Tyr Asn 100 105 110 Gln Ala Ala Gly Phe Val Asp Pro Asp Phe Leu Glu Leu Gly Ala Gly 115 120 125 Glu Leu Arg Asp Gln Thr Leu Val Pro Gly Leu Tyr Lys Trp Thr Ser 130 135 140 Ser Val Ser Val Pro Thr Asp Leu Thr Phe Glu Gly Asn Gly Asp Ala 145 150 155 160 Thr Trp Val Phe Gln Ile Ala Gly Gly Leu Ser Leu Ala Asp Gly Val 165 170 175 Ala Phe Thr Leu Ala Gly Gly Ala Asn Ser Thr Asn Ile Ala Phe Gln 180 185 190 Val Gly Asp Asp Val Thr Val Gly Lys Gly Ala His Phe Glu Gly Val 195 200 205 Leu Leu Ala Lys Arg Phe Val Thr Leu Gln Thr Gly Ser Ser Leu Asn 210 215 220 Gly Arg Val Leu Ser Gln Thr Glu Val Ala Leu Gln Lys Ala Thr Val 225 230 235 240 Asn Ser Pro Phe Val Pro Ala Pro Glu Val Val Gln Lys Arg Ser Asn 245 250 255 Ala Arg Gln Trp Leu 260

Claims (6)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질; 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 동결보존제; 및 덱스트란을 포함하는 조혈줄기세포의 냉동보존용 배지.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질의 농도가 0.0003 내지 0.3 w/v%인 것을 특징으로 하는 조혈줄기세포의 냉동보존용 배지.
  3. 제2항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질의 농도가 0.003 내지 0.03 w/v%인 것을 특징으로 하는 조혈줄기세포의 냉동보존용 배지.
  4. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질; 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 동결보존제; 및 덱스트란을 포함하는 배지 중에 조혈줄기세포를 가하는 단계, 및 얻어진 배양액을 냉동시키는 단계를 포함하는 조혈줄기세포의 냉동보존방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질의 농도가 0.0003 내지 0.3 w/v%인 것을 특징으로 하는 조혈줄기세포의 냉동보존방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질의 농도가 0.003 내지 0.03 w/v%인 것을 특징으로 하는 조혈줄기세포의 냉동보존방법.
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