RU2663793C2 - Содержащий трегалозу и декстран раствор для трансплантации клеток млекопитающих - Google Patents
Содержащий трегалозу и декстран раствор для трансплантации клеток млекопитающих Download PDFInfo
- Publication number
- RU2663793C2 RU2663793C2 RU2015154110A RU2015154110A RU2663793C2 RU 2663793 C2 RU2663793 C2 RU 2663793C2 RU 2015154110 A RU2015154110 A RU 2015154110A RU 2015154110 A RU2015154110 A RU 2015154110A RU 2663793 C2 RU2663793 C2 RU 2663793C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- cell
- cells
- trehalose
- dextran
- Prior art date
Links
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 137
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 title claims abstract description 136
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 title claims abstract description 132
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 title claims abstract description 126
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 70
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 306
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 242
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 32
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 31
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 19
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000008156 Ringer's lactate solution Substances 0.000 claims description 10
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 7
- 239000012891 Ringer solution Substances 0.000 claims description 6
- KWQANSZTMNRIHA-IBRINFIGSA-N 2-amino-n-[3-hydroxy-2-methyl-6-[[(1s,3s)-3,5,12-trihydroxy-3-(2-hydroxyacetyl)-10-methoxy-6,11-dioxo-2,4-dihydro-1h-tetracen-1-yl]oxy]oxan-4-yl]acetamide Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)C1CC(NC(=O)CN)C(O)C(C)O1 KWQANSZTMNRIHA-IBRINFIGSA-N 0.000 claims description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 91
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 127
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 122
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 98
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 98
- 229940090044 injection Drugs 0.000 description 94
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 31
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 29
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 28
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 25
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 18
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 16
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 14
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 14
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 13
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 13
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 13
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 13
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 12
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 12
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 12
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 12
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 12
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 11
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 11
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 11
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 10
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 10
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 8
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 6
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 229940119744 dextran 40 Drugs 0.000 description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 5
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 4
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 229940093181 glucose injection Drugs 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 trehalose or dextran Chemical class 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 150000003625 trehaloses Chemical class 0.000 description 3
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- FZWBNHMXJMCXLU-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrahydroxy-6-[3,4,5-trihydroxy-6-[[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxyhexanal Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LBLYYCQCTBFVLH-UHFFFAOYSA-M 2-methylbenzenesulfonate Chemical compound CC1=CC=CC=C1S([O-])(=O)=O LBLYYCQCTBFVLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M Glycolate Chemical compound OCC([O-])=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 2
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 125000005210 alkyl ammonium group Chemical group 0.000 description 2
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N alpha-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 2
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 229940119743 dextran 70 Drugs 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 150000004677 hydrates Chemical class 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940080526 mannitol injection Drugs 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000003643 myeloid progenitor cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000002444 unipotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940070710 valerate Drugs 0.000 description 2
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 1
- 239000012117 Alexa Fluor 700 Substances 0.000 description 1
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 102100029722 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100033299 Glia-derived nexin Human genes 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001012447 Homo sapiens Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000997803 Homo sapiens Glia-derived nexin Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- CTEMZTQLPNKNKP-REGJXUDFSA-N Maltosyl trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O1 CTEMZTQLPNKNKP-REGJXUDFSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUZBXMVHVQHCTQ-XFSSMLLMSA-N O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O1 Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O1 GUZBXMVHVQHCTQ-XFSSMLLMSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000026062 Tissue disease Diseases 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-BTLHAWITSA-N alpha,beta-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-BTLHAWITSA-N 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-NCFXGAEVSA-N beta,beta-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-NCFXGAEVSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006721 cell death pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940029030 dendritic cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 108091008800 n-Myc Proteins 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 244000062645 predators Species 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000275 quality assurance Methods 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M salicylate Chemical compound OC1=CC=CC=C1C([O-])=O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960001860 salicylate Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 235000019605 sweet taste sensations Nutrition 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
- A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
- A61K9/008—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy comprising drug dissolved or suspended in liquid propellant for inhalation via a pressurized metered dose inhaler [MDI]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу сохранения клеток млекопитающего в течение длительного периода времени с использованием раствора для трансплантации клеток, содержащего 2,0-6,0% (масс./об.) трегалозы, либо соли указанной трегалозы, и 4,0-7,0% (масс./об.) декстрана, либо соли декстрана. Изобретение позволяет повысить выживаемость клеток млекопитающего при хранении для последующей трансплантации в течение длительного периода времени, по меньшей мере 14 дней. 4 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл., 6 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к способу сохранения клеток млекопитающих в физиологическом водном растворе для трансплантации клеток, содержащем 2,0-6,0% (масс./об.) трегалозы, ее производного, либо соли трегалозы или ее производного (далее в настоящем документе иногда называемых «трегалоза») и 4,0-7,0% (масс./об.) декстрана, его производного, либо соли декстрана или его производного (далее в настоящем документе иногда называемых «декстран») (далее в настоящем документе иногда называемом «настоящий раствор для трансплантации клеток»), настоящему раствору для трансплантации, а также физиологическому водному раствору, содержащему клетки для трансплантации, который содержит клетки млекопитающих, а также трегалозу и декстран (далее в настоящем документе называемому «настоящий раствор, содержащий клетки для трансплантации»).
Уровень техники
В последние годы быстрое развитие исследований стволовых клеток способствовало значительному прогрессу регенеративной медицины, и знание и понимание в этой области стало достоянием не только научного сообщества, но и широкой общественности. Регенеративная медицина с использованием стволовых клеток является областью медицины, занимающейся восстановлением функции клеток и тканей, поврежденных в результате различных заболеваний, за счет использования потенциала самообновления и плюрипотентности стволовых клеток или факторов, секретируемых стволовыми клетками. Трансплантация костного мозга у пациентов, страдающих трудноизлечимыми гематологическими заболеваниями, такими как лейкоз и апластическая анемия, приводит к приживлению гемопоэтических клеток-предшественников в организме этих пациентов, что позволяет сохранять кроветворную способность на протяжении почти всей жизни. В последнее время многие исследователи направили свои усилия на клиническое применение иных стволовых клеток, чем гемопоэтические стволовые клетки, обнаружили стволовые клетки в центральных нервах, периферических нервах, костном мозге, тонком кишечнике и тому подобном, и начали проводить лечение травматических заболеваний и дегенеративных заболеваний тканей путем трансплантации тканевых стволовых клеток (непатентные документы 1-3). С другой стороны, лечение рака иммунными клетками является наиболее передовой областью клеточной медицины, при этом иммунные клетки, атакующие рак, забирают из организма, повышают их эффективность и затем вновь возвращают клетки в организм, и осуществляют терапию с использованием T-клеток, такую как терапия вакциной на основе дендритных клеток, альфа/бета T-клеточная терапия (αβ T-клеточная терапия), гамма/дельта T-клеточная терапия (γδ T-клеточная терапия), CTL терапия и терапия с помощью клеток - естественных киллеров (NK-клеточная терапия).
Когда стволовые клетки или T-клетки, используемые для трансплантационной терапии, сохраняют в течение длительного периода времени, содержание в жидкости не позволяет сохранять достаточную степень выживаемости клеток. Например, сообщают, что хранение охлажденных (при 4°C) человеческих стволовых клеток костного мозга в солевом растворе снижает жизнеспособность клеток до 40% или менее через 48 часов и до 20% или менее через 72 часа (непатентный документ 4). Таким образом, если стволовые клетки для трансплантации или T-клетки для трансплантации сохраняют в течение длительного периода времени, обычно используют низкотемпературную консервацию. Однако жидкость для низкотемпературной консервации, как правило, содержит средство для низкотемпературной консервации, такое как ДМСО или глицерин; следовательно, в случае трансплантации необходимо удалять средство для низкотемпературной консервации перед проведением трансплантационной терапии после размораживания сохраняемых при низкой температуре стволовых клеток или T-клеток, что считается проблематичным из-за трудоемкости процедуры. Жидкость для низкотемпературной консервации, содержащая средство для низкотемпературной консервации, также считается проблематичной, поскольку она приводит к значительному повреждению цитоскелета вследствие кристаллизации воды в процессе замораживания и уменьшает выживаемость клеток после замораживания и оттаивания. Таким образом, как считают, существует острая потребность в разработке жидкости для консервации клеток, превосходной с точки зрения простоты использования и способной подавлять уменьшение выживаемости клеток.
Трегалоза представляет собой дисахарид, образованный за счет 1,1-гликозидной связи молекул глюкозы. Трегалозу используют в различных продуктах и косметических товарах, поскольку она обладает сладким вкусом и имеет высокую влагоудерживающую способность. Трегалозу также используют в качестве активного ингредиента защищающего органы раствора при трансплантации органов, поскольку она обладает способностью стабилизировать клеточные мембраны и препятствовать повреждению клеток. Например, разработаны превосходные сохраняющие органы растворы, содержащие трегалозу, такие как раствор ET-Kyoto и раствор New ET-Kyoto (патентные документы 1 и 2 и непатентный документ 5).
Декстран представляет собой полисахарид, состоящий из глюкозы, и широко используется в качестве загустителя, увлажнителя или тому подобного в медицинских и косметических продуктах.
Авторы настоящего изобретения сообщали, что промывание мезенхимальных стволовых клеток, открепленных от сосуда для культивирования клеток путем обработки протеолитическими ферментами, содержащим трегалозу физиологическим водным раствором приводит к подавлению гибели мезенхимальных стволовых клеток (патентный документ 3). Поскольку повреждение клеток в результате обработки протеолитическими ферментами индуцирует путь клеточной гибели (апоптоз или тому подобное), такой эффект трегалозы, возможно, является следствием подавления пути апоптоза или стимулирования функции восстановления поврежденных клеток. Авторы настоящего изобретения также сообщали, что добавление сахарида, такого как трегалоза или декстран, к суспензии мезенхимальных стволовых клеток может подавлять агрегацию и уменьшение выживаемости мезенхимальных стволовых клеток при сохранении их в течение короткого периода времени (от 30 минут до 6 часов) (патентный документ 4). Тем не менее, оставалось неясным, будет ли комбинированное использование трегалозы и декстрана приводить к синергическому подавлению уменьшения выживаемости клеток млекопитающих, таких как мезенхимальные стволовые клетки, и синергическому увеличению процентной доли живых клеток.
Документы предшествующего уровня техники
Патентные документы
Патентный документ 1: Японский патент № 3253131
Патентный документ 2: Международная публикация № WO 2007/043698
Патентный документ 3: Международная публикация № WO 2012/133575
Патентный документ 4: Публикация Японской нерассмотренной патентной заявки № 2012-115253.
Непатентные документы
Непатентный документ 1: Gage, F. H., Science 287: 1433-1438 (2000)
Непатентный документ 2: Morrison, S. J. et al., Cell 96: 737-749 (1999)
Непатентный документ 3: Batle, E. et al., Cell 111: 251-263 (2002)
Непатентный документ 4: Lane, T. A. et al., Transfusion 49: 1471-1481 (2009)
Непатентный документ 5: Chem, F. et al., Yonsei Med. J. 45: 1107-1114 (2004)
Сущность изобретения
Цель, достигаемая с помощью изобретения
Целью настоящего изобретения является предложение способа сохранения клеток млекопитающих в течение длительного периода времени за счет использования раствора для трансплантации клеток, способного эффективно подавлять клеточную гибель при хранении клеток млекопитающих, а также раствора для трансплантации клеток.
Способы достижения цели
Авторы настоящего изобретения сообщали, что, как описано выше, кратковременное (от 30 минут до 6 часов) сохранение мезенхимальных стволовых клеток в растворе, содержащем сахарид, такой как трегалоза или декстран, может приводить к подавлению уменьшения выживаемости клеток (патентный документ 4). Однако изобретение, описанное в патентном документе 4, не демонстрирует синергический эффект комбинированного использования трегалозы и декстрана. В интенсивных исследованиях для решения указанной выше проблемы было обнаружено, что сохранение человеческих мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга (hMSC-BM) или человеческих T-клеток периферической крови (hPBT) в физиологическом водном растворе, содержащем трегалозу и декстран в конкретных концентрациях 2,0-6,0% [масс./об.] и 4,0-7,0% [масс./об.], соответственно, может приводить к синергическому подавлению уменьшения выживаемости клеток в течение длительного периода времени (по меньшей мере 14 дней) и синергическому увеличению процентной доли живых клеток, что явилось сущностью настоящего изобретения.
Таким образом, настоящее изобретение относится к (1) способу сохранения клетки млекопитающего в физиологическом водном растворе для трансплантации клеток, содержащем 2,0-6,0% (масс./об.) трегалозы, ее производного, либо соли трегалозы или ее производного, и 4,0-7,0% (масс./об.) декстрана, его производного, либо соли декстрана или его производного, (2) способу по вышеуказанному пункту (1), в котором физиологический водный раствор выбирают из группы, состоящей из раствора Рингера-лактата, солевого раствора, раствора Рингера и раствора Рингера-ацетата, (3) способу по вышеуказанным пунктам (1) или (2), в котором клетку млекопитающего сохраняют в физиологическом водном растворе для трансплантации клеток в течение 3-14 дней, (4) способу по любому из вышеуказанных пунктов (1)-(3), в котором клетка млекопитающего представляет собой мезенхимальную стволовую клетку млекопитающего или T-клетку млекопитающего, и (5) способу по вышеуказанному пункту (4), в котором мезенхимальная стволовая клетка млекопитающего представляет собой человеческую мезенхимальную стволовую клетку из костного мозга и T-клетка млекопитающего представляет собой человеческую T-клетку периферической крови.
Настоящее изобретение также относится к (6) физиологическому водному раствору для трансплантации клеток, содержащему 2,0-6,0% (масс./об.) трегалозы, ее производного, либо соли трегалозы или ее производного и 4,0-7,0% (масс./об.) декстрана, его производного, либо соли декстрана или его производного, (7) физиологическому водному раствору для трансплантации клеток по вышеуказанному пункту (6), выбранному из группы, состоящей из раствора Рингера-лактата, солевого раствора, раствора Рингера и раствора Рингера-ацетата, (8) физиологическому водному раствору для трансплантации клеток по вышеуказанному пункту (6) или (7) в случае, когда клетка млекопитающего представляет собой мезенхимальную стволовую клетку млекопитающего или T-клетку млекопитающего, и (9) физиологическому водному раствору для трансплантации клеток по вышеуказанному пункту (8) в случае, когда мезенхимальная стволовая клетка млекопитающего представляет собой человеческую мезенхимальную стволовую клетку из костного мозга и T-клетка млекопитающего представляет собой человеческую T-клетку периферической крови.
Настоящее изобретение также относится к (10) физиологическому водному раствору, содержащему клетку для трансплантации, который содержит: клетку млекопитающего; 2,0-6,0% (масс./об.) трегалозы, ее производного, либо соли трегалозы или ее производного; и 4,0-7,0% (масс./об.) декстрана, его производного, либо соли декстрана или его производного, (11) физиологическому водному раствору, содержащему клетку для трансплантации, по вышеуказанному пункту (10), выбранному из группы, состоящей из раствора Рингера-лактата, солевого раствора, раствора Рингера и раствора Рингера-ацетата, (12) физиологическому водному раствору, содержащему клетку для трансплантации, по вышеуказанному пункту (10) или (11), в котором клетка млекопитающего представляет собой мезенхимальную стволовую клетку млекопитающего или T-клетку млекопитающего, и (13) физиологическому водному раствору, содержащему клетку для трансплантации, по вышеуказанному пункту (12), в котором мезенхимальная стволовая клетка млекопитающего представляет собой человеческую мезенхимальную стволовую клетку из костного мозга и T-клетка млекопитающего представляет собой человеческую T-клетку периферической крови.
Другие варианты осуществления настоящего изобретения могут включать сочетание физиологического водного раствора и трегалозы, ее производного, либо соли трегалозы или ее производного и декстрана, его производного, либо соли декстрана или его производного для сохранения клеток млекопитающего, а также использование сочетания физиологического водного раствора и трегалозы, ее производного, либо соли трегалозы или ее производного и декстрана, его производного, либо соли декстрана или его производного для получения раствора для трансплантации клеток млекопитающего; более конкретно, вышеописанная трегалоза, ее производное, либо соль трегалозы или ее производного и декстран, его производное, либо соль декстрана или его производного являются активными ингредиентами для подавления уменьшения выживаемости клеток.
Эффект изобретения
В соответствии с настоящим изобретением уменьшение выживаемости клеток, включая стволовые клетки, такие как мезенхимальные стволовые клетки, и лейкоциты, такие как T-клетки, может быть подавлено, если суспензию клеток сохраняют в течение длительного периода времени (по меньшей мере 14 дней); таким образом, хорошего качества клеточная суспензия для трансплантации в регенеративной медицине или в лечении рака может быть доступна не только там, где получают клеточную суспензию, и поблизости, но и в отдаленных местах, и хотя тест на стерильность выполняют для проверки обеспечения качества при транспортировке фармацевтического препарата и выполнение теста на стерильность занимает 14 дней в соответствии с японской фармакопеей, хорошего качества клеточная суспензия может быть доступна даже после получения клеточной суспензии и выполнения теста на стерильность.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой график, демонстрирующий результаты анализа выживаемости клеток, когда hMSC-BM сохраняли в течение 14 дней с использованием каждого из 11 растворов для трансплантации клеток млекопитающих (растворов S, LR, «LR + 1% D», «LR + 3% D», «LR + 5% D», «LR + 7% D», «LR + 3% T», «LR + 3% T + 1% D», «LR + 3% T + 3% D», «LR + 3% T + 5% D» и «LR + 3% T + 7% D»: см. раздел «1-1-1 Раствор для трансплантации клеток» в примере 1). По оси ординат показана процентная доля живых клеток от общего количества клеток в качестве степени выживаемости клеток (%) (среднее ± стандартное отклонение [n=4]). В качестве контроля показана степень выживаемости клеток до сохранения в фосфатно-солевом буферном растворе Дульбекко (D-PBS [-]) (далее в настоящем документе для простоты называемом «PBS») («P» на оси абсцисс фигуры).
Фиг. 2 представляет собой график, демонстрирующий результаты анализа выживаемости клеток, когда hMSC-BM сохраняли в течение 3 дней, 7 дней и 14 дней с использованием каждого из 11 растворов для трансплантации клеток млекопитающих (растворов S, LR, «LR + 1% D», «LR + 3% D», «LR + 5% D», «LR + 7% D», «LR + 3% T», «LR + 3% T + 1% D», «LR + 3% T + 3% D», «LR + 3% T + 5% D» и «LR + 3% T + 7% D» [«2-12», соответственно, на оси абсцисс фигуры]: см. раздел «1-1-1 Раствор для трансплантации клеток» в примере 1). По оси ординат показана процентная доля живых клеток от общего количества клеток в качестве степени выживаемости клеток (%) (среднее ± стандартное отклонение [n=4]). В качестве контроля показана степень выживаемости клеток до сохранения (0 дней после сохранения) в растворе PBS («1» по оси абсцисс на фигуре).
Фиг. 3 представляет собой график, демонстрирующий результаты анализа выживаемости клеток, когда hMSC-BM сохраняли в течение 14 дней с использованием каждого из 13 растворов для трансплантации клеток млекопитающих (растворов S, LR, «LR + 1% T», «LR + 3% T», «LR + 5% T», «LR + 7% T», «LR + 10% T», «LR + 5% D», «LR + 5% D + 1% T», «LR + 5% D + 3% T», «LR + 5% D + 5% T», «LR + 5% D + 7% T» и «LR + 5% D + 10% T»: см. раздел «2-1-1 Раствор для трансплантации клеток» в примере 2). По оси ординат показана процентная доля живых клеток от общего количества клеток в качестве степени выживаемости клеток (%) (среднее ± стандартное отклонение [n=4]). В качестве контроля показана степень выживаемости клеток до сохранения в растворе PBS («P» по оси абсцисс на фигуре).
Фиг. 4 представляет собой график, демонстрирующий результаты анализа выживаемости клеток, когда hMSC-BM сохраняли в течение 3 дней, 7 дней и 14 дней с использованием каждого из 11 растворов для трансплантации клеток млекопитающих (растворов S, LR, «LR + 1% T», «LR + 3% T», «LR + 5% T», «LR + 7% T», «LR + 5% D», «LR + 5% D + 1% T», «LR + 5% D + 3% T», «LR + 5% D + 5% T» и «LR + 5% D + 7% T» [«2-12», соответственно, по оси абсцисс на фигуре]: см. раздел «2-1-1 Раствор для трансплантации клеток» в примере 2). По оси ординат показана процентная доля живых клеток от общего количества клеток в качестве степени выживаемости клеток (%) (среднее ± стандартное отклонение [n=4]). В качестве контроля показана степень выживаемости клеток до сохранения (0 дней после сохранения) в растворе PBS («1» по оси абсцисс на фигуре).
Фиг. 5 представляет собой график, демонстрирующий результаты анализа выживаемости клеток, когда hMSC-BM сохраняли в течение 14 дней с использованием каждого из 11 растворов для трансплантации клеток млекопитающих (растворов S, LR, LRD, LRTD, «LRD + GL», «LRD + SR», «LRD + MN», «LRD + LC», «LRD + RF», «LRD + ML» и «LRD + SC»: см. раздел «3-1-1 Раствор для трансплантации клеток» в примере 3). По оси ординат показана процентная доля живых клеток от общего количества клеток в качестве степени выживаемости клеток (%) (среднее ± стандартное отклонение [n=4]). «*» на фигуре указывает на наличие статистически значимого отличия (P < 0,05) относительно LRD согласно критерию Даннета.
Фиг. 6 представляет собой график, демонстрирующий результаты анализа выживаемости клеток, когда hMSC-BM сохраняли в течение 14 дней с использованием каждого из 11 растворов для трансплантации клеток млекопитающих (растворов S, LR, LRT, LRTD, «LRT + GL», «LRT + SR», «LRT + MN», «LRT + LC», «LRT + RF», «LRT + ML» и «LRT + SC»: см. раздел «4-1-1 Раствор для трансплантации клеток» в примере 4). По оси ординат показана процентная доля живых клеток от общего количества клеток в качестве степени выживаемости клеток (%) (среднее ± стандартное отклонение [n=4]). «*» на фигуре указывает на наличие статистически значимого отличия (P<0,05) относительно LRT согласно критерию Даннета.
Фиг. 7 представляет собой график, демонстрирующий результаты анализа выживаемости клеток, когда hMSC-BM сохраняли в течение 14 дней с использованием каждого из 11 растворов для трансплантации клеток млекопитающих (растворов S [нормальный солевой раствор Otsuka], LR [инъекция Lactec], LRD [содержащая 5% (масс./об.) декстрана инъекция Lactec], LRT [содержащая 3% (масс./об.) трегалозы инъекция Lactec], «LR + GL» [содержащая глюкозу инъекция Lactec], «LR + SR» [содержащая сорбит инъекция Lactec], «LR + MN» [содержащая маннит инъекция Lactec], «LR + LC» [содержащая лактозу инъекция Lactec], «LR + RF» [содержащая рафинозу инъекция Lactec], «LR + ML» [содержащая мальтозу инъекция Lactec] и «LR + SC» [содержащая сахарозу инъекция Lactec]). По оси ординат показана процентная доля живых клеток от общего количества клеток в качестве степени выживаемости клеток (%) (среднее ± стандартное отклонение [n=4]). «***» на фигуре указывает на наличие статистически значимого отличия (P<0,001) относительно LR согласно критерию Даннета.
Фиг. 8 представляет собой график, демонстрирующий результаты анализа выживаемости клеток, когда hMSC-BM сохраняли в течение 14 дней с использованием каждого из 10 растворов для трансплантации клеток млекопитающих (растворов LR, LRTD, S, STD, 5% глюкоза, 5% глюкоза TD, Рингера, Рингера TD, Veen и Veen TD: см. раздел «5-1-1 Раствор для трансплантации клеток» в примере 5). По оси ординат показана процентная доля живых клеток от общего количества клеток в качестве степени выживаемости клеток (%) (среднее ± стандартное отклонение [n=4]). В качестве контроля показана степень выживаемости клеток до сохранения в растворе PBS («P» по оси абсцисс на фигуре).
Фиг. 9 представляет собой график, демонстрирующий результаты анализа выживаемости клеток, когда hPBT сохраняли в течение 1 дня, 3 дней, 7 дней и 14 дней с использованием каждого из 5 растворов для трансплантации клеток млекопитающих (S, LR, LRT, LRD и LRTD). По оси ординат показана процентная доля живых клеток от общего количества клеток в качестве степени выживаемости клеток (%) (среднее ± стандартное отклонение [n=6]). В качестве контроля показана степень выживаемости клеток до сохранения (0 дней после сохранения) в растворе PBS («P» по оси абсцисс на фигуре).
Способ осуществления изобретения
Способ сохранения клеток млекопитающего по настоящему изобретению представляет собой способ с ограниченным применением «для использования в трансплантации клеток», что включает сохранение клеток млекопитающего в физиологическом водном растворе, содержащем 2,0-6,0% (масс./об.) трегалозы и 4,0-7,0% (масс./об.) декстрана (настоящий раствор для трансплантации клеток); более конкретно, настоящий раствор для трансплантации клеток содержит трегалозу и декстран в качестве активных ингредиентов для подавления уменьшения выживаемости клеток. Плотность клеток млекопитающего, сохраняемых в настоящем растворе для трансплантации клеток, находится, как правило, в диапазоне от 103 до 1010 клеток/мл.
В случае настоящего раствора, содержащего клетки для трансплантации, клетки млекопитающего, как правило, находятся в настоящем растворе для трансплантации клеток. Настоящий раствор, содержащий клетки для трансплантации, можно получать путем добавления клеток млекопитающего в настоящий раствор для трансплантации клеток или путем добавления трегалозы до концентрации 2,0-6,0% (масс./об.) и декстрана до концентрации 4,0-7,0% (масс./об.) в физиологический водный раствор, содержащий клетки млекопитающего.
Примеры млекопитающего по настоящему изобретению могут включать грызуна, такого как мышь, крыса, хомяк или морская свинка, зайцеобразного, такого, как кролик, копытного, такого как свинья, корова, коза, лошадь или овца, хищника, такого как собака или кошка, и примата, такого как человек, обезьяна, макака-резус, яванский макак, мартышка, орангутан или шимпанзе; в частности, предпочтительные примеры могут включать мышь, свинью и человека.
Физиологический водный раствор, используемый для настоящего раствора для трансплантации клеток и настоящего раствора, содержащего клетки для трансплантации, не имеет конкретных ограничений при условии, что он представляет собой изотонический водный раствор, в котором концентрацию соли, сахара и тому подобного доводят при помощи натрия, калия и тому подобного таким образом, чтобы обеспечивать почти такое же осмотическое давление, как осмотическое давление жидкостей организма или клеточной жидкости. Конкретные примеры растворов могут включать солевой раствор, солевые растворы, имеющие буферные свойства (фосфатно-солевой буфер [PBS], трис-буферный солевой раствор [TBS] и HEPES-буферный солевой раствор), раствор Рингера, раствор Рингера-лактат, раствор Рингера-ацетат, раствор Рингера-бикарбонат, 5% водный раствор глюкозы, минимальные среды для культивирования животных клеток (DMEM, EMEM, RPMI-1640, α-MEM, F-12, F-10, M-199 и тому подобное) и изотонические средства (глюкозу, D-сорбит, D-маннит, лактозу, хлорид натрия и тому подобное); в частности, предпочтительным является раствор, выбранный из группы, состоящей из раствора Рингера-лактата, солевого раствора, раствора Рингера и раствора Рингера-ацетата; особенно предпочтительным является раствор Рингера-лактат или солевой раствор. Физиологический водный раствор может быть коммерчески доступным или полученным самостоятельно раствором. Примеры коммерчески доступного раствора могут включать нормальный солевой раствор Otsuka (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (солевой раствор), раствор Рингера «Otsuka» (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (раствор Рингера), инъекцию Lactec (R) (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (раствор Рингера-лактат), инфузию Veen F (от компании Kowa Pharmaceutical Co., Ltd.) (раствор Рингера-ацетат), инъекцию 5% глюкозы Otsuka (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (5% водный раствор глюкозы) и инфузию Bicanate (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (раствор Рингера-бикарбонат). Используемый в настоящем документе термин «изотонический» означает имеющий осмотическое давление в диапазоне от 250 до 380 мОсм/л.
Настоящий раствор для трансплантации клеток и настоящий раствор, содержащий клетки для трансплантации, можно должным образом дополнять добавками, такими как стабилизатор (например, человеческий сывороточный альбумин или полиэтиленгликоль), буфер (например, фосфатный буфер или натрий-ацетатный буфер), хелатирующий агент (например, ЭДТА, ЭГТА, лимонная кислота или салицилат), аминокислота (например, заменимая аминокислота, такая как глютамин, аланин, аспарагин, серин, аспарагиновая кислота, цистеин, глютаминовая кислота, глицин, пролин или тирозин), витамин (например, холина хлорид, пантотеновая кислота, фолиевая кислота, никотинамид, пиридоксаль гидрохлорид, рибофлавин, тиамина гидрохлорид, аскорбиновая кислота, биотин или инозитол), солюбилизатор, консервант и антиоксидант.
Период хранения, в течение которого клетки млекопитающего сохраняют в настоящем растворе для трансплантации клеток, может представлять собой время (период), достаточное для подавления уменьшения выживаемости клеток и повышения процентной доли живых клеток, и составляет, например, 12 часов или более, 1 день или более, 2 дня или более, 3 дня или более, либо 7 дней или более. Поскольку слишком долгий период сохранения клеток млекопитающего может отрицательно влиять на выживаемость клеток, данный период, как правило, составляет 21 день или менее, предпочтительно 16 дней или менее, более предпочтительно 14 дней или менее, с тем, чтобы избежать неблагоприятного эффекта на выживаемость клеток. Таким образом, период сохранения составляет, как правило, от 12 часов до 21 дня, от 1 до 21 дня, от 2 до 21 дня, от 3 до 21 дня или от 7 до 21 дня, предпочтительно от 12 часов до 16 дней, от 1 до 16 дней, от 2 до 16 дней, от 3 до 16 дней или от 7 до 16 дней, более предпочтительно от 12 часов до 14 дней, от 1 до 14 дней, от 2 до 14 дней, от 3 до 14 дней или от 7 до 14 дней, наиболее предпочтительно от 3 до 14 дней. Подавление гибели клеток млекопитающего, сохраняемых в настоящем растворе для трансплантации клеток, можно подтверждать известным методом, позволяющим определять гибель клеток, таким как метод окрашивания трипановым синим, метод TUNEL, метод Nexin или метод FLICA.
Температура хранения, при которой клетки млекопитающего сохраняют в настоящем растворе для трансплантации клеток, может представлять собой температуру, при которой раствор для трансплантации клеток не замерзает и клетки являются жизнеспособными, и она находится в диапазоне, как правило, от 0 до 37°C, предпочтительно от 0 до 25°C (комнатная температура).
Примеры трегалозы в качестве описанной выше трегалозы могут включать α,β-трегалозу в виде дисахарида, в котором молекулы α-глюкозы и β-глюкозы связаны 1,1-гликозидной связью, и β,β-трегалозу в виде дисахарида, в котором 2 молекулы β-глюкозы связаны 1,1-гликозидной связью, в дополнение к α,α-трегалозе в виде дисахарида, в котором 2 молекулы α-глюкозы связаны 1,1-гликозидной связью; в частности, α,α-трегалоза является предпочтительной. Эти трегалозы можно получать любым из известных методов, таким как химический синтез, продуцировать с помощью микроорганизмов и продуцировать с помощью ферментов; однако также можно использовать коммерчески доступные соединения. Примеры трегалозы могут включать α,α-трегалозу (от компании Hayashibara Co., Ltd.) и α,α-трегалозу (от компании Wako Pure Chemical Industries Ltd.).
Производное трегалозы в качестве описанной выше трегалозы не имеет конкретных ограничений при условии, что оно является одним из гликозилтрегалоз, в которых одна или более сахаридных единиц связаны с трегалозой в виде дисахарида; гликозилтрегалозы включают гликозилтрегалозу, мальтозилтрегалозу и мальтотриозилтрегалозу.
Примеры соли трегалозы или ее производного в качестве описанной выше трегалозы могут включать кислотно-аддитивную соль, такую как гидрохлорид, гидробромат, гидроиодид, фосфат, нитрат, сульфат, ацетат, пропионат, толуолсульфонат, сукцинат, оксалат, лактат, тартрат, гликолят, метансульфонат, бутират, валерат, цитрат, фумарат, малеат, и малат; соль металла, такую как соль натрия, соль калия и соль кальция; соль аммония и соль алкиламмония. Каждую из этих солей используют в форме раствора в момент использования, и их действие предпочтительно имеет такую же эффективность, что и действие трегалозы. Эти соли могут образовывать гидраты или сольваты, и могут быть использованы отдельно или в надлежащем сочетании двух или более из них.
Декстран в качестве описанного выше декстрана не имеет конкретных ограничений при условии, что он представляет собой полисахарид (C6H10O5)n, состоящий из D-глюкозы, имеющий α 1 → 6 связь в основной цепи, и примеры декстрана могут включать декстран 40 (средневесовая молекулярная масса (Mw) = 40000) и декстран 70 (Mw=70000). Эти декстраны можно получать любым из известных методов, таким как химический синтез, продуцировать с помощью микроорганизмов и продуцировать с помощью ферментов; однако также можно использовать коммерчески доступные соединения. Примеры декстрана могут включать коммерческие продукты, такие как инъекция низкомолекулярного декстрана L (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) и декстран 70 (от компании Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.).
Примеры производного декстрана в качестве описанного выше декстрана включают сульфат декстрана, карбоксилированный декстран и диэтиламиноэтил (ДЭАЭ)-декстран.
Примеры соли декстрана и ее производного в качестве описанного выше декстрана могут включать кислотно-аддитивную соль, такую как гидрохлорид, гидробромат, гидроиодид, фосфат, нитрат, сульфат, ацетат, пропионат, толуолсульфонат, сукцинат, оксалат, лактат, тартрат, гликолят, метансульфонат, бутират, валерат, цитрат, фумарат, малеат и малат; соль металла, такую как соль натрия, соль калия и соль кальция; соль аммония и соль алкиламмония. Каждую из этих солей используют в форме раствора в момент использования, и их действие предпочтительно имеет такую же эффективность, что и действие декстрана. Эти соли могут образовывать гидраты или сольваты, и могут быть использованы отдельно или в надлежащем сочетании двух или более из них.
Примеры клеток млекопитающего по настоящему изобретению могут включать клетки панкреатических островков млекопитающего, вводимые внутривенно пациентам с диабетом I типа, и дендритные клетки млекопитающего, клетки - естественные киллеры (NK), T-клетки (например, альфа/бета (αβ) T-клетки, гамма/дельта (γδ) T-клетки, цитотоксические T-лимфоциты (CTL) и хелперные T-клетки), макрофаги и лейкоциты (например, нейтрофилы и эозинофилы), вводимые внутривенно онкологическим пациентам, в дополнение к стволовым клеткам млекопитающего, вводимым через кровеносный сосуд в регенеративной медицине, или тому подобное; предпочтительными являются T-клетки. Эти клетки можно выделять известными общими методами. Например, лейкоциты, T-клетки, T-хелперы, цитотоксические T-клетки и γδ T-клетки можно выделять из образца подвергнутой гемодиализу периферической крови или пуповинной крови с использованием клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS) при помощи антител к поверхностному маркеру лейкоцитов (CD45), поверхностному маркеру T-клеток (CD3), поверхностному маркеру T-хелперов (CD4), поверхностному маркеру цитотоксических T-клеток (CD8) и поверхностному маркеру γδ T-клеток (CD39), либо с использованием автоматического магнитного сепаратора клеток (autoMACS) при помощи антител к клеточным поверхностным маркерам, меченых маркирующим веществом, таким как флуоресцентное вещество, биотин или авидин, и конъюгированного с гранулой MACS (магнитной гранулой) антитела к маркирующему веществу. Примеры маркирующего вещества могут включать аллофикоцианин (APC), фикоэритрин (PE), FITC (флуоресцеин изотиоцианат), Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, PE-Texas Red, PE-Cy5 и PE-Cy7.
Термин «стволовые клетки» означает незрелые клетки, имеющие способность к самообновлению и способность к дифференциации/пролиферации. Стволовые клетки включают такие субпопуляции, как плюрипотентные стволовые клетки, полипотентные стволовые клетки или унипотентные стволовые клетки, в зависимости от способности к дифференциации. Плюрипотентные стволовые клетки представляют собой клетки, которые, как таковые, не могут становиться индивидуальным организмом, но обладают способностью к дифференциации во все ткани или клетки, составляющие живой организм. Полипотентные стволовые клетки представляют собой клетки, обладающие способностью к дифференциации во многие, но не во все, типы тканей или клеток. Унипотентные стволовые клетки представляют собой клетки, обладающие способностью к дифференциации в конкретную ткань или клетку.
Примеры плюрипотентных стволовых клеток могут включать эмбриональные стволовые клетки (ES клетки), EG клетки и iPS клетки. ES клетки можно получать путем культивирования внутренней клеточной массы на фидерных клетках или в среде, содержащей LIF. Способ получения ES клеток описан, например, в WO 96/22362, WO 02/101057, US 5843780, US 6200806 или US 6280718. EG клетки можно получать путем культивирования примордиальных зародышевых клеток в среде, содержащей mSCF, LIF, и bFGF (Cell, 70: 841-847, 1992). iPS клетки можно получать путем введения факторов перепрограммирования, таких как Oct3/4, Sox2, Klf4 (и, необязательно, дополнительно c-Myc или n-Myc), в соматические клетки (например, фибробласты или клетки кожи) (Cell, 126: p. 663-676, 2006; Nature, 448: p. 313-317, 2007; Nat. Biotechno1, 26: p. 101-106, 2008; Cell, 131: p. 861-872, 2007; Science, 318: p. 1917-1920, 2007; Cell Stem Cells, 1: p. 55-70, 2007; Nat. Biotechnol, 25: p. 1177-1181, 2007; Nature, 448: p. 318-324, 2007; Cell Stem Cells, 2: p. 10-12, 2008; Nature, 451: p. 141-146, 2008; Science, 318: p. 1917-1920, 2007). Стволовые клетки, полученные путем культивирования ранних эмбрионов, созданных за счет трансплантации ядра соматических клеток, также предпочтительны в качестве плюрипотентных стволовых клеток (Nature, 385, 810 (1997); Science, 280, 1256 (1998); Nature Biotechnology, 17, 456 (1999); Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96, 14984 (1999)), а также Rideout III et al. (Nature Genetics, 24, 109 (2000)).
Примеры полипотентных стволовых клеток включают мезенхимальные стволовые клетки, способные дифференцироваться в такие клетки, как адипоцит, остеоцит, хондроцит и адипоцит, гемопоэтические предшественники, способные дифференцироваться в гематоциты, такие как лейкоцит, эритроцит и тромбоцит, нервные стволовые клетки, способные дифференцироваться в такие клетки, как нейрон, астроцит и олигодендроцит, и соматические стволовые клетки, такие как миелоидная стволовая клетка и зародышевая стволовая клетка. Полипотентные стволовые клетки предпочтительно являются мезенхимальными стволовыми клетками. Мезенхимальные стволовые клетки представляют собой стволовые клетки, способные дифференцироваться во все или некоторые из остеобласта, хондробласта и липобласта. Полипотентные стволовые клетки можно выделять из живого организма способами, известными как таковые. Например, мезенхимальные стволовые клетки можно собирать из костного мозга, жировой ткани, периферической крови, пуповинной крови и тому подобного у млекопитающих известными общими методами. Например, человеческие мезенхимальные стволовые клетки можно выделять путем культивирования и пересева гемопоэтических стволовых клеток или тому подобного после пункции костного мозга (Journal of Autoimmunity, 30 (2008) 163-171). Полипотентные стволовые клетки также можно получать путем культивирования вышеописанных плюрипотентных стволовых клеток в подходящих условиях индукции. Мезенхимальные стволовые клетки предпочтительно являются мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из костного мозга человека.
Примеры клеток млекопитающего по настоящему изобретению могут включать прикрепляющиеся клетки. Используемый в настоящем документе термин «прикрепляющиеся» клетки означает зависящие от подложки клетки, способные выживать, пролиферировать и продуцировать вещества, будучи прикрепленными к подложке. Примеры прикрепляющихся стволовых клеток могут включать плюрипотентные стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, нервные стволовые клетки, миелоидные стволовые клетки и зародышевые стволовые клетки. Прикрепляющиеся стволовые клетки предпочтительно являются мезенхимальными стволовыми клетками или плюрипотентными стволовыми клетками.
Клетки млекопитающего (популяция) по настоящему изобретению могут представлять собой клетки, выделенные из живого организма, или клетки, пересеваемые in vitro; однако они предпочтительно являются клетками, выделенными или очищенными. Используемый в настоящем документе термин «выделенные или очищенные» означает, что была проведена процедура удаления компонентов, не являющихся желаемым компонентом. Чистота выделенных или очищенных клеток млекопитающего (процентная доля нужных клеток, таких как стволовые клетки млекопитающего, в расчете на общее количество клеток), как правило, составляет 30% или более, предпочтительно 50% или более, более предпочтительно 70% или более, еще более предпочтительно 90% или более (например, 100%).
Клетки млекопитающего (популяция), сохраняемые в настоящем растворе для трансплантации клеток, предпочтительно находятся в одноклеточном состоянии. Используемый в настоящем документе термин «одноклеточное состояние» означает, что клетки не собираются вместе с другими клетками, образуя массу (иными словами, находятся в неагрегированном состоянии). Клетки млекопитающего в одноклеточном состоянии можно получать, подвергая клетки млекопитающего, культивируемые in vitro, ферментативной обработке с помощью смеси трипсина/ЭДТА или тому подобного. Процентная доля клеток млекопитающего в одноклеточном состоянии среди клеток млекопитающего, как правило, составляет 70% или более, предпочтительно 90% или более, более предпочтительно 95% или более, еще более предпочтительно 99% или более (например, 100%). Процентную долю клеток в одноклеточном состоянии можно определять путем диспергирования клеток млекопитающего в PBS, рассматривания дисперсии под микроскопом и анализа определенного количества (например, 1000) случайно выбранных клеток на наличие агрегации.
Клетки млекопитающего (популяция), сохраняемые в настоящем растворе для трансплантации клеток, предпочтительно являются свободно плавающими. Используемый в настоящем документе термин «свободно плавающие» означает, что клетки находятся в растворе для трансплантации, не прикрепляясь к внутренней стенке контейнера, содержащего раствор для трансплантации.
Если клетки млекопитающего, сохраняемые в настоящем растворе для трансплантации клеток, агрегируют или осаждаются, клетки предпочтительно суспендируют перед трансплантацией методом, хорошо известным в данной области, таким как пипетирование или легкое постукивание.
Настоящее изобретение будет более конкретно описано ниже с помощью примеров. Однако данные примеры не должны ограничивать технический объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1
1. Подтверждение 1 того, что настоящий раствор для трансплантации клеток имеет синергический эффект подавления уменьшения выживаемости клеток (оценка зависимости между изменением концентрации декстрана и синергическим эффектом при фиксированной концентрации трегалозы, составляющей 3% (масс./об.)).
1-1 Материалы
1-1-1 Раствор для трансплантации клеток
S: Нормальный солевой раствор Otsuka (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LR: Инъекция Lactec (R) (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LR + 1% D: Содержащая 1% (масс./об.) декстрана инъекция Lactec
LR + 3% D: Содержащая 3% (масс./об.) декстрана инъекция Lactec
LR + 5% D: Содержащая 5% (масс./об.) декстрана инъекция Lactec
LR + 7% D: Содержащая 7% (масс./об.) декстрана инъекция Lactec
LR + 3% T: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы инъекция Lactec
LR + 3% T + 1% D: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы и 1% (масс./об.) декстрана инъекция Lactec
LR + 3% T + 3% D: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы и 3% (масс./об.) декстрана инъекция Lactec
LR + 3% T + 5% D: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы и 5% (масс./об.) декстрана инъекция Lactec
LR + 3% T + 7% D: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы и 7% (масс./об.) декстрана инъекция Lactec
1-1-2 Получение раствора для трансплантации клеток
1) Содержащую 3% (масс./об.) трегалозы инъекцию Lactec (раствор «LR + 3% T») получали путем добавления и растворения трегалозы (от компании Hayashibara Co., Ltd.) в инъекции Lactec (раствор LR).
2) Содержащую 3% (масс./об.) трегалозы и 10% (масс./об.) декстрана инъекцию Lactec (раствор «LR + 3% T + 10% D») получали путем добавления и растворения трегалозы (от компании Hayashibara Co., Ltd.) в инъекции низкомолекулярного декстрана L (содержащая 10% [масс./об.] декстрана инъекция Lactec) (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (раствор «LR + 10% D»).
3) Инъекции Lactec, содержащие декстран в заданных концентрациях (1, 3, 5 и 7% [масс./об.]) (растворы «LR + 1, 3, 5 и 7% D») готовили, разбавляя раствор «LR + 10% D» раствором LR.
4) Инъекции Lactec, содержащие 3% (масс./об.) трегалозы и декстран в заданных концентрациях (1, 3, 5 и 7% [масс./об.]) (растворы «LR + 3% T + 1, 3, 5 и 7% D») готовили, разбавляя раствор «LR + 3% T + 10% D» раствором «LR + 3% T».
1-1-3 Получение клеток млекопитающего
Человеческие мезенхимальные стволовые клетки из костного мозга [hMSC-BM] (от компании Lonza Co., Ltd.) получали методами, описанными в пунктах [1]-[8], ниже, и использовали в настоящем эксперименте.
[1] hMSC-BM культивировали в инкубаторе с 5% CO2 при температуре 37°C, используя набор для среды, специфической для человеческих мезенхимальных стволовых клеток (от компании Lonza Co., Ltd.) (далее в настоящем документе называемый «средой MSC»), в 75-см2 колбе. Состояние клеток наблюдали под микроскопом, и культивирование проводили до достижения конфлюэнтного состояния примерно 80%.
[2] Среду MDC удаляли с помощью аспиратора и hMSC-BM промывали, используя 8 мл/колбу PBS (от компании Invitrogen Co., Ltd.).
[3] PBS удаляли с помощью аспиратора и добавляли 3,75 мл/колбу раствора трипсин-ЭДТА (от компании Lonza Co., Ltd.), после чего оставляли при комнатной температуре на 5 минут.
[4] Колбу медленно качали, наблюдая hMSC-BM под микроскопом, до тех пор, пока не откреплялись примерно 90% клеток.
[5] 3,75 мл/колбу среды MSC добавляли для остановки действия трипсина, и hMSC-BM извлекали пипеткой и переносили в 50-мл центрифужную пробирку.
[6] Центрифугирование проводили при 600×g и температуре 25°C в течение 5 минут.
[7] Среду MSC в виде супернатанта удаляли с помощью аспиратора и добавляли 4 мл/колбу PBS (от компании Invitrogen Co., Ltd.), с последующим суспендированием осадка hMSC-BM (преципитат).
[8] Отбирали 10 мкл суспензии hMSC-BM, измеряли количество клеток с использованием счетчика клеток и к ним добавляли PBS (от компании Invitrogen Co., Ltd.) до достижения плотности 5×105 клеток/мл, после чего клетки охлаждали на льду.
1-2 Способ
Для подтверждения того, что настоящий раствор для трансплантации клеток имеет синергический эффект подавления уменьшения выживаемости клеток, проводили эксперимент в соответствии с процедурами, описанными в пунктах [1]-[3], ниже.
[1] Суспензию hMSC-BM, полученную на этапе [7] в разделе «1-1-3 Получение клеток млекопитающего», приведенном выше, переносили в 15-мл коническую центрифужную пробирку, используя FINPIPETTE (100-1000 мкл), и центрифугировали при 600×g и температуре 25°C в течение 5 минут.
[2] Супернатант после центрифугирования отсасывали/удаляли и остаток суспендировали в каждом из 11 растворов для трансплантации клеток, затем сохраняли в холодильнике (в условиях температуры 4°C) в течение 14 дней. Для определения выживаемости клеток перед сохранением супернатант после центрифугирования отсасывали/удаляли и остаток суспендировали в PBS (от компании Invitrogen Co., Ltd.), после чего немедленно отбирали часть (20 мкл) суспензии, смешивали ее с 20 мкл раствора красителя трипанового синего (от компании Gibco Co., Ltd.), затем измеряли общее количество клеток и количество мертвых клеток, используя счетчик клеток, под микроскопом для оценки количества живых клеток (см. «P» на фигуре 1).
[3] После сохранения hMSC-BM в растворе для трансплантации клеток в течение 14 дней их осторожно перемешивали (5-кратным пипетированием объема жидкости 500 мкл) таким образом, что кончик наконечника пипетки вводили до положения визуально примерно 5 мм от дна, чтобы перевести клетки в суспендированное состояние, и часть (20 мкл) суспензии отбирали в 1,5-мл микропробирку, смешивали с 20 мкл раствора красителя трипанового синего (от компании Gibco Co., Ltd.), затем измеряли общее количество клеток и количество мертвых клеток, используя счетчик клеток, под микроскопом для оценки количества живых клеток.
1-3 Результаты
Результаты оценки количества живых клеток приведены в таблице 1 и на фигуре 1. Если hMSC-BM сохраняли в растворе S и растворе LR, наблюдали небольшое количество выживших hMSC-BM (менее 1% для раствора S и 1% для раствора LR), в то время как если hMSC-BM сохраняли в растворах «LR + 1, 3, 5 и 7% D», процентная доля выживших hMSC-BM возрастала до 4%, 9%, 12% и 20%, соответственно (таблица 1 и фиг. 1). Если hMSC-BM сохраняли в растворе «LR + 3% T», процентная доля выживших hMSC-BM также возрастала до 4% (таблица 1 и фиг. 1). Эти результаты показывают, что, хотя долговременное хранение клеток млекопитающего, таких как hMSC-BM, в солевом растворе или физиологическом водном растворе, таком как раствор Рингера-лактат, приводит к гибели большинства клеток, использование физиологического водного раствора, содержащего декстран или трегалозу, может приводить к подавлению гибели клеток и может приводить к увеличению процентной доли живых клеток.
Если hMSC-BM сохраняли в растворах «LR + 3% T + 1, 3, 5 и 7% D», процентная доля выживших hMSC-BM составляла 11%, 33%, 57% и 50%, соответственно, и увеличивалась по сравнению с тем, когда hMSC-BM сохраняли в растворе «LR + 3% T» (таблица 1 и фиг. 1). Кроме того, выживаемость клеток при использовании растворов «LR + 3% T» и «LR + 1% D» составляла в каждом случае 4%, в общей сложности 8%, в то время как выживаемость клеток при использовании раствора «LR + 3% T + 1% D» достигала 11% (1,4 раз). Аналогично, показатели выживаемости клеток при использовании растворов «LR + 3% T» и «LR + 3% D» составляли в общей сложности 13%, в то время как выживаемость клеток при использовании раствора «LR + 3% T + 3% D» достигала 33% (2,5 раз); показатели выживаемости клеток при использовании растворов «LR + 3% T» и «LR + 5% D» в общей сложности составляли 16%, в то время как выживаемость клеток при использовании раствора «LR + 3% T + 5% D» достигала 57% (3,6 раз); и показатели выживаемости клеток при использовании растворов «LR + 3% T» и «LR + 7% D» в общей сложности составляли 24%, в то время как выживаемость клеток при использовании раствора «LR + 3% T + 7% D» достигала 50% (2,1 раз). Эти результаты показывают, что комбинированное использование 3% трегалозы и примерно 5% (4-7%) декстрана может приводить к синергическому подавлению уменьшения выживаемости клеток, когда клетки млекопитающего, такие как hMSC-BM, сохраняют в течение длительного периода времени, и может приводить к синергическому увеличению процентной доли живых клеток.
| Таблица 1 Выживаемость клеток (%) при хранении в течение 14 дней |
|
| Раствор для трансплантации клеток | Выживаемость клеток (%) |
| S | 0±1 |
| LR | 1±1 |
| LR + 1% D | 4±4 |
| LR + 3% D | 9±3 |
| LR + 5% D | 12±2 |
| LR + 7% D | 20±7 |
| LR + 3% T | 4±1 |
| LR + 3% T + 1% D | 11±3 |
| LR + 3% T + 3% D | 33±7 |
| LR + 3% T + 5% D | 57±11 |
| LR + 3% T + 7% D | 50±17 |
В графе «Выживаемость клеток (%)» вышеприведенной таблицы процентная доля живых клеток в расчете на общее количество клеток приведена в качестве показателя выживаемости клеток (%) (среднее ± стандартное отклонение, [n=4]. Выживаемость клеток до хранения составляла «93±2(%)». Для 11 типов «Раствора для трансплантации клеток» в вышеприведенной таблице см. раздел «1-1-1 Раствор для трансплантации клеток» в примере 1.
Далее изучали период хранения hMSC-BM в растворе для трансплантации клеток, составляющий 3 дней и 7 дней, в дополнение к 14 дням. Результаты приведены на фигуре 2. Аналогично ситуации с сохранением hMSC-BM в течение 14 дней, было продемонстрировано, что комбинированное использование 3% трегалозы и примерно 5% (4-7%) декстрана также может приводить к синергическому подавлению уменьшения выживаемости клеток, когда hMSC-BM сохраняют в течение длительного периода времени, и синергическому увеличению процентной доли живых клеток, даже когда hMSC-BM сохраняют в течение 3 дней или 7 дней.
Пример 2
2. Подтверждение 2 того, что настоящий раствор для трансплантации клеток имеет синергический эффект подавления уменьшения выживаемости клеток (оценка зависимости между изменением концентрации трегалозы и синергическим эффектом при фиксированной концентрации декстрана, составляющей 5% (масс./об.)).
2-1 Материалы
2-1-1 Раствор для трансплантации клеток
S: Нормальный солевой раствор Otsuka (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LR: Инъекция Lactec (R) (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LR + 1% T: Содержащая 1% (масс./об.) трегалозы инъекция Lactec
LR + 3% T: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы инъекция Lactec
LR + 5% T: Содержащая 5% (масс./об.) трегалозы инъекция Lactec
LR + 7% T: Содержащая 7% (масс./об.) трегалозы инъекция Lactec
LR + 10% T: Содержащая 10% (масс./об.) трегалозы инъекция Lactec
LR + 5% D: Содержащая 5% (масс./об.) декстрана инъекция Lactec
LR + 5% D + 1% T: Содержащая 5% (масс./об.) декстрана и 1% (масс./об.) трегалозы инъекция Lactec
LR + 5% D + 3% T: Содержащая 5% (масс./об.) декстрана и 3% (масс./об.) трегалозы инъекция Lactec
LR + 5% D + 5% T: Содержащая 5% (масс./об.) декстрана и 5% (масс./об.) трегалозы инъекция Lactec
LR + 5% D + 7% T: Содержащая 5% (масс./об.) декстрана и 7% (масс./об.) трегалозы инъекция Lactec
LR + 5% D + 10% T: Содержащая 5% (масс./об.) декстрана и 10% (масс./об.) трегалозы инъекция Lactec
2-1-2 Получение раствора для трансплантации клеток
1) Содержащую 5% (масс./об.) декстрана инъекцию Lactec (раствор «LR + 5% D») получали путем разбавления инъекции низкомолекулярного декстрана L (содержащая 10% [масс./об.] декстрана инъекция Lactec) (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (раствор «LR + 10% D») инъекцией Lactec (раствор LR).
2) Содержащую 10% (масс./об.) трегалозы инъекцию Lactec (раствор «LR + 10% T») получали путем добавления и растворения трегалозы (от компании Hayashibara Co., Ltd.) в растворе LR.
3) Содержащую 5% (масс./об.) декстрана и 10% (масс./об.) трегалозы инъекцию Lactec (раствор «LR + 5% D + 10% T») получали путем добавления и растворения трегалозы (от компании Hayashibara Co., Ltd.) в растворе «LR + 5% D».
4) Инъекции Lactec, содержащие трегалозу в заданных концентрациях (1, 3, 5 и 7% [масс./об.]) (растворы «LR + 1, 3, 5 и 7% T»), готовили, разбавляя раствор «LR + 10% T» раствором LR.
5) Инъекции Lactec, содержащие 5% (масс./об.) декстрана и трегалозу в заданных концентрациях (1, 3, 5 и 7% [масс./об.]) (растворы «LR + 5% D + 1, 3, 5 и 7% T»), готовили, разбавляя раствор «LR + 5% D + 10% T» раствором «LR + 5% D».
2-2 Результаты
После получения hMSC-BM способом, описанным в разделе «1-1-3 Получение клеток млекопитающего» в примере 1, проводили эксперимент в соответствии с процедурами, описанными в разделе «1-2 Способ» примера 1, с использованием 13 растворов для трансплантации клеток. Результаты приведены в таблице 2 и на фигуре 3. Аналогично результатам в примере 1, если hMSC-BM сохраняли в растворе S и растворе LR, наблюдали небольшое количество или отсутствие выживших hMSC-BM (1% для раствора S и 0% для раствора LR). Если hMSC-BM сохраняли в растворах «LR + 1, 3, 5, 7 и 10% T», процентные доли выживших hMSC-BM составляли 2%, 6%, 7%, 5% и 3%, соответственно, в то время как если hMSC-BM сохраняли в растворах «LR + 5% D + 1, 3, 5, 7 и 10% T», процентные доли выживших hMSC-BM составляли 30%, 48%, 49%, 30% и 14%, соответственно, демонстрируя значительное увеличение (таблица 2 и фиг. 3). В частности, показатели выживаемости клеток при использовании растворов «LR + 5% D» и «LR + 1% T» составляли 11% и 2%, соответственно, в общей сложности 13%, в то время как выживаемость клеток при использовании раствора «LR + 5% D + 1% T» достигала 30% (2,3 раз). Аналогично, показатели выживаемости клеток при использовании растворов «LR + 5% D» и «LR + 3% T» составляли в общей сложности 17%, в то время как выживаемость клеток при использовании раствора «LR + 5% D + 3% T» достигала 48% (2,8 раз); показатели выживаемости клеток при использовании растворов «LR + 5% D» и «LR + 5% T» составляли в общей сложности 18%, в то время как выживаемость клеток при использовании раствора «LR + 5% D + 5% T» достигала 49% (2,7 раз); и показатели выживаемости клеток при использовании растворов «LR + 5% D» и «LR + 7% T» составляли в общей сложности 16%, в то время как выживаемость клеток при использовании раствора «LR + 5% D + 7% T» достигала 30% (1,9 раз). Эти результаты показывают, что комбинированное использование примерно 3% (2-6%) трегалозы и 5% декстрана может приводить к синергическому подавлению уменьшения выживаемости клеток, когда клетки млекопитающего, такие как hMSC-BM, сохраняют в течение длительного периода времени, и может приводить к синергическому увеличению процентной доли живых клеток.
| Таблица 2 Выживаемость клеток (%) при хранении в течение 14 дней |
|
| Раствор для трансплантации клеток | Выживаемость клеток (%) |
| S | 1±1 |
| LR | 0±0 |
| LR + 1% T | 2±1 |
| LR + 3% T | 6±2 |
| LR + 5% T | 7±2 |
| LR + 7% T | 5±3 |
| LR + 10% T | 3±2 |
| LR + 5% D | 11±4 |
| LR + 5% D+ 1% T | 30±5 |
| LR + 5% D+ 3% T | 48±3 |
| LR + 5% D+ 5% T | 49±4 |
| LR + 5% D+ 7% T | 30±7 |
| LR + 5% D+ 10% T | 14±5 |
В графе «Выживаемость клеток (%)» вышеприведенной таблицы процентная доля живых клеток в расчете на общее количество клеток приведена в качестве показателя выживаемости клеток (%) (среднее ± стандартное отклонение, [n=4]. Выживаемость клеток до хранения составляла «95±2(%)». Для 13 типов «Раствора для трансплантации клеток» в вышеприведенной таблице см. раздел «2-1-1 Раствор для трансплантации клеток» в примере 2.
Кроме того, изучали период хранения hMSC-BM в растворе для трансплантации клеток, составляющий 3 дней и 7 дней, в дополнение к 14 дням. Результаты приведены на фигуре 4. Аналогично ситуации с сохранением hMSC-BM в течение 14 дней, было продемонстрировано, что комбинированное использование примерно 3% (2-6%) трегалозы и 5% декстрана также может приводить к синергическому подавлению уменьшения выживаемости клеток, когда hMSC-BM сохраняют в течение длительного периода времени, и синергическому увеличению процентной доли живых клеток, даже когда hMSC-BM сохраняют в течение 3 дней или 7 дней.
Подводя итоги для результатов примеров 1 и 2, было продемонстрировано, что комбинированное использование примерно 3% (2-6%) трегалозы и 5% (4-7%) декстрана может приводить к синергическому подавлению уменьшения выживаемости клеток, когда клетки млекопитающего, такие как hMSC-BM, сохраняют в течение длительного периода времени (по меньшей мере 14 дней), и может приводить к синергическому увеличению процентной доли живых клеток.
Пример 3
3. Изучение эффекта подавления уменьшения выживаемости клеток при использовании раствора для трансплантации клеток, содержащего смесь декстрана и другого сахарида
3-1 Материалы
3-1-1 Раствор для трансплантации клеток
S: Нормальный солевой раствор Otsuka (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LR: Инъекция Lactec (R) (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LRD: Содержащая 5% (масс./об.) декстрана инъекция Lactec
LRTD: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы и 5% (масс./об.) декстрана инъекция Lactec
LRD + GL: Содержащая 5% (масс./об.) декстрана и 1,6% (масс./об.) глюкозы инъекция Lactec
LRD + SR: Содержащая 5% (масс./об.) декстрана и 1,6% (масс./об.) сорбита инъекция Lactec
LRD + MN: Содержащая 5% (масс./об.) декстрана и 1,6% (масс./об.) маннита инъекция Lactec
LRD + LC: Содержащая 5% (масс./об.) декстрана и 3,0% (масс./об.) лактозы инъекция Lactec
LRD + RF: Содержащая 5% (масс./об.) декстрана и 4,8% (масс./об.) рафинозы инъекция Lactec
LRD + ML: Содержащая 5% (масс./об.) декстрана и 3,0% (масс./об.) мальтозы инъекция Lactec
LRD + SC: Содержащая 5% (масс./об.) декстрана и 3,0% (масс./об.) сахарозы инъекция Lactec
3-1-2 Получение раствора для трансплантации клеток
1) Содержащую 5% (масс./об.) декстрана инъекцию Lactec (раствор «LRD») и содержащую 3% (масс./об.) трегалозы и 5% (масс./об.) декстрана инъекцию Lactec (раствор «LRTD») получали способом, описанным в разделе «1-1-2 Получение раствора для трансплантации клеток» примера 1.
2) Содержащую 5% (масс./об.) декстрана и 1,6% (масс./об.) глюкозы инъекцию Lactec (раствор «LRD + GL») получали путем добавления и растворения глюкозы (от компании Wako Pure Chemical Industries Ltd.) в растворе «LRD».
3) Содержащую 5% (масс./об.) декстрана и 1,6% (масс./об.) сорбита инъекцию Lactec (раствор «LRD + SR») получали путем добавления и растворения сорбита (от компании Wako Pure Chemical Industries Ltd.) в растворе «LRD».
4) Содержащую 5% (масс./об.) декстрана и 1,6% (масс./об.) маннита инъекцию Lactec (раствор «LRD + MN») получали путем добавления и растворения маннита (от компании Wako Pure Chemical Industries Ltd.) в растворе «LRD».
5) Содержащую 5% (масс./об.) декстрана и 3,0% (масс./об.) лактозы инъекцию Lactec (раствор «LRD + LC») получали путем добавления и растворения лактозы (от компании Wako Pure Chemical Industries Ltd.) в растворе «LRD».
6) Содержащую 5% (масс./об.) декстрана и 4,8% (масс./об.) рафинозы инъекцию Lactec (раствор «LRD + RF») получали путем добавления и растворения рафинозы (от компании Wako Pure Chemical Industries Ltd.) в растворе «LRD».
7) Содержащую 5% (масс./об.) декстрана и 3,0% (масс./об.) мальтозы инъекцию Lactec (раствор «LRD + ML») получали путем добавления и растворения мальтозы (от компании Wako Pure Chemical Industries Ltd.) в растворе «LRD».
8) Содержащую 5% (масс./об.) декстрана и 3,0% (масс./об.) сахарозы инъекцию Lactec (раствор «LRD + SC») получали путем добавления и растворения сахарозы (от компании Wako Pure Chemical Industries Ltd.) в растворе «LRD». Концентрации 7 сахаридов (глюкозы, сорбита, маннита, лактозы, рафинозы, мальтозы и сахарозы) корректировали таким образом, чтобы они имели такое же осмотическое давление, как давление 3% (масс./об.) раствора трегалозы.
3-2 Результаты
После получения hMSC-BM способом, описанным в разделе «1-1-3 Получение клеток млекопитающего» в примере 1, проводили эксперимент в соответствии с процедурами, описанными в разделе «1-2 Способ» примера 1, с использованием 11 растворов для трансплантации клеток. Результаты приведены на фигуре 5. Аналогично результатам в примерах 1 и 2, показано, что комбинированное использование трегалозы и декстрана приводит к синергическому подавлению уменьшения выживаемости клеток, когда hMSC-BM сохраняют в течение 14 days, и увеличению количества живых клеток (сравнение «LRTD» с «LRD», «LR» или «S» на фигуре 5). С другой стороны, комбинированное использование декстрана с каждым из 7 сахаридов (глюкозой, сорбитом, маннитом, лактозой, рафинозой, мальтозой и сахарозой) вместо трегалозы приводило к небольшому изменению выживаемости клеток по сравнению с использованием только декстрана (сравнение «LRD» с «LRD + GL», «LRD + SR», «LRD + MN», «LRD + LC», «LRD + RF», «LRD + ML» или «LRD + SC» на фигуре 5). Эти результаты демонстрируют, что в отличие от трегалозы, 7 сахаридов не имели эффекта подавления гибели клеток и увеличения количества живых клеток в растворе для трансплантации клеток, когда клетки млекопитающего, такие как hMSC-BM, сохраняли в течение длительного периода времени.
Пример 4
4. Изучение эффекта подавления уменьшения выживаемости клеток при использовании раствора для трансплантации клеток, содержащего смесь трегалозы и другого сахарида
4-1 Материалы
4-1-1 Раствор для трансплантации клеток
S: Нормальный солевой раствор Otsuka (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LR: Инъекция Lactec (R) (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LRT: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы инъекция Lactec
LRTD: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы и 5% (масс./об.) декстрана инъекция Lactec
LTD + GL: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы и 1,6% (масс./об.) глюкозы инъекция Lactec
LTD + SR: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы и 1,6% (масс./об.) сорбита инъекция Lactec
LTD + MN: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы и 1,6% (масс./об.) маннита инъекция Lactec
LTD + LC: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы и 3,0% (масс./об.) лактозы инъекция Lactec
LTD + RF: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы и 4,8% (масс./об.) рафинозы инъекция Lactec
LTD + ML: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы и 3,0% (масс./об.) мальтозы инъекция Lactec
LTD + SC: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы и 3,0% (масс./об.) сахарозы инъекция Lactec
4-1-2 Получение раствора для трансплантации клеток
1) Содержащую 3% (масс./об.) трегалозы инъекцию Lactec (раствор «LRT») и содержащую 3% (масс./об.) трегалозы и 5% (масс./об.) декстрана инъекцию Lactec (раствор «LRTD») получали способом, описанным в разделе «1-1-2 Получение раствора для трансплантации клеток» примера 1.
2) Содержащую 3% (масс./об.) трегалозы и 1,6% (масс./об.) глюкозы инъекцию Lactec (раствор «LRD + GL») получали путем добавления и растворения глюкозы (от компании Wako Pure Chemical Industries Ltd.) в растворе «LRT».
3) Содержащую 3% (масс./об.) трегалозы и 1,6% (масс./об.) сорбита инъекцию Lactec (раствор «LRT + SR») получали путем добавления и растворения сорбита (от компании Wako Pure Chemical Industries Ltd.) в растворе «LRT».
4) Содержащую 3% (масс./об.) трегалозы и 1,6% (масс./об.) маннита инъекцию Lactec (раствор «LRT + MN») получали путем добавления и растворения маннита (от компании Wako Pure Chemical Industries Ltd.) в растворе «LRT».
5) Содержащую 3% (масс./об.) трегалозы и 3,0% (масс./об.) лактозы инъекцию Lactec (раствор «LRT + LC») получали путем добавления и растворения лактозы (от компании Wako Pure Chemical Industries Ltd.) в растворе «LRT».
6) Содержащую 3% (масс./об.) трегалозы и 4,8% (масс./об.) рафинозы инъекцию Lactec (раствор «LRT + RF») получали путем добавления и растворения рафинозы (от компании Wako Pure Chemical Industries Ltd.) в растворе «LRT».
7) Содержащую 3% (масс./об.) трегалозы и 3,0% (масс./об.) мальтозы инъекцию Lactec (раствор «LRT + ML») получали путем добавления и растворения мальтозы (от компании Wako Pure Chemical Industries Ltd.) в растворе «LRT».
8) Содержащую 3% (масс./об.) трегалозы и 3,0% (масс./об.) сахарозы инъекцию Lactec (раствор «LRT + SC») получали путем добавления и растворения сахарозы (от компании Wako Pure Chemical Industries Ltd.) в растворе «LRT». Концентрации 7 сахаридов (глюкозы, сорбита, маннита, лактозы, рафинозы, мальтозы и сахарозы) корректировали таким образом, чтобы они имели такое же осмотическое давление, как давление 5% (масс./об.) раствора декстрана.
4-2 Результаты
После получения hMSC-BM способом, описанным в разделе «1-1-3 Получение клеток млекопитающего» в примере 1, проводили эксперимент в соответствии с процедурами, описанными в разделе «1-2 Способ» примера 1, с использованием 11 растворов для трансплантации клеток. Результаты приведены на фигуре 6. Аналогично результатам в примерах 1-3, показано, что комбинированное использование декстрана и трегалозы приводит к синергическому подавлению уменьшения выживаемости клеток, когда клетки сохраняют в течение 14 дней, и увеличению количества живых клеток (сравнение «LRTD» с «LRT», «LR» или «S» на фигуре 6). С другой стороны, комбинированное использование трегалозы с каждым из 7 сахаридов (глюкозой, сорбитом, маннитом, лактозой, рафинозой, мальтозой и сахарозой) вместо декстрана приводило к небольшому изменению выживаемости клеток по сравнению с использованием только трегалозы (сравнение «LRT» с «LRT + GL», «LRT + SR», «LRT + MN», «LRT + LC», «LRT + RF», «LRT + ML» или «LRT + SC» на фигуре 6). Эти результаты демонстрируют, что в отличие от декстрана, 7 сахаридов не имели эффекта подавления гибели клеток и увеличения количества живых клеток в растворе для трансплантации клеток, когда клетки млекопитающего, такие как hMSC-BM, сохраняли в течение длительного периода времени.
Кроме того, проводили эксперимент, в котором каждый из 7 сахаридов (глюкозу, сорбит, маннит, лактозу, рафинозу, мальтозу и сахарозу) использовали отдельно, не сочетая с трегалозой или декстраном, для подтверждения того, что 7 сахаридов не имели эффекта подавления гибели клеток и увеличения количества живых клеток в растворе для трансплантации клеток, когда клетки млекопитающего, такие как hMSC-BM, сохраняли в течение длительного периода времени (фиг. 7).
Пример 5
5. Изучение физиологического водного раствора в настоящем растворе для трансплантации клеток
5-1 Материалы
5-1-1 Раствор для трансплантации клеток
LR: Инъекция Lactec (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LRTD: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы и 5% (масс./об.) декстрана инъекция Lactec
S: Нормальный солевой раствор Otsuka (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
STD: Содержащий 3% (масс./об.) трегалозы и 5% (масс./об.) декстрана нормальный солевой раствор Otsuka
5% Глюкоза: Инъекция 5% глюкозы Otsuka (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
5% Глюкоза TD: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы и 5% (масс./об.) декстрана инъекция 5% глюкозы Otsuka
Рингер: Раствор Рингера «Otsuka» (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
Рингер TD: Содержащий 3% (масс./об.) трегалозы и 5% (масс./об.) декстрана раствор Рингера «Otsuka»
Veen: Инфузия Veen F (от компании Kowa Pharmaceutical Co., Ltd.)
Veen TD: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы и 5% (масс./об.) декстрана инфузия Veen F
5-1-2 Получение раствора для трансплантации клеток
1) Содержащую 5% (масс./об.) декстрана инъекцию Lactec (раствор «LRD») и содержащую 3% (масс./об.) трегалозы и 5% (масс./об.) декстрана инъекцию Lactec (раствор «LRTD») получали способом, описанным в разделе «1-1-2 Получение раствора для трансплантации клеток» примера 1.
2) Содержащий 3% (масс./об.) трегалозы и 5% (масс./об.) декстрана нормальный солевой раствор Otsuka (раствор «STD») получали путем добавления и растворения трегалозы (от компании Hayashibara Co., Ltd.) и декстрана 40 (от компании Meito Sangyo Co., Ltd.) в нормальном солевом растворе Otsuka (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.).
3) Содержащую 3% (масс./об.) трегалозы и 5% (масс./об.) декстрана инъекцию 5% глюкозы Otsuka (раствор «5% глюкоза TD») получали путем добавления и растворения трегалозы (от компании Hayashibara Co., Ltd.) и декстрана 40 (от компании Meito Sangyo Co., Ltd.) в инъекции 5% глюкозы Otsuka (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.).
4) Содержащий 3% (масс./об.) трегалозы и 5% (масс./об.) декстрана раствор Рингера «Otsuka» (раствор «Рингер TD») получали путем добавления и растворения трегалозы (от компании Hayashibara Co., Ltd.) и декстрана 40 (от компании Meito Sangyo Co., Ltd.) в растворе Рингера «Otsuka» (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.).
5) Содержащую 3% (масс./об.) трегалозы и 5% (масс./об.) декстрана инфузию Veen F получали путем добавления и растворения трегалозы (от компании Hayashibara Co., Ltd.) и декстрана 40 (от компании Meito Sangyo Co., Ltd.) в инфузии Veen F (от компании Kowa Pharmaceutical Co., Ltd.).
5-2 Результаты
После получения hMSC-BM способом, описанным в разделе «1-1-3 Получение клеток млекопитающего» в примере 1, проводили эксперимент в соответствии с процедурами, описанными в разделе «1-2 Способ» примера 1, с использованием 10 растворов для трансплантации клеток. Результаты приведены на фигуре 8. Показано, что использование нормального солевого раствора Otsuka (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.), раствора Рингера «Otsuka» (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) или инфузии Veen F (от компании Kowa Pharmaceutical Co., Ltd.) в качестве физиологического водного раствора в растворе для трансплантации клеток приводило к подавлению гибели клеток, когда hMSC-BM сохраняли в течение 14 дней, и увеличению количества живых клеток в растворе для трансплантации клеток (сравнение «S» с «STD», сравнение «Рингер» с «Рингер TD» или сравнение «Veen» с «Veen TD» на фигуре 8). С другой стороны, использование инъекции 5% глюкозы Otsuka (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) не приводило к подавлению гибели клеток, когда hMSC-BM сохраняли в течение 14 дней (сравнение «5% глюкоза» с «5% глюкоза TD» на фигуре 8). Приведенные выше результаты показывают, что эффект подавления уменьшения выживаемости клеток за счет комбинированного использования трегалозы и декстрана наблюдали, когда в качестве физиологического водного раствора использовали по меньшей мере каждый из солевого раствора, раствора Рингера-лактата, раствора Рингера и раствора Рингера-ацетата.
Пример 6
6. Подтверждение 3 того, что настоящий раствор для трансплантации клеток имеет синергический эффект подавления уменьшения выживаемости клеток (оценка с использованием клеток млекопитающего, отличных от hMSC-BM).
Изучали, наблюдается ли аналогичный эффект подавления уменьшения выживаемости клеток, проявляемый настоящим раствором для трансплантации клеток, при использовании клеток млекопитающего, отличных от hMSC-BM.
6-1 Материалы
6-1-1 Раствор для трансплантации клеток
S: Нормальный солевой раствор Otsuka (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LR: Инъекция Lactec (R) (от компании Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LRT: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы инъекция Lactec
LRD: Содержащая 5% (масс./об.) декстрана инъекция Lactec
LRTD: Содержащая 3% (масс./об.) трегалозы и 5% (масс./об.) декстрана инъекция Lactec
6-1-2 Получение раствора для трансплантации клеток
Содержащую 3% (масс./об.) трегалозы инъекцию Lactec (раствор «LRT»), содержащую 5% (масс./об.) декстрана инъекцию Lactec (раствор «LRD») и содержащую 3% (масс./об.) трегалозы и 5% (масс./об.) декстрана инъекцию Lactec (раствор «LRTD») получали способом, описанным в разделе «1-1-2 Получение раствора для трансплантации клеток» примера 1.
6-2 Способ
[1] Среду RPMI (18 мл) (от компании Gibco Co., Ltd.) при комнатной температуре добавляли в 50-мл коническую центрифужную пробирку.
[2] Крышку контейнера для хранения (флакона), в котором человеческие T-клетки периферической крови (hPBT) (от компании CELL APPLICATIONS, INC.) были заморожены для хранения, приоткрывали для уменьшения давления, после чего крышку вновь закрывали.
[3] Клетки размораживали при легком перемешивании в инкубаторе при температуре 37°C.
[4] Оттаявшие клетки переносили в коническую центрифужную пробирку, в которую добавляли вышеуказанную среду RPMI.
[5] Центрифугирование проводили при 400×g и температуре 25°C в течение 5 минут, клетки извлекали, удаляя супернатант аспирацией, и суспендировали в 10 мл/флакон PBS (от компании Invitrogen Co., Ltd.).
[6] Количество клеток измеряли с использованием счетчика клеток, и PBS (от компании Invitrogen Co., Ltd.) добавляли до достижения плотности 5×105 клеток/мл, с последующим охлаждением на льду.
[7] Суспензию клеток (0,5 мл) распределяли в каждую из 12 15-мл конических центрифужных пробирок с использованием FINPIPETTE (100-1000 мкл) и центрифугировали при 400×g и температуре 25°C в течение 5 минут для сбора клеток.
[8] Супернатант отсасывали/удаляли, hPBT суспендировали в каждом из 5 растворов для трансплантации клеток и затем хранили в холодильнике (в условиях температуры 4°C). Для определения выживаемости клеток перед сохранением супернатант после центрифугирования отсасывали/удаляли и остаток суспендировали в PBS (от компании Invitrogen Co., Ltd.), после чего немедленно отбирали часть (20 мкл) суспензии, смешивали ее с 20 мкл раствора красителя трипанового синего (от компании Gibco Co., Ltd.), затем измеряли общее количество клеток и количество мертвых клеток, используя счетчик клеток, под микроскопом для оценки количества живых клеток (см. «P» на фигуре 9).
[9] После сохранения hPBT в растворе для трансплантации клеток их осторожно перемешивали (5-кратным пипетированием объема жидкости 250 мкл) таким образом, что кончик наконечника пипетки вводили до положения визуально примерно 5 мм от дна, чтобы перевести клетки в суспендированное состояние, в день 1, день 3, день 7 и день 14 хранения, и часть (20 мкл) суспензии отбирали в 1,5-мл микропробирку, смешивали с 20 мкл раствора красителя трипанового синего (от компании Gibco Co., Ltd.), затем измеряли общее количество клеток и количество мертвых клеток, используя счетчик клеток, под микроскопом для оценки количества живых клеток.
6-3 Результаты
Результаты оценки количества живых клеток приведены в таблице 3 и на фигуре 9. Если hPBT сохраняли в растворе S и растворе LR в течение 1 дня, показатели выживаемости клеток снижались до 18% и 29%, соответственно («S» и «LR» через 1 день после начала хранения в таблице 3 и на фигуре 9). Если hPBT сохраняли в растворе LRT и растворе LRD в течение 1 дня, показатели выживаемости клеток улучшались до 37% и 49%, соответственно, без статистически значимого отличия («LRT» и «LRD» через 1 день после начала хранения в таблице 3 и на фигуре 9). С другой стороны, если hPBT сохраняли в растворе LRTD в течение 1 дня, показатели выживаемости клеток достигали 82%, что существенно отличается от показателей при сохранении в растворе LR («LRTD» через 1 день после начала хранения в таблице 3 и на фигуре 9). Данные результаты демонстрируют, что комбинированное использование трегалозы и декстрана может приводить к эффективному подавлению уменьшения выживаемости клеток hPBT.
Эффект комбинированного использования трегалозы и декстрана становился более заметным, когда hPBT сохраняли в течение 3 дней, 7 дней и 14 дней. В частности, комбинированное использование трегалозы и декстрана приводило к возрастанию выживаемости клеток в два раза или более по сравнению с использованием отдельно трегалозы или декстрана, и, как показано, комбинированное использование трегалозы и декстрана имело синергический эффект («LRTD» через 3 дня, 7 дней и 14 дней после начала хранения в таблице 3 и на фигуре 9). В частности, в случае 7-дневного хранения процентные доли hPBT, выживающих в растворе LRT и растворе LRD, составляли 13% и 17%, соответственно, в общей сложности 30%, в то время как процентная доля hPBT, выживающих в растворе LRTD, достигала 57% (1,9 раз), что указывало на высокий синергический эффект комбинированного использования трегалозы и декстрана. Эти результаты показывают, что эффект подавления уменьшения количества живых клеток за счет комбинированного использования трегалозы и декстрана также наблюдается при использовании других клеток млекопитающего (hPBT), помимо hMSC-BM.
| Таблица 3 Выживаемость клеток(%) при хранении hPBT |
||||
| Раствор для трансплантации клеток | 1 день | 3 дня | 7 дней | 14 дней |
| S | 18±12 | 4±4 | 1±1 | 0±0 |
| LR | 29±21 | 22±15 | 8±5 | 4±3 |
| LRT | 37±17 | 22±11 | 13±7 | 11±6 |
| LRD | 49±13 | 25±18 | 17±7 | 16±7* |
| LRTD | 82±7*** | 66±19*** | 57±14*** | 32±8*** |
В графе «Выживаемость клеток (%)» вышеприведенной таблицы процентная доля живых клеток в расчете на общее количество клеток приведена в качестве показателя выживаемости клеток (%) (среднее ± стандартное отклонение, [n=6]. «*» и «***» в таблице указывают на наличие статистически значимого отличия (P<0,05 и P<0,001, соответственно) относительно LR согласно критерию Даннета. Выживаемость клеток до хранения составляла «92±3(%)». Для 5 типов «Раствора для трансплантации клеток» в вышеприведенной таблице см. раздел «6-1-1 Раствор для трансплантации клеток» в примере 6.
Промышленная применимость
Настоящее изобретение позволяет обеспечивать качественную клеточную суспензию, в которой может подавляться уменьшение выживаемости клеток, когда клеточную суспензию, содержащую стволовые клетки, такие как MSC, и лейкоциты, такие как T-клетки, сохраняют в течение длительного периода времени, и таким образом, оно полезно в области медицинской трансплантации в регенеративной медицине или тому подобном, а также в области лечения рака.
Claims (5)
1. Способ сохранения клетки млекопитающего, включающий стадию сохранения клетки млекопитающего в физиологическом водном растворе для трансплантации клеток, содержащем 2,0-6,0% (масс./об.) трегалозы, либо соли указанной трегалозы, и 4,0-7,0% (масс./об.) декстрана, либо соли декстрана, где клетку млекопитающего сохраняют в физиологическом водном растворе для трансплантации клеток в течение от 1 до 14 дней, где указанная клетка млекопитающего не является эмбриональной клеткой человека.
2. Способ по п.1, в котором физиологический водный раствор выбирают из группы, состоящей из раствора Рингера-лактата, физиологического солевого раствора, раствора Рингера и раствора Рингера-ацетата.
3. Способ по п.1 или 2, в котором клетку млекопитающего сохраняют в физиологическом водном растворе для трансплантации клеток в течение 3-14 дней.
4. Способ по п.1 или 2, в котором клетка млекопитающего представляет собой мезенхимальную стволовую клетку млекопитающего или T-клетку млекопитающего.
5. Способ по п.4, в котором мезенхимальная стволовая клетка млекопитающего представляет собой человеческую мезенхимальную стволовую клетку из костного мозга и T-клетка млекопитающего представляет собой человеческую T-клетку периферической крови.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013137454 | 2013-06-28 | ||
| JP2013-137454 | 2013-06-28 | ||
| PCT/JP2014/003266 WO2014208053A1 (ja) | 2013-06-28 | 2014-06-18 | トレハロース及びデキストラン含有哺乳動物細胞移植用溶液 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015154110A RU2015154110A (ru) | 2017-08-01 |
| RU2663793C2 true RU2663793C2 (ru) | 2018-08-09 |
Family
ID=52141419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015154110A RU2663793C2 (ru) | 2013-06-28 | 2014-06-18 | Содержащий трегалозу и декстран раствор для трансплантации клеток млекопитающих |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10945427B2 (ru) |
| EP (1) | EP3015545B1 (ru) |
| JP (2) | JP5820958B2 (ru) |
| KR (1) | KR102193132B1 (ru) |
| CN (1) | CN105324480B (ru) |
| AU (1) | AU2014300400B2 (ru) |
| BR (1) | BR112015030374A2 (ru) |
| CA (1) | CA2913478C (ru) |
| CL (1) | CL2015003599A1 (ru) |
| ES (1) | ES2708999T3 (ru) |
| HK (1) | HK1220225A1 (ru) |
| IL (1) | IL242856B (ru) |
| MY (1) | MY171390A (ru) |
| NZ (1) | NZ714410A (ru) |
| PH (1) | PH12015502722B1 (ru) |
| RU (1) | RU2663793C2 (ru) |
| SA (1) | SA515370295B1 (ru) |
| SG (2) | SG11201510045TA (ru) |
| TW (1) | TWI640629B (ru) |
| WO (1) | WO2014208053A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201507922B (ru) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ306800B6 (cs) * | 2016-05-13 | 2017-07-12 | Ústav experimentální medicíny AV ČR, v. v. i. | Prostředek pro uchování, transport a aplikaci kmenových buněk |
| CN105994253A (zh) * | 2016-07-15 | 2016-10-12 | 广州姿生生物科技有限公司 | 一种免疫细胞冻存液 |
| JP7006943B2 (ja) | 2016-11-04 | 2022-01-24 | 国立大学法人 東京大学 | 間葉系細胞及び間葉系幹細胞の凍結保存用溶液、凍結物、及び凍結保存方法 |
| WO2018110159A1 (ja) * | 2016-12-14 | 2018-06-21 | 株式会社大塚製薬工場 | 哺乳動物細胞凍結保存液 |
| WO2018123628A1 (ja) * | 2016-12-28 | 2018-07-05 | ロート製薬株式会社 | 細胞医薬組成物、疾患治療用キット及び細胞懸濁用溶液 |
| JP7133549B2 (ja) | 2017-06-06 | 2022-09-08 | 住友ファーマアニマルヘルス株式会社 | 細胞凝集低減方法および細胞凝集が低減された治療用組成物 |
| US20200291358A1 (en) | 2017-09-08 | 2020-09-17 | Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. | Stem cell derived from young pig and method for producing same |
| JP6667792B2 (ja) * | 2017-11-17 | 2020-03-18 | 良弘 鈴木 | 抗癌剤の製造方法、抗癌剤及び医薬 |
| SG11202102876XA (en) * | 2018-09-28 | 2021-04-29 | Otsuka Pharma Factory Inc | Mammal cell preserving solution containing acarbose or stachyose |
| FR3088541B1 (fr) * | 2018-11-15 | 2021-11-05 | Lab Francais Du Fractionnement | Procede de conservation de cellules a visee therapeutique |
| EP3940061A4 (en) * | 2019-03-15 | 2023-01-04 | Megakaryon Corporation | PRESERVATION LIQUID FOR MAMMALIAN CELLS |
| SG11202111764RA (en) | 2019-04-26 | 2021-11-29 | Otsuka Pharma Factory Inc | Trehalose-containing liquid for mammalian cell preservation |
| JP7079045B2 (ja) * | 2020-01-17 | 2022-06-01 | 株式会社大塚製薬工場 | トレハロースを含む血球系細胞保存用液 |
| WO2021193606A1 (ja) * | 2020-03-27 | 2021-09-30 | 株式会社大塚製薬工場 | アカルボース及びデキストランを含む哺乳動物細胞保存用液 |
| JP2022020549A (ja) * | 2020-07-20 | 2022-02-01 | イビデン株式会社 | 細胞製剤 |
| WO2024106538A1 (ja) * | 2022-11-18 | 2024-05-23 | 株式会社ヘリオス | リンパ球の製造及び凍結保存方法、そのための洗浄液及び凍結保存液、並びに凍結保存したリンパ球からの移植用リンパ球の調製 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1516923A2 (en) * | 2000-05-16 | 2005-03-23 | The General Hospital Corporation | Method of culturing cells |
| US20090081785A1 (en) * | 2007-09-24 | 2009-03-26 | Hememics Biotechnologies, Inc. | Desiccated Biologics And Methods Of Preparing The Same |
| WO2012063870A1 (ja) * | 2010-11-09 | 2012-05-18 | 株式会社大塚製薬工場 | 幹細胞懸濁液 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3253131B2 (ja) | 1992-07-24 | 2002-02-04 | 洋巳 和田 | 移植臓器用溶液 |
| US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
| US6280718B1 (en) | 1999-11-08 | 2001-08-28 | Wisconsin Alumni Reasearch Foundation | Hematopoietic differentiation of human pluripotent embryonic stem cells |
| EP1403374A4 (en) | 2001-06-08 | 2004-07-21 | Dnavec Research Inc | GENE TRANSFER IN EMBRYONIC PRIMATE STEM CELLS WITH THE VSV-G PSEUDOTYPE MONKEY IMMUNITY WEAK VIRUS VECTOR |
| US7880925B2 (en) | 2005-08-02 | 2011-02-01 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Apparatus and method for generating an image file with a color layer and a monochrome layer |
| JP5274017B2 (ja) | 2005-10-13 | 2013-08-28 | 株式会社大塚製薬工場 | 肝臓保存液 |
| TW200836625A (en) * | 2007-03-13 | 2008-09-16 | Otsuka Pharma Co Ltd | Evaluation method for tissue-preserving liquid |
| EP2229436B1 (en) * | 2007-12-04 | 2017-08-30 | Proteobioactives Pty Ltd | Protection of progenitor cells and regulation of their differentiation |
| MX339624B (es) * | 2008-08-20 | 2016-06-02 | Anthrogenesis Corp | Composiciones mejoradas de celulas y metodos para preparar las mismas. |
| ES2541212T3 (es) * | 2009-05-20 | 2015-07-16 | Celyad S.A. | Composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades cardiacas |
| WO2012133575A1 (ja) * | 2011-03-29 | 2012-10-04 | 株式会社大塚製薬工場 | 間葉系幹細胞の細胞死抑制方法 |
| CN102746372B (zh) * | 2012-07-19 | 2014-08-13 | 陕西佰傲再生医学有限公司 | 一种细胞外基质冷冻干燥保护液及其使用方法 |
-
2014
- 2014-06-18 RU RU2015154110A patent/RU2663793C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-06-18 ES ES14818277T patent/ES2708999T3/es active Active
- 2014-06-18 MY MYPI2015704333A patent/MY171390A/en unknown
- 2014-06-18 CA CA2913478A patent/CA2913478C/en active Active
- 2014-06-18 SG SG11201510045TA patent/SG11201510045TA/en unknown
- 2014-06-18 AU AU2014300400A patent/AU2014300400B2/en active Active
- 2014-06-18 CN CN201480034721.2A patent/CN105324480B/zh active Active
- 2014-06-18 SG SG10201710158QA patent/SG10201710158QA/en unknown
- 2014-06-18 JP JP2015514255A patent/JP5820958B2/ja active Active
- 2014-06-18 US US14/895,366 patent/US10945427B2/en active Active
- 2014-06-18 NZ NZ714410A patent/NZ714410A/en not_active IP Right Cessation
- 2014-06-18 KR KR1020157033949A patent/KR102193132B1/ko active IP Right Grant
- 2014-06-18 EP EP14818277.7A patent/EP3015545B1/en active Active
- 2014-06-18 WO PCT/JP2014/003266 patent/WO2014208053A1/ja active Application Filing
- 2014-06-18 BR BR112015030374A patent/BR112015030374A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2014-06-27 TW TW103122257A patent/TWI640629B/zh active
-
2015
- 2015-10-05 JP JP2015197577A patent/JP5998265B2/ja active Active
- 2015-10-23 ZA ZA2015/07922A patent/ZA201507922B/en unknown
- 2015-11-30 IL IL242856A patent/IL242856B/en not_active IP Right Cessation
- 2015-12-07 PH PH12015502722A patent/PH12015502722B1/en unknown
- 2015-12-11 CL CL2015003599A patent/CL2015003599A1/es unknown
- 2015-12-17 SA SA515370295A patent/SA515370295B1/ar unknown
-
2016
- 2016-07-13 HK HK16108221.6A patent/HK1220225A1/zh unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1516923A2 (en) * | 2000-05-16 | 2005-03-23 | The General Hospital Corporation | Method of culturing cells |
| US20090081785A1 (en) * | 2007-09-24 | 2009-03-26 | Hememics Biotechnologies, Inc. | Desiccated Biologics And Methods Of Preparing The Same |
| WO2012063870A1 (ja) * | 2010-11-09 | 2012-05-18 | 株式会社大塚製薬工場 | 幹細胞懸濁液 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ШАГИМАРДАНОВА Е. И. и др., Жизнь без воды: криптобиоз беспозвоночных как модель для разработки технологии консервации биоматериала нового поколения, Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2012, Т. 7, N. 3, c. 185-189. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2663793C2 (ru) | Содержащий трегалозу и декстран раствор для трансплантации клеток млекопитающих | |
| JP5341059B2 (ja) | 幹細胞懸濁液 | |
| JP7006943B2 (ja) | 間葉系細胞及び間葉系幹細胞の凍結保存用溶液、凍結物、及び凍結保存方法 | |
| JP6353615B1 (ja) | 哺乳動物細胞凍結保存液 | |
| KR20210045443A (ko) | 아카보즈 또는 스타키오스를 포함하는 포유동물 세포 보존용 액 | |
| JP5753874B2 (ja) | 細胞生存率低下抑制剤 | |
| JP6830294B1 (ja) | トレハロースを含む哺乳動物細胞保存用液 | |
| JP2013252126A (ja) | デキストラン含有肺塞栓形成予防用哺乳動物細胞懸濁液 | |
| WO2021193606A1 (ja) | アカルボース及びデキストランを含む哺乳動物細胞保存用液 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200619 |