KR20210045443A - 아카보즈 또는 스타키오스를 포함하는 포유동물 세포 보존용 액 - Google Patents

아카보즈 또는 스타키오스를 포함하는 포유동물 세포 보존용 액 Download PDF

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마스히로 니시무라
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가부시기가이샤오오쓰까세이야꾸고오죠오
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Abstract

본 발명은, 포유동물 세포를 액체 중에서 보존했을 때에 발생하는 세포 생존율 저하나 세포 응집을 효과적으로 억제할 수 있으면서, 포유동물의 생체 내에 투여했을 경우에, 포유동물의 생체에 악영향을 미칠 가능성이 낮은 물질이나, 이러한 물질을 포함하는 포유동물 세포 보존용 액 등을 제공하는 것을 과제로 한다.
아카보즈 혹은 그 염, 및/또는 스타키오스 혹은 그 염을 포함하는 액을, 포유동물 세포를 보존하기 위해서 이용하면, 포유동물 세포를 액체 중에 보존했을 때에 발생하는 세포 생존율 저하나 세포 응집을 효과적으로 억제할 수 있다. 또한, 상기액 중에서 보존한 포유동물 세포는, 새로운 이식용 액으로 옮기지 않고, 그대로 포유동물의 생체 내에 투여할 수 있다.

Description

아카보즈 또는 스타키오스를 포함하는 포유동물 세포 보존용 액
본 발명은, 아카보즈(acarbose) 혹은 그 염(이하, '아카보즈류'라고 하는 경우가 있다), 및/또는 스타키오스(stachyose) 혹은 그 염(이하, '스타키오스류'라고 하는 경우가 있다)을 포함하는 포유동물 세포 보존용 액(이하, '본건 포유동물 세포 보존용 액'이라고 하는 경우가 있다)이나, 본건 포유동물 세포 보존용 액(保存用液)을 이용하여 포유동물 세포를 보존하는 방법에 관한 것이다.
최근, 줄기세포 연구의 급속한 발전에 의해 재생 의료에 대한 기운이 높아지고 있어, 그 지식이나 이해는, 연구자뿐 아니라, 일반에도 널리 보급되어 오고 있다. 줄기세포를 이용한 재생 의료는, 줄기세포가 갖는 자기 복제능과 다분화능이나, 줄기세포가 분비하는 인자를 이용하여, 여러가지 질환으로 손상을 받은 세포나 조직의 기능을 회복시키는 것을 목적으로 한 의료이다. 백혈병이나 재생 불량성 빈혈 등의 혈액 난치병의 환자에게 골수 이식을 하면, 조혈 줄기세포가 환자 체내에 생착하여, 거의 일생에 걸쳐서 조혈능의 유지가 가능해진다. 또한, 최근에는 많은 연구자가 조혈줄기세포 이외의 줄기세포를 이용한 임상 응용을 목표로, 중추 신경, 말초 신경, 골수, 소장 등에서의 줄기세포를 동정(同定)하여, 외상성 질환이나 조직 변성 질환에 대한 조직줄기세포의 이식 치료가 실천되기 시작하고 있다(비특허문헌 1~3). 한편, 암면역 세포 요법은, 암을 공격하는 기능을 갖는 면역 세포를 체외로 꺼내, 그 기능을 강화한 후, 다시 체내에 되돌린다는 최첨단 세포 의료로, 수지상 세포 백신 요법, 알파·베타 T세포 요법(αβT세포 요법), 감마·델타 T세포 요법(γδT세포 요법), CTL 요법, 자연살해세포 요법(NK세포 요법) 등의 T세포를 이용한 요법이 실천되고 있다.
이식 치료에 이용하는 줄기세포나 T세포를 장기 보존하는 경우, 액체 중에서의 보존으로는 세포 생존율을 양호하게 유지할 수 없다. 예를 들어, 인간 골수줄기세포를 생리 식염수 중에 냉장 보존(4℃)하면, 세포 생존율이 48시간 후에는 40% 이하까지 저하되고, 72시간 후에는 20% 이하까지 저하하는 것이 보고되고 있다(비특허문헌 4). 그러므로, 이식용 줄기세포나 이식용 T세포를 장기 보존하는 경우, 동결 보존 하는 것이 일반적이다. 그러나, 동결 보존액 중에는, 통상적으로 DMSO, 글리세롤 등의 동결 보존제가 첨가되어 있으므로, 동결 보존한 줄기세포나 T세포를 해동한 후, 이식 치료를 수행하기 전에 이식 동결 보존제를 제거할 필요가 있어, 번거로운 것이 문제가 되었다. 또한, 동결 보존액에 동결 보존제를 첨가해도 동결 시의 물의 결정화에 의한 세포 골격의 데미지가 크고, 동결 융해 후의 세포 생존율이 저하되는 것도 문제가 되었다. 그러므로, 간편성이 뛰어나면서 세포 생존율의 저하를 억제할 수 있는 세포 보존액의 개발이 급선무가 되었다.
본 발명자들은, 트레할로스에는, 포유동물 세포를 액체 중에서 보존했을 때에 발생하는 세포 생존율 저하나 세포 응집을 억제하는 작용이 있는 것을 보고하고 있다(특허문헌 1 및 2). 그러나, 아카보즈나 스타키오스가, 이러한 작용을 갖는 것에 대해서는 지금까지 알려지지 않았다.
특허문헌 1: 일본 특허공개공보 제 2012-115253호 특허문헌 2: 국제 공개 팜플렛 제 2014/208053호
비특허문헌 1: Gage, F.H., Science 287: 1433-1438(2000) 비특허문헌 2: Morrison, S.J. et al., Cell 96: 737-749(1999) 비특허문헌 3: Batle, E. et al., Cell 111: 251-263(2002) 비특허문헌 4: Lane, T.A. et al., Transfusion 49: 1471-1481(2009)
본 발명의 과제는, 포유동물 세포를 액체 중에서 보존했을 때에 발생하는 세포 생존율 저하나 세포 응집을 효과적으로 억제할 수 있으면서, 포유동물의 생체 내에 투여했을 경우에, 포유동물의 생체에 악영향을 미칠 가능성이 낮은 물질이나, 이러한 물질을 포함하는 포유동물 세포 보존용 액 등을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 열심히 연구를 계속하고 있다. 그 과정에 있어서, 93종류의 당류 중에서, 포유동물 세포의 생존율 저하를 억제하면서, 그 작용 효과가 트레할로스보다 높은 것으로, 아카보즈와 스타키오스를 발견했다. 또한 이들 4당은, 포유동물 세포의 세포 응집을 억제하는 작용을 갖는 것도 확인했다. 본 발명은, 이러한 지견(知見)을 바탕으로, 완성하기에 이른 것이다.
즉, 본 발명은 아래와 같다.
[1] 아카보즈 혹은 그 염, 및/또는 스타키오스 혹은 그 염을 포함하는, 포유동물 세포 보존용 액.
[2] 아카보즈 혹은 그 염, 및/또는 스타키오스 혹은 그 염을 등장액 중에 포함하는, 상기 [1]에 기재된 액.
[3] 등장액 중의 아카보즈 혹은 그 염의 농도가, 적어도 40 mM인, 상기 [2]에 기재된 액.
[4] 등장액 중의 스타키오스 혹은 그 염의 농도가, 적어도 40 mM인, 상기 [2] 또는 [3]에 기재된 액.
[5] 등장액이, 젖산 링거액, 아세트산 링거액, 링거액, 또는 생리 식염액인, 상기 [2]~[4] 중 어느 하나에 기재된 액.
[6] 포유동물 세포를 0~40℃에서 보존하기 위한, 상기 [1]~[5] 중 어느 하나에 기재된 액.
[7] 포유동물 세포를 6시간~30일간 보존하기 위한, 상기 [1]~[6] 중 어느 하나에 기재된 액.
[8] 포유동물 세포의 생존율 저하를 억제하기 위해서 이용되는, 상기 [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 액.
[9] 포유동물 세포의 응집을 억제하기 위해서 이용되는, 상기 [1]~[8] 중 어느 하나에 기재된 액.
[10] 포유동물 세포의 이식에 이용되는, 상기 [1]~[9] 중 어느 하나에 기재된 액.
[11] 포유동물 세포가, 포유동물 줄기세포, 포유동물 림프구 세포, 또는 포유동물 간세포인, 상기 [1]~[10] 중 어느 하나에 기재된 액.
[12] 포유동물 줄기세포가, 포유동물 중간엽 줄기세포 또는 포유동물 림프구 세포인, 상기 [11]에 기재된 액.
[13] 아카보즈 혹은 그 염, 및/또는 스타키오스 혹은 그 염을 포함하는 액 중에서, 포유동물 세포를 보존하는 공정을 포함하는, 포유동물 세포의 보존 방법.
[14] 액이, 등장액인, 상기 [13]에 기재된 보존 방법.
[15] 등장액 중의 아카보즈 혹은 그 염의 농도가, 적어도 40 mM인, 상기 [14]에 기재된 보존 방법.
[16] 등장액 중의 스타키오스 또는 그 염의 농도가, 적어도 40 mM인, 상기 [14] 또는 [15]에 기재된 보존 방법.
[17] 등장액이, 젖산 링거액, 아세트산 링거액, 링거액, 또는 생리 식염액인, 상기 [14]~[16] 중 어느 하나에 기재된 보존 방법.
[18] 포유동물 세포를 0~40℃에서 보존하는 것을 특징으로 하는, 상기 [13]~[17] 중 어느 하나에 기재된 보존 방법.
[19] 포유동물 세포를 6시간~30일간 보존하는 것을 특징으로 하는, 상기 [13]~[18] 중 어느 하나에 기재된 보존 방법.
[20] 포유동물 세포가, 포유동물 줄기세포, 포유동물 림프구 세포, 또는 포유동물 간세포인, 상기 [13]~[19] 중 어느 하나에 기재된 보존 방법.
[21] 포유동물 줄기세포가, 포유동물 중간엽 줄기세포 또는 포유동물 림프구 세포인, 상기 [20]에 기재된 보존 방법.
[22] 아카보즈 혹은 그 염, 및/또는 스타키오스 혹은 그 염을 포함하는, 상기 [1]~[12] 중 어느 하나에 기재된 액을 조제하기 위한 분말 제제.
또한 본 발명의 실시의 다른 형태로, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액을, 포유동물 세포의 이식을 필요로 하는 대상(예를 들어, 외상성 질환 환자, 조직 변성 질환 환자, 암환자)에게 투여하는 공정을 포함하는, 포유동물 세포의 이식 방법;이나,
아카보즈류 및/또는 스타키오스류를 포함하는 액(液; 바람직하게는, 등장액)에, 포유동물 세포를 가하거나, 혹은, 포유동물 세포를 포함하는 액(바람직하게는, 등장액)에, 아카보즈류 및/또는 스타키오스류를 가함으로써, 본건 포유동물 세포 보존용 액을 조제하는 공정; 조제한 본건 포유동물 세포 보존용 액 중에서, 포유동물 세포를 보존하는 공정; 보존한 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액을, 포유동물 세포의 이식을 필요로 하는 대상(예를 들어, 외상성 질환 환자, 조직 변성 질환 환자, 암환자)에게 투여하는 공정;을 포함하는, 포유동물 세포의 이식 방법;이나,
본건 포유동물 세포 보존용 액의 제조에서의, 아카보즈류 및/또는 스타키오스류의 사용;이나,
액체 중의 포유동물 세포의 생존율 저하를 억제하기 위한, 아카보즈류 및/또는 스타키오스류의 사용;이나,
액체 중의 포유동물 세포의 세포 응집을 억제하기 위한, 아카보즈류 및/또는 스타키오스류의 사용;이나,
포유동물 세포 이식 치료를 필요로 하는 질환(예를 들어, 외상성 질환, 조직 변성 질환, 암)의 치료에서의 사용을 위한, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액;이나,
아카보즈류 및/또는 스타키오스류를 포함하는 액(바람직하게는, 등장액)에, 포유동물 세포를 가하거나, 혹은, 포유동물 세포를 포함하는 액(바람직하게는, 등장액)에, 아카보즈류 및/또는 스타키오스류를 가함으로써, 본건 포유동물 세포 보존용 액을 조제하는 공정을 포함하는, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액의 조제 방법;이나,
포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액
을 들 수 있다. 그리고, 상기 이식 방법의, 포유동물 세포를 보존하는 공정은, 통상적으로, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액을, 해당 보존용 액이 액체 상태로 존재하는 온도 조건하에서 보존하는 것으로, 해당 보존용 액을 고체 상태로 보존하는 공정(예를 들어, 동결 보존하는 공정, 동결 건조 보존하는 공정 등의 포유동물 세포를 휴면 상태로 보존하는 공정)을 포함하지 않는다.
본 발명에 의하면, 아카보즈류나 스타키오스류를 액체 중에 가함으로써, 포유동물 세포를 액체 중에 보존했을 때에 발생하는 세포 생존율 저하나 세포 응집을 효과적으로 억제할 수 있다. 또한, 이들 아카보즈류 및 스타키오스류는, 포유동물의 생체 내에 투여했을 경우에, 포유동물의 생체에 악영향을 미칠 가능성이 낮은 4당류인 점에서, 포유동물 세포를 본건 포유동물 세포 보존용 액 중에서 보존한 후, 새로운 이식용 액으로 치환하지 않고, 그대로 포유동물의 생체 내에 투여할 수 있다.
도 1은 골수 유래 인간 중간엽 줄기세포(hMSC;Human Mesenchymal Stem Cell)를, 5종류의 피험용 등장액(락텍주(Lactec注)［LR］, 175 mM 아카보즈를 포함하는 락텍주［LR＋175A］, 175 mM 니스토스(Nystose)를 포함하는 락텍주［LR＋175N］, 175 mM 말토테트라오스를 포함하는 락텍주［LR＋175Ma］, 및 175 mM 스타키오스를 포함하는 락텍주［LR＋175S］) 중에 4℃에서 2일간 보존 후의 세포 생존율을, 트리판 블루 염색법에 의해 해석한 결과(n=3)를 나타내는 도면이다(표 1 참조). 도면 중의 'Pre'는, 4℃에서 보존 전의 hMSC를 포함하는 인산 완충 생리 식염수(Phosphate buffered saline;PBS) 중의 hMSC의 세포 생존율(94.7±2.1)을 나타낸다. 도면 중의 '**' 및 '***'는, Dunnett 다중 비교 검정을 수행하여, 각각 통계학적으로 유의차가 있는(p＜0.01 및 p＜0.001) 것을 나타낸다.
도 2는 hMSC를, 9종류의 피험용 등장액(오오츠카생식주(大塚生食注; Otsuka Normal Saline)［S］, 락텍주［LR］, 88 mM 트레할로스를 포함하는 락텍주［LR＋88T］, 88 mM 아카보즈를 포함하는 락텍주［LR＋88A］, 88 mM 글루코스를 포함하는 락텍주［LR＋88G］, 175 mM 트레할로스를 포함하는 락텍주［LR＋175T］, 175 mM 아카보즈를 포함하는 락텍주［LR＋175A］, 175 mM 글루코스를 포함하는 락텍주［LR＋175G］, 및 배지［M］) 중에 4℃에서 3일간 보존 후의 세포 생존율을, XTT법에 의해 해석한 결과(배지 이외는 n=3, 배지는 n=2)를 나타내는 도면이다(표 2 참조). 도면 중의 '*', '**' 및 '***'는, Dunnett 다중 비교 검정을 수행하여, 각각 통계학적으로 유의차가 있는(p＜0.05, p＜0.01 및 p＜0.001) 것을 나타낸다. 또한, 도면 중의 '＃＃' 및 '＃＃＃'은, 88 mM의 3군(LR＋88 T, LR＋88 A 및 LR＋88 G) 사이, 및 175 mM의 3군(LR＋175 T, LR＋175 A, 및 LR＋175 G) 사이에서, Tukey type 다중 비교 검정을 수행하여, 각각 통계학적으로 유의차가 있는(p＜0.01 및 p＜0.001) 것을 나타낸다.
도 3은 hMSC를, 5종류의 피험용 등장액(락텍주［LR］, 44 mM 아카보즈를 포함하는 락텍주［LR＋44A］, 88 mM 아카보즈를 포함하는 락텍주［LR＋88A］, 175 mM 아카보즈를 포함하는 락텍주［LR＋175A］, 및 350 mM 아카보즈를 포함하는 락텍주［LR＋350A］) 중에 4℃에서 3일간 보존 후의 세포 생존율을, 트리판 블루 염색법에 의해 해석한 결과(n=3)를 나타내는 도면이다(표 3 참조). 도면 중의 'Pre'는, 4℃에서 보존 전의 hMSC를 포함하는 PBS 중의 hMSC의 세포 생존율(95.0%)을 나타낸다. 도면 중의 '**' 및 '***'는, Dunnett 다중 비교 검정을 수행하여, 각각 통계학적으로 유의차가 있는(p＜0.01 및 p＜0.001) 것을 나타낸다.
도 4는 hMSC를, 5종류의 피험용 등장액(락텍주［LR］, 88 mM 트레할로스를 포함하는 락텍주［LR＋88T］, 44 mM 아카보즈를 포함하는 락텍주［LR＋44A］, 88 mM 아카보즈를 포함하는 락텍주［LR＋88A］, 및 175 mM 아카보즈를 포함하는 락텍주［LR＋175A］) 중에 4℃에서 28일간 보존 후의 세포 생존율을, 트리판 블루 염색법에 의해 해석한 결과(n=3)를 나타내는 도면이다(표 4 참조). 도면 중의 'Pre'는, 4℃에서 보존 전의 hMSC를 포함하는 PBS 중의 hMSC의 세포 생존율(94.1%)을 나타낸다. 도면 중의 '**' 및 '***'는, Dunnett 다중 비교 검정을 수행하여, 각각 통계학적으로 유의차가 있는(p＜0.01 및 p＜0.001) 것을 나타낸다.
도 5는 랫트(rat) 간세포를, 6종류의 피험용 등장액(오오츠카생식주［S］, 락텍주［LR］, 175 mM 트레할로스를 포함하는 락텍주［LR＋175T］, 175 mM 아카보즈를 포함하는 락텍주［LR＋175A］, 175 mM 글루코스를 포함하는 락텍주［LR＋175G］, 및 배지［M］) 중에 4℃에서 24시간 보존 후의 세포 생존율을, 트리판 블루 염색법에 의해 해석한 결과(n=6)를 나타내는 도면이다(표 6 참조). 도면 중의 'Pre'는, 4℃에서 보존 전의 랫트 간세포를 포함하는 세정용 배지 중의 랫트 간세포의 세포 생존율(70.8±3.32)을 나타낸다. 도면 중의 '***'는, Dunnett 다중 비교 검정을 수행하여, 통계학적으로 유의차가 있는(p＜0.001) 것을 나타낸다. 또한, 도면 중의 '＃＃＃'은, 175 mM의 3군(LR＋175 T, LR＋175 A 및 LR＋175 G) 사이에서, Tukey type 다중 비교 검정을 수행하여, 통계학적으로 유의차가 있는(p＜0.001) 것을 나타낸다.
도 6은 hMSC를, 4종류의 피험용 등장액(락텍주［LR］, 175 mM 아카보즈를 포함하는 락텍주［LR＋175A］, 175 mM 미그리톨(miglitol)을 포함하는 락텍주［LR＋175Mi］, 및 175 mM 보글리보스(voglibose)를 포함하는 락텍주［LR＋175V］) 중에 4℃에서 3일간 보존 후의 세포 생존율을, 트리판 블루 염색법에 의해 해석한 결과(n=3)를 나타내는 도면이다(표 7 참조). 도면 중의 'Pre'는, 4℃에서 보존 전의 hMSC를 포함하는 PBS 중의 hMSC의 세포 생존율(98.5±0.6)을 나타낸다. 도면 중의 '***'는, Dunnett 다중 비교 검정을 수행하여, 통계학적으로 유의차가 있는(p＜0.001) 것을 나타낸다.
도 7은 hMSC를, 2종류의 피험용 등장액(락텍주［LR］, 및 88 mM 아카보즈를 포함하는 락텍주［LR＋88A］) 중에 25℃에서 48시간 보존 후의 위상차 현미경 화상을 나타내는 도면이다. 각각의 피험용 등장액에 대하여, 상이한 시야의 화상을 복수 촬영하고, 대표적인 3개의 화상을 나타낸다. 화상 중의 검은 동그라미로 둘러싼 부분은, 세포 응집괴(凝集塊)를 나타낸다.
도 8은 확대 배양한 CD8 양성 T세포를, 3종류의 피험용 등장액(락텍주［LR］, 88 mM 트레할로스를 포함하는 락텍주［LR＋88T］, 및 88 mM 아카보즈를 포함하는 락텍주［LR＋88A］) 중에 5℃에서 보존 전의 세포 생존율(도 8A) 또는 24시간 보존 후의 세포 생존율(도 8B)을, 트리판 블루 염색법에 의해 해석한 결과(n=3)를 나타내는 도면이다(표 8 참조). 도면 중의 '*' 및 '**'는, Student의 t검정을 수행하여, 각각 통계학적으로 유의차가 있는(p＜0.05및 p＜0.01) 것을 나타내고, 도면 중의 'n. s', Student의 t검정을 수행하여, 통계학적으로 유의차가 없는(p≥0.05) 것을 나타낸다.
도 9는, A는, 5℃에서 보존 전의 hMSC를 포함하는 PBS 중의 hMSC의 세포 생존율(93.7±2.0%)을 나타낸다. B는, 해당 hMSC를, 5종류의 피험용 등장액(락텍주［LR］, 44 mM 스타키오스를 포함하는 락텍주［LR＋44S］, 88 mM 스타키오스를 포함하는 락텍주［LR＋88S］, 175 mM 스타키오스를 포함하는 락텍주［LR＋175S］, 및 88 mM 트레할로스를 포함하는 락텍주［LR＋88T］) 중에 5℃에서 4일간 보존 후의 세포 생존율을, 트리판 블루 염색법에 의해 해석한 결과(n=3)를 나타내는 도면이다(표 9 참조). 도면 중의 '**' 및 '***'는, Dunnett 다중 비교 검정을 수행하여, 각각 통계학적으로 유의차가 있는(p＜0.01 및 p＜0.001) 것을 나타낸다.
도 10은, A는, 5℃에서 보존 전의 hMSC를 포함하는 PBS 중의 hMSC의 세포 생존율(93.7±3.2%)을 나타낸다. B 및 C는, 해당 hMSC를, 8종류의 피험용 등장액(락텍주［LR］, 88 mM 아카보즈를 포함하는 락텍주［LR＋88A］, 오오츠카생식주［S］, 88 mM 아카보즈를 포함하는 오오츠카생식주［S＋88A］, 링거액 '오오츠카'［R］, 88 mM 아카보즈를 포함하는 링거액 '오오츠카'［R＋88A］, 빈F(Veen-F) 수액［AR］, 및 88 mM 아카보즈를 포함하는 빈F 수액［AR＋88A］) 중에 5℃에서, 각각 3일간 및 9일간 보존 후의 세포 생존율을, 트리판 블루 염색법에 의해 해석한 결과(n=3)를 나타내는 도면이다(표 10 참조). 도면 중의 '*', '**', 및 '***'는, Student의 t검정을 수행하여, 각각 통계학적으로 유의차가 있는(p＜0.05, p＜0.01, 및 p＜0.001) 것을 나타내고, 도면 중의 'n. s', Student의 t검정을 수행하여, 통계학적으로 유의차가 없는(p≥0.05) 것을 나타낸다.
본 발명의 포유동물 세포 보존용 액은, '포유동물 세포를 보존하기 위해'라는 용도로 특정된, 아카보즈류 및/또는 스타키오스류를 포함하는 액(즉, 본건 포유동물 세포 보존용 액)이다.
본건 포유동물 세포 보존용 액으로는, 포유동물 세포의 보존이 가능한 액(예를 들어, 등장액, 저장액, 고장액)이면 되고, 등장액을 바람직하게 예시할 수 있다. 본 명세서에 있어서 '등장액'이란, 체액이나 세포액의 침투압과 거의 동일한 침투압을 갖는 액을 의미하고, 구체적으로, 250~380 mOsm/L 범위 내의 침투압을 갖는 액을 의미한다. 또한, 본 명세서에 있어서 '저장액'이란, 체액이나 세포액의 침투압보다 낮은 침투압을 갖는 액을 의미하고, 구체적으로, 250 mOsm/L 미만의 침투압을 갖는 액을 의미한다. 이러한 저장액으로는, 세포가 파열되지 않는 정도의 저장액(구체적으로, 100~250 mOsm/L 미만의 범위 내의 침투압을 갖는 액)이 바람직하다. 또한, 본 명세서에 있어서 '고장액'이란, 체액이나 세포액의 침투압보다 높은 침투압을 갖는 액을 의미하고, 구체적으로, 침투압이 380 mOsm/L 초과(바람직하게는, 380 mOsm/L 초과~1000 mOsm/L 범위 내)를 의미한다.
상기 등장액으로는, 체액이나 세포액의 침투압과 거의 동일해지도록 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 등에 의해 염 농도나 당 농도 등을 조정한 등장액이면 특별히 제한되지 않고, 구체적으로 생리 식염수나, 완충 효과가 있는 생리 식염수(예를 들어, PBS, 트리스 완충 생리 식염수［Tris Buffered Saline;TBS］, HEPES 완충 생리 식염수), 링거액, 젖산 링거액, 아세트산 링거액, 중탄산 링거액, 5% 글루코스 수용액, 동물 세포 배양용 기초 배지(예를 들어, DMEM, EMEM, RPMI-1640,α-MEM, F-12, F-10, M-199), 등장제(예를 들어, 포도당, D-소르비톨, D-만니톨, 락토스, 염화나트륨) 등을 들 수 있고, 이들 중에서도 젖산 링거액, 아세트산 링거액, 링거액, 또는 생리 식염수(생리 식염액)가 바람직하다. 등장액은, 시판의 것일 수도, 직접 조제한 것일 수도 있다. 시판의 것으로는, 오오츠카생식주(오오츠카세이야쿠코죠사 제품)(생리 식염액), 링거액 '오오츠카'(오오츠카세이야쿠코죠사 제품)(링거액), 락텍(등록상표)주(오오츠카세이야쿠코죠사 제품)(젖산 링거액), 젖산 링거액 'KS'(쿄리츠세이야쿠사 제품)(젖산 링거액), 빈F 수액(후소야쿠힝코교사 제품)(아세트산 링거액), 오오츠카 당액(糖液) 5%(오오츠카세이야쿠코죠사 제품)(5% 글루코스 수용액), 비카네이트(BICANATE) 수액(오오츠카세이야쿠코죠사 제품)(중탄산 링거액)를 들 수 있다.
상기 아카보즈(Acarbose)란, D-글루코스, D-글루코스, D-글루코스, 및(1S, 4R, 5S, 6S)-4,5,6-트리하이드록시-3-(하이드록시메틸)-2-사이클로헥센이 연속된 4당으로, 보다 구체적으로, 아래의 식으로 표현되는 물질이다. 아카보즈는, 화학 합성, 미생물에 의한 생산(예를 들어, 악티노플라네스［Actinoplanes］속의 아미노당 산생균의 배양), 효소에 의한 생산 등 중 어느 하나의 공지된 방법에 의해서도 제조할 수 있지만, 시판품을 이용할 수도 있다. 예를 들어, 아카보즈(와코쥰야쿠코교사 제품), 아카보즈(상품명: 글루코바이)(바이엘야쿠힝사 제품) 등의 시판품을 들 수 있다.
[화학식 1]
Figure pct00001
상기 아카보즈의 염으로는, 예를 들어, 염산염, 브롬화 수소산염, 요오드화 수소산염, 인산염, 질산염, 젖산염, 아세트산염, 프로피온산염, 톨루엔 설폰산염, 숙신산염, 옥살산염, 젖산염, 주석산염, 글리콜산염, 메탄 설폰산염, 부티르산염, 길초산염, 구연산염, 푸마르산염, 말레산염, 사과산염 등의 산부가염; 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 등의 금속염; 암모늄염, 알킬 암모늄염; 등을 들 수 있다. 그리고, 이들 염은 사용 시에 용액으로 이용되며, 그 작용은, 아카보즈와 동일한 효과인 것이 바람직하다. 이들 염류는, 수화물 또는 용매화물을 형성할 수도 있고, 또한 어느 하나를 단독으로 또는 2종 이상을 적절히 조합하여 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 등장액 중의 아카보즈류의 농도로는, 아카보즈류에 의한 세포 생존율 저하의 억제 효과가 발휘되는 농도이면 되고, 예를 들어, 적어도 40 mM, 바람직하게는 적어도 80 mM, 보다 바람직하게는 적어도 150 mM, 보다 더 바람직하게는 적어도 160 mM, 한층 더 바람직하게는 적어도 170 mM이다. 또한, 비용 대비 효과의 측면에서, 등장액 중의 아카보즈류의 농도는, 예를 들어, 1000 mM 이하, 바람직하게는 700 mM 이하, 보다 바람직하게는 600 mM 이하, 보다 더 바람직하게는 500 mM 이하, 한층 더 바람직하게는 400 mM 이하이다. 따라서, 등장액 중의 아카보즈류 농도는, 예를 들어, 40~1000 mM 범위 내, 바람직하게는 80~700 mM, 보다 바람직하게는 150~600 mM, 보다 더 바람직하게는 160 m~500 mM, 한층 더 바람직하게는 170~400 mM이다.
상기 스타키오스(Stachyose)란, D-프럭토스, D-글루코스, D-갈락토스, 및 D-갈락토스가 연속된 4당으로, 보다 구체적으로, 아래의 식으로 표현되는 물질이다. 스타키오스는, 화학 합성, 식물에 의한 생산(예를 들어, 대두 등의 콩류나 오이과식물로부터 열수 추출), 효소에 의한 생산 등 중 어느 하나의 공지된 방법에 의해서도 제조할 수 있지만, 시판품을 이용할 수도 있다. 예를 들어, 스타키오스 n 수화물(와코쥰야쿠코교사 제품), 스타키오스 수화물(도쿄카세이코교사 제품) 등의 시판품을 들 수 있다.
[화학식 2]
Figure pct00002
상기 스타키오스의 염으로는, 예를 들어, 염산염, 브롬화 수소산염, 요오드화 수소산염, 인산염, 질산염, 젖산염, 아세트산염, 프로피온산염, 톨루엔 설폰산염, 석신산염, 옥살산염, 젖산염, 주석산염, 글리콜산염, 메탄 설폰산염, 부티르산염, 길초산염, 구연산염, 푸마르산염, 말레산염, 사과산염 등의 산부가염; 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 등의 금속염; 암모늄염, 알킬 암모늄염; 등을 들 수 있다. 그리고, 이들 염은 사용 시에 용액으로 이용되며, 그 작용은, 스타키오스와 동일한 효과인 것이 바람직하다. 이들 염류는, 수화물 또는 용매화물을 형성할 수도 있고, 또한 어느 하나를 단독으로 또는 2종 이상을 적절히 조합하여 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 등장액 중의 스타키오스류의 농도로는, 스타키오스류에 의한 세포 생존율 저하의 억제 효과가 발휘되는 농도이면 되고, 예를 들어, 적어도 40 mM, 바람직하게는 적어도 80 mM, 보다 바람직하게는 적어도 150 mM, 보다 더 바람직하게는 적어도 160 mM, 한층 더 바람직하게는 적어도 170 mM이다. 또한, 비용대비 효과의 측면에서, 등장액 중의 스타키오스류의 농도는, 예를 들어, 1000 mM 이하, 바람직하게는 700 mM 이하, 보다 바람직하게는 600 mM 이하, 보다 더 바람직하게는 500 mM 이하, 한층 더 바람직하게는 400 mM 이하이다. 따라서, 등장액 중의 스타키오스류 농도는, 예를 들어, 40~1000 mM 범위 내, 바람직하게는 80~700 mM, 보다 바람직하게는 150~600 mM, 보다 더 바람직하게는 160 m~500 mM, 한층 더 바람직하게는 170~400 mM이다.
본건 포유동물 세포 보존용 액은, 포유동물 세포를, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액이 액체 상태로 존재하는 온도 조건하에서 임의 기간동안 보존하기 위해 이용하는 것이다. 본건 포유동물 세포 보존용 액 중에 포함되는 아카보즈류나 스타키오스류는, 포유동물 세포를 액체 중에서 보존했을 때에 발생하는 세포 생존율 저하나 세포 응집을 효과적으로 억제하는 작용을 갖는 한편, 포유동물의 생체 내에 투여했을 경우에, 포유동물의 생체에 악영향을 미칠 가능성이 낮은 물질이다. 그러므로, 본건 포유동물 세포 보존용 액은, '포유동물 세포의 생존율 저하를 억제하기 위해'라는 용도;'포유동물 세포의 세포 응집을 억제하기 위해'라는 용도; 및 '포유동물 세포를 이식하기 위해'라는 용도;에서 선택되는 1 또는 2 이상의 용도로, 더 특정된 것이 바람직하다.
본건 포유동물 세포 보존용 액은, 아카보즈류 및 스타키오스류 이외에도, 포유동물 세포의 생존율 저하 억제 작용을 갖는 성분을 포함하는 것일 수도 있지만, 아카보즈류나 스타키오스류만으로도, 포유동물 세포의 생존율 저하 억제 효과를 발휘하므로, 아카보즈류 및 스타키오스류 이외에, 포유동물 세포의 생존율 저하 억제 작용을 갖는 성분(예를 들어, 트레할로스, 하이드록시에틸녹말［Hydroxyethyl starch; HES］, 글루코스)을 포함하지 않는 것일 수도 있다.
본건 포유동물 세포 보존용 액은, 통상적으로, 포유동물 세포를 동결 보존 또는 동결 건조 보존했을 때의 포유동물 세포의 생존율 저하를 억제하는 작용을 갖는 성분, 예를 들어, 디메틸설폭사이드［Dimethyl sulfoxide;DMSO］, 글리세린, 에틸렌글리콜, 트리메틸렌글리콜, 디메틸아세트아미드, 폴리에틸렌글리콜［PEG］, 폴리비닐피롤리돈, 혈청 또는 혈청 유래 성분(예를 들어, 알부민) 등의 동결 보호제 또는 동결 건조 보호제를 포함하지 않는 것일 수도 있다.
본건 포유동물 세포 보존용 액으로는, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액을 그대로 이식에 이용하는 경우, 포유동물 세포 이식에 적합한 액이 바람직하고, 이러한 포유동물 세포 이식에 적합한 액은, 포유동물 세포 이식에 적합하지 않은 물질, 예를 들어, 생체 유래의 성분(예를 들어, 혈청 또는 혈청 유래 성분［예를 들어, 알부민］)이나, 상술한 동결 보호제 또는 동결 건조 보호제를 포함하지 않는 것이 바람직하다.
본건 포유동물 세포 보존용 액으로는, 아카보즈류 또는 스타키오스류를 단독으로 포함하는 액일 수도 있고, 아카보즈류 및 스타키오스류에서 선택되는 2종류 이상의 4당을 포함하는 액이나, 아카보즈류나 스타키오스류 이외에, 추가로 임의 성분을 포함하는 액일 수도 있다.
본 명세서에 있어서 '임의 성분'으로는, 예를 들어, 등장제(예를 들어, 글루코스, 소르비톨, 만니톨, 락토스, 염화나트륨), 킬레이트제(예를 들어, EDTA, EGTA, 구연산, 살리실레이트), 용해 보조제, 보존제, 산화 방지제, 아미노산(예를 들어, 프롤린, 글루타민), 폴리머(예를 들어, 폴리에테르), 인지질(예를 들어, 리소포스파티드산［LPA;Lysophosphatidic acid］)을 들 수 있다. 본 명세서에 있어서 '임의 성분'이란, 포함해도 되고 포함하지 않아도 되는 성분을 의미한다.
또한, 본 발명에는, 아카보즈 혹은 그 염, 및/또는 스타키오스 혹은 그 염을 포함하는, 본건 포유동물 세포 보존용 액을 조제하기 위한 분말 제제가 포함된다. 해당 분말 제제에는 상기 임의 성분을 포함하고 있을 수도 있다.
본 발명의 포유동물 세포의 보존 방법은, 아카보즈류 및/또는 스타키오스류를 포함하는 액(즉, 본건 포유동물 세포 보존용 액) 중에서, 포유동물 세포를 임의의 기간 보존하는 공정을 포함하는 것(이하, '본건 보존 방법'이라고 할 수 있다)이다. 본건 보존 방법은, 통상적으로, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액을, 해당 보존용 액이 액체 상태로 존재하는 온도 조건하에서 보존하는 것으로, 해당 보존용 액이 고체 상태로 존재하는 온도 조건하에서 보존하는 공정(예를 들어, 동결 보존하는 공정, 동결 건조 보존하는 공정 등의 포유동물 세포를 휴면 상태로 보존하는 공정)을 포함하지 않는다. 또한, 본건 포유동물 세포 보존용 액 중의 포유동물 세포의 밀도는, 예를 들어, 103~1010개/mL 범위 내이다.
본건 보존 방법으로는, 본건 포유동물 세포 보존용 액 중에서 포유동물 세포를 보존하기 전에, 아카보즈류 및/또는 스타키오스류를 포함하는 액(바람직하게는, 등장액)에, 포유동물 세포를 가하거나, 혹은, 포유동물 세포를 포함하는 액(바람직하게는, 등장액)에, 아카보즈류 및/또는 스타키오스류를 가함으로써, 아카보즈류 및/또는 스타키오스류를 포함하는 액을 조제하는 공정을, 더 포함하는 것일 수도 있다.
본 발명에 있어서, 포유동물 세포를 보존하는 임의의 기간으로는, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액을 액체 상태로 보존했을 때에, 해당 보존용 액 중의 포유동물 세포의 세포 생존율 저하를 억제하여, 생세포의 비율을 높일 수 있는 기간이 바람직하고, 예를 들어, 6시간 이상, 12시간 이상, 24시간(1일) 이상, 36시간(1.5일) 이상, 48시간(2일) 이상, 3일 이상, 7일 이상, 10일 이상이며, 또한, 포유동물 세포의 보존 기간이 너무 길면 세포의 생존에 악영향을 미칠 가능성이 있기 때문에, 세포의 생존율에 대한 악영향을 회피하는 관점에서, 통상적으로는 30일 이하, 바람직하게는 20일 이하, 보다 바람직하게는 10일 이하, 보다 더 바람직하게는 6일 이하이다. 따라서, 상기 임의의 보존 기간으로는, 통상적으로, 6시간~30일 범위 내, 12시간~30일 범위 내, 24시간~30일 범위 내, 36시간~30일 범위 내, 48시간~30일 범위 내, 3~30일 범위 내, 7~30일 범위 내, 또는 10~30일 범위 내이며, 바람직하게는, 6시간~20일, 12시간~20일, 24시간~20일, 36시간~20일, 48시간~20일, 3~20일, 7~20일, 또는 10~20일이며, 보다 바람직하게는, 6시간~10일, 12시간~10일, 24시간~10일, 36시간~10일, 48시간~10일, 3~10일, 또는 7~10일이며, 보다 더 바람직하게는, 6시간~6일, 12시간~6일, 24시간~6일, 36시간~6일, 48시간~6일, 또는 3~6일이다.
본 발명에 있어서, '포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액이 액체 상태로 존재하는 온도'로는, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액이, 동결하지 않고 액체 상태로 존재하면서, 해당 보존용 액 중의 포유동물 세포가 생육 가능한 온도이면 되고, 통상적으로 0~40℃ 범위 내, 바람직하게는 0~30℃(실온) 범위 내이다.
본 발명의 포유동물 세포로는, 예를 들어, 포유동물 세포 이식 치료를 필요로 하는 질환(암; I형 당뇨병; 간질환 등의 장기 질환; 등)에 대한 재생 의료에 있어서, 혈관 경유로 투여되는 포유동물 세포, 구체적으로, 줄기세포; 췌도세포; 간세포; 백혈구(예를 들어, 수지상 세포, 림프구 세포, 대식세포, 호중구, 호산구); 등을 예시할 수 있고, 바람직하게는, 줄기세포, 림프구 세포, 또는 간세포이다. 여기서 '림프구 세포'란, 포유동물 세포의 면역계에서의 백혈구의 아류형(subtype) 중 하나로, 항원을 인식하고, 면역능을 갖는 세포를 의미한다. 림프구 세포에는, 구체적으로, T세포(예를 들어, 알파·베타［αβ］T세포, 감마·델타［γδ］T세포, 세포 독성 T세포［cytotoxic T lymphocyte;CTL］, 헬퍼 T세포), B세포, 자연살해(NK) 세포가 포함된다.
상기 포유동물 세포는, 공지된 일반적인 방법으로 단리할 수 있다. 예를 들어, 백혈구나, 백혈구에 포함 되는 림프구 세포(예를 들어, T세포, 헬퍼 T세포, 세포 독성 T세포,γδT세포)는, 용혈 처리한 말초혈 또는 제대혈 시료로부터, 필요에 따라, IL-2나 항CD3 항체의 존재하에서 확대 배양한 후, 백혈구의 세포 표면 마커(CD45), T세포의 세포 표면 마커(CD3), 헬퍼 T세포의 세포 표면 마커(CD4), 세포 독성 T세포(CD8), γδT세포의 세포 표면 마커(CD39)에 대한 항체를 이용한 형광 활성화 셀 소터(FACS)나, 형광 물질이나 비오틴, 아비딘 등의 표지 물질로 표지한 상기 세포 표면 마커에 대한 항체와, 이러한 표지 물질에 대한 항체와 MACS 비즈(자성 비즈)의 컨쥬게이트 항체를 이용한 자동 자기 세포 분리 장치(autoMACS)에 의해, 각각의 마커가 양성의 세포로 단리할 수 있다. 상기 형광 물질로는, 알로피코시아닌(APC), 피코에리트린(PE), FITC(fluorescein isothiocyanate), Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, PE-Texas Red, PE-Cy5, PE-Cy7 등을 들 수 있다.
또한 상기 '줄기세포'란, 자기 복제능 및 분화·증식능을 갖는 미숙한 세포를 의미한다. 줄기세포에는, 분화 능력에 따라, 다능성 줄기세포(pluripotent stem ce11), 복능성 줄기세포(multipotent stem ce11), 단능성 줄기세포(unipotent stem ce11) 등의 아집단이 포함된다. 다능성 줄기세포란, 그 자체로는 개체가 될 수 없지만, 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 복능성 줄기세포란, 모든 종류는 아니지만, 복수 종류의 조직이나 세포로 분화 할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 단능성 줄기세포란, 특정 조직이나 세포로 분화 할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다.
다능성 줄기세포로는, 배아 줄기세포(Embryonic stem cell; ES 세포), EG 세포(Embryonic germ cell), 유도 만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cell; iPS 세포) 등을 들 수 있다. ES 세포는, 내부 세포 덩어리를 피더 세포상 또는 LIF를 포함하는 배지 내에서 배양함으로써 제조할 수 있다. ES 세포의 제조 방법은, 예를 들어, WO96/22362, WO02/101057, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718 등에 기재되어 있다. EG 세포는, 시원 생식 세포를 mSCF, LIF 및 bFGF를 포함하는 배지 내에서 배양함으로써 제조할 수 있다(Ce11,70: 841-847, 1992). iPS 세포는, 체세포(예를 들어 섬유아세포, 피부 세포 등)에 Oct3/4, Sox2 및 Klf4(필요에 따라 추가로 c-Myc 또는 n-Myc) 등의 리프로그래밍(reprogramming) 인자를 도입함으로써 제조할 수 있다(Ce11, 126: p. 663-676, 2006;Nature, 448: p. 313-317, 2007; Nat Biotechno1, 26; p,101-106, 2008;Cel1 131: p. 861­872,2007; Science, 318: p. 1917-1920, 2007; Ce11 Stem Cells 1: p. 55-70, 2007; Nat Biotechnol, 25: p. 1177-1181, 2007; Nature, 448: p. 318-324, 2007; Cell Stem Cells 2: p. 10-12, 2008; Nature 451: p. 141-146, 2008; Science, 318: p. 1917-1920, 2007). 체세포의 핵을 핵 이식함으로써 제작된 초기 배아를 배양하는 것에 의해 수립한 줄기세포도, 다능성 줄기세포로 바람직하다(Nature, 385,810(1997); Science, 280,1256(1998); Nature Biotechnology, 17,456(1999); Nature, 394,369(1998); Nature Genetics, 22,127(1999); Proc.Natl. Acad.Sci.USA, 96,14984(1999)), Rideout III 등(Nature Genetics, 24,109(2000)).
복능성 줄기세포로는, 지방세포, 골세포, 연골 세포, 지방세포 등의 세포로 분화 가능한 중간엽 줄기세포, 백혈구, 적혈구, 혈소판 등의 혈구계 세포로 분화 가능한 조혈 줄기세포, 뉴런, 성상 세포(astrocyte), 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte) 등의 세포로 분화 가능한 신경 줄기세포, 골수 줄기세포, 생식 줄기세포 등의 체성 줄기세포 등을 들 수 있다. 복능성 줄기세포는, 바람직하게는 중간엽 줄기세포이다. 중간엽 줄기세포란, 골아세포, 연골아세포 및 지방아세포의 모두 또는 몇몇으로의 분화가 가능한 줄기세포를 의미한다. 복능성 줄기세포는, 자체 공지된 방법에 의해, 생체로부터 단리할 수 있다. 예를 들어, 중간엽 줄기세포는, 포유동물의 골수, 지방 조직, 말초혈, 제대혈 등으로부터 공지된 일반적인 방법으로 채취할 수 있다. 예를 들어, 골수 천자 후의 조혈 줄기세포 등의 배양, 계대에 의해 인간 중간엽 줄기세포를 단리할 수 있다(Journal of Autoimmunity, 30(2008)163-171). 복능성 줄기세포는, 상기 다능성 줄기세포를 적절한 유도 조건하에서 배양하는 것에 의해서도 얻을 수 있다.
본 발명의 포유동물로는, 마우스, 랫트, 햄스터, 모르모트 등의 설치류, 토끼 등의 토끼목, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제목(有蹄目), 개, 고양이 등의 고양이목, 인간, 원숭이, 붉은털 원숭이, 게잡이 원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등을 예시할 수 있고, 그 중에서도, 마우스, 돼지, 인간을 바람직하게 예시할 수 있다.
본 발명의 포유동물 세포로, 부착성('접착성'이라고도 한다) 세포를 예시할 수 있다. 본 명세서 중, '부착성'세포란, 기반(足場)에 접착함으로써 생존, 증식, 물질의 생산을 수행할 수 있는 부착 의존성(anchorage dependency) 세포를 의미한다. 부착성 줄기세포로는, 예를 들어, 다능성 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 신경 줄기세포, 골수 줄기세포, 생식 줄기세포 등을 들 수 있고, 중간엽 줄기세포를 바람직하게 예시할 수 있다.
본 발명의 포유동물 세포(집단)는, 생체 내로부터 분리된 것일 수도, 인비트로에서 계대 배양된 것일 수도 있지만, 단리 또는 정제되어 있는 것이 바람직하다. 본 명세서 중, '단리 또는 정제'란, 목적으로 하는 성분 이외의 성분을 제거하는 조작이 실시되어 있는 것을 의미한다. 단리 또는 정제된 포유동물 세포의 순도(전체 세포 수에 대한 포유동물 줄기세포 수 등의 목적으로 하는 세포의 비율)는, 통상적으로 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상(예를 들어 100%)이다.
본건 포유동물 세포 보존용 액 중에 보존하는 포유동물 세포(집단)는, 단일 세포(싱글 셀) 상태일 수도 있다. 본 명세서에 있어서, '단일 세포 상태'란, 다른 세포와 모여 덩어리를 형성하지 않은 것(즉, 응집하지 않은 상태)을 의미한다. 단일 세포 상태의 포유동물 세포는, 인비트로에서 배양한 포유동물 세포를 트립신/EDTA 등으로 효소 처리함으로써 조제할 수 있다. 포유동물 세포 중에 포함되는 단일 세포 상태의 포유동물 세포의 비율은, 예를 들어 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상(예를 들어 100%)이다. 단일 세포 상태의 세포의 비율은, 포유동물 세포를 PBS 중에 분산시키고, 이를 현미경하에서 관찰하여, 무작위로 선택된 복수개(예를 들어, 1000개)의 세포에 대해 응집 유무를 조사함으로써 결정할 수 있다.
본건 포유동물 세포 보존용 액 중에 보존하는 포유동물 세포(집단)는, 부유하고 있을 수도 있다. 본 명세서에 있어서, '부유'란, 포유동물 세포가, 보존용 액을 수용한 용기의 내벽에 접촉하지 않고, 액 중에 유지되어 있는 것을 말한다.
본건 포유동물 세포 보존용 액 중에 보존한 포유동물 세포가, 응집 또는 침전되어 있는 경우, 이식 전에 피펫팅이나 탭핑 등의 해당 기술 분야에서의 주지의 방법에 의해 포유동물 세포를 현탁하는 것이 바람직하다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위가 이들 예시로 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 아카보즈 및 스타키오스의 스크리닝
본 발명자들은, 지금까지, 포유동물 세포를 포함하는 액 중에, 트레할로스를 첨가하면, 용액 상태로 보존했을 때의 세포 생존율 저하를 억제할 수 있는 것을 보고하고 있다(일본 특허공개공보 제 2012-115253호, 국제 공개 팜플렛 제 2014/208053호). 따라서, 본 실시예에 있어서는, 트레할로스 이외의 당류로부터, 세포 생존율 저하의 억제 효과를 나타내는 것을 탐색했다.
1-1. 재료 및 방법
［피험용 등장액의 조제］
93종류의 당류를 선택하고, 분자량이 명확한 당류에 대해서는, 87.5 mM의 농도가 되도록, 각각 젖산 링거액인 락텍(등록상표)주(오오츠카세이야쿠코죠사 제품)에 첨가·융해하여 조제하고, 또한, 분자량이 불명확한 당류에 대해서는, 4~5%의 농도가 되도록, 각각 락텍주에 첨가·융해하여, 93종류의 당류를 포함하는 등장액을 조제했다. 또한, 트레할로스(가부시키가이샤 하야시바라 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여 조제하고, 88 mM 트레할로스를 포함하는 등장액을 조제했다.
［포유동물 세포］
포유동물 세포는, 골수 유래 인간 중간엽 줄기세포(Lonza Walkersville사 제품)(이하, 'hMSC'이라고 한다)를 이용했다.
［hMSC를 포함하는 PBS의 조제］
hMSC를 포함하는 PBS는, 아래의 순서 [1]~[8]에 따라 조제했다.
[1] 4×105개의 hMSC를, 75 cm2 플라스크에 가하고, 배지 존재하에서 37℃, 5%CO2 인큐베이터에서 배양을 수행했다. 현미경하에서 세포 상태를 관찰하여, 약 80% 정도 융합(confluent)될 때까지 배양했다.
[2] 배지를 제외하고, 8 mL의 PBS(-)로 hMSC를 행궈냈다.
[3] PBS(-)를 제외하고, 3.75 mL의 트립신 EDTA(Lonza사 제품)를 가하여 실온으로 5분간 정치했다.
[4] hMSC가 90% 정도 박리될 때까지 현미경하에서 관찰하면서, 천천히 흔들었다.
[5] 3.75 mL의 배지를 가하고, 트립신 반응을 정지시켜, 피펫팅에 의해 hMSC를 회수하고, 50 mL 원심 튜브로 옮겼다.
[6] 600×g, 5분간, 22℃에서 원심분리를 수행했다.
[7] 상청(배지)을 제외하고, 1.5 mL의 PBS(-)를 가하여 침전(hMSC)을 현탁했다.
[8] 세포 수를 계측하고, 5×105 cells/mL가 되도록 PBS(-)로 조정하여, hMSC를 포함하는 PBS를 조제했다.
［각종 피험용 등장액 중에서의 hMSC의 보존 방법］
각종 피험용 등장액 중에서의 hMSC의 보존은, 아래의 순서 [1]~[2]에 따라 수행했다.
[1] 조제한 hMSC를 포함하는 PBS를, 각 튜브에 0.5 mL씩 분주하고, 원심분리(600×g, 5분간)를 수행했다.
[2] 상청(PBS)을 제외하고, 침전(hMSC)을, 0.5 mL의 각종 피험용 등장액으로 현탁하여, 4℃에서 3일간 보존했다.
［트리판 블루 염색법에 의한 hMSC의 세포 생존율의 해석］
트리판 블루 염색법에 의한 hMSC의 세포 생존율의 해석은, 아래의 순서 [1]~[2]에 따라 수행했다.
[1] 4℃에서 3일간 보존 후의 hMSC를 포함하는 각종 피험용 등장액 각각으로부터, 20 μL(1×104 cells 상당)를 채취하고, 튜브로 옮긴 후, 트리판 블루 염색액(Gibco사 제품) 20 μL를 혼합했다. 그리고, 비교 대조로, 각종 피험용 등장액에 현탁하기 전(4℃에서 보존 전)의 hMSC를 포함하는 PBS 각각으로부터, 20 μL(1×104 cells 상당)를 채취하고, 튜브로 옮긴 후, 트리판 블루 염색액 20 μL를 혼합했다.
[2] 현미경하에서 원 셀 카운터(onecellcounter)(바이오메디컬사이언스사 제품)를 이용하여 전체 세포 수와 트리판 블루 양성 세포(사세포) 수의 측정을 수행하여, 전체 세포 수에 대한 트리판 블루 음성 세포의 비율, 즉, 세포 생존율을 산출했다.
1-2. 결과
93종류의 당류 중, 트레할로스보다 세포 생존율 저하의 억제 효과가 높은 것으로, 아카보즈와 스타키오스를 얻을 수 있었다.
한편, D-락토바이온산, (-)-2, 3-O-이소프로필리덴-D-트레이톨, D-갈락투론산, 및 D-만노사민에 대해서는, 젖산 링거액 중에서 hMSC를 보존했을 경우보다 세포 생존율이 저하했다.
실시예 2: 아카보즈 및 스타키오스에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과의 확인
아카보즈와 스타키오스는 4당류로 공통된다. 따라서, 아카보즈와 스타키오스 이외의 4당류에 대해서도, 세포 생존율 저하 억제 효과가 있는지 아닌지를 확인하기 위해, 2종류의 4당(니스토스 및 말토테트라오스)을 이용하여 검토했다.
2-1. 재료 및 방법
［피험용 등장액의 조제］
아카보즈(와코쥰야쿠코교사 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여, 175 mM 아카보즈를 포함하는 등장액을 조제했다.
또한, 스타키오스 n수화물(와코쥰야쿠코교사 제품)을 락텍주에 첨가·융해하여, 175 mM 스타키오스를 포함하는 등장액을 조제했다. 또한, 니스토스 삼수화물(와코쥰야쿠코교사 제품)을 락텍주에 첨가·융해하여, 175 mM 니스토스를 포함하는 등장액을 조제했다. 또한, 말토테트라오스(와코쥰야쿠코교사 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여, 175 mM 말토테트라오스를 포함하는 등장액을 조제했다. 그리고, 비교 대조로, 락텍주를 이용했다.
［포유동물 세포］
포유동물 세포는, 실시예 1에서 사용한 hMSC를 이용했다.
［hMSC를 포함하는 PBS의 조제］
hMSC를 포함하는 PBS는, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 조제했다.
［각종 피험용 등장액 중에서의 hMSC의 보존 방법］
hMSC를, 실시예 1에 기재된 방법에 따라, 각종 피험용 등장액 중에 4℃에서 2일간 보존했다.
［트리판 블루 염색법에 의한 hMSC의 세포 생존율의 해석］
트리판 블루 염색법에 의한 hMSC의 세포 생존율의 해석은, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 수행했다.
2-2. 결과
hMSC를, 아카보즈 또는 스타키오스를 포함하는 락텍주 중에 보존하면, 락텍주 중에 보존했을 경우에 비해, 세포 생존율은 상승하는 것이 확인된 것에 반해, hMSC를, 니스토스 또는 말토테트라오스를 포함하는 락텍주 중에 보존해도, 이러한 세포 생존율의 상승은 인정되지 않았다(표 1 및 도 1 참조).
이 결과는, 아카보즈 및 스타키오스에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과는, 4당류에 공통되는 것이 아니라, 아카보즈 및 스타키오스에 특이적인 것임을 나타내고 있다.
Figure pct00003
실시예 3: 아카보즈에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과의 확인 1
아카보즈에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과와, 트레할로스나 글루코스에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과를 비교 검토했다.
3-1. 재료 및 방법
［피험용 등장액의 조제］
아카보즈(와코쥰야쿠코교사 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여, 88 mM 아카보즈를 포함하는 등장액, 및 175 mM 아카보즈를 포함하는 등장액을 조제했다. 또한, 트레할로스(가부시키가이샤 하야시바라 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여 조제하고, 88 mM 트레할로스를 포함하는 등장액, 및 175 mM 트레할로스를 포함하는 등장액을 조제했다. 또한, 글루코스(와코쥰야쿠코교사 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여, 88 mM 글루코스를 포함하는 등장액, 및 175 mM 글루코스를 포함하는 등장액을 조제했다. 그리고, 비교 대조로, 생리 식염액인 오오츠카생식주(오오츠카세이야쿠코죠사 제품), 락텍주, 및 인간 중간엽 줄기세포 전용 배지 키트(MSCGM BulletKit, 이하 '배지'라고 한다)(Lonza Walkersville사 제품, PT-3001)를 이용했다.
［포유동물 세포］
포유동물 세포는, 실시예 1에서 사용한 hMSC를 이용했다.
［hMSC를 포함하는 PBS의 조제］
hMSC를 포함하는 PBS는, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 조제했다.
［각종 피험용 등장액 중에서의 hMSC의 보존 방법］
hMSC를, 실시예 1에 기재된 방법에 따라, 각종 피험용 등장액 중에 4℃에서 3일간 보존했다.
［XTT법에 의한 hMSC의 세포 생존율의 해석］
XTT(sodium 3'-[1(-phenylaminocarbonyl)-3, 4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro) benzene sulfonic acid hydrate)법에 의한 세포 생존율의 해석은, 아래의 순서 [1]~[3]에 따라 수행했다.
[1] 4℃에서 3일간 보존 후의 hMSC를 포함하는 각종 피험용 등장액 각각으로부터, 100 μL(5×104 cells 상당)를 채취하여, 튜브로 옮긴 후, 600×g, 5분간, 22℃에서 원심분리를 수행했다.
[2] 상청(각종 피험용 등장액)을 제외하고, 100 μL의 배지를 가하여 침전(hMSC)을 현탁한 후, 96 웰 플레이트로 옮겼다.
[3] 세포 증식 키트 II(Cat. No. 1465015, Roche사 제품)의 XTT 혼합 시약(XTT 시약과 전자 커플링액을 50:1의 비율로 혼합한 것)을, 각 웰에 50 μL씩 가했다.
[4] 24분후에 플레이트 리더(Viento　XS　［KC　junior］, 다이니뽄세이야쿠사 제품)를 이용하여, 생세포에 의해 대사되어, 산생되는 포르마잔 색소의 흡광도인 480 nm의 흡광도(A480)와 대조 파장의 흡광도인 650 nm의 흡광도(A650)를 측정하고, A650으로 보정한 A480의 흡광도(A480-A650)를 산출했다.
3-2. 결과
hMSC를, 88 mM 또는 175 mM의 아카보즈를 포함하는 락텍주 중에 보존하면, 락텍주 중에 보존했을 경우에 비해, 생세포의 지표인 'A480-A650'값이 높았다(표 2 및 도 2 참조). 또한, hMSC를, 88 mM 또는 175 mM의 트레할로스나 글루코스를 포함하는 락텍주 중에 보존하면, 락텍주 중에 보존했을 경우에 비해, 'A480-A650'값은 높았지만, 동일한 농도의 아카보즈를 포함하는 락텍주 중에 hMSC를 보존했을 경우가, 유의(有意)하게 높았다(표 2 및 도 2 참조).
이 결과는, 아카보즈를 등장액 중에 첨가하여, 포유동물 세포를 보존하면, 아카보즈 비첨가의 등장액이나, 트레할로스 또는 글루코스를 첨가한 등장액 중에 포유동물 세포를 보존했을 경우에 비해, 해당 액 중의 포유동물 세포의 세포사가 효과적으로 억제되어, 생세포의 비율을 높일 수 있는 것을 나타내고 있다.
Figure pct00004
실시예 4: 아카보즈의 최적(至適) 농도의 검토
44~350 mM 아카보즈를 포함하는 등장액을 이용하여, 아카보즈에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과의 최적 농도를 검토했다.
4-1. 재료 및 방법
［피험용 등장액의 조제］
아카보즈(와코쥰야쿠코교사 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여, 44 mM 아카보즈를 포함하는 등장액, 88 mM 아카보즈를 포함하는 등장액, 175 mM 아카보즈를 포함하는 등장액, 및 350 mM 아카보즈를 포함하는 등장액을 조제했다. 그리고, 비교 대조로, 락텍주를 이용했다.
［포유동물 세포］
포유동물 세포는, 실시예 1에서 사용한 hMSC를 이용했다.
［hMSC를 포함하는 PBS의 조제］
hMSC를 포함하는 PBS는, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 조제했다.
［각종 피험용 등장액 중에서의 hMSC의 보존 방법］
hMSC를, 실시예 1에 기재된 방법에 따라, 각종 피험용 등장액 중에 4℃에서 3일간 보존했다.
［트리판 블루 염색법에 의한 hMSC의 세포 생존율의 해석］
트리판 블루 염색법에 의한 hMSC의 세포 생존율의 해석은, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 수행했다.
4-2. 결과
hMSC를, 44~175 mM의 아카보즈를 포함하는 락텍주 중에 보존하면, 세포 생존율은, 아카보즈의 농도 의존적으로 상승한 것에 반해, hMSC를, 175~350 mM의 아카보즈를 포함하는 락텍주 중에 보존하면, 세포 생존율은 거의 변하지 않았다(표 3 및 도 3 참조).
이 결과는, 적어도 44 mM 전후(바람직하게는, 적어도 175 mM 전후)의 아카보즈를 등장액 중에 첨가하여, 포유동물 세포를 보존하면, 해당 액 중의 포유동물 세포의 세포사를 효과적으로 억제할 수 있는 것을 나타내고 있다.
Figure pct00005
실시예 5: 장기간 포유동물 세포를 보존했을 경우의 아카보즈에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과의 확인
아카보즈에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과가, 포유동물 세포를 장기간 보존했을 때에도 인정되는지 어떤지를 확인하기 위해, hMSC를, 아카보즈를 포함하는 등장액 중에 4℃에서 28일간 보존하여, 세포 생존율을 해석했다.
5-1. 재료 및 방법
［피험용 등장액의 조제］
아카보즈(와코쥰야쿠코교사 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여, 44 mM 아카보즈를 포함하는 등장액, 88 mM 아카보즈를 포함하는 등장액, 및 175 mM 아카보즈를 포함하는 등장액을 조제했다. 또한, 트레할로스(가부시키가이샤 하야시바라 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여 조제하고, 88 mM 트레할로스를 포함하는 등장액을 조제했다. 그리고, 비교 대조로, 락텍주를 이용했다.
［포유동물 세포］
포유동물 세포는, 실시예 1에서 사용한 hMSC를 이용했다.
［hMSC를 포함하는 PBS의 조제］
hMSC를 포함하는 PBS는, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 조제했다.
［각종 피험용 등장액 중에서의 hMSC의 보존 방법］
hMSC를, 실시예 1에 기재된 방법에 따라, 각종 피험용 등장액 중에 4℃에서 28일간 보존했다.
［트리판 블루 염색법에 의한 hMSC의 세포 생존율의 해석］
트리판 블루 염색법에 의한 hMSC의 세포 생존율의 해석은, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 수행했다.
5-2. 결과
hMSC를 락텍주 중에 28일간 보존하면, 세포 생존율은 0%인 것에 반해, hMSC를, 88 mM의 아카보즈를 포함하는 락텍주 중에 28일간 보존하면, 세포 생존율은 15.9±5.90%로 상승했다(표 4 및 도 4 참조). 또한, 트레할로스를 포함하는 락텍주 중에 hMSC를 28일간 보존했을 경우에도, 세포 생존율은 상승했지만, 아카보즈를 포함하는 락텍주 중에 hMSC를 28일간 보존했을 경우쪽이 그 비율은 높았다(표 4 및 도 4 참조). 게다가, 175 mM의 아카보즈를 포함하는 락텍주 중에 hMSC를 보존하면, 88 mM의 아카보즈를 포함하는 락텍주 중에 hMSC를 보존했을 경우에 비해, 세포 생존율은 보다 더 상승하는 것이 나타났다(표 4 및 도 4 참조).
이들 결과는, 아카보즈를 등장액에 첨가하여, 포유동물 세포를 장기간(4℃에서 28일간) 보존했을 경우에도, 트레할로스를 해당 등장액에 첨가하여, 포유동물 세포를 장기간 보존했을 경우에 비해, 포유동물 세포의 생존율 저하를 효과적으로 억제할 수 있는 것을 나타내고 있다.
Figure pct00006
실시예 6: 아카보즈에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과의 확인 2
아카보즈에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과를, hMSC 이외의 포유동물 세포(랫트 간세포)를 이용하여 확인했다.
6-1. 재료 및 방법
［피험용 등장액의 조제］
아카보즈(와코쥰야쿠코교사 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여, 175 mM 아카보즈를 포함하는 등장액을 조제했다. 또한, 트레할로스(가부시키가이샤 하야시바라 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여 조제하고, 175 mM 트레할로스를 포함하는 등장액을 조제했다. 또한, 글루코스(와코쥰야쿠코교사 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여, 175 mM 글루코스를 포함하는 등장액을 조제했다. 그리고, 비교 대조로, 오오츠카생식주, 락텍주, 및 배지를 이용했다.
［포유동물 세포］
포유동물 세포는, 아래의 표 5에 나타내는 랫트 간세포를 이용했다.
포유동물 세포 랫트 간세포
유래 수컷SD(Sprague-Dawley)랫트
예 수 13
로트 번호 HNA
보존 방법 액체 질소 중에서 보존
공급원 In Vitro Technologies사
대리점 베리타스사
［랫트 간세포를 포함하는 세정용 배지의 조제］
랫트 간세포를 포함하는 세정용 배지는, 아래의 순서 [1]~[6]에 따라 조제했다.
[1] 랫트 간세포의 스톡 튜브를, 액체 질소 탱크로부터 꺼내, 37℃ 항온조에서 융해했다.
[2] 융해 후, 바로 얼음 위에 정치하고, 50 mL 원심 튜브로 옮겼다.
[3] 25 mL의 빙냉(氷冷)한 간세포 세정용 배지(Hepatocyte Wash Medium, 이하 '세정용 배지'라고 한다)(GIBCO사 제품)를 적하했다.
[4] 50×g, 3분간, 4℃에서 원심분리를 수행했다.
[5] 상청(세정용 배지)을 제외하고, 6 mL의 세정용 배지를 가하여 침전(랫트 간세포)을 2~3회 피펫팅에 의해 현탁했다.
[6] 세포 수를 계측하고, 5Х105 cells/mL가 되도록 세정용 배지에서 조정하여, 랫트 간세포를 포함하는 세정용 배지를 조제했다.
［각종 피험용 등장액 중에서의 랫트 간세포의 보존 방법］
각종 피험용 등장액 중에서의 랫트 간세포의 보존은, 아래의 순서 [1]~[2]에 따라 수행했다.
[1] 조제한 랫트 간세포를 포함하는 세정용 배지를, 각 튜브에 0.5 mL씩 분주하여, 원심분리(50×g, 3분간, 4℃)를 수행했다.
[2] 상청(세정용 배지)을 제외하고, 침전(랫트 간세포)을, 0.5 mL의 각종 피험용 등장액으로 현탁하여, 4℃에서 24시간 보존했다.
［트리판 블루 염색법에 의한 랫트 간세포의 세포 생존율의 해석］
트리판 블루 염색법에 의한 랫트 간세포의 세포 생존율의 해석은, 실시예 1에 기재된 방법에 있어서, hMSC를 랫트 간세포로 바꾸어 수행했다.
6-2. 결과
랫트 간세포를, 아카보즈를 포함하는 락텍주 중에 보존하면, 락텍주 중에 보존했을 경우나, 트레할로스나 글루코스를 포함하는 락텍주 중에 보존했을 경우에 비해, 세포 생존율은 유의하게 상승했다(표 6 및 도 5 참조). 이러한 결과에 의해, 아카보즈에 의한 세포사 억제 효과는, 중간엽 줄기세포(hMSC)에 한정되지 않고, 간세포에서도 인정되는 점에서, 포유동물 세포 전반에서 인정되는 것으로 생각된다.
Figure pct00007
실시예 7: 아카보즈에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과의 확인 3
아카보즈는, α글루코시다아제의 활성 부위에 결합하여, 당의 가수분해를 저해하는 작용을 갖는다. 따라서, 아카보즈에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과가, 포유동물 세포 중의 α글루코시다아제 활성이 저해된 결과로 발생한 것인지 아닌지를 확인하기 위해, 아카보즈 이외의 α-글루코시다아제 저해약인 2종류의 물질(미그리톨 및 보글리보스)을 이용하여 검토했다.
7-1. 재료 및 방법
［피험용 등장액의 조제］
아카보즈(와코쥰야쿠코교사 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여, 175 mM 아카보즈를 포함하는 등장액을 조제했다. 또한, 미그리톨(도쿄카세이코교사 제품)을 락텍주에 첨가·융해하여, 175 mM 미그리톨을 포함하는 등장액을 조제했다. 또한, 보글리보스(도쿄카세이코교사 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여, 175 mM 보글리보스를 포함하는 등장액을 조제했다. 그리고, 비교 대조로, 락텍주를 이용했다.
［포유동물 세포］
포유동물 세포는, 실시예 1에서 사용한 hMSC를 이용했다.
［hMSC를 포함하는 PBS의 조제］
hMSC를 포함하는 PBS는, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 조제했다.
［각종 피험용 등장액 중에서의 hMSC의 보존 방법］
hMSC를, 실시예 1에 기재된 방법에 따라, 각종 피험용 등장액 중에 4℃에서 3일간 보존했다.
［트리판 블루 염색법에 의한 hMSC의 세포 생존율의 해석］
트리판 블루 염색법에 의한 hMSC의 세포 생존율의 해석은, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 수행했다.
7-2. 결과
hMSC를, 아카보즈를 포함하는 락텍주 중에 보존했을 경우, 락텍주 중에 보존했을 경우에 비해, 세포 생존율이 상승하는 것이 확인된 것에 반해, hMSC를, 미그리톨 또는 보글리보스를 포함하는 락텍주 중에 보존했을 경우, 락텍주 중에 보존했을 경우에 비해, 세포 생존율은 거의 변하지 않았다(표 7 및 도 6 참조).
이 결과는, 아카보즈에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과는, 포유동물 세포중의 α글루코시다아제 활성이 저해된 효과로 발생한 것이 아닌 것을 나타내고 있다.
Figure pct00008
실시예 8: 아카보즈에 의한 세포 응집 억제 효과
아카보즈가 세포 응집 억제 효과를 갖는지 아닌지를 확인하기 위해, 아카보즈를 포함하는 등장액 중에 hMSC를 보존하여, 세포 응집 레벨을 해석했다.
8-1. 재료 및 방법
［피험용 등장액의 조제］
아카보즈(와코쥰야쿠코교사 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여, 88 mM 아카보즈를 포함하는 등장액을 조제했다. 그리고, 비교 대조로, 락텍주를 이용했다.
［hMSC를 포함하는 PBS의 조제］
hMSC를 포함하는 PBS는, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 조제했다.
［각종 피험용 등장액 중에서의 hMSC의 보존 방법］
hMSC를, 실시예 1에 기재된 방법에 따라, 각종 피험용 등장액 중에 25℃에서 48시간 보존했다.
［세포 응집 레벨의 해석법］
보존 후의 hMSC를 포함하는 각종 피험용 등장액을 일부 채취하여, 위상차 현미경하에서 3개 이상의 세포가 모인 세포 응집괴의 유무를 관찰했다.
8-2. 결과
hMSC를 락텍주 중에 보존하면, 세포 응집괴의 형성이 다수 확인되었다(도 7의 상단, 검은 동그라미로 둘러싼 부분 참조). 한편, hMSC를, 아카보즈를 포함하는 락텍주 중에 보존하면, 세포 응집괴의 형성이 거의 확인되지 않았다(도 7의 하단 참조).
이 결과는, 아카보즈를 등장액에 첨가하여, 포유동물 세포를 보존하면, 해당 액 중의 포유동물 세포의 세포 응집을 효과적으로 억제할 수 있는 것을 나타내고 있다.
실시예 9: hMSC 이외의 포유동물 세포의 검토
아카보즈에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과가, hMSC 이외의 포유동물 세포를 보존했을 때에도 인정되는 것을 확인하기 위해, 림프구 세포 중 하나인 CD8 양성 T세포를 이용하여 검토했다.
9-1. 재료 및 방법
［피험용 등장액의 조제］
아카보즈(와코쥰야쿠코교사 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여, 88 mM 아카보즈를 포함하는 등장액을 조제했다. 또한, 비교 대조로, 트레할로스(가부시키가이샤 하야시바라 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여 조제하고, 88 mM 트레할로스를 포함하는 등장액을 조제했다. 그리고, 비교 대조로, 락텍주를 이용했다.
［포유동물 세포］
포유동물 세포는, CD8 양성 T세포(VERITAS사 제품)를 이용했다.
［CD8 양성 T세포의 확대 배양법］
CD8 양성 T세포의 확대 배양은, 아래의 순서 [1]~[3]에 따라 수행했다.
[1] 동결 보존한 CD8 양성 T세포를 융해 후, 림프구 배양 배지(LGM3, Lonza사 제품)에서 세정하고, 해당 배지 중에서 약 1시간 인큐베이트(37℃, 5%CO2) 했다.
[2] CD8 양성 T세포를 포함하는 배지를 분취하여, 원심분리(300×g, 10분간, 실온)를 수행했다.
[3] 상청을 제외하고, TLY CULTURE 키트 25(GC림포텍사 제품)에 부유시켜, CD8 양성 T세포를 37℃, 5%CO2 조건하에서 7일간 확대 배양했다.
［확대 배양한 CD8 양성 T세포의 보존 및 세포 생존율의 측정］
확대 배양한 CD8 양성 T세포의 보존 및 세포 생존율의 측정은, 아래의 순서 [1]~[3]에 따라 수행했다.
[1] 7일간 확대 배양한 CD8 양성 T세포(세포 농도가 약 1.1×106 세포/5 mL)를, 88 mM 트레할로스를 포함하는 락텍주로 세정하고, 스템풀(stemfull) 튜브(스미토모베이클라이트사 제품)에 분주 후, 원심분리(300×g, 10분간, 실온)를 수행했다.
[2] 상청을 제외하고, 침전(CD8 양성 T세포)을, 3종류의 피험용 등장액(88 mM 아카보즈를 포함하는 락텍주, 88 mM 트레할로스를 포함하는 락텍주, 및 락텍주)으로 현탁한 후, 5℃에서 24시간 보존했다. 그리고, 보존 전의 세포 생존율을 측정하기 위해, 현탁 직후에, 각 스템풀 튜브로부터 CD8 양성 T세포 현탁액을 일부(20 μL) 회수하여, 트리판 블루 염색액 20 μL를 혼합한 후, 현미경하에서 원 셀 카운터(바이오메디컬사이언스사 제품)를 이용하여, 1부분의 세포 계수부의 네 모퉁이의 세포 계수실의 에리어(area)의 합계 세포 수와 트리판 블루 양성 세포(사세포) 수를 계측하여, 전체 세포 수에 대한 트리판 블루 음성 세포의 비율(세포 생존율)을 산출했다.
[3] 24시간 보존 후, 상기 [2]에 기재된 방법에 따라, 세포 생존율을 계측 했다.
9-2. 결과
CD8 양성 T세포를, 아카보즈를 포함하는 락텍주 중에 보존하면, 락텍주 중에 보존했을 경우에 비해, 세포 생존율은 유의하게 상승했다(표 8 및 도 8 참조). 또한, 트레할로스를 포함하는 락텍주 중에 CD8 양성 T세포를 보존했을 경우에도, 세포 생존율은 상승했지만, 아카보즈를 포함하는 락텍주 중에 CD8 양성 T세포를 보존했을 경우쪽이 그 비율은 유의하게 높았다(표 8 및 도 8 참조).
이 결과는, 아카보즈에 의한 생존율 저하의 억제 효과는, CD8 양성 T세포 등의 림프구 세포를 보존했을 경우에도 발휘되는 것을 나타내는 동시에, 해당 효과는, 트레할로스보다 높은 것을 나타내고 있다.
Figure pct00009
실시예 10: 스타키오스의 최적 농도의 검토
44~150 mM 스타키오스를 포함하는 등장액을 이용하여, 스타키오스에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과의 최적 농도를 검토했다.
10-1. 재료 및 방법
［피험용 등장액의 조제］
스타키오스 n수화물(와코쥰야쿠코교사 제품)을 락텍주에 첨가·융해하여, 44 mM 스타키오스를 포함하는 등장액, 88 mM 스타키오스를 포함하는 등장액, 및 175 mM 스타키오스를 포함하는 등장액을 조제했다. 또한, 비교 대조로, 트레할로스(가부시키가이샤 하야시바라 제품)를 락텍주에 첨가·융해하여 조제하고, 88 mM 트레할로스를 포함하는 등장액을 조제했다. 그리고, 비교 대조로, 락텍주를 이용했다.
［포유동물 세포］
포유동물 세포는, 실시예 1에서 사용한 hMSC를 이용했다.
［hMSC를 포함하는 PBS의 조제］
hMSC를 포함하는 PBS는, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 조제했다.
［각종 피험용 등장액 중에서의 hMSC의 보존 방법］
hMSC를, 실시예 1에 기재된 방법에 따라, 각종 피험용 등장액 중에 5℃에서 4일간 보존했다.
［트리판 블루 염색법에 의한 hMSC의 세포 생존율의 해석］
트리판 블루 염색법에 의한 hMSC의 세포 생존율의 해석은, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 수행했다.
10-2. 결과
hMSC를, 스타키오스를 포함하는 락텍주 중에 보존하면, 락텍주 중에 보존했을 경우에 비해, 어느 농도의 스타키오스에 있어서도 세포 생존율은 유의하게 상승하는 것이나, 세포 생존율은, 스타키오스의 농도 의존적으로 상승하는 것이 나타났다(표 9 및 도 9 참조). 또한, hMSC를, 트레할로스를 포함하는 락텍주 중에 보존했을 경우에도, 세포 생존율은 상승했지만, 스타키오스를 포함하는 락텍주 중에 hMSC를 보존했을 경우쪽이 그 비율은 높았다(표 9 및 도 9 참조).
이 결과는, 스타키오스에 의한 세포 생존율 저하의 억제 효과는, 등장액 중의 스타키오스 농도가, 적어도 44 mM 전후에서 발휘되는 것을 나타내는 동시에, 해당 효과는, 트레할로스보다 높은 것을 나타내고 있다.
Figure pct00010
실시예 11: 등장액의 검토
등장액으로 락텍주 이외의 등장액에 대해서도 검토를 수행했다.
11-1. 재료 및 방법
［피험용 등장액의 조제］
아카보즈(와코쥰야쿠코교사 제품)를, 각각 4종류의 등장액(락텍주, 생리 식염액인 오오츠카생식주［오오츠카세이야쿠코죠사 제품］, 링거액 '오오츠카'［오오츠카세이야쿠코죠사 제품］, 아세트산 링거액인 빈F 수액［후소야쿠힝코교사 제품］)에 첨가·융해하여, 88 mM 아카보즈를 포함하는 상기 4종류의 등장액을 조제했다. 또한, 비교 대조로, 상기 4종류의 등장액을 이용했다.
［포유동물 세포］
포유동물 세포는, 실시예 1에서 사용한 hMSC를 이용했다.
［hMSC를 포함하는 PBS의 조제］
hMSC를 포함하는 PBS는, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 조제했다.
［각종 피험용 등장액 중에서의 hMSC의 보존 방법］
hMSC를, 실시예 1에 기재된 방법에 따라, 각종 피험용 등장액 중에 5℃에서 3일간(도 10B 참조) 또는 9일간(도 10C참조) 보존했다.
［트리판 블루 염색법에 의한 hMSC의 세포 생존율의 해석］
트리판 블루 염색법에 의한 hMSC의 세포 생존율의 해석은, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 수행했다.
11-2. 결과
hMSC를, 아카보즈를 포함하는 4종류의 등장액(락텍주, 오오츠카생식주, 링거액 '오오츠카', 빈F 수액) 중에 3일간 보존하면, 이러한 4종류의 등장액 중에 3일간 보존했을 경우에 비해, 세포 생존율이 상승하고, 특히, 락텍주 및 빈F 수액을 이용했을 경우, 세포 생존율이 유의하게 상승하는 것이 나타났다(표 10 및 도 10B참조). 또한, hMSC를, 아카보즈를 포함하는 상기 4종류의 등장액 중에 9일간 보존하면, 이러한 4종류의 등장액 중에 9일간 보존했을 경우에 비해, 세포 생존율이 유의하게 상승하는 것이 나타났다(표 10 및 도 10C참조).
이 결과는, 아카보즈에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과는, 락텍주(즉, 젖산 링거액)에 한정되지 않고, 오오츠카생식주(즉, 생리 식염액), 링거액 '오오츠카'(즉, 링거액), 빈F 수액(즉, 아세트산 링거액) 등의 등장액 전반에서 발휘되는 것을 나타내고 있다.
Figure pct00011
본 발명에 의하면, 아카보즈류나 스타키오스류를 액체 중에 가함으로써, 포유동물 세포를 액체 중에 보존했을 때에 발생하는 세포 생존율 저하나 세포 응집을 효과적으로 억제할 수 있다. 또한, 이들 아카보즈류 및 스타키오스류는, 포유동물의 생체 내에 투여했을 경우에, 포유동물의 생체에 악영향을 미칠 가능성이 낮은 4당류인 점에서, 포유동물 세포를 본건 포유동물 세포 보존용 액 중에서 보존한 후, 새로운 이식용 액으로 치환하지 않고, 그대로 포유동물의 생체 내에 투여할 수 있다.

Claims (22)

  1. 아카보즈 혹은 그 염, 및/또는 스타키오스 혹은 그 염을 포함하는, 포유동물 세포 보존용 액.
  2. 제 1항에 있어서,
    아카보즈 혹은 그 염, 및/또는 스타키오스 혹은 그 염을 등장액 중에 포함하는, 액.
  3. 제 2항에 있어서,
    등장액 중의 아카보즈 혹은 그 염의 농도가, 적어도 40 mM인, 액.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서,
    등장액 중의 스타키오스 혹은 그 염의 농도가, 적어도 40 mM인, 액.
  5. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    등장액이, 젖산 링거액, 아세트산 링거액, 링거액, 또는 생리 식염액인, 액.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물 세포를 0~40℃에서 보존하기 위한, 액.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물 세포를 6시간~30일간 보존하기 위한, 액.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물 세포의 생존율 저하를 억제하기 위해서 이용되는, 액.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물 세포의 응집을 억제하기 위해서 이용되는, 액.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물 세포의 이식에 이용되는, 액.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물 세포가, 포유동물 줄기세포, 포유동물 림프구 세포, 또는 포유동물 간세포인, 액.
  12. 제 11항에 있어서,
    포유동물 줄기세포가, 포유동물 중간엽 줄기세포 또는 포유동물 림프구 세포인, 액.
  13. 아카보즈 혹은 그 염, 및/또는 스타키오스 혹은 그 염을 포함하는 액 중에서, 포유동물 세포를 보존하는 공정을 포함하는, 포유동물 세포의 보존 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    액이, 등장액인, 보존 방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    등장액 중의 아카보즈 혹은 그 염의 농도가, 적어도 40 mM인, 보존 방법.
  16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서,
    등장액 중의 스타키오스 또는 그 염의 농도가, 적어도 40 mM인, 보존 방법.
  17. 제 14항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서,
    등장액이, 젖산 링거액, 아세트산 링거액, 링거액, 또는 생리 식염액인, 보존 방법.
  18. 제 13항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물 세포를 0~40℃에서 보존하는 것을 특징으로 하는, 보존 방법.
  19. 제 13항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물 세포를 6시간~30일간 보존하는 것을 특징으로 하는, 보존 방법.
  20. 제 13항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물 세포가, 포유동물 줄기세포, 포유동물 림프구 세포, 또는 포유동물 간세포인, 보존 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    포유동물 줄기세포가, 포유동물 중간엽 줄기세포 또는 포유동물 림프구 세포인, 보존 방법.
  22. 아카보즈 혹은 그 염, 및/또는 스타키오스 혹은 그 염을 포함하는, 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 액을 조제하기 위한 분말 제제.
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