WO2020066991A1 - アカルボース又はスタキオースを含む哺乳動物細胞保存用液 - Google Patents

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WO2020066991A1
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cells
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mammalian
cell
acarbose
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智景 白川
西村　益浩
土居　雅子
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株式会社大塚製薬工場
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    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a mammalian cell preservation solution containing acarbose or a salt thereof (hereinafter, sometimes referred to as “acarbose”), and / or stachyose or a salt thereof (hereinafter, sometimes referred to as “stachyose”) (hereinafter, referred to as “stachyose”).
  • acarbose acarbose or a salt thereof
  • stachyose stachyose
  • stachyose stachyose
  • Regenerative medicine using stem cells aims to restore the function of cells and tissues damaged by various diseases by utilizing the self-renewal ability and multipotency of stem cells and factors secreted by stem cells. Medical care. When bone marrow transplantation is performed on patients with intractable blood diseases such as leukemia and aplastic anemia, hematopoietic stem cells engraft in the patient, and hematopoietic ability can be maintained for almost a lifetime.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 cancer immuno-cell therapy is a state-of-the-art cell therapy that removes immune cells that have the function of attacking cancer outside the body, strengthens their functions, and returns them to the body again.
  • T cells such as beta T cell therapy ( ⁇ T cell therapy), gamma delta T cell therapy ( ⁇ T cell therapy), CTL therapy, and natural killer cell therapy (NK cell therapy) have been practiced.
  • trehalose has an effect of suppressing cell viability reduction and cell aggregation that occur when mammalian cells are stored in a liquid (Patent Documents 1 and 2).
  • Patent Documents 1 and 2 it has not been known that acarbose or stachyose has such an effect.
  • An object of the present invention is to effectively suppress cell viability reduction and cell aggregation that occur when mammalian cells are stored in a liquid, and when administered into a living body of a mammal, reduce the ecology of the mammal.
  • An object of the present invention is to provide a substance having a low possibility of causing adverse effects, a liquid for preserving mammalian cells containing the substance, and the like.
  • the present inventors have been conducting intensive research to solve the above problems.
  • acarbose and stachyose were found out of 93 types of saccharides as suppressing the decrease in the survival rate of mammalian cells and having a higher effect than trehalose.
  • these tetrasaccharides have an action of suppressing cell aggregation of mammalian cells.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • the present invention is as follows.
  • [1] A mammalian cell preservation solution containing acarbose or a salt thereof and / or stachyose or a salt thereof.
  • [2] The liquid according to the above [1], wherein the isotonic liquid contains acarbose or a salt thereof and / or stachyose or a salt thereof.
  • [3] The solution according to the above [2], wherein the concentration of acarbose or a salt thereof in the isotonic solution is at least 40 mM.
  • [4] The liquid according to the above [2] or [3], wherein the concentration of stachyose or a salt thereof in the isotonic liquid is at least 40 mM.
  • a method for storing mammalian cells comprising the step of storing mammalian cells in a solution containing acarbose or a salt thereof and / or stachyose or a salt thereof.
  • the mammalian cell preservation solution containing mammalian cells may be used as a target for transplantation of mammalian cells (for example, a patient with traumatic disease, a patient with tissue degenerative disease, A method of transplanting mammalian cells, comprising administering to a patient); Mammalian cells are added to a solution containing acarbose and / or stachyose (preferably isotonic solution), or acarbose and / or stachyose is added to a solution containing mammalian cells (preferably isotonic solution).
  • acarbose and / or stachyose preferably isotonic solution
  • acarbose and / or stachyose is added to a solution containing mammalian cells (preferably isotonic solution).
  • a step of preparing the mammalian cell storage solution by adding stachyoses a step of storing the mammalian cells in the prepared mammalian cell storage solution; and a method of storing the mammalian cells containing the preserved mammalian cells.
  • Administering the animal cell preservation solution to a subject in need of mammalian cell transplantation eg, a patient with a traumatic disease, a patient with a tissue degenerative disease, a cancer patient
  • acarbose and / or stachyose in the production of the mammalian cell storage solution
  • a liquid for preserving mammalian cells containing mammalian cells for use in treating diseases requiring mammalian cell transplantation treatment eg, traumatic disease, tissue degenerative disease, cancer
  • Mammalian cells are added to a solution containing acarbose and / or stachyose (preferably isotonic solution), or acarbose and / or stachyo
  • a method for preparing the present mammalian cell storage solution containing mammalian cells comprising the step of preparing the present mammalian cell storage solution by adding stachyoses;
  • the present mammalian cell preservation solution containing mammalian cells can be mentioned.
  • the step of preserving mammalian cells in the above transplantation method generally involves storing the mammalian cell preservation solution containing mammalian cells under a temperature condition in which the preservation solution exists in a liquid state. And does not include the step of storing the preservation liquid in a solid state (for example, the step of preserving mammalian cells in a dormant state, such as the step of freezing preservation, the step of freeze-dry preservation, etc.).
  • acarboses and stachyoses by adding acarboses and stachyoses to a liquid, it is possible to effectively suppress cell viability reduction and cell aggregation that occur when mammalian cells are stored in a liquid. Furthermore, since these acarboses and stachyoses are tetrasaccharides which are unlikely to adversely affect the ecology of mammals when administered in vivo to mammals, the mammalian cells are used for storing mammalian cells in the present case. After preservation in a liquid, it can be directly administered into a mammal without replacing it with a new transplant liquid.
  • Pre indicates the cell viability (94.7 ⁇ 2.1) of hMSC in phosphate buffered saline (PBS) containing hMSC before storage at 4 ° C.
  • PBS phosphate buffered saline
  • ** and “***” in the figure indicate that there is a statistically significant difference (p ⁇ 0.01 and p ⁇ 0.001), respectively, by performing Dunnett's multiple comparison test.
  • hMSCs were prepared using 9 kinds of isotonic solutions for test (Otsuka Raw Food Injection [S], Lactec Injection [LR], Lactec Injection [LR + 88T] containing 88 mM trehalose, Lactec Injection [LR + 88A] containing 88 mM Acarbose, Lactec Injection containing 88 mM Glucose.
  • S Industrial Food Injection
  • LR Lactec Injection
  • LR + 88T Lactec Injection
  • LR + 88A Lactec Injection containing 88 mM Acarbose
  • Lactec Injection containing 88 mM Glucose Note [LR + 88G], lactech containing 175 mM trehalose [LR + 175T], lactech containing 175 mM acarbose [LR + 175A], lactec containing 175 mM glucose [LR + 175G], and medium [M]) after storage at 4 ° C
  • "*”, "**”, and “***” in the figure were subjected to Dunnett's multiple comparison test, and had statistically significant differences (p ⁇ 0.05, p ⁇ 0.01, and p ⁇ 0.001).
  • “##” and “####” represent Tukey @ type among the 88 mM groups (LR + 88T, LR + 88A and LR + 88G) and between the 175 mM groups (LR + 175T, LR + 175A, and LR + 175G).
  • the hMSCs were prepared from 5 test isotonic solutions (Lactek® Injection [LR], Lactec Injection [LR + 44A] containing 44 mM acarbose, Lactec Injection [LR + 88A] containing 88 mM Acarbose, Lactec Injection [LR + 175A] containing 175 mM Acarbose, and 350 mM.
  • pouring [LR + 175A] containing acarbose for 28 days by trypan blue staining method (n 3) (refer Table 4).
  • FIG. 10 is a diagram showing a phase contrast microscope image after storing hMSC in two kinds of isotonic solutions for test (Lactec injection [LR] and Lactec injection [LR + 88A] containing 88 mM acarbose) at 25 ° C. for 48 hours.
  • LR Lactec injection
  • LR + 88A Lactec injection
  • 88 mM acarbose a plurality of images with different visual fields are taken, and three representative images are shown. The portions surrounded by black circles in the image indicate cell aggregates.
  • the expanded CD8-positive T cells were placed at 5 ° C.
  • FIG. 9A shows cell viability (93.7 ⁇ 2.0%) of hMSCs in PBS containing hMSCs before storage at 5 ° C.
  • FIG. 9B shows that the hMSCs were prepared using 5 different isotonic solutions for test (Lactek® Injection [LR], Lactec Injection containing 44 mM stachyose [LR + 44S], Lactec Injection containing 88 mM stachyose [LR + 88S], Lactec Injection containing 175 mM stachyose [LR + 88S].
  • FIG. 9A shows cell viability (93.7 ⁇ 2.0%) of hMSCs in PBS containing hMSCs before storage at 5 ° C.
  • FIG. 9B shows that the hMSCs were prepared using 5 different isotonic solutions for test (Lactek® Injection [LR], Lactec Injection containing 44 mM stachyose [LR + 44S], Lactec Injection containing 88 mM stachyos
  • FIG. 10A shows cell viability (93.7 ⁇ 3.2%) of hMSCs in PBS with hMSCs before storage at 5 ° C.
  • 10B and 10C show that the hMSCs were treated with eight types of isotonic solutions for test (Lactec injection [LR], Lactec injection [LR + 88A] containing 88 mM acarbose, Otsuka raw food injection [S], Otsuka raw food injection containing 88 mM acarbose [ S + 88A], Ringer's solution "Otsuka” [R], Ringer's solution "Otsuka” containing 88 mM acarbose [R + 88A], Vien F infusion [AR], and Vien F infusion [A + 88A] containing 88 mM acarbose at 5 ° C for 3 each.
  • Lactec injection [LR] Lactec injection [LR + 88A] containing 88 mM acarbose
  • Otsuka raw food injection [S] Otsuka raw food injection containing 88 mM a
  • the mammalian cell preservation solution of the present invention is a solution containing acarboses and / or stachyoses specified for the use of “for preserving mammalian cells” (that is, the present mammalian cell preservation solution). .
  • the mammalian cell storage solution may be any solution that can store mammalian cells (eg, isotonic solution, hypotonic solution, hypertonic solution), and isotonic solution can be suitably exemplified.
  • isotonic solution means a solution having an osmotic pressure substantially equal to the osmotic pressure of a body fluid or a cell fluid, and specifically, a solution having an osmotic pressure in the range of 250 to 380 mOsm / L.
  • hypotonic solution means a solution having an osmotic pressure lower than the osmotic pressure of a body fluid or a cell fluid, and specifically, a solution having an osmotic pressure of less than 250 mOsm / L. I do.
  • a hypotonic solution a hypotonic solution that does not rupture cells (specifically, a solution having an osmotic pressure in the range of 100 to less than 250 mOsm / L) is preferable.
  • hypothermic solution refers to a solution having an osmotic pressure higher than the osmotic pressure of a body fluid or a cell fluid, and specifically has an osmotic pressure of more than 380 mOsm / L (preferably 380 mOsm / L to within 1000 mOsm / L).
  • the isotonic solution is not particularly limited as long as it is an isotonic solution in which the salt concentration, the sugar concentration, and the like are adjusted by sodium ions, potassium ions, calcium ions, and the like so that the osmotic pressure is substantially the same as the osmotic pressure of a body fluid or a cell fluid.
  • physiological saline physiological saline having a buffering effect
  • a buffering effect for example, PBS, Tris buffered saline [Tris Buffered Saline; TBS], HEPES buffered saline
  • Ringer's solution Ringer's lactate, Ringer's acetate, Ringer's bicarbonate solution, 5% aqueous glucose solution
  • basal medium for culturing animal cells eg, DMEM, EMEM, RPMI-1640, ⁇ -MEM, F-12, F-10, M-199
  • isotonic agent eg, glucose
  • D-sorbitol D-mannitol
  • lactose sodium chloride
  • lactated Ringer's solution lactated Ringer's solution, Acid Ringer's solution, Ringer's solution, or physiological saline (saline) is preferable.
  • the isotonic solution may be a commercially available solution or a solution prepared by oneself.
  • Otsuka Raw Food Injection manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory
  • Ringer's solution “Otsuka” (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory) (Ringer's solution)
  • Lactec registered trademark
  • Injection manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory
  • Lactate Ringer solution Lactate Ringer solution "KS” (Kyoritsu Pharmaceutical Co., Ltd.) (Lactate Ringer solution)
  • Vin F infusion Feuso Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Acetate Ringer solution Otsuka sugar solution 5% (Otsuka Pharmaceutical factory) % Glucose aqueous solution)
  • bicanate infusion manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (Ring bicarbonate solution).
  • acarbose is D-glucose, D-glucose, D-glucose, and (1S, 4R, 5S, 6S) -4,5,6-trihydroxy-3- (hydroxymethyl) -2-cyclohexene Is a series of tetrasaccharides, and more specifically, a substance represented by the following formula.
  • Acarbose can be produced by any known method such as chemical synthesis, production by microorganisms (for example, culture of amino sugar-producing bacteria of the genus Actinoplanes [Actinoplanes]), production by enzymes, and the like, but commercially available products are used. You can also.
  • acarbose manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • acarbose brand name: Glucobay
  • Bayer Yakuhin commercially available products
  • acarbose manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • acarbose brand name: Glucobay
  • acarbose salt examples include hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, phosphate, nitrate, sulfate, acetate, propionate, toluenesulfonate, succinate, and oxalate.
  • Acid addition salts such as acid, lactate, tartrate, glycolate, methanesulfonate, butyrate, valerate, citrate, fumarate, maleate, malate; sodium salts, potassium Metal salts such as salts and calcium salts; ammonium salts and alkylammonium salts; These salts are used as a solution at the time of use, and the action thereof is preferably the same as that of acarbose.
  • These salts may form a hydrate or a solvate, and any one of them may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of acarbose in the isotonic solution may be a concentration at which the effect of suppressing a decrease in cell viability by the acarbose is exerted, for example, at least 40 mM, preferably at least 80 mM, more preferably at least 80 mM. It is 150 mM, more preferably at least 160 mM, even more preferably at least 170 mM.
  • the concentration of acarbose in the isotonic solution is, for example, 1000 mM or less, preferably 700 mM or less, more preferably 600 mM or less, still more preferably 500 mM or less, and still more preferably 400 mM or less.
  • the concentration of acarbose in the isotonic solution is, for example, in the range of 40 to 1000 mM, preferably 80 to 700 mM, more preferably 150 to 600 mM, still more preferably 160 to 500 mM, and still more preferably 170 to 400 mM. .
  • Stachyose is a tetrasaccharide in which D-fructose, D-glucose, D-galactose, and D-galactose are linked, and more specifically, a substance represented by the following formula.
  • Stachyose can be produced by any known method such as chemical synthesis, production by plants (for example, hot water extraction from legumes such as soybeans and cucurbits), and production by enzymes. Can also.
  • commercially available products such as stachyose n hydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and stachyose hydrate (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) can be exemplified.
  • stachyose salt examples include hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, phosphate, nitrate, sulfate, acetate, propionate, toluenesulfonate, succinate, and oxalate.
  • Acid addition salts such as acid, lactate, tartrate, glycolate, methanesulfonate, butyrate, valerate, citrate, fumarate, maleate, malate; sodium salts, potassium Metal salts such as salts and calcium salts; ammonium salts and alkylammonium salts;
  • these salts are used as a solution at the time of use, and the action thereof is preferably the same as that of stachyose.
  • These salts may form a hydrate or a solvate, and any one of them may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of stachyose in the isotonic solution may be a concentration at which the effect of suppressing the decrease in cell viability by stachyose is exerted, for example, at least 40 mM, preferably at least 80 mM, more preferably at least 80 mM. It is 150 mM, more preferably at least 160 mM, even more preferably at least 170 mM.
  • the concentration of stachyoses in the isotonic solution is, for example, 1000 mM or less, preferably 700 mM or less, more preferably 600 mM or less, still more preferably 500 mM or less, and still more preferably 400 mM or less. .
  • the stachyose concentration in the isotonic solution is, for example, in the range of 40 to 1000 mM, preferably 80 to 700 mM, more preferably 150 to 600 mM, still more preferably 160 to 500 mM, and still more preferably 170 to 400 mM. .
  • the mammalian cell preservation solution is used for preserving mammalian cells for an arbitrary period under a temperature condition in which the mammalian cell preservation solution containing mammalian cells exists in a liquid state.
  • Acarboses and stachyoses contained in the mammalian cell preservation solution have an effect of effectively suppressing cell viability reduction and cell aggregation that occur when mammalian cells are stored in a liquid, and It is a substance that is unlikely to adversely affect the ecology of a mammal when administered to the body of the mammal.
  • the present mammalian cell preservation solution is used for “to suppress a decrease in the survival rate of mammalian cells”; for “to suppress cell aggregation of mammalian cells”; and One or more uses selected from “uses to do”; those further specified are preferable.
  • the liquid for preserving mammalian cells of the present invention may contain, in addition to acarbose and stachyose, a component having an inhibitory effect on a decrease in the survival rate of mammalian cells, but only acarbose and stachyose may be used in mammals.
  • acarbose and stachyose a component having an inhibitory effect on a decrease in the survival rate of mammalian cells.
  • components having an action of suppressing the decrease in the survival rate of mammalian cells for example, trehalose, hydroxyethyl starch [HES], glucose
  • HES hydroxyethyl starch
  • the mammalian cell preservation solution is generally a component having an effect of suppressing a decrease in the survival rate of mammalian cells when the mammalian cells are cryopreserved or freeze-dried, for example, dimethyl sulfoxide [Dimethyl @ sulfoxide; DMSO],
  • a cryoprotective agent such as glycerin, ethylene glycol, trimethylene glycol, dimethylacetamide, polyethylene glycol [PEG], polyvinylpyrrolidone, serum or a serum-derived component (eg, albumin), or a cryoprotective agent-free one may be used. .
  • a solution suitable for mammalian cell transplantation is preferable, and such a solution suitable for mammalian cell transplantation is Preferably, it does not contain a substance that is not suitable for mammalian cell transplantation, for example, a component derived from a living body (for example, serum or a serum-derived component [for example, albumin]), or the above-described cryoprotectant or lyophilized protective agent.
  • a component derived from a living body for example, serum or a serum-derived component [for example, albumin]
  • cryoprotectant or lyophilized protective agent for example, a component derived from a living body
  • the mammalian cell preservation solution may be a solution containing acarbose or stachyose alone, a solution containing two or more tetrasaccharides selected from acarbose and stachyose, and acarbose and In addition to stachyoses, it may be a liquid further containing an optional component.
  • optional components include, for example, isotonic agents (eg, glucose, sorbitol, mannitol, lactose, sodium chloride), chelating agents (eg, EDTA, EGTA, citric acid, salicylate), solubilizing agents, Examples include preservatives, antioxidants, amino acids (eg, proline, glutamine), polymers (eg, polyether), and phospholipids (eg, lysophosphatidic acid [LPA; Lysophosphatidic acid]).
  • isotonic agents eg, glucose, sorbitol, mannitol, lactose, sodium chloride
  • chelating agents eg, EDTA, EGTA, citric acid, salicylate
  • solubilizing agents examples include preservatives, antioxidants, amino acids (eg, proline, glutamine), polymers (eg, polyether), and phospholipids (eg, lysophosphatidic acid [LPA; Lysophosphatidic acid
  • the present invention also includes a powder formulation for preparing the mammalian cell preservation solution of the present invention, which comprises acarbose or a salt thereof, and / or stachyose or a salt thereof.
  • the powder formulation may contain the above optional components.
  • the method for preserving mammalian cells of the present invention comprises a step of preserving mammalian cells for an arbitrary period in a solution containing acarboses and / or stachyoses (ie, the mammalian cell preservation solution of the present invention) (hereinafter, referred to as a mammalian cell preservation solution).
  • a mammalian cell preservation solution ie, the mammalian cell preservation solution of the present invention
  • this storage method generally involves storing the mammalian cell storage solution containing mammalian cells under a temperature condition in which the storage solution exists in a liquid state, and the storage solution is in a solid state.
  • the density of the mammalian cells in the mammalian cell storage solution is, for example, in the range of 10 3 to 10 10 cells / mL.
  • the preservation method includes adding mammalian cells to a solution containing acarboses and / or stachyoses (preferably isotonic solution) before storing the mammalian cells in the mammalian cell storage solution.
  • the method further comprises a step of preparing a liquid containing acarboses and / or stachyoses by adding acarboses and / or stachyoses to a liquid containing mammalian cells (preferably, isotonic liquid). It may be.
  • the cell survival of the mammalian cells in the preservation solution may be any time period for storing the mammalian cells.
  • a period in which the decrease in rate can be suppressed and the ratio of living cells can be increased is preferable. For example, 6 hours or more, 12 hours or more, 24 hours (1 day) or more, 36 hours (1.5 days) or more, 48 hours ( 2 days) or more, 3 days or more, 7 days or more, and 10 days or more. If the storage period of the mammalian cells is too long, the survival of the cells may be adversely affected.
  • the above optional storage period is usually in the range of 6 hours to 30 days, in the range of 12 hours to 30 days, in the range of 24 hours to 30 days, in the range of 36 hours to 30 days, and 48 hours.
  • the “temperature at which the present mammalian cell preservation solution containing mammalian cells exists in a liquid state” is such that the present mammalian cell preservation solution containing mammalian cells is in a liquid state without freezing.
  • the temperature may be any temperature at which the mammalian cells in the storage solution can grow, and are usually in the range of 0 to 40 ° C, preferably in the range of 0 to 30 ° C (room temperature).
  • the mammalian cells of the present invention include, for example, mammals administered via blood vessels in regenerative medicine for diseases requiring mammalian cell transplantation treatment (cancer; type I diabetes; organ diseases such as liver diseases).
  • Animal cells specifically, stem cells; pancreatic islet cells; hepatocytes; leukocytes (eg, dendritic cells, lymphocyte cells, macrophages, neutrophils, eosinophils); and the like. It is a stem cell, a lymphocyte cell, or a hepatocyte.
  • leukocytes eg, dendritic cells, lymphocyte cells, macrophages, neutrophils, eosinophils
  • lymphocyte cells are one of the subtypes of leukocytes in the immune system of mammalian cells, and refer to cells that recognize antigens and have immunological ability.
  • lymphocyte cells include T cells (eg, alpha beta [ ⁇ ] T cells, gamma delta [ ⁇ ] T cells, cytotoxic T cells [cytotoxic ⁇ T lymphocyte; CTL], helper T cells ), B cells and natural killer (NK) cells.
  • T cells eg, alpha beta [ ⁇ ] T cells, gamma delta [ ⁇ ] T cells, cytotoxic T cells [cytotoxic ⁇ T lymphocyte; CTL], helper T cells ), B cells and natural killer (NK) cells.
  • leukocytes and lymphocyte cells contained in leukocytes can be obtained from a hemolyzed peripheral blood or cord blood sample, if necessary.
  • cell surface markers for leukocytes CD45
  • cell surface markers for T cells CD3
  • cell surface markers for helper T cells CD4
  • cytotoxic T A fluorescence-activated cell sorter FACS
  • FACS fluorescence-activated cell sorter
  • fluorescent substance examples include allophycocyanin (APC), phycoerythrin (PE), FITC (fluorescein isothiocyanate), Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, PE-Texas Red, PE-Cy5, and PE-Cy7. be able to.
  • APC allophycocyanin
  • PE phycoerythrin
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Alexa Fluor 488 Alexa Fluor 647
  • Alexa Fluor 700 Alexa Fluor 700
  • PE-Texas Red PE-Cy5, and PE-Cy7.
  • stem cell means an immature cell having self-renewal ability and differentiation / proliferation ability.
  • the stem cells include subpopulations such as pluripotent stem cells (pluripotent stem ce11), multipotent stem cells (multipotent ⁇ stem ce11), and unipotent stem cells (unipotent stem ce11), depending on the differentiation ability.
  • Pluripotent stem cells refer to cells that cannot themselves become individuals, but have the ability to differentiate into all tissues and cells that constitute a living body.
  • Pluripotent stem cells refer to cells that have the ability to differentiate into, but not all types of, multiple types of tissues and cells.
  • Unipotent stem cells refer to cells having the ability to differentiate into specific tissues and cells.
  • Pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), EG cells (Embryonic germ cells), induced pluripotent stem cells (Induced pluripotent stem cells; iPS cells) and the like.
  • ES cells can be produced by culturing the inner cell mass on feeder cells or in a medium containing LIF. The method for producing ES cells is described in, for example, WO 96/22362, WO 02/101057, US 5,843,780, US 6,200,806, US 6,280,718 and the like.
  • EG cells can be produced by culturing primordial germ cells in a medium containing mSCF, LIF and bFGF (Ce11, 70: 841-847, 1992).
  • iPS cells are produced by introducing a reprogramming factor such as Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 (c-Myc or n-Myc as needed) into somatic cells (eg, fibroblasts, skin cells, etc.).
  • somatic cells eg, fibroblasts, skin cells, etc.
  • Multipotent stem cells include adipocytes, bone cells, chondrocytes, mesenchymal stem cells that can be differentiated into cells such as fat cells, leukocytes, erythrocytes, hematopoietic stem cells that can be differentiated into blood cells such as platelets, neurons, Examples include neural stem cells, bone marrow stem cells, and somatic stem cells such as germ stem cells that can be differentiated into cells such as astrocytes and oligodendrocytes.
  • the multipotent stem cells are preferably mesenchymal stem cells.
  • Mesenchymal stem cells refer to stem cells capable of differentiating into all or some of osteoblasts, chondroblasts and lipoblasts.
  • Pluripotent stem cells can be isolated from a living body by a method known per se.
  • mesenchymal stem cells can be collected from mammalian bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, umbilical cord blood, and the like by a known general method.
  • human mesenchymal stem cells can be isolated by culture and passage of hematopoietic stem cells or the like after bone marrow aspiration (Journal @ of @ Autoimmunity, 30 (2008) 163-171).
  • Pluripotent stem cells can also be obtained by culturing the pluripotent stem cells under appropriate induction conditions.
  • the mammals of the present invention include mice, rats, hamsters, rodents such as guinea pigs, lagomorphs such as rabbits, ungulates such as pigs, cows, goats, horses, sheep, and cats such as dogs and cats; Primates such as humans, monkeys, rhesus monkeys, cynomolgus monkeys, marmosets, orangutans, chimpanzees, etc. can be exemplified, and among them, mice, pigs, and humans can be preferably exemplified.
  • Adhesive cells can be exemplified as the mammalian cells of the present invention.
  • adherent stem cells include pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, nervous stem cells, bone marrow stem cells, germ stem cells, and the like, and preferred examples include mesenchymal stem cells.
  • the mammalian cells (population) of the present invention may be isolated from a living body or subcultured in vitro, but are preferably isolated or purified.
  • isolated or purification means that an operation for removing components other than the target component has been performed.
  • the purity of isolated or purified mammalian cells is usually 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 70% or more. More preferably, it is 90% or more (for example, 100%).
  • the mammalian cells (population) stored in the mammalian cell storage solution may be in a state of a single cell (single cell).
  • single cell state means that the cells are not clustered together with other cells to form a clump (ie, not aggregated).
  • Mammalian cells in a single cell state can be prepared by enzymatically treating mammalian cells cultured in vitro with trypsin / EDTA or the like.
  • the ratio of the mammalian cells in a single cell state contained in the mammalian cells is, for example, 70% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 99% or more (eg, 100%). is there.
  • the ratio of cells in a single cell state is determined by dispersing mammalian cells in PBS, observing the cells under a microscope, and determining the presence or absence of aggregation of a plurality (eg, 1000) of randomly selected cells. It can be determined by checking.
  • the mammalian cells (population) stored in the mammalian cell storage solution may be floating.
  • “suspended” means that mammalian cells are held in a solution without contacting the inner wall of a container containing the solution for storage.
  • the mammalian cells stored in the mammalian cell storage solution are aggregated or precipitated, the mammalian cells can be suspended by a well-known method in the art such as pipetting or tapping before transplantation. preferable.
  • Example 1 Screening of acarbose and stachyose
  • the present inventors have previously reported that the addition of trehalose to a solution containing mammalian cells can suppress a decrease in cell viability when stored in a solution state.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2012-115253, International Publication No. 2014/208053 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2012-115253, International Publication No. 2014/208053.
  • saccharides other than trehalose were searched for those that exhibited an inhibitory effect on cell viability reduction.
  • hMSC bone marrow-derived human mesenchymal stem cells
  • hMSC-containing PBS was prepared according to the following procedures [1] to [8]. [1] 4 ⁇ 10 5 hMSCs were added to a 75 cm 2 flask, and cultured in the presence of a medium at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. The state of the cells was observed under a microscope, and the cells were cultured until about 80% confluent. [2] The medium was removed, and the hMSC was rinsed with 8 mL of PBS (-). [3] Excluding PBS (-), 3.75 mL of trypsin-EDTA (Lonza) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • HMSCs were stored in various isotonic solutions for test according to the following procedures [1] and [2]. [1] 0.5 mL of the prepared PBS containing hMSC was dispensed into each tube and centrifuged (600 ⁇ g, 5 minutes). [2] The supernatant (PBS) was removed, and the precipitate (hMSC) was suspended in 0.5 mL of an isotonic solution for various tests and stored at 4 ° C. for 3 days.
  • PBS supernatant
  • hMSC precipitate
  • Example 2 Confirmation of effect of suppressing a decrease in cell viability by acarbose and stachyose
  • Acarbose and stachyose are common to tetrasaccharides. Therefore, tetrasaccharides other than acarbose and stachyose were also examined using two types of tetrasaccharides (nystose and maltotetraose) in order to confirm whether or not there was an effect of suppressing the decrease in cell viability.
  • maltotetraose manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Lactec injection was used as a control.
  • HMSCs used in Example 1 were used as mammalian cells.
  • hMSCs were stored in various isotonic solutions for test at 4 ° C. for 2 days according to the method described in Example 1.
  • Example 3 Confirmation of Acarbose-Suppressing Effect on Cell Survival Rate 1 The effect of acarbose on inhibiting cell viability reduction was compared with the effect of trehalose or glucose on cell viability reduction.
  • glucose manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • a physiological saline solution Otsuka Raw Food Injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory), Lactec Injection, and a human mesenchymal stem cell-dedicated medium kit (MSCGM BulletKit, hereinafter referred to as “medium”) (manufactured by Lonza Walkersville, Inc.) PT-3001).
  • HMSCs used in Example 1 were used as mammalian cells.
  • hMSCs were stored in various isotonic solutions for test at 4 ° C. for 3 days according to the method described in Example 1.
  • the results show that when acarbose is added to an isotonic solution and the mammalian cells are stored, compared to the case where the mammalian cells are stored in an isotonic solution without acarbose or in an isotonic solution with trehalose or glucose. It shows that the cell death of mammalian cells in the liquid can be effectively suppressed and the ratio of living cells can be increased.
  • Example 4 Examination of the optimal concentration of acarbose Using an isotonic solution containing 44 to 350 mM acarbose, the optimal concentration of the inhibitory effect of acarbose on cell viability reduction was examined.
  • HMSCs used in Example 1 were used as mammalian cells.
  • hMSCs were stored in various isotonic solutions for test at 4 ° C. for 3 days according to the method described in Example 1.
  • Example 5 Confirmation of the effect of suppressing a decrease in cell viability by acarbose when mammalian cells are stored for a long period of time Confirm whether the effect of suppressing a decrease in cell viability by acarbose is observed even when mammalian cells are stored for a long period of time
  • hMSCs were stored in an isotonic solution containing acarbose at 4 ° C. for 28 days, and the cell viability was analyzed.
  • HMSCs used in Example 1 were used as mammalian cells.
  • hMSCs were stored in various isotonic solutions for test at 4 ° C. for 28 days according to the method described in Example 1.
  • Example 6 Confirmation of the effect of suppressing a decrease in cell viability by acarbose 2 The inhibitory effect of acarbose on cell viability reduction was confirmed using mammalian cells other than hMSCs (rat hepatocytes).
  • Rat hepatocytes shown in Table 5 below were used as mammalian cells.
  • washing medium containing rat hepatocytes A washing medium containing rat hepatocytes was prepared according to the following procedures [1] to [6]. [1] A rat hepatocyte stock tube was taken out of a liquid nitrogen tank and thawed in a 37 ° C constant temperature bath. [2] Immediately after thawing, it was left still on ice and transferred to a 50 mL centrifuge tube. [3] 25 mL of ice-cooled hepatocyte wash medium (Hepatocyte Wash Medium, hereinafter referred to as “wash medium”) (manufactured by GIBCO) was dropped. [4] Centrifugation was performed at 4 ° C. for 3 minutes at 50 ⁇ g.
  • wash medium ice-cooled hepatocyte wash medium
  • washing medium The supernatant (washing medium) was removed, 6 mL of washing medium was added, and the precipitate (rat hepatocytes) was suspended by pipetting 2-3 times.
  • the number of cells was counted and adjusted with a washing medium to 5 ⁇ 10 5 cells / mL, to prepare a washing medium containing rat hepatocytes.
  • rat hepatocytes were stored in Lactec injections containing acarbose, cell viability increased significantly compared to those stored in Lactec injections or in Lactec injections containing trehalose or glucose (Table 1). 6 and FIG. 5). From these results, the cell death inhibitory effect of acarbose is not limited to mesenchymal stem cells (hMSCs), but is also observed in hepatocytes, and thus is considered to be observed in mammalian cells in general.
  • hMSCs mesenchymal stem cells
  • Example 7 Confirmation of the effect of suppressing a decrease in cell viability by acarbose 3
  • Acarbose has an effect of binding to the active site of ⁇ -glucosidase and inhibiting hydrolysis of sugar. Therefore, ⁇ -glucosidase inhibitors other than acarbose are used in order to confirm whether or not the effect of suppressing a decrease in cell viability by acarbose is the result of inhibition of ⁇ -glucosidase activity in mammalian cells.
  • the study was performed using two types of substances (miglitol and voglibose).
  • HMSCs used in Example 1 were used as mammalian cells.
  • hMSCs were stored in various isotonic solutions for test at 4 ° C. for 3 days according to the method described in Example 1.
  • Example 8 Cell aggregation inhibitory effect of acarbose
  • hMSC was stored in an isotonic solution containing acarbose, and the cell aggregation level was analyzed.
  • Method of analyzing cell aggregation level A portion of various isotonic solutions for testing including hMSCs after storage were collected, and the presence or absence of cell aggregates in which three or more cells were collected was observed under a phase-contrast microscope.
  • Example 9 Examination of mammalian cells other than hMSCs One of the lymphocyte cells was used to confirm that the effect of suppressing a decrease in cell viability by acarbose was observed even when mammalian cells other than hMSCs were preserved. It examined using CD8 positive T cell.
  • CD8 positive T cells manufactured by VERITAS
  • CD8-positive T cells (cell concentration of about 1.1 ⁇ 10 6 cells / 5 mL) expanded and cultured for 7 days are washed with Lactec injection containing 88 mM trehalose, and distributed into stem full tubes (Sumitomo Bakelite). After the injection, centrifugation (300 ⁇ g, 10 minutes, room temperature) was performed.
  • Example 10 Examination of optimal concentration of stachyose Using an isotonic solution containing 44 to 150 mM stachyose, the optimal concentration of stachyose in suppressing the cell viability reduction was examined.
  • HMSCs used in Example 1 were used as mammalian cells.
  • Example 11 Examination of isotonic solution The isotonic solution other than Lactec injection was also examined as the isotonic solution.
  • HMSCs used in Example 1 were used as mammalian cells.
  • acarboses and stachyoses by adding acarboses and stachyoses to a liquid, it is possible to effectively suppress cell viability reduction and cell aggregation that occur when mammalian cells are stored in a liquid. Furthermore, since these acarboses and stachyoses are tetrasaccharides which are unlikely to adversely affect the ecology of mammals when administered in vivo to mammals, the mammalian cells are used for storing mammalian cells in the present case. After preservation in a liquid, it can be directly administered into a mammal without replacing it with a new transplant liquid.

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Abstract

本発明は、哺乳動物細胞を液体中で保存したときに生じる細胞生存率低下や細胞凝集を効果的に抑制でき、かつ、哺乳動物の生体内に投与した場合に、哺乳動物の生態に悪影響を及ぼす可能性が低い物質や、かかる物質を含む哺乳動物細胞保存用液等を提供することを課題とする。　アカルボース若しくはその塩、及び／又はスタキオース若しくはその塩を含む液を、哺乳動物細胞を保存するために用いると、哺乳動物細胞を液体中に保存したときに生じる細胞生存率低下や細胞凝集を効果的に抑制することができる。さらに、上記液中で保存した哺乳動物細胞は、新しい移植用液に移すことなく、そのまま哺乳動物の生体内へ投与することができる。

Description

アカルボース又はスタキオースを含む哺乳動物細胞保存用液
　本発明は、アカルボース若しくはその塩（以下、「アカルボース類」ということがある）、及び／又はスタキオース若しくはその塩（以下、「スタキオース類」ということがある）を含む哺乳動物細胞保存用液（以下、「本件哺乳動物細胞保存用液」ということがある）や、本件哺乳動物細胞保存用液を用いて哺乳動物細胞を保存する方法に関する。
　近年、幹細胞研究の急速な発展によって再生医療への気運は高まっており、その知識や理解は、研究者のみならず、一般にも広く普及してきている。幹細胞を用いた再生医療は、幹細胞が有する自己複製能と多分化能や、幹細胞が分泌する因子を利用して、様々な疾患で損傷を受けた細胞や組織の機能を回復させることを目的とした医療である。白血病や再生不良性貧血などの血液難病の患者に骨髄移植をすると、造血系幹細胞が患者体内に生着し、ほぼ一生にわたって造血能の維持が可能となる。また、最近では多くの研究者が造血幹細胞以外の幹細胞を用いた臨床応用を目指し、中枢神経、末梢神経、骨髄、小腸などにおける幹細胞を同定し、外傷性疾患や組織変性疾患に対する組織幹細胞の移植治療が実践され始めている（非特許文献１～３）。他方、がん免疫細胞療法は、がんを攻撃する働きを有する免疫細胞を体外に取り出し、その働きを強化後、再び体内に戻すという最先端の細胞医療であり、樹状細胞ワクチン療法、アルファ・ベータＴ細胞療法（αβＴ細胞療法）、ガンマ・デルタＴ細胞療法（γδＴ細胞療法）、ＣＴＬ療法、ナチュラルキラー細胞療法（ＮＫ細胞療法）などのＴ細胞を用いた療法が実践されている。
　移植治療に用いる幹細胞やＴ細胞を長期保存する場合、液体中での保存では細胞生存率を良好に保つことができない。例えば、ヒト骨髄幹細胞を生理食塩水中に冷蔵保存（４℃）すると、細胞生存率が４８時間後には４０％以下まで低下し、７２時間後には２０％以下まで低下することが報告されている（非特許文献４）。このため、移植用幹細胞や移植用Ｔ細胞を長期保存する場合、凍結保存することが一般的である。しかし、凍結保存液中には、通常ＤＭＳＯ、グリセロール等の凍結保存剤が添加されているため、凍結保存した幹細胞やＴ細胞を解凍した後、移植治療を行う前に移植凍結保存剤を除去する必要があり、手間がかかることが問題とされていた。また、凍結保存液に凍結保存剤を添加しても凍結時の水の結晶化による細胞骨格のダメージが大きく、凍結融解後の細胞生存率が低下することも問題とされていた。このため、簡便性に優れ、且つ細胞生存率の低下を抑制できる細胞保存液の開発が急務とされていた。
　本発明者らは、トレハロースには、哺乳動物細胞を液体中で保存したときに生じる細胞生存率低下や細胞凝集を、抑制する作用があることを報告している（特許文献１及び２）。しかしながら、アカルボースやスタキオースが、かかる作用を有することについてはこれまで知られていなかった。
特開２０１２－１１５２５３号公報 国際公開第２０１４／２０８０５３号パンフレット
Gage, F.H., Science 287: 1433-1438 (2000) Morrison, S.J. et al., Cell 96: 737-749 (1999) Batle, E. et al., Cell 111: 251-263 (2002) Lane, T.A. et al., Transfusion 49: 1471-1481 (2009)
　本発明の課題は、哺乳動物細胞を液体中で保存したときに生じる細胞生存率低下や細胞凝集を効果的に抑制でき、かつ、哺乳動物の生体内に投与した場合に、哺乳動物の生態に悪影響を及ぼす可能性の低い物質や、かかる物質を含む哺乳動物細胞保存用液等を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けている。その過程において、９３種類の糖類の中から、哺乳動物細胞の生存率低下を抑制し、かつその作用効果がトレハロースより高いものとして、アカルボースとスタキオースを見出した。さらにこれらの四糖は、哺乳動物細胞の細胞凝集を抑制する作用を有することも確認した。本発明は、これらの知見に基づき、完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕アカルボース若しくはその塩、及び／又はスタキオース若しくはその塩を含む、哺乳動物細胞保存用液。
〔２〕アカルボース若しくはその塩、及び／又はスタキオース若しくはその塩を等張液中に含む、上記〔１〕に記載の液。
〔３〕等張液中のアカルボース若しくはその塩の濃度が、少なくとも４０ｍＭである、上記〔２〕に記載の液。
〔４〕等張液中のスタキオース若しくはその塩の濃度が、少なくとも４０ｍＭである、上記〔２〕又は〔３〕に記載の液。
〔５〕等張液が、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、リンゲル液、又は生理食塩液である、上記〔２〕～〔４〕のいずれか１つに記載の液。
〔６〕哺乳動物細胞を０～４０℃で保存するための、上記〔１〕～〔５〕のいずれか１つに記載の液。
〔７〕哺乳動物細胞を６時間～３０日間保存するための、上記〔１〕～〔６〕のいずれか１つに記載の液。
〔８〕哺乳動物細胞の生存率低下を抑制するために用いられる、上記〔１〕～〔７〕のいずれか１つに記載の液。
〔９〕哺乳動物細胞の凝集を抑制するために用いられる、上記〔１〕～〔８〕のいずれか１つに記載の液。
〔１０〕哺乳動物細胞の移植に用いられる、上記〔１〕～〔９〕のいずれか１つに記載の液。
〔１１〕哺乳動物細胞が、哺乳動物幹細胞、哺乳動物リンパ球細胞、又は哺乳動物肝細胞である、上記〔１〕～〔１０〕のいずれか１つに記載の液。
〔１２〕哺乳動物幹細胞が、哺乳動物間葉系幹細胞又は哺乳動物リンパ球細胞である、上記〔１１〕に記載の液。
〔１３〕アカルボース若しくはその塩、及び／又はスタキオース若しくはその塩を含む液中で、哺乳動物細胞を保存する工程を含む、哺乳動物細胞の保存方法。
〔１４〕液が、等張液である、上記〔１３〕に記載の保存方法。
〔１５〕等張液中のアカルボース若しくはその塩の濃度が、少なくとも４０ｍＭである、上記〔１４〕に記載の保存方法。
〔１６〕等張液中のスタキオース又はその塩の濃度が、少なくとも４０ｍＭである、上記〔１４〕又は〔１５〕に記載の保存方法。
〔１７〕等張液が、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、リンゲル液、又は生理食塩液である、上記〔１４〕～〔１６〕のいずれか１つに記載の保存方法。
〔１８〕哺乳動物細胞を０～４０℃で保存することを特徴とする、上記〔１３〕～〔１７〕のいずれか１つに記載の保存方法。
〔１９〕哺乳動物細胞を６時間～３０日間保存することを特徴とする、上記〔１３〕～〔１８〕のいずれか１つに記載の保存方法。
〔２０〕哺乳動物細胞が、哺乳動物幹細胞、哺乳動物リンパ球細胞、又は哺乳動物肝細胞である、上記〔１３〕～〔１９〕のいずれか１つに記載の保存方法。
〔２１〕哺乳動物幹細胞が、哺乳動物間葉系幹細胞又は哺乳動物リンパ球細胞である、上記〔２０〕に記載の保存方法。
〔２２〕アカルボース若しくはその塩、及び／又はスタキオース若しくはその塩を含む、上記〔１〕～〔１２〕のいずれか１つに記載の液を調製するための粉末製剤。
　また本発明の実施の他の形態として、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液を、哺乳動物細胞の移植を必要とする対象（例えば、外傷性疾患患者、組織変性疾患患者、がん患者）へ投与する工程を含む、哺乳動物細胞の移植方法；や、
アカルボース類及び／又はスタキオース類を含む液（好ましくは、等張液）に、哺乳動物細胞を加えるか、或いは、哺乳動物細胞を含む液（好ましくは、等張液）に、アカルボース類及び／又はスタキオース類を加えることにより、本件哺乳動物細胞保存用液を調製する工程と、調製した本件哺乳動物細胞保存用液中で、哺乳動物細胞を保存する工程と、保存した哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液を、哺乳動物細胞の移植を必要とする対象（例えば、外傷性疾患患者、組織変性疾患患者、がん患者）へ投与する工程とを含む、哺乳動物細胞の移植方法；や、
本件哺乳動物細胞保存用液の製造における、アカルボース類及び／又はスタキオース類の使用；や、
液体中の哺乳動物細胞の生存率低下を抑制するための、アカルボース類及び／又はスタキオース類の使用；や、
液体中の哺乳動物細胞の細胞凝集を抑制するための、アカルボース類及び／又はスタキオース類の使用；や、
哺乳動物細胞移植治療を必要とする疾患（例えば、外傷性疾患、組織変性疾患、がん）の治療における使用のための、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液；や、
アカルボース類及び／又はスタキオース類を含む液（好ましくは、等張液）に、哺乳動物細胞を加えるか、或いは、哺乳動物細胞を含む液（好ましくは、等張液）に、アカルボース類及び／又はスタキオース類を加えることにより、本件哺乳動物細胞保存用液を調製する工程を含む、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液の調製方法；や、
哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液
を挙げることができる。なお、上記移植方法の、哺乳動物細胞を保存する工程は、通常、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液を、当該保存用液が液体の状態で存在する温度条件下で保存するものであり、当該保存用液が固体の状態で保存する工程（例えば、凍結保存する工程、凍結乾燥保存する工程等の哺乳動物細胞を休眠状態で保存する工程）を含まない。
　本発明によると、アカルボース類やスタキオース類を液体中に加えることにより、哺乳動物細胞を液体中に保存したときに生じる細胞生存率低下や細胞凝集を効果的に抑制することができる。さらに、これらアカルボース類及びスタキオース類は、哺乳動物の生体内に投与した場合に、哺乳動物の生態に悪影響を及ぼす可能性の低い四糖類であることから、哺乳動物細胞を本件哺乳動物細胞保存用液中で保存した後、新しい移植用液に置換することなく、そのまま哺乳動物の生体内へ投与することができる。
骨髄由来ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ；Human Mesenchymal Stem Cell）を、５種類の被験用等張液（ラクテック注［ＬＲ］、１７５ｍＭアカルボースを含むラクテック注［ＬＲ＋１７５Ａ］、１７５ｍＭニストースを含むラクテック注［ＬＲ＋１７５Ｎ］、１７５ｍＭマルトテトラオースを含むラクテック注［ＬＲ＋１７５Ｍａ］、及び１７５ｍＭスタキオースを含むラクテック注［ＬＲ＋１７５Ｓ］）中に４℃で２日間保存後の細胞生存率を、トリパンブルー染色法により解析した結果（ｎ＝３）を示す図である（表１参照）。図中の「Ｐｒｅ」は、４℃で保存前のｈＭＳＣを含むリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline；ＰＢＳ）中のｈＭＳＣの細胞生存率（９４．７±２．１）を示す。図中の「＊＊」及び「＊＊＊」は、Dunnett多重比較検定を行い、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）ことを示す。 ｈＭＳＣを、９種類の被験用等張液（大塚生食注［Ｓ］、ラクテック注［ＬＲ］、８８ｍＭトレハロースを含むラクテック注［ＬＲ＋８８Ｔ］、８８ｍＭアカルボースを含むラクテック注［ＬＲ＋８８Ａ］、８８ｍＭグルコースを含むラクテック注［ＬＲ＋８８Ｇ］、１７５ｍＭトレハロースを含むラクテック注［ＬＲ＋１７５Ｔ］、１７５ｍＭアカルボースを含むラクテック注［ＬＲ＋１７５Ａ］、１７５ｍＭグルコースを含むラクテック注［ＬＲ＋１７５Ｇ］、及び培地［Ｍ］）中に４℃で３日間保存後の細胞生存率を、ＸＴＴ法により解析した結果（培地以外はｎ＝３、培地はｎ＝２）を示す図である（表２参照）。図中の「＊」、「＊＊」及び「＊＊＊」は、Dunnett多重比較検定を行い、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）ことを示す。また、図中の「＃＃」及び「＃＃＃」は、８８ｍＭの３群（ＬＲ＋８８Ｔ、ＬＲ＋８８Ａ及びＬＲ＋８８Ｇ）の間、及び１７５ｍＭの３群（ＬＲ＋１７５Ｔ、ＬＲ＋１７５Ａ、及びＬＲ＋１７５Ｇ）の間で、Tukey type多重比較検定を行い、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）ことを示す。 ｈＭＳＣを、５種類の被験用等張液（ラクテック注［ＬＲ］、４４ｍＭアカルボースを含むラクテック注［ＬＲ＋４４Ａ］、８８ｍＭアカルボースを含むラクテック注［ＬＲ＋８８Ａ］、１７５ｍＭアカルボースを含むラクテック注［ＬＲ＋１７５Ａ］、及び３５０ｍＭアカルボースを含むラクテック注［ＬＲ＋３５０Ａ］）中に４℃で３日間保存後の細胞生存率を、トリパンブルー染色法により解析した結果（ｎ＝３）を示す図である（表３参照）。図中の「Ｐｒｅ」は、４℃で保存前のｈＭＳＣを含むＰＢＳ中のｈＭＳＣの細胞生存率（９５．０％）を示す。図中の「＊＊」及び「＊＊＊」は、Dunnett多重比較検定を行い、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）ことを示す。 ｈＭＳＣを、５種類の被験用等張液（ラクテック注［ＬＲ］、８８ｍＭトレハロースを含むラクテック注［ＬＲ＋８８Ｔ］、４４ｍＭアカルボースを含むラクテック注［ＬＲ＋４４Ａ］、８８ｍＭアカルボースを含むラクテック注［ＬＲ＋８８Ａ］、及び１７５ｍＭアカルボースを含むラクテック注［ＬＲ＋１７５Ａ］）中に４℃で２８日間保存後の細胞生存率を、トリパンブルー染色法により解析した結果（ｎ＝３）を示す図である（表４参照）。図中の「Ｐｒｅ」は、４℃で保存前のｈＭＳＣを含むＰＢＳ中のｈＭＳＣの細胞生存率（９４．１％）を示す。図中の「＊＊」及び「＊＊＊」は、Dunnett多重比較検定を行い、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）ことを示す。 ラット肝細胞を、６種類の被験用等張液（大塚生食注［Ｓ］、ラクテック注［ＬＲ］、１７５ｍＭトレハロースを含むラクテック注［ＬＲ＋１７５Ｔ］、１７５ｍＭアカルボースを含むラクテック注［ＬＲ＋１７５Ａ］、１７５ｍＭグルコースを含むラクテック注［ＬＲ＋１７５Ｇ］、及び培地［Ｍ］）中に４℃で２４時間保存後の細胞生存率を、トリパンブルー染色法により解析した結果（ｎ＝６）を示す図である（表６参照）。図中の「Ｐｒｅ」は、４℃で保存前のラット肝細胞を含む洗浄用培地中のラット肝細胞の細胞生存率（７０．８±３．３２）を示す。図中の「＊＊＊」は、Dunnett多重比較検定を行い、統計学的に有意差がある（ｐ＜０．００１）ことを示す。また、図中の「＃＃＃」は、１７５ｍＭの３群（ＬＲ＋１７５Ｔ、ＬＲ＋１７５Ａ及びＬＲ＋１７５Ｇ）の間で、Tukey type多重比較検定を行い、統計学的に有意差がある（ｐ＜０．００１）ことを示す。 ｈＭＳＣを、４種類の被験用等張液（ラクテック注［ＬＲ］、１７５ｍＭアカルボースを含むラクテック注［ＬＲ＋１７５Ａ］、１７５ｍＭミグリトール（miglitol）を含むラクテック注［ＬＲ＋１７５Ｍｉ］、及び１７５ｍＭボグリボース（voglibose）を含むラクテック注［ＬＲ＋１７５Ｖ］）中に４℃で３日間保存後の細胞生存率を、トリパンブルー染色法により解析した結果（ｎ＝３）を示す図である（表７参照）。図中の「Ｐｒｅ」は、４℃で保存前のｈＭＳＣを含むＰＢＳ中のｈＭＳＣの細胞生存率（９８．５±０．６）を示す。図中の「＊＊＊」は、Dunnett多重比較検定を行い、統計学的に有意差がある（ｐ＜０．００１）ことを示す。 ｈＭＳＣを、２種類の被験用等張液（ラクテック注［ＬＲ］、及び８８ｍＭアカルボースを含むラクテック注［ＬＲ＋８８Ａ］）中に２５℃で４８時間保存後の位相差顕微鏡画像を示す図である。それぞれの被験用等張液について、異なる視野の画像を複数撮影し、代表的な３つの画像を示す。画像中の黒丸で囲った箇所は、細胞凝集塊を示す。 拡大培養したＣＤ８陽性Ｔ細胞を、３種類の被験用等張液（ラクテック注［ＬＲ］、８８ｍＭトレハロースを含むラクテック注［ＬＲ＋８８Ｔ］、及び８８ｍＭアカルボースを含むラクテック注［ＬＲ＋８８Ａ］）中に５℃で保存前の細胞生存率（図８Ａ）又は２４時間保存後の細胞生存率（図８Ｂ）を、トリパンブルー染色法により解析した結果（ｎ＝３）を示す図である（表８参照）。図中の「＊」及び「＊＊」は、Studentのt検定を行い、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）ことを示し、図中の「ｎ．ｓ」、Studentのt検定を行い、統計学的に有意差がない（ｐ≧０．０５）ことを示す。 図９Ａは、５℃で保存前のｈＭＳＣを含むＰＢＳ中のｈＭＳＣの細胞生存率（９３．７±２．０％）を示す。図９Ｂは、当該ｈＭＳＣを、５種類の被験用等張液（ラクテック注［ＬＲ］、４４ｍＭスタキオースを含むラクテック注［ＬＲ＋４４Ｓ］、８８ｍＭスタキオースを含むラクテック注［ＬＲ＋８８Ｓ］、１７５ｍＭスタキオースを含むラクテック注［ＬＲ＋１７５Ｓ］、及び８８ｍＭトレハロースを含むラクテック注［ＬＲ＋８８Ｔ］）中に５℃で４日間保存後の細胞生存率を、トリパンブルー染色法により解析した結果（ｎ＝３）を示す図である（表９参照）。図中の「＊＊」及び「＊＊＊」は、Dunnett多重比較検定を行い、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）ことを示す。 図１０Ａは、５℃で保存前のｈＭＳＣを含むＰＢＳ中のｈＭＳＣの細胞生存率（９３．７±３．２％）を示す。図１０Ｂ及び１０Ｃは、当該ｈＭＳＣを、８種類の被験用等張液（ラクテック注［ＬＲ］、８８ｍＭアカルボースを含むラクテック注［ＬＲ＋８８Ａ］、大塚生食注［Ｓ］、８８ｍＭアカルボースを含む大塚生食注［Ｓ＋８８Ａ］、リンゲル液「オーツカ」［Ｒ］、８８ｍＭアカルボースを含むリンゲル液「オーツカ」［Ｒ＋８８Ａ］、ヴィーンＦ輸液［ＡＲ］、及び８８ｍＭアカルボースを含むヴィーンＦ輸液［ＡＲ＋８８Ａ］）中に５℃で、それぞれ３日間及び９日間保存後の細胞生存率を、トリパンブルー染色法により解析した結果（ｎ＝３）を示す図である（表１０参照）。図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、Studentのt検定を行い、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）ことを示し、図中の「ｎ．ｓ」、Studentのt検定を行い、統計学的に有意差がない（ｐ≧０．０５）ことを示す。
　本発明の哺乳動物細胞保存用液は、「哺乳動物細胞を保存するため」という用途に特定された、アカルボース類及び／又はスタキオース類を含む液（すなわち、本件哺乳動物細胞保存用液）である。
　本件哺乳動物細胞保存用液としては、哺乳動物細胞の保存が可能な液（例えば、等張液、低張液、高張液）であればよく、等張液を好適に例示することができる。本明細書において「等張液」とは、体液や細胞液の浸透圧とほぼ同じ浸透圧を有する液を意味し、具体的には、２５０～３８０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲内の浸透圧を有する液を意味する。また、本明細書において「低張液」とは、体液や細胞液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する液を意味し、具体的には、２５０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の浸透圧を有する液を意味する。かかる低張液としては、細胞が破裂しない程度の低張液（具体的には、１００～２５０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の範囲内の浸透圧を有する液）が好ましい。また、本明細書において「高張液」とは、体液や細胞液の浸透圧よりも高い浸透圧を有する液を意味し、具体的には、浸透圧が３８０ｍＯｓｍ／Ｌ超（好ましくは、３８０ｍＯｓｍ／Ｌ超～１０００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲内）を意味する。
　上記等張液としては、体液や細胞液の浸透圧とほぼ同じになるようにナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等によって塩濃度や糖濃度等を調整した等張液であれば特に制限されず、具体的には生理食塩水や、緩衝効果のある生理食塩水（例えば、ＰＢＳ、トリス緩衝生理食塩水［Tris Buffered Saline；ＴＢＳ］、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液、５％グルコース水溶液、動物細胞培養用基礎培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９）、等張剤（例えば、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、ラクトース、塩化ナトリウム）等を挙げることができ、これらの中でも乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、リンゲル液、又は生理食塩水（生理食塩液）が好ましい。等張液は、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販のものとしては、大塚生食注（大塚製薬工場社製）（生理食塩液）、リンゲル液「オーツカ」（大塚製薬工場社製）（リンゲル液）、ラクテック（登録商標）注（大塚製薬工場社製）（乳酸リンゲル液）、乳酸リンゲル液「ＫＳ」（共立製薬社製）（乳酸リンゲル液）、ヴィーンＦ輸液（扶桑薬品工業社製）（酢酸リンゲル液）、大塚糖液５％（大塚製薬工場社製）（５％グルコース水溶液）、ビカネイト輸液（大塚製薬工場社製）（重炭酸リンゲル液）を挙げることができる。
　上記アカルボース（Acarbose）とは、Ｄ－グルコース、Ｄ－グルコース、Ｄ－グルコース、及び(1S,4R,5S,6S)-4,5,6-トリヒドロキシ-3-(ヒドロキシメチル)-2-シクロヘキセンが連なった四糖であり、より具体的には、以下の式で表される物質である。アカルボースは、化学合成、微生物による生産（例えば、アクチノプラネス［Actinoplanes］属のアミノ糖産生菌の培養）、酵素による生産等のいずれの公知の方法によっても製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、アカルボース（和光純薬工業社製）、アカルボース（商品名：グルコバイ）（バイエル薬品社製）等の市販品を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　上記アカルボースの塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩；ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩；などを挙げることができる。なお、これらの塩は使用時において溶液として用いられ、その作用は、アカルボースと同効なものが好ましい。これらの塩類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
　本発明において、等張液中のアカルボース類の濃度としては、アカルボース類による細胞生存率低下の抑制効果が発揮される濃度であればよく、例えば、少なくとも４０ｍＭ、好ましくは少なくとも８０ｍＭ、より好ましくは少なくとも１５０ｍＭ、さらに好ましくは少なくとも１６０ｍＭ、さらにより好ましくは少なくとも１７０ｍＭである。また、費用対効果の面から、等張液中のアカルボース類の濃度は、例えば、１０００ｍＭ以下、好ましくは７００ｍＭ以下、より好ましくは６００ｍＭ以下、さらに好ましくは５００ｍＭ以下、さらにより好ましくは４００ｍＭ以下である。したがって、等張液中のアカルボース類濃度は、例えば、４０～１０００ｍＭの範囲内、好ましくは８０～７００ｍＭ、より好ましくは１５０～６００ｍＭ、さらに好ましくは１６０ｍ～５００ｍＭ、さらにより好ましくは１７０～４００ｍＭである。
　上記スタキオース（Stachyose）とは、Ｄ－フルクトース、Ｄ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－ガラクトースが連なった四糖であり、より具体的には、以下の式で表される物質である。スタキオースは、化学合成、植物による生産（例えば、大豆等の豆類やウリ科植物から熱水抽出）、酵素による生産等のいずれの公知の方法によっても製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、スタキオースｎ水和物（和光純薬工業社製）、スタキオース水和物（東京化成工業社製）等の市販品を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　上記スタキオースの塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩；ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩；などを挙げることができる。なお、これらの塩は使用時において溶液として用いられ、その作用は、スタキオースと同効なものが好ましい。これらの塩類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
　本発明において、等張液中のスタキオース類の濃度としては、スタキオース類による細胞生存率低下の抑制効果が発揮される濃度であればよく、例えば、少なくとも４０ｍＭ、好ましくは少なくとも８０ｍＭ、より好ましくは少なくとも１５０ｍＭ、さらに好ましくは少なくとも１６０ｍＭ、さらにより好ましくは少なくとも１７０ｍＭである。また、費用対効果の面から、等張液中のスタキオース類の濃度は、例えば、１０００ｍＭ以下、好ましくは７００ｍＭ以下、より好ましくは６００ｍＭ以下、さらに好ましくは５００ｍＭ以下、さらにより好ましくは４００ｍＭ以下である。したがって、等張液中のスタキオース類濃度は、例えば、４０～１０００ｍＭの範囲内、好ましくは８０～７００ｍＭ、より好ましくは１５０～６００ｍＭ、さらに好ましくは１６０ｍ～５００ｍＭ、さらにより好ましくは１７０～４００ｍＭである。
　本件哺乳動物細胞保存用液は、哺乳動物細胞を、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液が液体の状態で存在する温度条件下で任意の期間保存するために用いるものである。本件哺乳動物細胞保存用液中に含まれるアカルボース類やスタキオース類は、哺乳動物細胞を液体中で保存したときに生じる細胞生存率低下や細胞凝集を効果的に抑制する作用を有し、かつ、哺乳動物の生体内に投与した場合に、哺乳動物の生態に悪影響を及ぼす可能性の低い物質である。このため、本件哺乳動物細胞保存用液は、「哺乳動物細胞の生存率低下を抑制するため」という用途；「哺乳動物細胞の細胞凝集を抑制するため」という用途；及び「哺乳動物細胞を移植するため」という用途；から選択される１又は２以上の用途に、さらに特定されたものが好ましい。
　本件哺乳動物細胞保存用液は、アカルボース類及びスタキオース類以外にも、哺乳動物細胞の生存率低下抑制作用を有する成分を含むものであってもよいが、アカルボース類やスタキオース類だけでも、哺乳動物細胞の生存率低下抑制効果を発揮するため、アカルボース類及びスタキオース類以外に、哺乳動物細胞の生存率低下抑制作用を有する成分（例えば、トレハロース、ヒドロキシエチルスターチ［Hydroxyethyl starch；ＨＥＳ］、グルコース）を含まないものであってもよい。
　本件哺乳動物細胞保存用液は、通常、哺乳動物細胞を凍結保存又は凍結乾燥保存したときの哺乳動物細胞の生存率低下を抑制する作用を有する成分、例えば、ジメチルスルホキシド［Dimethyl sulfoxide；ＤＭＳＯ］、グリセリン、エチレングリコール、トリメチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ポリエチレングリコール［ＰＥＧ］、ポリビニルピロリドン、血清又は血清由来成分（例えば、アルブミン）等の凍結保護剤又は凍結乾燥保護剤を含まないものであってもよい。
　本件哺乳動物細胞保存用液としては、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液をそのまま移植に用いる場合、哺乳動物細胞移植に適した液が好ましく、かかる哺乳動物細胞移植に適した液は、哺乳動物細胞移植に適さない物質、例えば、生体由来の成分（例えば、血清又は血清由来成分［例えば、アルブミン］）や、前述の凍結保護剤又は凍結乾燥保護剤を含まないことが好ましい。
　本件哺乳動物細胞保存用液としては、アカルボース類又はスタキオース類を単独で含む液であってもよいし、アカルボース類及びスタキオース類から選択される２種類以上の四糖を含む液や、アカルボース類やスタキオース類以外に、さらに任意成分を含む液であってもよい。
　本明細書において「任意成分」としては、例えば、等張剤（例えば、グルコース、ソルビトール、マンニトール、ラクトース、塩化ナトリウム）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、サリチレート）、溶解補助剤、保存剤、酸化防止剤、アミノ酸（例えば、プロリン、グルタミン）、ポリマー（例えば、ポリエーテル）、リン脂質（例えば、リゾホスファチジン酸［ＬＰＡ；Lysophosphatidic acid］）を挙げることができる。本明細書において「任意成分」とは、含んでもよいし含まなくてもよい成分のことを意味する。
　また、本発明には、アカルボース若しくはその塩、及び／又はスタキオース若しくはその塩を含む、本件哺乳動物細胞保存用液を調製するための粉末製剤が含まれる。当該粉末製剤には上記の任意成分を含んでいてもよい。
　本発明の哺乳動物細胞の保存方法は、アカルボース類及び／又はスタキオース類を含む液（すなわち、本件哺乳動物細胞保存用液）中で、哺乳動物細胞を任意の期間保存する工程を含むもの（以下、「本件保存方法」ということがある）である。本件保存方法は、通常、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液を、当該保存用液が液体の状態で存在する温度条件下で保存するものであり、当該保存用液が固体の状態で存在する温度条件下で保存する工程（例えば、凍結保存する工程、凍結乾燥保存する工程等の哺乳動物細胞を休眠状態で保存する工程）を含まない。また、本件哺乳動物細胞保存用液中の哺乳動物細胞の密度は、例えば、１０３～１０１０個／ｍＬの範囲内である。
　本件保存方法としては、本件哺乳動物細胞保存用液中で哺乳動物細胞を保存する前に、アカルボース類及び／又はスタキオース類を含む液（好ましくは、等張液）に、哺乳動物細胞を加えるか、或いは、哺乳動物細胞を含む液（好ましくは、等張液）に、アカルボース類及び／又はスタキオース類を加えることにより、アカルボース類及び／又はスタキオース類を含む液を調製する工程を、さらに含むものであってもよい。
　本発明において、哺乳動物細胞を保存する任意の期間としては、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液を液体の状態で保存したときに、当該保存用液中の哺乳動物細胞の細胞生存率低下を抑制し、生細胞の割合を高めることができる期間が好ましく、例えば、６時間以上、１２時間以上、２４時間（１日）以上、３６時間（１．５日）以上、４８時間（２日）以上、３日以上、７日以上、１０日以上であり、また、哺乳動物細胞の保存期間が長すぎると細胞の生存に悪影響を及ぼす可能性があるため、細胞の生存率への悪影響を回避する観点から、通常は３０日以下、好ましくは２０日以下、より好ましくは１０日以下、さらに好ましくは６日以下である。したがって、上記任意の保存期間としては、通常、６時間～３０日の範囲内、１２時間～３０日の範囲内、２４時間～３０日の範囲内、３６時間～３０日の範囲内、４８時間～３０日の範囲内、３～３０日の範囲内、７～３０日の範囲内、又は１０～３０日の範囲内であり、好ましくは、６時間～２０日、１２時間～２０日、２４時間～２０日、３６時間～２０日、４８時間～２０日、３～２０日、７～２０日、又は１０～２０日であり、より好ましくは、６時間～１０日、１２時間～１０日、２４時間～１０日、３６時間～１０日、４８時間～１０日、３～１０日、又は７～１０日であり、さらに好ましくは、６時間～６日、１２時間～６日、２４時間～６日、３６時間～６日、４８時間～６日、又は３～６日である。
　本発明において、「哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液が液体の状態で存在する温度」としては、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液が、凍結せずに液体の状態で存在し、かつ当該保存用液中の哺乳動物細胞が生育可能な温度であればよく、通常０～４０℃の範囲内、好ましくは０～３０℃（室温）の範囲内である。
　本発明の哺乳動物細胞としては、例えば、哺乳動物細胞移植治療を必要とする疾患（がん；Ｉ型糖尿病；肝疾患等の臓器疾患；など）に対する再生医療において、血管経由で投与される哺乳動物細胞、具体的には、幹細胞；膵島細胞；肝細胞；白血球（例えば、樹状細胞、リンパ球細胞、マクロファージ、好中球、好酸球）；等を例示することができ、好ましくは、幹細胞、リンパ球細胞、又は肝細胞である。ここで「リンパ球細胞」とは、哺乳動物細胞の免疫系における白血球のサブタイプの１つであり、抗原を認識し、免疫能を有する細胞を意味する。リンパ球細胞には、具体的には、Ｔ細胞（例えば、アルファ・ベータ［αβ］Ｔ細胞、ガンマ・デルタ［γδ］Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞［cytotoxic T lymphocyte；ＣＴＬ］、ヘルパーＴ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。
　上記哺乳動物細胞は、公知の一般的な方法で単離することができる。例えば、白血球や、白血球に包含されるリンパ球細胞（例えば、Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、γδＴ細胞）は、溶血処理した末梢血又は臍帯血試料から、必要に応じて、ＩＬ－２や抗ＣＤ３抗体の存在下で拡大培養した後、白血球の細胞表面マーカー（ＣＤ４５）、Ｔ細胞の細胞表面マーカー（ＣＤ３）、ヘルパーＴ細胞の細胞表面マーカー（ＣＤ４）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８）、γδＴ細胞の細胞表面マーカー（ＣＤ３９）に対する抗体を用いた蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）や、蛍光物質やビオチン、アビジン等の標識物質で標識した上記細胞表面マーカーに対する抗体と、かかる標識物質に対する抗体とＭＡＣＳビーズ（磁性ビーズ）とのコンジュゲート抗体とを用いた自動磁気細胞分離装置（ａｕｔｏＭＡＣＳ）により、それぞれのマーカーが陽性の細胞として単離することができる。上記蛍光物質としては、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、ＰＥ－Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＰＥ－Ｃｙ５、ＰＥ－Ｃｙ７等を挙げることができる。
　また上記「幹細胞」とは、自己複製能及び分化・増殖能を有する未熟な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（pluripotent stem ce11）、複能性幹細胞（multipotent stem ce11）、単能性幹細胞（unipotent stem ce11）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、それ自体では個体になることができないが、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
　多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（Embryonic stem cell；ＥＳ細胞）、ＥＧ細胞（Embryonic germ cell）、誘導多能性幹細胞（Induced pluripotent stem cell；ｉＰＳ細胞）等を挙げることができる。ＥＳ細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はＬＩＦを含む培地中で培養することにより製造することができる。ＥＳ細胞の製造方法は、例えば、ＷＯ９６／２２３６２、ＷＯ０２／１０１０５７、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６、ＵＳ６，２８０，７１８等に記載されている。ＥＧ細胞は、始原生殖細胞をｍＳＣＦ、ＬＩＦ及びｂＦＧＦを含む培地中で培養することにより製造することができる（Ce11,70:841-847,1992）。ｉＰＳ細胞は、体細胞（例えば線維芽細胞、皮膚細胞等）にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（必要に応じて更にｃ－Ｍｙｃ又はｎ－Ｍｙｃ）等のリプログラミング因子を導入することにより製造することができる（Ce11,126:p.663-676,2006;Nature,448:p.313-317,2007;Nat Biotechno1,26;p,101-106,2008;Cel1 131:p.861‐872,2007;Science,318:p.1917-1920,2007;Ce11 Stem Cells 1:p.55-70,2007;Nat Biotechnol,25:p.1177-1181,2007;Nature,448:p.318-324,2007;Cell Stem Cells 2:p.10-12,2008;Nature 451:p.141-146,2008;Science,318:p.1917-1920,2007）。体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した幹細胞も、多能性幹細胞としてまた好ましい（Nature,385,810（1997）；Science,280,1256（1998）；Nature Biotechnology,17,456（1999）；Nature,394,369（1998）；Nature Genetics,22,127（1999）；Proc.Natl. Acad.Sci.USA,96,14984（1999））、Rideout IIIら（Nature Genetics,24,109（2000））。
　複能性幹細胞としては、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等の細胞に分化可能な間葉系幹細胞、白血球、赤血球、血小板等の血球系細胞に分化可能な造血系幹細胞、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト等の細胞に分化可能な神経系幹細胞、骨髄幹細胞、生殖幹細胞等の体性幹細胞等を挙げることができる。複能性幹細胞は、好ましくは間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞とは、骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪芽細胞の全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞を意味する。複能性幹細胞は、自体公知の方法により、生体から単離することができる。例えば、間葉系幹細胞は、哺乳動物の骨髄、脂肪組織、末梢血、臍帯血等から公知の一般的な方法で採取することができる。例えば、骨髄穿刺後の造血幹細胞等の培養、継代によりヒト間葉系幹細胞を単離することができる（Journal of Autoimmunity，30（2008）163-171）。複能性幹細胞は、上記多能性幹細胞を適切な誘導条件下で培養することによっても得ることができる。
　本発明の哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を例示することができ、中でも、マウス、ブタ、ヒトを好適に例示することができる。
　本発明の哺乳動物細胞として、付着性（「接着性」ともいう）の細胞を例示することができる。本明細書中、「付着性」細胞とは、足場に接着することで生存、増殖、物質の生産を行なうことができる足場依存性の細胞を意味する。付着性幹細胞としては、例えば、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞、生殖幹細胞等を挙げることができ、間葉系幹細胞を好適に例示することができる。
　本発明の哺乳動物細胞（集団）は、生体内から分離されたものであっても、インビトロで継代培養されたものであってもよいが、単離又は精製されていることが好ましい。本明細書中、「単離又は精製」とは、目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。単離又は精製された哺乳動物細胞の純度（全細胞数に対する、哺乳動物幹細胞数等の目的とする細胞の割合）は、通常３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば１００％）である。
　本件哺乳動物細胞保存用液中に保存する哺乳動物細胞（集団）は、単一細胞（シングルセル）の状態であってもよい。本明細書において、「単一細胞の状態」とは、他の細胞と寄り集まって塊を形成していないこと（即ち、凝集していない状態）を意味する。単一細胞の状態の哺乳動物細胞は、インビトロで培養した哺乳動物細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ等で酵素処理することにより調製することができる。哺乳動物細胞中に含まれる単一細胞の状態の哺乳動物細胞の割合は、例えば７０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上（例えば１００％）である。単一細胞の状態の細胞の割合は、哺乳動物細胞をＰＢＳ中に分散させ、これを顕微鏡下で観察し、無作為に選択された複数個（例えば、１０００個）の細胞について凝集の有無を調べることにより決定することができる。
　本件哺乳動物細胞保存用液中に保存する哺乳動物細胞（集団）は、浮遊していてもよい。本明細書において、「浮遊」とは、哺乳動物細胞が、保存用液を収容した容器の内壁に接触することなく、液中に保持されていることをいう。
　本件哺乳動物細胞保存用液中に保存した哺乳動物細胞が、凝集又は沈殿している場合、移植前にピペッティングやタッピング等の当該技術分野における周知の方法により哺乳動物細胞を懸濁することが好ましい。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１：アカルボース及びスタキオースのスクリーニング
　本発明者らは、これまでに、哺乳動物細胞を含む液中に、トレハロースを添加すると、溶液の状態で保存したときの細胞生存率低下を抑制できることを報告している（特開２０１２－１１５２５３号公報、国際公開第２０１４／２０８０５３号パンフレット）。そこで、本実施例においては、トレハロース以外の糖類から、細胞生存率低下の抑制効果を示すものを探索した。
１－１．材料及び方法
［被験用等張液の調製］
　９３種類の糖類を選択し、分子量が明確な糖類については、８７．５ｍＭの濃度となるように、それぞれ乳酸リンゲル液であるラクテック（登録商標）注（大塚製薬工場社製）に添加・融解して調製し、また、分子量が不明な糖類については、４～５％の濃度となるように、それぞれラクテック注に添加・融解し、９３種類の糖類を含む等張液を調製した。また、トレハロース（株式会社林原社製）をラクテック注に添加・融解して調製し、８８ｍＭトレハロースを含む等張液を調製した。
［哺乳動物細胞］
　哺乳動物細胞は、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞（Lonza Walkersville社製）（以下、「ｈＭＳＣ」という）を用いた。
［ｈＭＳＣを含むＰＢＳの調製］
　ｈＭＳＣを含むＰＢＳは、以下の手順〔１〕～〔８〕に従って調製した。
〔１〕４×１０５個のｈＭＳＣを、７５ｃｍ２フラスコに加え、培地存在下で３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて培養を行った。顕微鏡下で細胞の状態を観察し、約８０％程度コンフルエントになるまで培養した。
〔２〕培地を除き、８ｍＬのＰＢＳ（－）でｈＭＳＣをリンスした。
〔３〕ＰＢＳ（－）を除き、３．７５ｍＬのトリプシン－ＥＤＴＡ（Lonza社製）を加え、室温で５分間静置した。
〔４〕ｈＭＳＣが９０％程度剥離するまで顕微鏡下で観察しながら、ゆっくりと揺らした。
〔５〕３．７５ｍＬの培地を加え、トリプシン反応を停止させ、ピペッティングによりｈＭＳＣを回収し、５０ｍＬ遠心チューブに移した。
〔６〕６００×ｇ、５分間、２２℃で遠心分離を行った。
〔７〕上清（培地）を除き、１．５ｍＬのＰＢＳ（－）を加え、沈殿（ｈＭＳＣ）を懸濁した。
〔８〕細胞数を計測し、５×１０５cells／ｍＬとなるようにＰＢＳ（－）で調整し、ｈＭＳＣを含むＰＢＳを調製した。
［各種被験用等張液中でのｈＭＳＣの保存方法］
　各種被験用等張液中でのｈＭＳＣの保存は、以下の手順〔１〕～〔２〕に従って行った。
〔１〕調製したｈＭＳＣを含むＰＢＳを、各チューブに０．５ｍＬずつ分注し、遠心分離（６００×ｇ、５分間）を行った。
〔２〕上清（ＰＢＳ）を除き、沈殿（ｈＭＳＣ）を、０．５ｍＬの各種被験用等張液で懸濁し、４℃で３日間保存した。
［トリパンブルー染色法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析］
　トリパンブルー染色法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析は、以下の手順〔１〕～〔２〕に従って行った。
〔１〕４℃で３日間保存後のｈＭＳＣを含む各種被験用等張液のそれぞれから、２０μＬ（１×１０４cells相当）を採取し、チューブに移した後、トリパンブルー染色液（Gibco社製）２０μＬを混合した。なお、比較対照として、各種被験用等張液に懸濁する前（４℃で保存前）のｈＭＳＣを含むＰＢＳのそれぞれから、２０μＬ（１×１０４cells相当）を採取し、チューブに移した後、トリパンブルー染色液２０μＬを混合した。
〔２〕顕微鏡下にてワンセルカウンター（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて全細胞数とトリパンブルー陽性細胞（死細胞）数の測定を行い、全細胞数に対するトリパンブルー陰性細胞の割合、すなわち、細胞生存率を算出した。
１－２．結果
　９３種類の糖類のうち、トレハロースよりも細胞生存率低下の抑制効果が高いものとして、アカルボースとスタキオースが得られた。
　一方、Ｄ－ラクトビオン酸、（－）－２，３－Ｏ－イソプロピリデン－Ｄ－スレイトール、Ｄ－ガラクツロン酸、及びＤ－マンノサミンについては、乳酸リンゲル液中でｈＭＳＣを保存した場合よりも細胞生存率が低下した。
実施例２：アカルボース及びスタキオースによる細胞生存率低下抑制効果の確認
　アカルボースとスタキオースは四糖類で共通する。そこで、アカルボースとスタキオース以外の四糖類についても、細胞生存率低下抑制効果があるか否かを確認するために、２種類の四糖（ニストース及びマルトテトラオース）を用いて検討した。
２－１．材料及び方法
［被験用等張液の調製］
　アカルボース（和光純薬工業社製）をラクテック注に添加・融解し、１７５ｍＭアカルボースを含む等張液を調製した。
また、スタキオースｎ水和物（和光純薬工業社製）をラクテック注に添加・融解し、１７５ｍＭスタキオースを含む等張液を調製した。また、ニストース三水和物（和光純薬工業社製）をラクテック注に添加・融解し、１７５ｍＭニストースを含む等張液を調製した。また、マルトテトラオース（和光純薬工業社製）をラクテック注に添加・融解し、１７５ｍＭマルトテトラオースを含む等張液を調製した。なお、比較対照として、ラクテック注を用いた。
［哺乳動物細胞］
　哺乳動物細胞は、実施例１で使用したｈＭＳＣを用いた。
［ｈＭＳＣを含むＰＢＳの調製］
　ｈＭＳＣを含むＰＢＳは、実施例１に記載の方法に従って調製した。
［各種被験用等張液中でのｈＭＳＣの保存方法］
　ｈＭＳＣを、実施例１に記載の方法に従い、各種被験用等張液中に４℃で２日間保存した。
［トリパンブルー染色法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析］
　トリパンブルー染色法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析は、実施例１に記載の方法に従って行った。
２－２．結果
　ｈＭＳＣを、アカルボース又はスタキオースを含むラクテック注中に保存すると、ラクテック注中に保存した場合と比べ、細胞生存率は上昇することが確認されたのに対して、ｈＭＳＣを、ニストース又はマルトテトラオースを含むラクテック注中に保存しても、かかる細胞生存率の上昇は認められなかった（表１及び図１参照）。
　この結果は、アカルボース及びスタキオースによる細胞生存率低下抑制効果は、四糖類に共通するものではなく、アカルボース及びスタキオースに特異的なものであることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例３：アカルボースによる細胞生存率低下抑制効果の確認１
　アカルボースによる細胞生存率低下抑制効果と、トレハロースやグルコースによる細胞生存率低下抑制効果とを比較検討した。
３－１．材料及び方法
［被験用等張液の調製］
　アカルボース（和光純薬工業社製）をラクテック注に添加・融解し、８８ｍＭアカルボースを含む等張液、及び１７５ｍＭアカルボースを含む等張液を調製した。また、トレハロース（株式会社林原社製）をラクテック注に添加・融解して調製し、８８ｍＭトレハロースを含む等張液、及び１７５ｍＭトレハロースを含む等張液を調製した。また、グルコース（和光純薬工業社製）をラクテック注に添加・融解し、８８ｍＭグルコースを含む等張液、及び１７５ｍＭグルコースを含む等張液を調製した。なお、比較対照として、生理食塩液である大塚生食注（大塚製薬工場社製）、ラクテック注、及びヒト間葉系幹細胞専用培地キット（MSCGM BulletKit、以下「培地」という）（Lonza Walkersville社製、PT-3001）を用いた。
［哺乳動物細胞］
　哺乳動物細胞は、実施例１で使用したｈＭＳＣを用いた。
［ｈＭＳＣを含むＰＢＳの調製］
　ｈＭＳＣを含むＰＢＳは、実施例１に記載の方法に従って調製した。
［各種被験用等張液中でのｈＭＳＣの保存方法］
　ｈＭＳＣを、実施例１に記載の方法に従い、各種被験用等張液中に４℃で３日間保存した。
［ＸＴＴ法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析］
　ＸＴＴ（sodium 3'-[1(-phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro)benzene sulfonic acid hydrate）法による細胞生存率の解析は、以下の手順〔１〕～〔３〕に従って行った。
〔１〕４℃で３日間保存後のｈＭＳＣを含む各種被験用等張液のそれぞれから、１００μＬ（５×１０４cells相当）を採取し、チューブに移した後、６００×ｇ、５分間、２２℃で遠心分離を行った。
〔２〕上清（各種被験用等張液）を除き、１００μＬの培地を加え、沈殿（ｈＭＳＣ）を懸濁した後、９６ウェルプレートに移した。
〔３〕細胞増殖キットII（Ｃａｔ．Ｎｏ．１４６５０１５、Roche社製）のＸＴＴ混合試薬（ＸＴＴ試薬と、電子カップリング液とを５０：１の比率で混合したもの）を、各ウェルに５０μＬずつ加えた。
〔４〕２４分後にプレートリーダー（Ｖｉｅｎｔｏ　ＸＳ　［ＫＣ　ｊｕｎｉｏｒ］、大日本製薬社製）を用いて、生細胞により代謝され、産生されるフォルマザン色素の吸光度である４８０ｎｍの吸光度（Ａ４８０）と、対照波長の吸光度である６５０ｎｍの吸光度（Ａ６５０）とを測定し、Ａ６５０で補正したＡ４８０の吸光度（Ａ４８０－Ａ６５０）を算出した。
３－２．結果
　ｈＭＳＣを、８８ｍＭ又は１７５ｍＭのアカルボースを含むラクテック注中に保存すると、ラクテック注中に保存した場合と比べ、生細胞の指標である「Ａ４８０－Ａ６５０」値が高かった（表２及び図２参照）。また、ｈＭＳＣを、８８ｍＭ又は１７５ｍＭのトレハロースやグルコースを含むラクテック注中に保存すると、ラクテック注中に保存した場合と比べ、「Ａ４８０－Ａ６５０」値は高かったものの、同じ濃度のアカルボースを含むラクテック注中にｈＭＳＣを保存した場合の方が、有意に高かった（表２及び図２参照）。
　この結果は、アカルボースを等張液中に添加し、哺乳動物細胞を保存すると、アカルボース非添加の等張液や、トレハロース又はグルコースを添加した等張液中に哺乳動物細胞を保存した場合と比べ、当該液中の哺乳動物細胞の細胞死が効果的に抑制され、生細胞の割合を高めることができることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例４：アカルボースの至適濃度の検討
　４４～３５０ｍＭアカルボースを含む等張液を用いて、アカルボースによる細胞生存率低下抑制効果の至適濃度を検討した。
４－１．材料及び方法
［被験用等張液の調製］
　アカルボース（和光純薬工業社製）をラクテック注に添加・融解し、４４ｍＭアカルボースを含む等張液、８８ｍＭアカルボースを含む等張液、１７５ｍＭアカルボースを含む等張液、及び３５０ｍＭアカルボースを含む等張液を調製した。なお、比較対照として、ラクテック注を用いた。
［哺乳動物細胞］
　哺乳動物細胞は、実施例１で使用したｈＭＳＣを用いた。
［ｈＭＳＣを含むＰＢＳの調製］
　ｈＭＳＣを含むＰＢＳは、実施例１に記載の方法に従って調製した。
［各種被験用等張液中でのｈＭＳＣの保存方法］
　ｈＭＳＣを、実施例１に記載の方法に従い、各種被験用等張液中に４℃で３日間保存した。
［トリパンブルー染色法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析］
　トリパンブルー染色法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析は、実施例１に記載の方法に従って行った。
４－２．結果
　ｈＭＳＣを、４４～１７５ｍＭのアカルボースを含むラクテック注中に保存すると、細胞生存率は、アカルボースの濃度依存的に上昇したのに対して、ｈＭＳＣを、１７５～３５０ｍＭのアカルボースを含むラクテック注中に保存すると、細胞生存率はほとんど変わらなかった（表３及び図３参照）。
　この結果は、少なくとも４４ｍＭ前後（好ましくは、少なくとも１７５ｍＭ前後）のアカルボースを等張液中に添加し、哺乳動物細胞を保存すると、当該液中の哺乳動物細胞の細胞死を効果的に抑制できることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例５：長期間哺乳動物細胞を保存した場合のアカルボースによる細胞生存率低下抑制効果の確認
　アカルボースによる細胞生存率低下抑制効果が、哺乳動物細胞を長期間保存したときも認められるかどうかを確かめるために、ｈＭＳＣを、アカルボースを含む等張液中に４℃で２８日間保存し、細胞生存率を解析した。
５－１．材料及び方法
［被験用等張液の調製］
　アカルボース（和光純薬工業社製）をラクテック注に添加・融解し、４４ｍＭアカルボースを含む等張液、８８ｍＭアカルボースを含む等張液、及び１７５ｍＭアカルボースを含む等張液を調製した。また、トレハロース（株式会社林原社製）をラクテック注に添加・融解して調製し、８８ｍＭトレハロースを含む等張液を調製した。なお、比較対照として、ラクテック注を用いた。
［哺乳動物細胞］
　哺乳動物細胞は、実施例１で使用したｈＭＳＣを用いた。
［ｈＭＳＣを含むＰＢＳの調製］
　ｈＭＳＣを含むＰＢＳは、実施例１に記載の方法に従って調製した。
［各種被験用等張液中でのｈＭＳＣの保存方法］
　ｈＭＳＣを、実施例１に記載の方法に従い、各種被験用等張液中に４℃で２８日間保存した。
［トリパンブルー染色法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析］
　トリパンブルー染色法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析は、実施例１に記載の方法に従って行った。
５－２．結果
　ｈＭＳＣをラクテック注中に２８日間保存すると、細胞生存率は０％であったのに対して、ｈＭＳＣを、８８ｍＭのアカルボースを含むラクテック注中に２８日間保存すると、細胞生存率は１５．９±５．９０％に上昇した（表４及び図４参照）。また、トレハロースを含むラクテック注中にｈＭＳＣを２８日間保存した場合も、細胞生存率は上昇したものの、アカルボースを含むラクテック注中にｈＭＳＣを２８日間保存した場合の方がその割合は高かった（表４及び図４参照）。さらに、１７５ｍＭのアカルボースを含むラクテック注中にｈＭＳＣを保存すると、８８ｍＭのアカルボースを含むラクテック注中にｈＭＳＣを保存した場合と比べ、細胞生存率はさらに上昇することが示された（表４及び図４参照）。
　これらの結果は、アカルボースを等張液に添加し、哺乳動物細胞を長期間（４℃で２８日間）保存した場合でも、トレハロースを当該等張液に添加し、哺乳動物細胞を長期間保存した場合と比べ、哺乳動物細胞の生存率低下を効果的に抑制できることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例６：アカルボースによる細胞生存率低下抑制効果の確認２
　アカルボースによる細胞生存率低下抑制効果を、ｈＭＳＣ以外の哺乳動物細胞（ラット肝細胞）を用いて確認した。
６－１．材料及び方法
［被験用等張液の調製］
　アカルボース（和光純薬工業社製）をラクテック注に添加・融解し、１７５ｍＭアカルボースを含む等張液を調製した。また、トレハロース（株式会社林原社製）をラクテック注に添加・融解して調製し、１７５ｍＭトレハロースを含む等張液を調製した。また、グルコース（和光純薬工業社製）をラクテック注に添加・融解し、１７５ｍＭグルコースを含む等張液を調製した。なお、比較対照として、大塚生食注、ラクテック注、及び培地を用いた。
［哺乳動物細胞］
　哺乳動物細胞は、以下の表５に示すラット肝細胞を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［ラット肝細胞を含む洗浄用培地の調製］
　ラット肝細胞を含む洗浄用培地は、以下の手順〔１〕～〔６〕に従って調製した。
〔１〕ラット肝細胞のストックチューブを、液体窒素タンクから取出し、３７℃恒温槽で融解した。
〔２〕融解後、すぐに氷上に静置し、５０ｍＬ遠心チューブに移した。
〔３〕２５ｍＬの氷冷した肝細胞洗浄用培地（Hepatocyte Wash Medium、以下「洗浄用培地」という）（GIBCO社製）を滴下した。
〔４〕５０×ｇ、３分間、４℃で遠心分離を行った。
〔５〕上清（洗浄用培地）を除き、６ｍＬの洗浄用培地を加え、沈殿（ラット肝細胞）を２～３回ピペッティングにより懸濁した。
〔６〕細胞数を計測し、５×１０５cells／ｍＬとなるように洗浄用培地で調整し、ラット肝細胞を含む洗浄用培地を調製した。
［各種被験用等張液中でのラット肝細胞の保存方法］
　各種被験用等張液中でのラット肝細胞の保存は、以下の手順〔１〕～〔２〕に従って行った。
〔１〕調製したラット肝細胞を含む洗浄用培地を、各チューブに０．５ｍＬずつ分注し、遠心分離（５０×ｇ、３分間、４℃）を行った。
〔２〕上清（洗浄用培地）を除き、沈殿（ラット肝細胞）を、０．５ｍＬの各種被験用等張液で懸濁し、４℃で２４時間保存した。
［トリパンブルー染色法によるラット肝細胞の細胞生存率の解析］
　トリパンブルー染色法によるラット肝細胞の細胞生存率の解析は、実施例１に記載の方法において、ｈＭＳＣをラット肝細胞に代えて行った。
６－２．結果
　ラット肝細胞を、アカルボースを含むラクテック注中に保存すると、ラクテック注中に保存した場合や、トレハロースやグルコースを含むラクテック注中に保存した場合と比べ、細胞生存率は有意に上昇した（表６及び図５参照）。かかる結果により、アカルボースによる細胞死抑制効果は、間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）に限らず、肝細胞でも認められることから、哺乳動物細胞全般に認められるものであると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
実施例７：アカルボースによる細胞生存率低下抑制効果の確認３
　アカルボースは、αグルコシダーゼの活性部位に結合し、糖の加水分解を阻害する作用を有する。そこで、アカルボースによる細胞生存率低下抑制効果が、哺乳動物細胞中のαグルコシダーゼ活性が阻害された結果、生じたものであるか否かを確認するために、アカルボース以外のα－グルコシダーゼ阻害薬である２種類の物質（ミグリトール及びボグリボース）を用いて検討した。
７－１．材料及び方法
［被験用等張液の調製］
　アカルボース（和光純薬工業社製）をラクテック注に添加・融解し、１７５ｍＭアカルボースを含む等張液を調製した。また、ミグリトール（東京化成工業社製）をラクテック注に添加・融解し、１７５ｍＭミグリトールを含む等張液を調製した。また、ボグリボース（東京化成工業社製）をラクテック注に添加・融解し、１７５ｍＭボグリボースを含む等張液を調製した。なお、比較対照として、ラクテック注を用いた。
［哺乳動物細胞］
　哺乳動物細胞は、実施例１で使用したｈＭＳＣを用いた。
［ｈＭＳＣを含むＰＢＳの調製］
　ｈＭＳＣを含むＰＢＳは、実施例１に記載の方法に従って調製した。
［各種被験用等張液中でのｈＭＳＣの保存方法］
　ｈＭＳＣを、実施例１に記載の方法に従い、各種被験用等張液中に４℃で３日間保存した。
［トリパンブルー染色法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析］
　トリパンブルー染色法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析は、実施例１に記載の方法に従って行った。
７－２．結果
　ｈＭＳＣを、アカルボースを含むラクテック注中に保存した場合、ラクテック注中に保存した場合と比べ、細胞生存率が上昇することが確認されたのに対して、ｈＭＳＣを、ミグリトール又はボグリボースを含むラクテック注中に保存した場合、ラクテック注中に保存した場合と比べ、細胞生存率はほとんど変わらなかった（表７及び図６参照）。
　この結果は、アカルボースによる細胞生存率低下抑制効果は、哺乳動物細胞中のαグルコシダーゼ活性が阻害された効果、生じたものではないことを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
実施例８：アカルボースによる細胞凝集抑制効果
　アカルボースが細胞凝集抑制効果を有するか否かを確認するために、アカルボースを含む等張液中にｈＭＳＣを保存し、細胞凝集レベルを解析した。
８－１．材料及び方法
［被験用等張液の調製］
　アカルボース（和光純薬工業社製）をラクテック注に添加・融解し、８８ｍＭアカルボースを含む等張液を調製した。なお、比較対照として、ラクテック注を用いた。
［ｈＭＳＣを含むＰＢＳの調製］
　ｈＭＳＣを含むＰＢＳは、実施例１に記載の方法に従って調製した。
［各種被験用等張液中でのｈＭＳＣの保存方法］
　ｈＭＳＣを、実施例１に記載の方法に従い、各種被験用等張液中に２５℃で４８時間保存した。
［細胞凝集レベルの解析法］
　保存後のｈＭＳＣを含む各種被験用等張液を一部採取し、位相差顕微鏡下で３個以上の細胞が集まった細胞凝集塊の有無を観察した。
８－２．結果
　ｈＭＳＣをラクテック注中に保存すると、細胞凝集塊の形成が多数認められた（図７の上段、黒丸で囲った箇所参照）。一方、ｈＭＳＣを、アカルボースを含むラクテック注中に保存すると、細胞凝集塊の形成がほとんど認められなかった（図７の下段参照）。
　この結果は、アカルボースを等張液に添加し、哺乳動物細胞を保存すると、当該液中の哺乳動物細胞の細胞凝集を効果的に抑制できることを示している。
実施例９：ｈＭＳＣ以外の哺乳動物細胞の検討
　アカルボースによる細胞生存率低下抑制効果が、ｈＭＳＣ以外の哺乳動物細胞を保存したときも認められることを確認するために、リンパ球細胞の１つであるＣＤ８陽性Ｔ細胞を用いて検討した。
９－１．材料及び方法
［被験用等張液の調製］
　アカルボース（和光純薬工業社製）をラクテック注に添加・融解し、８８ｍＭアカルボースを含む等張液を調製した。また、比較対照として、トレハロース（株式会社林原社製）をラクテック注に添加・融解して調製し、８８ｍＭトレハロースを含む等張液を調製した。なお、比較対照として、ラクテック注を用いた。
［哺乳動物細胞］
　哺乳動物細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（VERITAS社製）を用いた。
［ＣＤ８陽性Ｔ細胞の拡大培養法］
　ＣＤ８陽性Ｔ細胞の拡大培養は、以下の手順〔１〕～〔３〕に従って行った。
〔１〕凍結保存したＣＤ８陽性Ｔ細胞を融解後、リンパ球培養培地（ＬＧＭ３、Lonza社製）で洗浄し、当該培地中で約１時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）した。
〔２〕ＣＤ８陽性Ｔ細胞を含む培地を分取し、遠心分離（３００×ｇ、１０分間、室温）を行った。
〔３〕上清を除き、TLY CULTUREキット25（GCリンフォテック社製）に浮遊させ、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件下で７日間拡大培養した。
［拡大培養したＣＤ８陽性Ｔ細胞の保存及び細胞生存率の測定］
　拡大培養したＣＤ８陽性Ｔ細胞の保存及び細胞生存率の測定は、以下の手順〔１〕～〔３〕に従って行った。
〔１〕７日間拡大培養したＣＤ８陽性Ｔ細胞（細胞濃度が約１．１×１０６細胞／５ｍＬ）を、８８ｍＭトレハロースを含むラクテック注で洗浄し、ステムフルチューブ（住友ベークライト社製）に分注後、遠心分離（３００×ｇ、１０分間、室温）を行った。
〔２〕上清を除き、沈殿（ＣＤ８陽性Ｔ細胞）を、３種類の被験用等張液（８８ｍＭアカルボースを含むラクテック注、８８ｍＭトレハロースを含むラクテック注、及びラクテック注）で懸濁した後、５℃で２４時間保存した。なお、保存前の細胞生存率を測定するために、懸濁直後に、各ステムフルチューブからＣＤ８陽性Ｔ細胞懸濁液を一部（２０μＬ）回収し、トリパンブルー染色液２０μＬを混合した後、顕微鏡下にてワンセルカウンター（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて、1ヵ所の細胞計数部の四隅の細胞計数室のエリアの合計細胞数とトリパンブルー陽性細胞（死細胞）数を計測し、全細胞数に対するトリパンブルー陰性細胞の割合（細胞生存率）を算出した。
〔３〕２４時間保存後、上記〔２〕に記載の方法に従って、細胞生存率を計測した。
９－２．結果
　ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、アカルボースを含むラクテック注中に保存すると、ラクテック注中に保存した場合と比べ、細胞生存率は有意に上昇した（表８及び図８参照）。また、トレハロースを含むラクテック注中にＣＤ８陽性Ｔ細胞を保存した場合も、細胞生存率は上昇したものの、アカルボースを含むラクテック注中にＣＤ８陽性Ｔ細胞を保存した場合の方がその割合は有意に高かった（表８及び図８参照）。
　この結果は、アカルボースによる生存率低下の抑制効果は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞等のリンパ球細胞を保存した場合にも発揮されることを示すとともに、当該効果は、トレハロースよりも高いことを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
実施例１０：スタキオースの至適濃度の検討
　４４～１５０ｍＭスタキオースを含む等張液を用いて、スタキオースによる細胞生存率低下抑制効果の至適濃度を検討した。
１０－１．材料及び方法
［被験用等張液の調製］
　スタキオースｎ水和物（和光純薬工業社製）をラクテック注に添加・融解し、４４ｍＭスタキオースを含む等張液、８８ｍＭスタキオースを含む等張液、及び１７５ｍＭスタキオースを含む等張液を調製した。また、比較対照として、トレハロース（株式会社林原社製）をラクテック注に添加・融解して調製し、８８ｍＭトレハロースを含む等張液を調製した。なお、比較対照として、ラクテック注を用いた。
［哺乳動物細胞］
　哺乳動物細胞は、実施例１で使用したｈＭＳＣを用いた。
［ｈＭＳＣを含むＰＢＳの調製］
　ｈＭＳＣを含むＰＢＳは、実施例１に記載の方法に従って調製した。
［各種被験用等張液中でのｈＭＳＣの保存方法］
　ｈＭＳＣを、実施例１に記載の方法に従い、各種被験用等張液中に５℃で４日間保存した。
［トリパンブルー染色法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析］
　トリパンブルー染色法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析は、実施例１に記載の方法に従って行った。
１０－２．結果
　ｈＭＳＣを、スタキオースを含むラクテック注中に保存すると、ラクテック注中に保存した場合と比べ、いずれの濃度のスタキオースにおいても細胞生存率は有意に上昇することや、細胞生存率は、スタキオースの濃度依存的に上昇することが示された（表９及び図９参照）。また、ｈＭＳＣを、トレハロースを含むラクテック注中に保存した場合も、細胞生存率は上昇したものの、スタキオースを含むラクテック注中にｈＭＳＣを保存した場合の方がその割合は高かった（表９及び図９参照）。
　この結果は、スタキオースによる細胞生存率低下の抑制効果は、等張液中のスタキオース濃度が、少なくとも４４ｍＭ前後で発揮されることを示すとともに、当該効果は、トレハロースよりも高いことを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
実施例１１：等張液の検討
　等張液としてラクテック注以外の等張液についても検討を行った。
１１－１．材料及び方法
［被験用等張液の調製］
　アカルボース（和光純薬工業社製）を、それぞれ４種類の等張液（ラクテック注、生理食塩液である大塚生食注［大塚製薬工場社製］、リンゲル液「オーツカ」［大塚製薬工場社製］、酢酸リンゲル液であるヴィーンＦ輸液［扶桑薬品工業社製］）に添加・融解し、８８ｍＭアカルボースを含む上記４種類の等張液を調製した。また、比較対照として、上記４種類の等張液を用いた。
［哺乳動物細胞］
　哺乳動物細胞は、実施例１で使用したｈＭＳＣを用いた。
［ｈＭＳＣを含むＰＢＳの調製］
　ｈＭＳＣを含むＰＢＳは、実施例１に記載の方法に従って調製した。
［各種被験用等張液中でのｈＭＳＣの保存方法］
　ｈＭＳＣを、実施例１に記載の方法に従い、各種被験用等張液中に５℃で３日間（図１０Ｂ参照）又は９日間（図１０Ｃ参照）保存した。
［トリパンブルー染色法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析］
　トリパンブルー染色法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析は、実施例１に記載の方法に従って行った。
１１－２．結果
　ｈＭＳＣを、アカルボースを含む４種類の等張液（ラクテック注、大塚生食注、リンゲル液「オーツカ」、ヴィーンＦ輸液）中に３日間保存すると、かかる４種類の等張液中に３日間保存した場合と比べ、細胞生存率が上昇し、特に、ラクテック注及びヴィーンＦ輸液を用いた場合、細胞生存率が有意に上昇することが示された（表１０及び図１０Ｂ参照）。また、ｈＭＳＣを、アカルボースを含む上記４種類の等張液中に９日間保存すると、かかる４種類の等張液中に９日間保存した場合と比べ、細胞生存率が有意に上昇することが示された（表１０及び図１０Ｃ参照）。
　この結果は、アカルボースによる細胞生存率低下抑制効果は、ラクテック注（すなわち、乳酸リンゲル液）に限らず、大塚生食注（すなわち、生理食塩液）、リンゲル液「オーツカ」（すなわち、リンゲル液）、ヴィーンＦ輸液（すなわち、酢酸リンゲル液）等の等張液全般で発揮されることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　本発明によると、アカルボース類やスタキオース類を液体中に加えることにより、哺乳動物細胞を液体中に保存したときに生じる細胞生存率低下や細胞凝集を効果的に抑制することができる。さらに、これらアカルボース類及びスタキオース類は、哺乳動物の生体内に投与した場合に、哺乳動物の生態に悪影響を及ぼす可能性の低い四糖類であることから、哺乳動物細胞を本件哺乳動物細胞保存用液中で保存した後、新しい移植用液に置換することなく、そのまま哺乳動物の生体内へ投与することができる。

Claims (22)

  1. 　アカルボース若しくはその塩、及び／又はスタキオース若しくはその塩を含む、哺乳動物細胞保存用液。
  2. 　アカルボース若しくはその塩、及び／又はスタキオース若しくはその塩を等張液中に含む、請求項１に記載の液。
  3. 　等張液中のアカルボース若しくはその塩の濃度が、少なくとも４０ｍＭである、請求項２に記載の液。
  4. 　等張液中のスタキオース若しくはその塩の濃度が、少なくとも４０ｍＭである、請求項２又は３に記載の液。
  5. 　等張液が、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、リンゲル液、又は生理食塩液である、請求項２～４のいずれか１項に記載の液。
  6. 　哺乳動物細胞を０～４０℃で保存するための、請求項１～５のいずれか１項に記載の液。
  7. 　哺乳動物細胞を６時間～３０日間保存するための、請求項１～６のいずれか１項に記載の液。
  8. 　哺乳動物細胞の生存率低下を抑制するために用いられる、請求項１～７のいずれか１項に記載の液。
  9. 　哺乳動物細胞の凝集を抑制するために用いられる、請求項１～８のいずれか１項に記載の液。
  10. 　哺乳動物細胞の移植に用いられる、請求項１～９のいずれか１項に記載の液。
  11. 　哺乳動物細胞が、哺乳動物幹細胞、哺乳動物リンパ球細胞、又は哺乳動物肝細胞である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の液。
  12. 　哺乳動物幹細胞が、哺乳動物間葉系幹細胞又は哺乳動物リンパ球細胞である、請求項１１に記載の液。
  13. 　アカルボース若しくはその塩、及び／又はスタキオース若しくはその塩を含む液中で、哺乳動物細胞を保存する工程を含む、哺乳動物細胞の保存方法。
  14. 　液が、等張液である、請求項１３に記載の保存方法。
  15. 　等張液中のアカルボース若しくはその塩の濃度が、少なくとも４０ｍＭである、請求項１４に記載の保存方法。
  16. 　等張液中のスタキオース若しくはその塩の濃度が、少なくとも４０ｍＭである、請求項１４又は１５に記載の保存方法。
  17. 　等張液が、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、リンゲル液、又は生理食塩液である、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の保存方法。
  18. 　哺乳動物細胞を０～４０℃で保存することを特徴とする、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の保存方法。
  19. 　哺乳動物細胞を６時間～３０日間保存することを特徴とする、請求項１３～１８のいずれか１項に記載の保存方法。
  20. 　哺乳動物細胞が、哺乳動物幹細胞、哺乳動物リンパ球細胞、又は哺乳動物肝細胞である、請求項１３～１９のいずれか１項に記載の保存方法。
  21. 　哺乳動物幹細胞が、哺乳動物間葉系幹細胞又は哺乳動物リンパ球細胞である、請求項２０に記載の保存方法。
  22. 　アカルボース若しくはその塩、及び／又はスタキオース若しくはその塩を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の液を調製するための粉末製剤。
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