CN114958724A - 一种稳定的原代肝细胞试剂盒的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稳定的原代肝细胞试剂盒的生产方法。通过灌注和消化、提取、纯化、培养获得的原代肝细胞，保存在下列保存液中：10‑40％的胎牛血清、8‑12％的二甲基亚砜、2‑5％的磺基水杨酸、5‑10％的乙酰胺、4‑10％的螺旋藻多糖、0.5‑2％的青链霉素、10‑20％的甘油、0.5‑3％的牛磺酸、6‑11％的肌醇半乳糖苷，以磷酸缓冲液磷酸二氢钾、磷酸氢二钠调pH值至7.2‑7.4。本发明制成的原代肝细胞试剂盒，保存时间更长，运输方便，在复苏后即可应用。可方便和广泛用于各项相应研究。

Description

一种稳定的原代肝细胞试剂盒的生产方法

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，涉及原代肝细胞分离、纯化、培养及稳定的试剂盒生产方法。

背景技术

肝脏是身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面起着去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质的合成等作用。肝脏相关疾病及其代谢的研究，可以通过从肝组织获得正常的原代肝细胞，实现离体研究。且离体原代培养的肝细胞不受到体内神经内分泌系统的复杂影响，还能够保持肝细胞的特异性功能。可以更多更方便地用于药物研发、疾病研究和环境安全研究等。

原代肝细胞主要是肝实质细胞，肝实质细胞是指具有肝功能的单位，是肝脏的基本组成单位之一。目前有多个专利公开了原代肝细胞的分离方法和培养方法。

但肝实质细胞属于中高度分化细胞，生长营养需求高，在体外存活时间短；每次使用之前，需要临时分离和培养，对于很多缺乏相应设备的试验室无法进行，且因临时分离和培养的操作技术差异等，造成数据不稳定。因此，本发明开发一种稳定型的原代肝细胞试剂盒，可供研究人员方便使用。

发明内容

本发明主要内容和关键点如下：

1、小鼠肝灌注和消化：以蠕动泵进行灌注。消化期间定期按压下腔静脉，这种方法可以使肝脏反复膨胀，肝内增加的压力有助于肝脏的消化，从而提高产率。

2、肝细胞提取：在肝脏溶解在分散液后，用镊子夹住肝脏的中央部位，轻轻摇动以分散残留的细胞，丢弃所有残留的固体颗粒。

3、肝细胞纯化：以预冷培养基溶解细胞团，重悬，离心3次。

4、肝细胞培养：在将细胞放入培养箱之前，以线性方式(即直线前后或左右)彻底震板。在培养4h后，铺上层胶原蛋白以形成三明治夹层培养。以后分别每24h换液，连续培养3天。

5、原代肝细胞试剂稳定液生产：保存液主要成份及配比：10-40％的胎牛血清、8-12％的二甲基亚砜、2-5％的磺基水杨酸、5-10％的乙酰胺、4-10％的螺旋藻多糖、0.5-2％的青链霉素、10-20％的甘油、0.5-3％的牛磺酸、6-11％的肌醇半乳糖苷。以磷酸缓冲液磷酸二氢钾、磷酸氢二钠调pH值至7.2-7.4，4℃保存。

6、细胞活性检测及连续性检测：对存储的试剂盒肝原代细胞进行复活，以台盼蓝染色法和MTT法检测细胞活性。

附图说明

图1是每个试剂盒肝细胞连续6个月的计数板计数。

图2是台盼蓝染色法活性测定结果不同时间的肝细胞活率。

图3是MTT法活性测定结果OD值。

具体实施方式

为了更清楚明白本发明，将结合实施的具体例子进行详细描述和说明。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不应视为限制本发明的范围。尤其是一些试剂的具体配比，无法全部列出，但也在本发明范围之内。同时描述的部分具体实施方式为常规条件进行。

具体实施步骤1、小鼠肝灌注和消化：

麻醉小鼠。1.25％三溴乙醇0.13-0.15ml/10g，腹腔注射。腹部向上将小鼠固定于工作平台上；胶带固定四肢。用75％酒精清洁、消毒腹部和胸部区域。用剪刀和镊子取下腹部切口，剪开表皮，拨开到一边，直线剪开肌肉层至剑突，将肌肉层拨开。用棉球拨开腹腔其他脏器，使肝脏、门静脉(PV)和下腔静脉(IVC) 充分暴露。启动蠕动泵，等待套管针前端有液体流出后，伴随着液体的流出，迅速地将套管针置入门静脉中。当剪断下腔静脉后，将灌流速度加大到5ml/min。当灌注液即将耗尽时，打开消化液管道阀门。消化期间定期按压下腔静脉，这种方法可以使肝脏反复膨胀，肝内增加的压力有助于肝脏的消化，从而提高产率。在肝下叶或许会看到小的清亮透明的部分，肝脏可能出现湿透的条纹布样纹理。当消化效果满意后，关掉蠕动泵并小心地拔出套管。

具体实施步骤2、肝细胞提取：

用新的镊子和剪刀小心取下肝脏，立即将肝脏浸入盛有4℃预冷DMEM的10cm 培养皿中，撕裂肝叶。肝脏可以大部分溶解在分散液之中。将肝脏撕开后，用镊子夹住肝脏的中央部位，轻轻摇动以分散残留的细胞。丢弃所有残留的固体颗粒。

具体实施步骤3、肝细胞纯化：

用100μm滤网过滤细胞悬浮液。然后将其转移到无菌、干净的50ml离心管中。300rpm、4℃离心3分钟。用移液管吸弃上清，加入10mL4℃预冷WE培养基。轻轻吹打几次以溶解底部的细胞团，并重悬。再重复上述步骤2次，共计离心3 次。离心完成后，吸弃上清，并加入10ml冷培养基。保持足够的细胞悬液浓度，这样就不必在细胞铺板之前重新离心，但也不要使细胞悬液浓度过高，以免造成计数困难。轻柔重悬细胞。

具体实施步骤4、肝细胞培养：

在计数细胞后，对铺板细胞悬液进行适当稀释。在确认细胞密度正常并进行过各种必要的调整后，将细胞种在铺好下层1型胶原蛋白的孔板中。种板时确保每1-2分钟重悬一次细胞，因为肝细胞密度较大、沉淀迅速。在将细胞放入培养箱之前，以线性方式(即直线前后或左右)彻底震板。提前铺好下胶，保存在细胞培养箱中，使用前用PBS缓冲液小心洗板1次，本实验培养液均为无血清 William’s E培养液，添加培养液至2ml，在放入培养箱培养时注意震板摇匀，培养4h后，铺上层胶原蛋白以形成三明治夹层培养，不另加培养基。以后分别每24h换液。连续培养3天。

具体实施步骤5、原代肝细胞试剂稳定液生产：

弃去培养基，对贴壁细胞以下列保存液进行冲洗，然后将其转移到无菌、干净的50ml离心管中。300rpm、4℃离心2分钟。用移液管吸弃上清，加入20-30ml 保存液，密封保存。

保存液主要成份及配比：10-40％的胎牛血清、8-12％的二甲基亚砜、2-5％的磺基水杨酸、5-10％的乙酰胺、4-10％的螺旋藻多糖、0.5-2％的青链霉素、 10-20％的甘油、0.5-3％的牛磺酸、6-11％的肌醇半乳糖苷。以磷酸缓冲液磷酸二氢钾、磷酸氢二钠调pH值至7.2-7.4，4℃保存。

具体实施步骤6、细胞复苏和细胞活性检测：

将冻存保存的肝细胞，置于37℃水浴锅中迅速解冻，加以直接加入到复苏培养基中，或者再经过离心，去掉上清，加入复苏培养基进行重悬。

复苏后，检查细胞活性，所复苏的肝细胞活力应至少超过85％，以确保不同实验批次间的一致性，连续检查6个月。

台盼蓝染色法：向100μl细胞悬浮液中加入800μl培养基或PBS，再添加 100μl0.4％的台盼蓝。上下摇动几次使其与细胞悬液充分混合。室温染色约 1min。再次轻柔吹打数次，吸取10μl悬液滴加到血细胞计数板上。显微镜下计数所有未蓝染、非空泡样细胞。活的、健康的肝细胞具有明亮，清澈，平滑的外观，相对较小并且有聚集性。受损、死亡的细胞通常肿胀并且看起来粗糙、呈颗粒状。

MTT法：取细胞悬液，以1x10个/孔(100LL)接种于96孔培养板中。待 24h贴壁后，弃去原培养基。在37℃，5％C02条件下继续培养24h，每孔加入 200μl MTT储存液(5g/L-1)，孵育4h后弃培养基，每孔加100μl DMSO，振荡5min，在酶标仪570nm处测定吸光度(OD值)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.一种能保存较长时间(6个月及以上)，方便运输，在复苏后即可应用的原代肝细胞试剂盒。

2.根据权利要求1所述的原代肝细胞试剂盒，其特征在于：通过灌注和消化、提取、纯化、培养，最终保存在保存液中的原代肝细胞。

3.根据权利要求2所述的保存液，其主要组分及体积百分数如下：10-40％的胎牛血清、8-12％的二甲基亚砜、2-5％的磺基水杨酸、5-10％的乙酰胺、4-10％的螺旋藻多糖、0.5-2％的青链霉素、10-20％的甘油、0.5-3％的牛磺酸、6-11％的肌醇半乳糖苷。最后以磷酸缓冲液磷酸二氢钾、磷酸氢二钠调pH值至7.2-7.4，4℃保存。

4.根据权利要求3所述的保存液，其中组分可以同功能类产品取代，以人血白蛋白取代胎牛血清，以海藻糖取代螺旋藻多糖。

5.根据权利要求3所述的保存液，其中磷酸缓冲液可以为磷酸二氢钾、氢氧化钠配制调pH值。

6.根据权利要求1、2、3、4、5所述原代肝细胞试剂盒，可以用于制作：小鼠原代肝细胞试剂盒，大鼠原代肝细胞试剂盒，人原代肝细胞试剂盒，猴原代肝细胞试剂盒，猪原代肝细胞试剂盒，鸟原代肝细胞试剂盒，鱼原代肝细胞试剂盒。

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